白介素-22在治療病毒性肝炎中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人白介素-22的二聚體及其藥物組合物，其中，所述二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示的人白介素-22的二聚體，所述式I為M1-L-M2，式中，M1是人白介素-22的第一單體；M2是人白介素-22的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素-22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。本發(fā)明還公開了所述人白介素-22的二聚體在制備治療病毒性肝炎的藥物中的用途。
【專利說明】白介素-22在治療病毒性肝炎中的應(yīng)用
[0001] 本申請是申請日為2011年08月30日、申請?zhí)枮?01180041737. 2、發(fā)明名稱為"白 介素-22在治療病毒性肝炎中的應(yīng)用"的發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物和醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及白介 素-22 (Interleukin-22)在治療病毒性肝炎（viral hepatitis)中的用途。

【背景技術(shù)】
[0003] 病毒性肝炎是由甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒引起的肝臟炎癥疾病。所有肝炎病毒 都能引起急性肝炎（acute hepatitis)，此外乙、丙、丁型病毒還可引起慢性肝炎（chronic h印atitis)，慢性肝炎可以導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭以及肝癌。
[0004] 以美國為例，每年大約新增的50-60萬病毒性肝炎患者，其中甲型肝炎患者為15 萬，甲型肝炎是由甲型肝炎病毒引起的一種急性疾病。同時(shí)新增20-30萬乙型肝炎患者。大 約6-10%的乙型肝炎患者發(fā)展成慢性乙肝。慢性乙肝患者容易轉(zhuǎn)化成肝硬化、肝功能衰竭 及肝癌。據(jù)估計(jì)全世界有2-3億慢性乙肝患者，美國有120萬。乙型肝炎是由乙型肝炎病 毒引起的。除此之外，每年還新增大約15萬丙型肝炎患者（之前丙型肝炎被稱為非甲非 乙型肝炎）。大約50-70%的急性丙型肝炎發(fā)展成慢性丙型肝炎。慢性丙型肝炎容易轉(zhuǎn)化 成肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。據(jù)估計(jì)，在美國大約有350萬慢性丙型肝炎患者。乙、丙型 肝炎患者可以轉(zhuǎn)化成慢性肝炎。慢性肝炎狀態(tài)下，病毒長期在肝臟中生存并復(fù)制，同時(shí)引起 肝臟的慢性炎癥，從而導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的發(fā)生和發(fā)展。
[0005] 以中國為例，每年大約新增的50-60萬病毒性肝炎患者，其中甲型肝炎患者為15 萬。
[0006] 病毒性肝炎的診斷基礎(chǔ)是檢測病毒抗體、病毒遺傳物質(zhì)、蛋白、抗原的存在與否。 肝臟炎癥導(dǎo)致肝組織損傷的重要生物標(biāo)志（biomarker)是血液各種酶和轉(zhuǎn)氨酶的活性增 加，例如：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST或S (GOT)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT或SGPT)。
[0007] 急性肝炎和慢性肝炎的治療方法有所不同。急性病毒性肝炎（甲型肝炎）的治療 首先是減輕病人惡心、嘔吐和腹痛的癥狀。目前對于甲型肝炎臨床上還沒有特效藥，治療 重點(diǎn)是保證患者有足夠的營養(yǎng)補(bǔ)充和避免肝臟的永久性損傷。急性肝炎患者在發(fā)病2周 內(nèi)可以使用免疫球蛋白。慢性乙肝患者的治療主要是干擾素（干擾素 a-2b或干擾素 A) 和聚乙二醇干擾素 a-2a(Pegasys)，以及抗病毒藥物，如：替比夫定（Tyzeka)、恩替卡韋 (Baraclude)、拉米夫定（Epivir-HBV)、阿德福韋醋（Hepsera)。慢性丙肝患者的治療主要 以抗病毒藥物和干擾素或者干擾素的復(fù)方，比如：聚乙二醇干擾素 a -2a和聚乙二醇干擾 素 a-2b配合抗病毒藥物病毒唑聯(lián)合應(yīng)用。目前，對由于病毒引起的肝損傷本身，并無有 效的治療藥物。
[0008] 白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一種T細(xì)胞分泌的糖蛋白，又名白介素10 誘導(dǎo)的 T細(xì)胞因子（IL-lO-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)。白介素 22mRNA的表達(dá)最初證明在小鼠的IL-9刺激后的T細(xì)胞株和IL-9刺激的肥大細(xì)胞株（mast cells)，以及concanavalinA激活后的脾細(xì)胞。人白介素22mRNA的表達(dá)主要在外周自分離 的T細(xì)胞并通過抗⑶-3的抗體或ConA刺激。白介素22mRNA在激活后的NK細(xì)胞也有表達(dá)。 活化的T細(xì)胞主要是⑶4+，特別是由⑶28通路的Thl細(xì)胞。
[0009] 白介素-22前體由179個(gè)氨基酸殘基組成（成熟肽為146個(gè)氨基酸殘 基），Dumoutier等最先報(bào)道了克隆小鼠和人的白介素-22基因（Dumoutier, et al, JI, 164:1814-1819, 2000)。此夕卜，Dumoutier 還取得了 IL-22 的專利（US 專利號 6, 359, 117和6, 274, 710)。Gurney也取得了 IL-22在治療人胰腺病變方面的應(yīng)用專利（US 專利號 6, 551，799)。
[0010] 白介素_22主要在胸腺、大腦、活化的T細(xì)胞和肥大細(xì)胞、lectin刺激后的脾細(xì)胞 (Duroutier JI 2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK細(xì)胞（Wolk，K JI 2002)，以及 LPS刺激后的多個(gè)器官和組織中表達(dá)（Dumoutier PNAS paper)，包括腸道，肝，胃，腎，肺，心 臟，胸腺，脾都可測到IL-22的表達(dá)升高。
[0011] IL-22通過結(jié)合IL-22RI受體和IL-10R2受體，發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-22R1是IL-22 特異的受體，它表達(dá)在皮膚，腎，消化系統(tǒng)（胰腺，小腸，肝，大腸，結(jié)腸）以及呼吸系統(tǒng)（肺， 支氣管）。已公開的研宄表明，白介素22是一個(gè)免疫調(diào)節(jié)劑。
[0012] 在專利申請白介素-22的醫(yī)藥用途中，已報(bào)道IL-22對降低血清甘油三酯，肥胖的 醫(yī)療用途（見專利：WO 2006/073508, CN 200510023103.0)。
[0013] 然而，目前并未發(fā)現(xiàn)白介素 _22可以在治療病毒性肝炎中可發(fā)揮積極的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的就是一種有效的治療病毒性肝炎的藥物及其用途，即白介 素-22 (Interleukin-22)在治療哺乳動(dòng)物病毒性肝炎（Viral h印atitis)中的用途。
[0015] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人白介素 -22或其二聚體的用途，它用于制備 治療病毒性肝炎的藥物。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝 炎和戊型肝炎。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的人白介素 -22的二聚體是式I所示的人白介素 -22的二 聚體：
