Ace c-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種ACE C-結(jié)構(gòu)域抑制肽以及制備方法，以燕麥蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備，工藝流程為：原料液制備—酶膜反應(yīng)器制備、分離—蛋白水解產(chǎn)物收集—親和色譜篩選目標(biāo)肽。本發(fā)明制備的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽不僅能夠有效調(diào)節(jié)機體血壓，而且能夠克服傳統(tǒng)技術(shù)制備的結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽可能導(dǎo)致的干咳、水腫等副作用，在使用中更安全。同時，由于本發(fā)明采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行，不僅易于實現(xiàn)連續(xù)化操作、酶的可重復(fù)利用、有效提高反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，而且保證了目標(biāo)肽的高篩選效率和操作便捷性。
【專利說明】ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能性食品配料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ang1tensin1-converting enzyme, ACE, EC3.4.15.1)是心血管疾病治療中的重要靶標(biāo)之一。通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-ang1tensinsystem, RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system, KKS), ACE 對血壓、電解質(zhì)和體液平衡、心血管系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)重塑等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，ACE抑制劑(ACEI)現(xiàn)已成功地作為治療高血壓的一線藥物應(yīng)用于臨床。
[0003]ACE已被證實是一種肽鏈被高度糖基化的含鋅二肽羧酶，可將無活性的Ang I轉(zhuǎn)化為具有血管收縮活性的Ang II，同時還能催化具有舒張血管作用的舒緩激肽(bradykinin, BK)的降解，因此體內(nèi)ACE活性過高，易導(dǎo)致高血壓。ACE分子中存在著兩個同源程度較高的結(jié)構(gòu)域，即C-結(jié)構(gòu)域和N-結(jié)構(gòu)域，但它們在底物特異性、催化能力、氯離子激活以及發(fā)揮的生理功能方面存在著較大差別。
[0004]長期以來受限于對ACE的分子結(jié)構(gòu)與作用機理的認知水平，對ACE抑制活性的研究大多還未上升到分子結(jié)構(gòu)域選擇性水平，當(dāng)前所認識到的ACE抑制肽多為結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽。近年來的研究成果表明:選擇性抑制ACE C-結(jié)構(gòu)域活性不僅可有效調(diào)節(jié)機體血壓，而且可保留N-結(jié)構(gòu)域?qū)κ婢徏る牡乃饣钚?，從而避免舒緩激肽在組織中的過度累積而導(dǎo)致干咳、水腫等副作用，因此ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽比當(dāng)前普遍應(yīng)用的結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽更安全且無副作用。目前為止，國內(nèi)外尚未見食源性ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的研究報道。
[0005]目前對各種食源性活性肽的常規(guī)篩選方法為:間歇酶解一色譜分離一活性檢測一再分離一再活性檢測，直至得到純活性肽組分。間歇式酶解方式盡管操作簡便，反應(yīng)易于控制，但缺點是生產(chǎn)效率較低、酶使用成本高、不同批次產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等；另一方面，采用多種色譜聯(lián)用技術(shù)篩選酶解產(chǎn)物，不僅過程繁瑣耗時，難以實現(xiàn)快速、高通量篩選目的，而且肽回收率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是為解決上述問題進行的，基于ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽相對分子質(zhì)量較小，且與ACE C-結(jié)構(gòu)域活性位點存在較強非共價相互作用這一基本科學(xué)理論，以燕麥分離蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的高效制備與篩選。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了 ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽，用于抑制ACE中C-結(jié)構(gòu)域活性，其特征在于:ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的序列為Gly-Tyr以及Ile-Arg-Pro中的任意一種。
