一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法，將低溫保存的含1-1型結(jié)合珠蛋白的人血漿離心上清依次進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀和聚乙二醇沉淀，以提取1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白供精細(xì)純化使用。本方法制備的提取液中1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白純度大于50％，低溫操作、方法溫和，非常適合作為從人血漿中大規(guī)模純化1-1型結(jié)合珠蛋白的粗提取方法。
【專利說明】 一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化工藝【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及蛋白質(zhì)分離純化工藝中一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)合珠蛋白(haptoglobin, Hp)又稱觸珠蛋白，是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物血液等體液的酸性糖蛋白，主要通過肝臟合成和降解，其含量受脂多糖、細(xì)胞因子、激素等調(diào)節(jié)，屬于急性期反應(yīng)蛋白。結(jié)合珠蛋白分子由a、β亞基組成，在多數(shù)哺乳動(dòng)物中以(ai3)2的構(gòu)型存在，而人結(jié)合珠蛋白存在1-1、2-1、2-2三種主要亞型，這主要是由a亞基的多樣性造成的。人結(jié)合珠蛋白a亞基由等位基因Hpl、Hp2編碼，Hpl編碼亞基(分子量約9.1kDa)，Hp2編碼a2亞基(分子量約16kDa)。人結(jié)合珠蛋白1_1型是由2個(gè)亞基、2個(gè)β亞基組成的呈啞鈴狀的四聚體分子[(%β)2];人結(jié)合珠蛋白2-1型是由ai亞基、a2亞基、β亞基組成的多聚體分子[(%β)2(&2β)η];人結(jié)合珠蛋白2-2型是由a2亞基、β亞基組成的多聚體分子[(a2i3)n]。結(jié)合珠蛋白與游離血紅蛋白緊密結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，引導(dǎo)血紅蛋白進(jìn)入降解代謝程序，阻止游離血紅蛋白損傷機(jī)體；另外越來越多的研究表明結(jié)合珠蛋白亞型與感染、糖尿病、腫瘤、心血管疾病等病理狀態(tài)存在相關(guān)性，有的亞型具有作為疾病治療蛋白質(zhì)藥物的潛力。
[0003]進(jìn)行結(jié)合珠蛋白相關(guān)研究，尤其是以人血漿結(jié)合珠蛋白為材料的藥物開發(fā)研究，需要大量高純度人血漿結(jié)合珠蛋白，然而人血漿結(jié)合珠蛋白的分離提取一直面臨效率低、成本高等問題，一直沒有能夠?qū)崿F(xiàn)高效率、低成本的大規(guī)模純化。最早的人血漿結(jié)合珠蛋白純化方法由Jayle、Boussier> Tonnelat等人于1956年建立,他們利用鹽析和制備電泳分離結(jié)合珠蛋白，由于制備電泳的產(chǎn)量非常低，此方法制備的結(jié)合珠蛋白僅適于研究使用。CBLaurell于1959年建立了包括硫酸銨沉淀、冷丙酮沉淀、冷乙醇沉淀等方法在內(nèi)的純化方法，該方法提高了產(chǎn)量，但丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑可能對(duì)結(jié)合珠蛋白得結(jié)構(gòu)造成破壞，殘留的丙酮、乙醇可能危害人體健康。GE Connell等、Hideo Hamaguchi分別于1961年、1969年建立了以陰離子交換層析為核心的純化方案，包括硫酸銨分級(jí)沉淀、分子排阻層析、多次陰離子交換層析等眾多步驟，效率低而耗時(shí)長(zhǎng):(I)分子排阻層析樣品處理量小、耗時(shí)長(zhǎng)，由于人結(jié)合珠蛋白分子量分布區(qū)間很寬，純化效果不佳且回收率低；(2)多達(dá)4-6次陰離子交換層析增加了人力和時(shí)間成本，且進(jìn)一步降低了回收率?？贵w親和層析技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了結(jié)合珠蛋白純化效率，通過不同亞型結(jié)合珠蛋白抗體親和填料可實(shí)現(xiàn)分型提取，但抗體親和層析填料制備復(fù)雜、成本高、使用壽命短，不適于作為大量純化提取方法。