[0018] M1-L-M2 式 I
[0019] 式中，
[0020] Ml是人白介素-22的第一單體；
[0021] M2是人白介素-22的第二單體；
[0022] L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在 一起的接頭元件，
[0023] 其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期 是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的接頭元件L選自下組：
[0025] (i) 3-50個(gè)氨基酸的短肽；
[0026] (ii)式II所示的多肽元件：
[0027] -Z-Y-Z-式 II
[0028] 式中，
[0029] Y為載體蛋白；
[0030] Z為無、或1-30個(gè)氨基酸的短肽；
[0031] 為化學(xué)鍵或共價(jià)鍵。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是相同的。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是不同的。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物活性包括：
[0035] (a)降低肝臟炎癥和減少肝細(xì)胞壞死，對肝炎病毒引起的肝細(xì)胞損傷起到保護(hù)作 用；
[0036] (b)抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是二個(gè)IgG的Fc片段之間通過二硫鍵連接而形 成。在另一優(yōu)選例中，所述二硫鍵的數(shù)量為2-4個(gè)。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的""是肽鍵。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的IL-22二聚體的血清半衰期是所述第一單體和/或第二 單體的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述二聚體是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5所示的單體所構(gòu) 成的二聚體。
[0042] 在本發(fā)明的第二方面，提供了式I所示的人白介素 -22的二聚體：
[0043] M1-L-M2 式 I
[0044] 式中，
[0045] Ml是人白介素 -22的第一單體；
[0046] M2是人白介素 -22的第二單體；
[0047] L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在 一起的接頭元件，
[0048] 其中，所述的白介素 -22二聚體保持了白介素 22的生物活性，并且其血清半衰期 是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。
[0049] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種可用于治療病毒性肝炎的藥物組合物，它含有 藥學(xué)上可接受的載體以及式I所示的人白介素-22的二聚體，
[0050] M1-L-M2 式 I
[0051] 式中，
[0052] Ml是人白介素 -22的第一單體；
[0053] M2是人白介素 -22的第二單體；
[0054] L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在 一起的接頭元件，
[0055] 其中，所述的白介素 -22二聚體保持了白介素 22的生物活性，并且其血清半衰期 是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述二聚體是由氨基酸序列如SEQ ID NO:3或5所示的單體所 構(gòu)成的二聚體。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述集落刺激因子IL-22的二聚體采用以下步驟制備：
[0058] (a)采用包含編碼IL-22-Fc復(fù)合物的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0059] (b)培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和
[0060] (c)分離純化所述IL-22二聚體。
[0061] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再 一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1顯示了本發(fā)明一種IL-22二聚體的示意圖。其中，表示連接肽，IL-22橢 圓形表示IL-22單體。
[0063] 該IL-22二聚體的一種序列如SEQ ID ΝΟ:1所示，其中第1-146位為IL-22,第 147-162位為連接肽，第163-308位為另一 IL-22。
[0064] 圖2A和2B顯示了本發(fā)明IL-22二聚體的示意圖。其中，表示氨基酸連接肽， IL-22橢圓形表示IL-22單體，標(biāo)記為"C"的橢圓形表示載體蛋白，并且IL-22位于載體蛋 白的N-末端，圖2B中顯示二個(gè)Fc通過二硫鍵配對。
[0065] -種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fc片段的IL-22單體的序列如SEQ ID NO:2 所示，其中第1-146位為IL-22,第147-162位為連接肽，第163-385位為人IgG2的Fe片 段。二個(gè)帶有Fe片段的IL-22單體，通過Fe的配對作用構(gòu)成二聚體。
[0066] -種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fe片段的IL-22單體的序列如SEQ ID NO:3 所示，其中第1-146位為IL-22,第147-152位為連接肽，第153-375位為人IgG2的Fe片 段。二個(gè)帶有Fe片段的IL-22單體，通過Fe的配對作用構(gòu)成二聚體。
[0067] 圖3A和3B顯示了本發(fā)明IL-22二聚體的示意圖。其中，表示氨基酸連接肽， IL-22橢圓形表示IL-22單體，標(biāo)記為"C"的橢圓形表示載體蛋白，并且IL-22位于載體蛋 白的C-末端，圖3B中顯示二個(gè)Fe通過二硫鍵配對。
[0068] 一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fe片段的IL-22單體的序列如SEQ ID N0:4 所示，其中第1-223位為人IgG2的Fe片段，第224-239位為連接肽，第240-385位為IL-22。 二個(gè)帶有Fe片段的IL-22單體，通過Fe的配對作用構(gòu)成二聚體。
[0069] 一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fe片段的IL-22單體的序列如SEQ ID NO:5 所示，其中第1-223位為人IgG2的Fe片段，第224-229位為連接肽，第230-375位為IL-22。 二個(gè)帶有Fe片段的IL-22單體，通過Fe的配對作用構(gòu)成二聚體。
[0070] 圖4顯示了 IL-22和IL-22二聚體（IL-22-Fc)對激活小鼠肝STAT3的影響。結(jié) 果顯示，IL-22二聚體激活STAT3的生物活性明顯高于單體IL-22的活性。
[0071] 圖5顯示了小鼠感染肝炎病毒后，血清ALT水平變化。重組人IL-22單體 (IL-22，PEG化的IL-22)和IL-22二聚體都可以抑制由肝炎病毒引起的ALT的升高，其中 IL-22二聚體的抑制效果尤為顯著。
[0072] 圖6顯不了小鼠感染肝炎病毒后，血清AST水平變化。重組人IL-22單體（IL-22， PEG化的IL-22)和IL-22二聚體都可以顯著地抑制由肝炎病毒引起的AST的升高，其中 IL-22二聚體的抑制效果尤為顯著。