[0009]本發(fā)明提供了一種ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:以燕麥分離蛋白為原料，
[0010]步驟1，配制質(zhì)量濃度為5% -10%燕麥分離蛋白溶液，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0?8.5，置于酶膜反應(yīng)器的反應(yīng)罐中，溫度控制在40°C?50°C，按酶/底物(質(zhì)量比)為1.0%?3.0%在蛋白溶液中加入胰蛋白酶，開啟循環(huán)泵，開始酶膜反應(yīng)，收集膜透過液，得到燕麥蛋白水解產(chǎn)物；
[0011]步驟2，將步驟I中的燕麥蛋白水解產(chǎn)物干燥后溶解于碳酸氫銨溶液中，在親和色譜柱上進行親和吸附，至濾出物在214nm處出現(xiàn)最大吸收并趨于平穩(wěn)為止；
[0012]步驟3，對步驟2中的親和色譜柱進行洗脫，得到目標(biāo)肽溶液；
[0013]步驟4，對步驟3中的目標(biāo)肽溶液進行濃縮、分離純化、序列解析以及抑制活性驗證，得到ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽。
[0014]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:酶膜反應(yīng)器中的膜為超濾膜或納濾膜，超濾膜或納濾膜的截留分子量為6000Da?lOOOODa，過濾壓力為0.8?1.0Mpa0
[0015]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:酶膜反應(yīng)過程中，利用0.lmol/L的NaOH溶液進行滴定，控制酶解液pH為8.0?8.5。
[0016]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:酶膜反應(yīng)結(jié)束后，對得到的燕麥蛋白水解產(chǎn)物進行噴霧干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在170°C?190°C和90°C?110°C。
[0017]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:酶膜反應(yīng)的反應(yīng)時間為3-4小時。
[0018]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:親和色譜柱選用tACE Δ 36-gl3親和色譜柱
[0019]本發(fā)明提供的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征:采用RP-HPLC技術(shù)，對所述目標(biāo)肽溶液進行分離純化，獲得兩種肽組分。
[0020]發(fā)明作用與效果
[0021]本發(fā)明以燕麥分離蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備，工藝流程為:原料液制備一酶膜反應(yīng)器制備、分離一蛋白水解產(chǎn)物收集一親和色譜篩選目標(biāo)肽。
[0022]本發(fā)明制備的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽不僅能夠有效調(diào)節(jié)機體血壓，而且能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽可能導(dǎo)致干咳、水腫等副作用，在使用中更安全。
[0023]同時，由于本發(fā)明采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行，不僅易于實現(xiàn)連續(xù)化操作、酶的可重復(fù)利用、有效提高反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，而且保證了目標(biāo)肽的高篩選效率和操作便捷性。

【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]步驟I，配制質(zhì)量濃度為5%燕麥分離蛋白溶液1L，調(diào)節(jié)其pH值為8.0，置于酶膜反應(yīng)器中，控制其溫度為40°C，按酶/底物(w/w)為1%在反應(yīng)器中加入胰蛋白酶，攪拌均勻后，開啟循環(huán)泵開始酶膜反應(yīng)，選用超濾膜的截留分子量為lOOOODa，超濾壓力0.8MPa，反應(yīng)過程中利用0.lmol/L的NaOH溶液進行滴定，控制酶解液pH保持在8.0 ；
[0026]步驟2，保證酶膜反應(yīng)過程持續(xù)3小時，反應(yīng)過程中，利用液位控制器不斷往酶膜反應(yīng)器中補給燕麥分離蛋白溶液，保證循環(huán)液總體積恒定；
[0027]步驟3，反應(yīng)結(jié)束后將收集的超濾液進行噴霧干燥,噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在170°C和90°C，得到燕麥蛋白水解產(chǎn)物；
[0028]步驟4，將步驟3得到的燕麥蛋白水解產(chǎn)物溶解于pH8.3、含300mmol/L NaCl、濃度為100mmol/L的碳酸氫銨溶液中，制成100mg/mL的肽溶液；