[0004]充分利用粗提取工藝去除雜蛋白，再通過單次陰離子交換層析、疏水層析等效率高、成本低的工藝進(jìn)行精細(xì)純化，是大規(guī)模純化人血漿結(jié)合珠蛋白的理想方式。選擇粗提取工藝時(shí)，應(yīng)盡量選擇不損傷蛋白質(zhì)、對(duì)人體無毒性、對(duì)環(huán)境無污染的方法。鹽析是常用的蛋白質(zhì)粗提取方法，蛋白質(zhì)在鹽析過程中空間結(jié)構(gòu)、功能基團(tuán)不受破壞，發(fā)生可逆沉淀。硫酸銨沉淀是應(yīng)用最普遍的鹽析方法，但Jayle、CB Laurell>Hideo Hamaguchi等人的研究已經(jīng)證實(shí)僅僅通過硫酸銨沉淀無法充分去除雜蛋白，必須引入其他的蛋白質(zhì)粗提取工藝。
[0005]聚乙二醇是經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)表面修飾劑，其生物毒性很低，也有將其用于蛋白質(zhì)粗純化的報(bào)道。聚乙二醇沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)制尚不明確，沒有特定的規(guī)律可循，需要考慮的因素包括溫度、酸堿度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等，一般需經(jīng)精密設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)來確定目的蛋白質(zhì)能否通過聚乙二醇沉淀進(jìn)行粗提取。LijingSun等曾報(bào)道通過聚乙二醇10000從冷乙醇沉淀的人血漿組分IV中粗提取結(jié)合珠蛋白的方法，其主要過程包括:(I)將人血漿冷乙醇沉淀組分用生理鹽水溶解，離心取上清并調(diào)節(jié)酸度值至6.5 ； (2)邊攪拌邊緩慢加入聚乙二醇10000至質(zhì)量體積比(m/v) 10%，室溫靜置30min ； (3)高速離心，將沉淀以緩沖液重懸浮。該方法的不足之處在于，冷乙醇沉淀法可能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能基團(tuán)造成破壞，應(yīng)盡量避免采用，而上述聚乙二醇10000粗提取方法正是建立在冷乙醇沉淀的基礎(chǔ)上；另外該方法提取前，體系中雜蛋白種類已經(jīng)很少，不能用于從血漿中直接提取結(jié)合珠蛋白，因此應(yīng)用范圍受到很大限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法，該方法利用硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀依次對(duì)含有1-1型人結(jié)合珠蛋白的血漿進(jìn)行分級(jí)沉淀，可以滿足陰離子交換層析、疏水層析等大規(guī)模精細(xì)純化工藝要求，通過該方法制備的1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液，其結(jié)合珠蛋白含量顯著提高，符合大規(guī)模精細(xì)純化要求。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法，在(TC環(huán)境條件下按照以下步驟進(jìn)行:
[0008]I)將一份低溫冷藏的含有1-1型結(jié)合珠蛋白的人血漿充分冰浴，高速離心取上清液；
[0009]2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨至0°C時(shí)終飽和度35?40%，冰浴20?30min后高速離心，取上清液加入硫酸銨至0°C時(shí)終飽和度65%?70%，冰浴20?30min后高速離心，取沉淀；
[0010]3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入pH5.0?6.0緩沖鹽溶液使緩沖鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補(bǔ)足至與步驟I)中離心上清液相同的體積；
[0011]4)步驟3)所得溶液中加入以pH5.0?6.0緩沖鹽溶液溶解的分子量為3000?4500的聚乙二醇，使緩沖鹽溶液最終濃度為50?100毫摩爾，聚乙二醇的最終質(zhì)量體積比濃度為15?20%，冰浴20?30min后，高速離心取上清液，得到1_1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液。
[0012]步驟3)、4)所述的緩沖鹽溶液為磷酸鹽溶液或檸檬酸鹽溶液或醋酸鹽溶液。