[0073] 圖7顯示了小鼠感染肝炎病毒后肝臟組織學(xué)形態(tài)變化。小鼠感染MHV-A59病毒后 第5天可見肝組織嚴(yán)重炎癥，細(xì)胞壞死亡灶，形態(tài)異常改變。使用IL-22或其二聚體治療后 的動(dòng)物，可見明顯的肝臟組織學(xué)形態(tài)的保護(hù)作用，明顯降低的炎癥和細(xì)胞壞死。
[0074] 圖8顯示了 IL-22二聚體、IL-22單體的體外活性分析結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0075] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研宄，首次意外地發(fā)現(xiàn)：白介素 -22在病毒性誘導(dǎo)的 肝炎表現(xiàn)出明顯的治療效果。IL-22能有效地保護(hù)肝臟功能，顯著地降低由病毒引起的血 液ALT/AST的升高。此外，與IL-22單體相比，本發(fā)明的二聚體IL-22能夠延長體內(nèi)半衰期， 改善藥物的動(dòng)力學(xué)，減少注射頻率；尤其是能顯著增強(qiáng)體內(nèi)生物活性，因而能夠更有效地治 療病毒性肝炎。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0076] 術(shù)語
[0077] 術(shù)語"氨基酸序列基本相同"是指序列相同或由一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變（缺失、增 加、取代）引起的不同，但這種改變基本上不降低其生物學(xué)活性，即可以通過結(jié)合IL-22靶 細(xì)胞受體而發(fā)生生物學(xué)功能。任何符合"基本相同"要求的白介素-22均包括在本發(fā)明內(nèi)， 無論它是糖基化的（即來源于天然的或來源于真核生物表達(dá)系統(tǒng)的）或是非糖基化的（即 來源于原核生物表達(dá)系統(tǒng)或化學(xué)合成的）。
[0078] 術(shù)語"治療"是指基于治愈、緩解、改善、減輕、影響治療對象疾病、癥狀、疾病體質(zhì) (predisposition)的目的而給予需要治療的對象本發(fā)明的白介素-22。
[0079] 術(shù)語"治療對象"是指鼠、人及其他哺乳動(dòng)物。
[0080] 術(shù)語"治療有效量"是指能夠在治療對象體內(nèi)達(dá)到治療目的的白介素-22的量。本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述"治療有效量"可隨白介素-22的給藥途徑、所用藥物輔 料以及與其他藥物聯(lián)合用藥情況的不同而有所不同。
[0081] 白介素22及其制備
[0082] 如本發(fā)明所用，"白介素-22"或"IL-22"是指一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)（a)具有與 Dumoutier等人在US Patent No. 359, 117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序 列和（b)具有與天然白介素-22相同的生物學(xué)活性。本發(fā)明的白介素-22包括，但不限于： 人白介素-22、重組人白介素、鼠白介素-22和/或重組鼠白介素-22。
[0083] "白介素-22"還包括PEG化的IL-22以及共價(jià)修飾的IL-22蛋白質(zhì)。例如，可用 各種活化的分子量為5, 000?100, 000的聚乙二醇（PEG)修飾以使IL-22高分子化，延 長其半衰期。具體操作可參見 Greenwald et al.，Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 2465 ; Caliceti et al·，IL Farmaco, 1993, 48, 919 ;Zalipsky and Lee,《聚乙二醇化學(xué)：生物技 術(shù)與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，J. M. Harris編，Plenum Press, N. Y.，1992。優(yōu)選使用多臂樹杈型活性 PEG(CN ZL02101672. 0,W09932139, PCT/US95/0755,PCT/US94/13013, US Pat:4, 640, 835, 4, 496, 689,4, 301, 144,4, 670, 417,4, 791, 192,4, 179, 337)。
[0084] 本發(fā)明的白介素 -22可用基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的。表達(dá)的宿主細(xì)胞包括原 核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或者高等真核生物細(xì)胞。適用的原核宿主細(xì)胞包括，但不限于：G +或 G一菌，如大腸桿菌E. coli.，能夠通過公共途徑得到的E. coli.菌株包括：K12麗294(ATCC 31，446)、乂1776(八丁(1：31，537)、？3110(八丁(1：27,325)和 1(5 772(八丁(1：53,635)等。其他 可用的原核細(xì)胞包括但不限于：歐式桿菌（Erwinia)、克雷伯桿菌（Klebsiella)、變形桿菌 (Proteus)、沙門桿菌（Salmonella)如鼠傷寒桿菌（Salmonella typhimurium)、沙雷菌屬 (Serratia)如粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescans)、志賀菌屬（Shigella)、枯草桿菌.（B. subtilis)、地衣芽胞桿菌（B. Iicheniformis)、假單胞菌屬（Pseudomonas)如綠膿桿菌 (P. aeruginosa)、鏈球菌（Streptomyces) a E. coli. W3110因其常被用作重組DNA產(chǎn)品的發(fā) 酵宿主而被推薦為優(yōu)選。
[0085] 除了原核細(xì)胞，真核細(xì)胞如絲狀真菌（filamentous fungi)或酵母 菌（yeast)等同樣適用于表達(dá)或者克隆本發(fā)明的白介素-22。釀酒酵母菌 (Saccharomyces)就是一種常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖 酵母菌（Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse，Nature，290:140[1981]; EP 139, 383);克魯維酵母菌（Kluyveromyces hosts) (U. S. Pat. No. 4, 943, 529 ;Flee et al·，Bio/Technology，9:968-975 (1991))如 Κ· lactis (MW98-8C，CBS683，CBS4574; Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，154 (2) :737_742[1983])，Κ· fragiI is (ATCC 12,424), K.waltii(ATCC 56, 500) ? K. drosophilarum(ATCC 36, 906 ；Van den Berg et al. , Bio/Technology,8:135 (1990))? K. thermotolerans? K. marxianus ；yarrowia (EP 402,226);巴氏畢赤酵母菌（卩;[。1113?&8七01^8)出？ 183.070;3代610^811仙6七&1.，<1· Basic Microbiol.，28:265_278[1988]);念珠菌（Candida) ;Trichoderma reesia(EP 244,234);脈胞菌（Neurospora crassa) (Case et al.