[0029]步驟5，將步驟4中的肽溶液以4mL/min的速度流經(jīng)tACE Δ 36_gl3親和色譜柱(300mmX 25mm)，同時用紫外檢測器測試濾出物在214nm處的吸光值，當(dāng)濾出物在214nm處出現(xiàn)最大吸收并趨于平穩(wěn)時，表明ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽完成了飽和親和吸附過程，停止親和吸附操作；
[0030]步驟6，用含300mmol/L NaCl、pH8.3、濃度為100mmol/L的碳酸氫銨溶液對步驟5中的親和吸附柱進行洗脫，至濾出物在214nm處無吸收為止；
[0031]步驟7,用 captopril 溶液(溶解于 pH 為 8.3、含 300mmol/L NaCl 的 10Ommol /I,的碳酸氫銨溶液中)進行目標(biāo)肽的解吸附，至濾出物在214nm處無吸收為止；
[0032]步驟8，步驟7中解吸附下來的活性肽經(jīng)真空濃縮后，進一步采用RP-HPLC制備柱(C18H1-Pore RP-318, 250mmX 10mm B1-RAD)進行分離純化，獲得了兩種強活性ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽，采用MALD1-T0F-T0F MS技術(shù)進行活性肽序列解析，其結(jié)構(gòu)分別為GY(Gly-Tyr)和 IRP(Ile-Arg-Pro)。
[0033]采用雙熒光底物技術(shù)(McaSer與McaAla底物法)測定了 GY與IRP對sACE的結(jié)構(gòu)域選擇性抑制活性，結(jié)果顯示GY與IRP的Ki(N)/Ki(。)值分別為52.3和78.0，表明兩種肽均具有對C-結(jié)構(gòu)域有較強的選擇性抑制活性。
[0034]本實施例中，選用瓊脂糖凝膠作為固定化載體進行tACEA36_gl3的固定化，步驟為:將瓊脂糖與tACE Δ 36-gl3共混懸于0.2MpH10.0的碳酸氫鈉溶液中3h，之后滴加NaBH4繼續(xù)孵育2h完成固定化過程；之后采用hippuryl-histidyl-leucine底物法對固定化酶酶活進行檢測，結(jié)果表明固定化酶酶活仍保持在85 %左右。
[0035]實施例二
[0036]步驟I，配制質(zhì)量濃度為10%燕麥分離蛋白溶液1L，調(diào)節(jié)其pH值為8.5，置于酶膜反應(yīng)器中，控制其溫度為50°C，按酶/底物(w/w)為3%在反應(yīng)器中加入胰蛋白酶，攪拌均勻后，開啟循環(huán)泵開始酶膜反應(yīng)，選用納濾膜的截留分子量為6000Da，過濾壓力1.0MPa,反應(yīng)過程中利用0.lmol/L的NaOH溶液進行滴定，控制酶解液pH保持在8.5 ；
[0037]步驟2，保證酶膜反應(yīng)過程持續(xù)4小時，反應(yīng)過程中，利用液位控制器不斷往酶膜反應(yīng)器中補給燕麥分離蛋白溶液，保證循環(huán)液總體積恒定；
[0038]步驟3，反應(yīng)結(jié)束后將收集的膜透過液進行噴霧干燥,噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在190°C和110°C，得到燕麥蛋白水解產(chǎn)物；
[0039]步驟4，將步驟3得到的燕麥蛋白水解產(chǎn)物溶解于pH8.3、含300mmol/L NaCl、濃度為100mmol/L的碳酸氫銨溶液中，制成100mg/mL的肽溶液；
[0040]步驟5，將步驟4中的肽溶液以4mL/min的速度流經(jīng)tACE Δ 36_gl3親和色譜柱(300mmX 25mm)，同時用紫外檢測器測試濾出物在214nm處的吸光值，當(dāng)濾出物在214nm處出現(xiàn)最大吸收并趨于平穩(wěn)時，表明ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽完成了飽和親和吸附過程，停止親和吸附操作；
[0041]步驟6，用含300mmol/L NaCl、pH8.3、濃度為100mmol/L的碳酸氫銨溶液對步驟5中的親和吸附柱進行洗脫，至濾出物在214nm處無吸收為止；
[0042]步驟7,用 captopril 溶液(溶解于 pH 為 8.3、含 300mmol/L NaCl 的 10Ommol /I,的碳酸氫銨溶液中)進行目標(biāo)肽的解吸附，至濾出物在214nm處無吸收為止；
[0043]步驟8，步驟7中解吸附下來的活性肽經(jīng)真空濃縮后，進一步采用RP-HPLC制備柱(C18H1-Pore RP-318, 250mmX 10mm B1-RAD)進行分離純化，獲得了兩種強活性ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽，采用MALD1-T0F-T0F MS技術(shù)進行活性肽序列解析，其結(jié)構(gòu)分別為GY(Gly-Tyr)和 IRP(Ile-Arg-Pro)。
[0044]采用雙熒光底物技術(shù)(McaSer與McaAla底物法)測定了 GY與IRP對sACE的結(jié)構(gòu)域選擇性抑制活性，結(jié)果顯示GY與IRP的Ki(N)/Ki(。)值分別為52.3和78.0，表明兩種肽均具有對C-結(jié)構(gòu)域有較強的選擇性抑制活性。
[0045]本實施例中的親和色譜柱選用瓊脂糖凝膠作為固定化載體進行tACEA36_gl3的固定化，步驟為:將瓊脂糖與tACE Δ 36-gl3固定化酶共混懸于0.2M ρΗΙΟ.0的碳酸氫鈉溶液中3h，之后滴加NaBH4繼續(xù)孵育2h完成固定化過程；之后采用hippuryl-histidyl-leucine底物法對固定化酶酶活進行檢測，結(jié)果表明固定化酶酶活仍保持在85%左右。