[0013]人血漿中含有冷凝蛋白質(zhì)，低溫冷藏時(shí)冷凝蛋白質(zhì)將從血漿中沉淀析出。將冷藏的人血漿充分冰浴一段時(shí)間，可以使血漿中冷凝蛋白質(zhì)的析出更充分，并在0°c高速離心過程中沉淀到離心管底部而去除。去除的冷凝蛋白質(zhì)可作為結(jié)合珠蛋白純化的副產(chǎn)物，產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0014]人結(jié)合珠蛋白是酸性蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)約為4.8-5.3，本發(fā)明在選擇的pH5.0-6.0之間的緩沖體系，更容易使人結(jié)合珠蛋白在等電點(diǎn)附近析出。另外，同一硫酸銨溶液的飽和度隨著溫度的降低而升高，本發(fā)明采用0°c的沉淀溫度，可以減少硫酸銨的用量，提高了經(jīng)濟(jì)效益。
[0015]聚乙二醇沉淀工藝中的影響因素包括蛋白質(zhì)性質(zhì)、溫度、酸堿度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等。 申請(qǐng)人:對(duì)上述影響因素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)1-1型結(jié)合珠蛋白純化時(shí)，聚乙二醇分子量介于3000-4500之間最合適-分子量小的聚乙二醇需要增加用量，分子量大的聚乙二醇粘度大，離心時(shí)沉淀的蛋白質(zhì)不易沉降到離心管底部。溫度下降時(shí)，1-1型結(jié)合珠蛋白的溶解度降低， 申請(qǐng)人:選擇0°C的沉淀溫度，減少了聚乙二醇的使用量，提高了經(jīng)濟(jì)效益；本發(fā)明將體系的PH控制在5-6之間，與1-1型結(jié)合珠蛋白的等電點(diǎn)接近，此時(shí)更容易發(fā)生沉淀，從而減少聚乙二醇的使用量，進(jìn)一步提高經(jīng)濟(jì)效益。通過硫酸銨沉淀得到的1-1型人結(jié)合珠蛋白粗提液中還含有以白蛋白、免疫球蛋白等為主的大量雜蛋白，再以聚乙二醇沉淀工藝進(jìn)行一次提取，去除了大部分雜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定1-1型結(jié)合珠蛋白純度大于50%，已經(jīng)滿足陰離子交換層析、疏水層析純化等大規(guī)模純化工藝的要求。
[0016]本發(fā)明所述的制備方法具備以下優(yōu)勢(shì):(I)所有操作在低溫下進(jìn)行，減少結(jié)合珠蛋白降解、微生物繁殖的發(fā)生率；(2)利用硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀依次對(duì)含有1-1型人結(jié)合珠蛋白的血漿進(jìn)行分級(jí)沉淀，提取方法溫和，最大限度的保護(hù)1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白的結(jié)構(gòu)與功能；(3)體系中未引入可能具有毒性的物質(zhì)。
[0017]本方法適用于從新鮮采集或過期人血漿中直接提取1-1型結(jié)合珠蛋白，所制備的人血漿結(jié)合珠蛋白提取液中1-1型結(jié)合珠蛋白含量得到顯著提高，可以滿足陰離子交換層析、疏水層析等大規(guī)模精細(xì)純化工藝要求，非常適合作為從人血漿中大規(guī)模純化結(jié)合珠蛋白的粗提取方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1和圖2分別是含1-1型結(jié)合珠蛋白的人血漿按照本發(fā)明方法制備的硫酸銨分級(jí)沉淀提取液的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖和免疫印跡圖；圖中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1為sigma公司各型結(jié)合珠蛋白混合物標(biāo)準(zhǔn)品；2為1-1型人血漿冰浴離心上清液；3為人血漿冰浴離心沉淀；4為硫酸銨終飽和度40% (0°C )時(shí)離心沉淀；5為硫酸銨終飽和度65%(0°C )時(shí)離心沉淀；6為硫酸銨終飽和度65% (0°C )時(shí)離心上清。
[0019]圖3和圖4分別為對(duì)1-1型結(jié)合珠蛋白硫酸銨提取液進(jìn)行聚乙二醇分級(jí)沉淀所得組分的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖和免疫印跡圖；圖中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1為sigma公司各型結(jié)合珠蛋白混合物標(biāo)準(zhǔn)品；2為1-1型結(jié)合珠蛋白血漿的硫酸銨終飽和度65%(0°C )時(shí)的離心沉淀；3為加入聚乙二醇4500至最終質(zhì)量體積比濃度為15%后的離心沉淀；4為加入聚乙二醇4500至最終質(zhì)量體積比濃度為15%后的離心上清。

【具體實(shí)施方式】
[0020]人血漿來自血站過期人血漿，采用SDS-PAGE電泳或PCR分型法進(jìn)行分型，其它試劑均采用市售的分析純產(chǎn)品。