，Proc. Natl. Acad.Sci. USA，76:5259_5263[1979]);施萬異樣霉菌（schwanniomyces)如 Schwanniomyces occidentalis(EP 394,538);絲狀真菌（filamentous fungi)如 Neurospora，青 霉菌（Penicillium)， Tolypocladium(TO 91/00357)，曲霉菌（Aspergillus)如 A. nidulans (Balance et al. , Biochem. Biophys. Res. Commum. , 112:284-289[1983]； Tilburm et al. , Gene,26:205-221 [1983] ；Yelton et al.,Proc.Nat I. Acad. Sci.USA，81:1470-1474[1984])和黑曲霉（A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4:475_479[1985])D甲基營養(yǎng)酵母菌（Methylotropic yeasts)同樣可用于表達(dá)本發(fā)明 的白介素-22,包括但不限于各種能夠在甲醇中生長的酵母菌如漢遜酵母菌（Hansenula)， 念珠菌（Candida)，克勒克酵母菌（kloeckera)，畢赤酵母菌（Pichia)，釀酒酵母菌 (Saccharomyces)，球擬酵母菌（Torulopsis)，紅酵母菌（Rhodotorula) cj屬于甲基營養(yǎng)酵 母菌類的典型菌種參見 C. Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269 (1982) 〇
[0086] 用于表達(dá)糖基化的本發(fā)明的白介素-22的宿主細(xì)胞來源于多細(xì)胞有機(jī)體。無 脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括昆蟲細(xì)胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9,植物細(xì) 胞。適用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括中華倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO)，COS細(xì)胞。特 別是，經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞株（COS-7, ATCC CRL 1651);人胚胎腎細(xì)胞株 293 (Graham et al. , J. Gen Virol. , 36:59 (1977)) ；CH0/-DHFR (Urlaub and ChasinjProc. Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980));小鼠睪丸滋養(yǎng)細(xì)胞〇￥4，]\^讓61'，81〇1· Reprod.，23:243-251 (1980));人肺細(xì)胞（WI38, ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺癌細(xì)胞（MMT 060562, ATCC CCL51)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何選擇 合適的宿主細(xì)胞。
[0087] 上述宿主細(xì)胞經(jīng)白介素-22表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化后可在傳統(tǒng)的營 養(yǎng)基（nutrient media)中培養(yǎng)，所述營養(yǎng)基經(jīng)修飾后適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子（promoter)、選擇性 轉(zhuǎn)化體（selecting transformant)或者擴(kuò)增白介素-22編碼基因序列。培養(yǎng)條件如培養(yǎng) 基、溫度、PH等的選擇對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說則是應(yīng)知的。如何使細(xì)胞培養(yǎng)繁殖力最 大化的一般原則、方案以及操作技術(shù)可參見Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)and Sambrook et al.，supra。
[0088] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)熟知真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，例如CaCl2 法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體媒介法或電穿孔法。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞的不同，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員可選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如〇3〇1 2法（Sambrook et al. ,supra.) 或電穿孔法通常用于原核細(xì)胞；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)感染主 要用于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（Shaw et al. ,Gene, 23:315(1983)and WO 89/05859); 對于沒有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則可以使用磷酸媽沉淀法（Graham and van der Eb，Virology, 52:456-457 (1978));有關(guān)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染的全面描述可參見 U.S.Pat.N..4,399,216。有關(guān)如何轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞可參見 Van Sol ingen et al.，J. Bact·，130:946(1977)和Hsiao et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829(1979)。其他 將DNA引入細(xì)胞的方法，如核酸微量注射、電穿孔、完整細(xì)菌細(xì)胞原生質(zhì)體融合（bacterial protoplast fusion with intact cells)、或者聚陽離子法（polycations)如 1，5_ 二甲 基-1,5-二氮^--亞甲基聚甲溴化物（polybrene)、聚鳥氨酸（polyornithine)等皆可用 于本發(fā)明中。有關(guān)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述可參見Keown et al.，Methods in Enzymology, 185:527-537(1990)和 Mansour et al·，Nature, 336:348-352(1988)〇
[0089] 編碼本發(fā)明的白介素-22的核苷酸序列（即cDNA或基因組DNA)可被插入一可 復(fù)制載體（replicable vector)進(jìn)行基因克?。―NA擴(kuò)增）或者表達(dá)。各種載體如質(zhì)粒、 粘粒（cosmid，裝配型質(zhì)粒）、病毒顆粒或噬菌體等均可通過公共途徑獲得。運(yùn)用本領(lǐng)域的 公知技術(shù)，可將本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列按常規(guī)步驟插入可復(fù)制載體上適宜 的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。一個(gè)可復(fù)制載體通常包括但不限于以下部件：一條或多條信號 序列（signal sequence)，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication)，一條或多條標(biāo)記基因 (marker gene)，一個(gè)增強(qiáng)子元件（enhancer element)，一個(gè)啟動(dòng)子（promoter)，以及一段 轉(zhuǎn)錄中止序列（transcription termination sequence)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可運(yùn)用本 領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)（ligation techniques)構(gòu)建含有一個(gè)或多個(gè)上述部件的合適的可復(fù) 制載體。