[0046]實施例一和實施例二中，以燕麥蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用親和色譜進行ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備，還可以采用本制備方法以大麥蛋白、大豆蛋白等其他食源性蛋白材料為原料制備ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽。當(dāng)然選用不同的原料、不同的酶以及不同的酶解條件制備的抑制肽的序列會有所不同，但并不妨礙本制備方法的推廣應(yīng)用。
[0047]實施例作用與效果
[0048]實施例一和實施例二以燕麥蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用親和色譜技術(shù)進行ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備,本發(fā)明制備的ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽不僅能夠有效調(diào)節(jié)機體血壓，而且能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽可能導(dǎo)致干咳、水腫等副作用，在使用中更安全。
[0049]同時，由于本發(fā)明采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進行，不僅易于實現(xiàn)連續(xù)化操作、酶的可重復(fù)利用，省去滅酶步驟、有效提高反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，而且保證了目標(biāo)肽的高篩選效率和操作便捷性。
[0050]本發(fā)明不限于【具體實施方式】的范圍，對本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來講，只要各種變化在所述的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護之列。
【權(quán)利要求】
1.一種ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽，用于抑制ACE中C-結(jié)構(gòu)域活性，其特征在于: 所述ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的序列為Gly-Tyr以及Ile-Arg-Pro中的任意一種。
2.—種ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1，以燕麥分離蛋白為原料，配制質(zhì)量濃度為5% -10%燕麥分離蛋白溶液，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0?8.5，置于酶膜反應(yīng)器的反應(yīng)罐中，溫度控制在40°C?50°C，按酶/底物(質(zhì)量比)為1.0%?3.0%在蛋白溶液中加入蛋白酶,開啟循環(huán)栗，開始酶?吳反應(yīng)，收集膜透過液，得到燕麥蛋白水解產(chǎn)物； 步驟2，將步驟I中的所述燕麥蛋白水解產(chǎn)物干燥后，溶解于碳酸氫銨溶液中，在親和色譜柱上進行親和吸附，至濾出物在214nm處出現(xiàn)最大吸收并趨于平穩(wěn)為止； 步驟3，對步驟2中的所述親和色譜柱進行洗脫，得到目標(biāo)肽溶液； 步驟4，對步驟3中的所述目標(biāo)肽溶液進行濃縮、分離純化、序列解析以及抑制活性驗證，得到所述ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，所述酶膜反應(yīng)器中的膜為超濾膜以及納濾膜中的任意一種，所述濾膜的截留分子量為6000Da?lOOOODa，過濾壓力為0.8?1.0Mpa0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，所述酶膜反應(yīng)過程中，利用0.lmol/L的NaOH溶液進行滴定，控制酶解液pH為8.0 ?8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟: 所述酶膜反應(yīng)結(jié)束后，對得到的所述燕麥蛋白水解產(chǎn)物進行噴霧干燥，所述噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在170°C?190°C和90°C?110°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，所述酶膜反應(yīng)的反應(yīng)時間為3-4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，所述親和色譜柱選用tACEA36-gl3親和色譜柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACEC-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于: 其中，采用RP-HPLC技術(shù)，對所述目標(biāo)肽溶液進行分離純化，獲得兩種肽組分。
【文檔編號】C07K1/22GK104327157SQ201410612840
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】管驍, 劉靜, 程文宇 申請人:上海理工大學(xué), 上海海事大學(xué)