[0021]在0°C環(huán)境條件下制備1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液:
[0022]I)將經(jīng)鑒定含有1-1型結(jié)合珠蛋白的人血漿50毫升充分冰浴，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘除去冷凝蛋白質(zhì)，得到上清液49毫升；
[0023]2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨粉末11.074克，使0°C時(shí)硫酸銨終飽和度達(dá)到40%，冰浴20?30min后8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，得到上清液46毫升，加入硫酸銨粉末7.038克，使(TC時(shí)硫酸銨終飽和度達(dá)到65 %，冰浴20?30min后8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取沉淀；
[0024]參見圖1和圖2，當(dāng)1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白位于硫酸銨終飽和度65% (0°C )時(shí)離心沉淀中，經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀提取，去除了大量雜蛋白，為后續(xù)的聚乙二醇分級(jí)沉淀奠定了基礎(chǔ)。
[0025]3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入0.4M醋酸鈉-醋酸pH5.0緩沖溶液6.25毫升，使醋酸鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補(bǔ)足溶液體積至50ml，得到溶解液；
[0026]4)將聚乙二醇4500加入0.4M醋酸鈉-醋酸pH5.0溶液中，配成質(zhì)量體積比為50%的溶液。取21.43毫升50%聚乙二醇溶液加入步驟3)所得溶解液中，使聚乙二醇的最終質(zhì)量體積比濃度為15%，冰浴20?30min后，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘取上清液，得到1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液。
[0027]參見圖3和圖4，通過聚乙二醇4500對(duì)1_1型結(jié)合珠蛋白人血漿硫酸銨沉淀提取物進(jìn)行再次提純得到的提取液，進(jìn)一步去除了雜蛋白，使通過陰離子交換層析、疏水層析等精細(xì)工藝進(jìn)行1-1型結(jié)合珠蛋白的低成本、高效率大量純化成為現(xiàn)實(shí)。
[0028]所得1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)其提取液中含1_1型人血衆(zhòng)結(jié)合珠蛋白大于50%。參見圖3。
【權(quán)利要求】
1.一種1-1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液的制備方法，其特征在于，在(TC環(huán)境條件下按照以下步驟進(jìn)行: 1)取低溫冷藏的含有1-1型結(jié)合珠蛋白的人血漿充分冰浴，高速離心取上清液； 2)步驟I)所得上清液中加入硫酸銨至(TC時(shí)終飽和度35?40%，冰浴20?30min后高速離心，取上清液加入硫酸銨至0°C時(shí)終飽和度65%?70%，冰浴20?30min后高速離心，取沉淀； 3)步驟2)所得沉淀用雙蒸水溶解，加入pH5.0?6.0緩沖鹽溶液使緩沖鹽溶液的最終濃度為50?100毫摩爾，用雙蒸水補(bǔ)足至與步驟I)中離心上清液相同的體積； 4)步驟3)所得溶液中加入以pH5.0?6.0緩沖鹽溶液溶解的分子量為3000?4500的聚乙二醇，使緩沖鹽溶液最終濃度為50?100毫摩爾，聚乙二醇的最終質(zhì)量體積比濃度為15?20%，冰浴20?30min后，高速離心取上清液，得到1_1型人血漿結(jié)合珠蛋白提取液。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)、4)所述的緩沖鹽溶液為磷酸鹽溶液或檸檬酸鹽溶液或醋酸鹽溶液。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK104327178SQ201410613876
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】劉良明, 臧家濤, 李濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所