[0090] 本發(fā)明的白介素-22不但可以通過基因重組直接表達(dá)，也可以通過與異種多肽形 成融和多肽的方式生產(chǎn)，后者可以是一段位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的信號序列，也可以 是位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的具有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽片段。通常情況下，這段 信號序列是上述可復(fù)制載體的一部分，或者它也可以是插入可復(fù)制載體的本發(fā)明的白介 素-22編碼核苷酸序列的一部分。所述信號序列可以是原核信號序列，例如堿性磷酸酶，青 霉素酶，lpp，或者熱穩(wěn)定腸毒素 II前導(dǎo)序列。在酵母分泌系統(tǒng)（yeast secretion)中，該信 號序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列（yeast invertase leader)，α因子前導(dǎo)序列（包括釀 酒酵母菌和克魯維酵母菌α因子前導(dǎo)序列，參見U.S. Pat. No. 5, 010, 182)，或酸性磷酸酶 前導(dǎo)序列，c. albicans葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列（EP 362, 179)。在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中，哺 乳動(dòng)物信號序列可直接用于分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)，此類序列包括來源于相同或相近物種哺乳動(dòng) 物分泌蛋白的信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列。
[0091] 表達(dá)載體和克隆載體均含有一段核苷酸序列，該序列使載體能夠在一個(gè)或多個(gè)相 應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。與各種細(xì)菌、酵母或病毒宿主細(xì)胞對應(yīng)的核苷酸序列為本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所公知。例如，質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)G-細(xì)菌，2. mu.質(zhì)粒復(fù)制起 點(diǎn)適用于酵母細(xì)胞，而各種病毒復(fù)制起點(diǎn)（SV40,多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)則適用于 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的克隆載體。
[0092] 表達(dá)載體和克隆載體通常含有一段選擇基因，又名"選擇標(biāo)記"。典型的選擇基因 編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（a)對某些抗生素或毒素如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四環(huán)素等具 有抗性；(b)能彌補(bǔ)營養(yǎng)缺陷型缺乏（auxotrophic deficiencies) (c)補(bǔ)充復(fù)合型培養(yǎng)基 不能提供的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)如桿菌宿主細(xì)胞需要的D-丙氨酸消旋酶的編碼基因。
[0093] 適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇基因應(yīng)該可以將有能力吸納本發(fā)明的白介素-22 編碼基因的宿主細(xì)胞區(qū)分出來，如DHFR或胸（腺嘧啶核）苷激酶。適用的以野生型DHFR 為選擇基因的宿主細(xì)胞是無 DHFR活性的CHO細(xì)胞株，該細(xì)胞株的制備及繁殖方法可參 見 Urlaub et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)。適用于酵母細(xì)胞的選擇基 因是在酵母質(zhì)粒 Yrp7 中表達(dá)的 trpl 基因 （Stinchcomb et al·，Nature, 282:39(1979); Kingsman et al·，Gene, 7:141 (1979) ;Tschemperet al·，Gene, 10:157 (1980))。trpl 基因 可用于篩選不能在色氨酸中生長的酵母菌突變株如ATCC No. 44047或PEP4-1 (Jones, Gene tics, 85:12(1977))。
[0094] 表達(dá)載體和克隆載體通常含有一個(gè)可人工操縱地連接到本發(fā)明的白介素-22編 碼核苷酸序列上的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA的合成。與各種宿主細(xì)胞對應(yīng)的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員所公知。適用于原核宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系 統(tǒng)（Chang et al·，Nature, 275:6I5 (I978) ;Goeddel et al·，Nature, 281:544(1979))， 堿性磷酸酶，色氨酸（trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)（Goeddel, Nucleic Acids Res. ,8:4057 (1980); EP 36, 776)，雜合啟動(dòng)子如 tac 啟動(dòng)子（(^13〇616七31.，？1'〇(3.似1:1.八〇&(1.3(3；[· USA，80:21-25 (1983))。細(xì)菌宿主細(xì)胞啟動(dòng)子同樣包含一段可人工操縱地連接到本發(fā)明的 白介素-22編碼基因序列的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。
[0095] 適用于酵母宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子序列包括3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子（Hitzeman et al.，J.Biol. Chem. ,255:2073(1980))或其他糖酵解酶的啟動(dòng)子（Hess et al.，J.Adv. Enzvme Reg.，7:149 (1968) ;Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978))，如稀醇化酶，甘油 醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸 甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，葡糖磷酸異構(gòu)酶，和葡糖激酶。
[0096] 還有一些可誘導(dǎo)的酵母啟動(dòng)子，它們能更好地根據(jù)生長情況來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，包括醇 脫氫酶2,異細(xì)胞色素 C，酸性磷酸酶，氮素代謝相關(guān)降解酶，金屬硫蛋白，甘油醛-3-磷酸， 麥芽糖和半乳糖代謝酶等的啟動(dòng)子。有關(guān)適用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體和啟動(dòng)子的進(jìn)一步描 述參見EP 73,657。
[0097] 啟動(dòng)子可以控制哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)可復(fù)制載體上本發(fā)明的白介素-22編碼基 因序列的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子包括來自于多形瘤病毒，禽痘病毒（通2,211，504)，腺病毒，牛 乳頭（狀）瘤病毒，禽類肉瘤病毒，巨細(xì)胞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒 (SV40)等病毒基因組的啟動(dòng)子，來自于異種哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球 蛋白啟動(dòng)子，以及來自于熱休克蛋白的啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子同宿主細(xì)胞表達(dá)體系相 容。
[0098] 通過在可復(fù)制載體中插入增強(qiáng)子可增強(qiáng)本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列 在高等真核生物表達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是一種DNA分子的順式作用元件，通常為10到 300個(gè)bp，通過作用于啟動(dòng)子而增強(qiáng)DNA分子的轉(zhuǎn)錄。目前已知很多增強(qiáng)子序列來自于哺 乳動(dòng)物基因（珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰島素）。而使用較多的是來自于 真核病毒細(xì)胞的增強(qiáng)子，如位于復(fù)制起點(diǎn)下游（late side)的SV40增強(qiáng)子（100-270bp)，巨 細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)下游的多形瘤病毒增強(qiáng)子，腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng) 子可被剪切插入位于可復(fù)制載體上的本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列的5'端或3' 端，優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'端。
[0099] 真核宿主細(xì)胞（酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞， 或者來源于其他多細(xì)胞有機(jī)體的有核細(xì)胞）中的表達(dá)載體同樣含有中止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA 所需的核苷酸序列。此類序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端，有時(shí)也 可取自3'端。所述"非翻譯區(qū)"包含的核苷酸片段可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生位于本發(fā)明的白介素-22mRNA 非翻譯區(qū)的聚腺苷?；巍?br> [0100] 其他可在重組脊椎動(dòng)物培養(yǎng)體系中用于合成本發(fā)明的白介素-22的方法、 載體和宿主細(xì)胞可參見 Gething et al. ,Nature, 293:620-625(1981) ;Mantei et al·，Nature, 281:40-46(1979) ;EP 117, 060;以及 EP 117,058。
[0101] IL-22 二聚體
[0102] 本發(fā)明的IL-22二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示。代表性的結(jié)構(gòu)如圖1-3中所示。其中， 載體蛋白包括（但并不限于）是指人IgG(l，2, 3, 4)的Fc片段、或人白蛋白（albumin)。
[0103] IL-22位于可用載體蛋白的C-末端，也可用位于載體蛋白的N-末端。
[0104] 如本文所用，術(shù)語"連接肽"（linker)指位于IL-22單體和IL-22單體之間的、起 連接作用的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度通常為5-50個(gè)氨基酸。通 常，連接肽不影響或不顯著影響IL-22單體和IL-22單體形成正確的折疊和空間構(gòu)象。一 些連接肽的例子包括（但并不限于）：
[0105] 較佳地，所述的連接肽具有選自下組的氨基酸序列：
[0106] (a)疏水性氨基酸Gly和Pro構(gòu)成的3-16個(gè)氨基酸序列，例如 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro ；
[0107] (b)多克隆位點(diǎn)所編碼的氨基酸序列。該序列通常為5-20個(gè)，較佳地10-20個(gè)氨 基酸；
[0108] (c)來自于IL-22單體之外的蛋白的氨基酸序列，例如來自于IgG或白蛋白的氨基 酸序列；
[0109] (d)由（a)、（b)和（c)組合形成的氨基酸序列。
[0110] 優(yōu)選的連接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 1 中第 147-162 位）和 ASTKGP(SEQ ID NO:3 中第 147-152 位）。
[0111] 此外，在融合蛋白的N端或C末端還可添加其他不影響IL-22單體活性的氨基酸 序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(dá)（如信號肽），有利于純化（如6XHis序 列）、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點(diǎn)（Glu-Lys-Arg)，或可促進(jìn)融合蛋白的活性。
[0112] 二聚體的制備方法
[0113] 編碼本發(fā)明IL-22二聚體或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR 擴(kuò)增或合成的方法獲得IL-22第一單體和/或IL-22第二單體的編碼DNA序列，然后將其 拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。
[0114] 為了提尚宿主細(xì)胞的表達(dá)量，可以對IL-22二聚體編碼序列進(jìn)行改造，例如米用 宿主細(xì)胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。在本發(fā)明中，可以采用酵母細(xì) 胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏好的密碼子，并采用計(jì)算機(jī)DNA軟件對IL-22二聚體基因進(jìn)行檢測，排 除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列等。
[0115] 在獲得了編碼本發(fā)明新融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再 轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的融合 蛋白。
[0116] 如本文所用，術(shù)語"載體"包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。
[0117] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載 體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋 白表達(dá)載體。
[0118] 如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的 分泌，那么信號肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動(dòng)子控制序列 的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置 時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0119] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng) 物細(xì)胞等。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0120] 在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞， 從而表達(dá)出融合蛋白。然后再分離出表達(dá)的融合蛋白。
[0121] 藥物組合物和施用方法
[0122] 由于本發(fā)明IL-22二聚體可產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活序號并具有優(yōu)異的血清半衰期， 因此本發(fā)明IL-22二聚體以及含有本發(fā)明IL-22二聚體為主要活性成分的藥物組合物可用 于治療病毒性肝炎。其中，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝 炎和戊型肝炎。
[0123] 本發(fā)明的藥物組合物包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明IL-22二聚體及藥理上可 以接受的賦形劑或載體。其中"安全、有效量"指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不 至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有0. OOl-IOOOmg的IL-22或其二聚體/劑， 較佳地〇· 05-300mg的IL-22或其二聚體/劑，更佳地，含有0· 5-200mg的IL-22或其二聚 體/劑。
[0124] 本發(fā)明的化合物及其藥理上可接受的鹽可制成各種制劑，其中包含安全、有效量 范圍內(nèi)的本發(fā)明IL-22或其二聚體或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或 載體。其中"安全、有效量"指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副 作用?；衔锏陌踩?、有效量根據(jù)治療對象的年齡、病情、療程等具體情況來確定。
[0125] "藥理上可以接受的賦形劑或載體"指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或 凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。"相容性"在此指 的是組合物中各組份能與本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的 藥效。藥理上可以接受的賦形劑或載體部分例子有纖維素及其衍生物（如羧甲基纖維素 鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等）、明膠、滑石、固體潤滑劑（如硬脂酸、硬脂酸鎂）、硫酸 鈣、植物油（如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等）、多元醇（如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇 等）、乳化劑（如吐溫?:)、潤濕劑（如十二烷基硫酸鈉）、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、 防腐劑、無熱原水等。
[0126] 施用本發(fā)明IL-22或其二聚體時(shí)，可以口服、直腸、腸胃外（靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮 下）、局部給藥。
[0127] 用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑 型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑（或載體）混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或 與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b) 粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕 劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅 酸鹽、和碳酸鈉；（e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；（g)潤濕劑，例 如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和（i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸 鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也 可包含緩沖劑。
[0128] 固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和 其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的 釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì) 和蠟類物質(zhì)。必要時(shí)，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0129] 用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。 除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增 溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰 胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物 等。
[0130] 除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味 劑、嬌味劑和香料。
[0131] 除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯 山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。
[0132] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0133] 用于局部給藥的本發(fā)明IL-22或其二聚體的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑 和吸入劑?；钚猿煞衷跓o菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí) 可能需要的推進(jìn)劑一起混合。
[0134] 本發(fā)明IL-22或其二聚體可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物聯(lián)合 給藥。
[0135] 含有本發(fā)明的白介素 -22或其二聚體的微膠囊可用于本發(fā)明的白介素 -22的 緩釋給藥。重組蛋白的微囊緩釋給藥技術(shù)已成功應(yīng)用于重組人生長激素（rhGH)、重組人 干擾素（rhIFN)、白介素 -2 和 MNrgpl20(Johnson et al.，Nat.Med. ,2:795-799(1996); Yasuda, Biomed. Ther 27:1221-1223(1993) ；W0 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399； U. S. Pat. No. 5654010)。
[0136] 本發(fā)明的白介素 -22或其二聚體的緩釋制劑可用具有良好生物兼容性和寬泛生 物可降解性的乳酸羥基乙酸高聚物（PLGA)制備。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和羥基乙酸可被 人體很快清除。而且，該高聚物的降解能力可隨其分子量和組成的不同，從幾個(gè)月延長到 幾年(Lewis, "Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer, "in:M.Chasin and R. Langer(Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York, 1990),pp. l-41))〇
[0137] 本發(fā)明的藥物組合物的劑量和濃度范圍可因?qū)嶋H使用情況的不同而變化。本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何根據(jù)實(shí)際需求去選擇合適的劑量和給藥途徑。對于不同種系，例 如人和鼠之間藥物劑量范圍的調(diào)整原則，可參見Mordenti, J. and Chappell，W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Deve lopment, Yacobi et al. ；Pergamon Press, New York 1989,pp. 42-96。
[0138] 使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明IL-22或其二聚體適用于需要治療 的哺乳動(dòng)物（如人），其中施用時(shí)劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而 言，每次給藥劑量通常為0. 01?300mg，優(yōu)選0. 5?100mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥 途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0139] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0140] 1.白介素-22或其二聚體在動(dòng)物模型已證實(shí)可有效治療病毒性肝炎。
[0141] 2. IL-22二聚體能夠延長體內(nèi)半衰期，改善藥物的動(dòng)力學(xué)，減少注射頻率；能顯著 增強(qiáng)體內(nèi)生物活性。
[0142] 3.在相同IL-22摩爾濃度下，與IL-22單體相比，IL-22二聚體具有更強(qiáng)的體內(nèi) STAT3激活信號，從而提高了治療效果。
[0143] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0144] 實(shí)施例1
[0145] 用常規(guī)方法制備和純化，獲得結(jié)構(gòu)如圖1-圖3所示的IL-22二聚體（序列為SEQ ID NO: 1，或單體序列如SEQ ID NO:2-5所示）。
[0146] 實(shí)施例2IL-22二聚體體內(nèi)半衰期
[0147] 大鼠皮下單次注射IL-22二聚體（由序列如SEQ ID NO:2所示的二個(gè)IL-22單體 構(gòu)成的二聚體）l〇〇ug/kg，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下表所示（n = 6)。而單體IL-22在大鼠的半 衰期約1. 3小時(shí)。

【權(quán)利要求】
1. 一種人白介素-22二聚體，其特征在于，所述二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示的人白介 素-22的二聚體， M1-L-M2 式 I 式中， Ml是人白介素-22的第一單體； M2是人白介素-22的第二單體； L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起 的接頭元件， 其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素-22的生物活性，并且其血清半衰期是所 述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。
2. 如權(quán)利要求1所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的接頭元件L選自下 組： (i) 3-50個(gè)氨基酸的短肽； (ii) 式II所示的多肽元件： -Z-Y-Z-式 II 式中， Y為載體蛋白； Z為無、或1-30個(gè)氨基酸的短肽； 為化學(xué)鍵或共價(jià)鍵。
3. 如權(quán)利要求1所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的第一單體和第二單體 是相同的。
4. 如權(quán)利要求1所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的生物活性包括： (a) 降低肝臟炎癥和減少肝細(xì)胞壞死，對肝炎病毒引起的肝細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用； (b) 抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高。
5. 如權(quán)利要求2所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的載體蛋白是白蛋白或 人IgG的Fc片段。
6. 如權(quán)利要求2所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的載體蛋白是人IgG的 Fc片段；較佳地，所述的載體蛋白是人IgG2的Fc片段；較佳地，所述的載體蛋白包含SEQ ID NO:2中第163-385位所示氨基酸的人IgG2的Fc片段。
7. 如權(quán)利要求2所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述的載體蛋白是二個(gè)IgG 的Fc片段之間通過二硫鍵連接而形成；較佳地，所述的載體蛋白是二個(gè)人IgG2的Fc片段 之間通過二硫鍵連接而形成；更佳地，所述的載體蛋白包含SEQ ID N0:2中第163-385位所 示氨基酸的人IgG2的Fc片段。
8. 如權(quán)利要求7所述的人白介素-22二聚體，其特征在于，所述二硫鍵的數(shù)量為2-4 個(gè)。
9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物含有藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1-8 任意一項(xiàng)所述的人白介素-22二聚體。
10. -種如權(quán)利要求9所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備治療病毒性肝 炎的藥物。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型 肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。
【文檔編號】C07K19/00GK104479026SQ201410612763
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2010年8月31日
【發(fā)明者】嚴(yán)孝強(qiáng), 黃智華, 楊紅舟, 黃予良 申請人:健能隆醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司