一種海參抗氧化多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種海參抗氧化多肽及其制備方法，該方法以海參肉或海參內(nèi)臟蛋白為原料，通過(guò)對(duì)酸性蛋白酶的酶解，分離純化得到特異性海參抗氧化多肽，其氨基酸全序列為：malsvl。本發(fā)明制得的海參抗氧化多肽彌補(bǔ)了天然抗氧化劑所具有的缺陷，并且消除了公眾對(duì)人工合成抗氧化劑的憂慮，為開發(fā)基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種海參抗氧化多肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供了一種海參抗氧化多肽及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物分子的氧化是一個(gè)自由基介導(dǎo)的過(guò)程，它會(huì)對(duì)食品和生物系統(tǒng)造成許多不利 的影響。在好氧器官內(nèi)，與動(dòng)脈硬化、癌癥等多種疾病相關(guān)的游離自由基會(huì)不可避免地隨著 氧代謝的過(guò)程而產(chǎn)生。在食品中，營(yíng)養(yǎng)成分的氧化會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物，其不僅會(huì)影響食品的營(yíng) 養(yǎng)價(jià)值，造成食品品質(zhì)下降，嚴(yán)重的甚至還會(huì)導(dǎo)致攝入者的身體發(fā)生疾病。因此，尋找安全 的抗氧化劑以抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生一直是生化營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于BHT、TBHQ等化學(xué)合 成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價(jià)格，因此其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食 品行業(yè)中。但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑對(duì)人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作 用，從而引起了人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂，并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把 目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。α -生育酚是一種被普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品 中油脂的穩(wěn)定性，但是卻不利于食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來(lái)源的安全的天 然抗氧化劑。
[0003] 多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，使蛋白質(zhì)具有一定的生 理功能。在人類的生命活動(dòng)中，肽在體內(nèi)的消化吸收優(yōu)于游離的氨基酸，且有著區(qū)別于氨基 酸的體內(nèi)輸送體系。某些短肽在提供人體生長(zhǎng)、發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還能夠防病 治病，調(diào)節(jié)人體機(jī)能，這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，很多不同來(lái) 源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子 蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
[0004] 國(guó)內(nèi)海參加工目前大多停留在初級(jí)加工階段，由于資源利用率低，加工過(guò)程產(chǎn)生 的下腳料浪費(fèi)等原因造成資源浪費(fèi)，甚至是環(huán)境污染。海參肉或海參內(nèi)臟中含有大量蛋 白質(zhì)，且其組成均衡，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)其中的蛋白質(zhì)資源進(jìn)行深加工，合理的選用酶類 等，通過(guò)工藝優(yōu)化將使得抗氧化活性肽的研究具有更廣闊的前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)天然抗氧化劑的不足、以及人工合成抗氧化劑的安全性堪 憂，提供一種海參抗氧化多肽及其制備方法。本發(fā)明制得的海參抗氧化多肽抗氧化活性高， 彌補(bǔ)了天然抗氧化劑的缺陷，消除了人們對(duì)人工合成抗氧化劑安全性的擔(dān)憂。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種海參抗氧化多肽，所述海參抗氧化多肽的氨基酸序列為：malsvl。
[0007] -種制備如上所述的海參抗氧化多肽的方法：以海參肉或海參內(nèi)臟為原料提取蛋 白，然后對(duì)其進(jìn)行酶解；酶解產(chǎn)物經(jīng)濃縮除雜、分離純化、冷凍干燥得到海參抗氧化多肽。
[0008] 所述酶解條件為：pH為3. 5、溫度50°C、酶解時(shí)間為6 h、酶-底物配比為3000U/ g ;所述酶為酸性蛋白酶。
[0009] 所述分離純化的方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50 分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
[0010] 所述分離純化的具體步驟為： (1) 首先利用膜過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離，得到不同分子量的多肽組分； (2) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S印hadex C-25陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行 分離，上樣后洗去未吸附組分，再以乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為〇. 5ml/ min，在215nm下進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用S印hadex G-50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液 為去離子水，流速為0. 5ml/min，在215nm下進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗 氧化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步的 分離，然后采用乙腈和水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為42 %乙腈和58 %水處的 洗脫峰，得到海參抗氧化多肽； (5) 利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
[0011] 步驟（1)所述的多肽組分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的組 分。
[0012] 步驟（2)中所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液濃度為0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/ L NaCl。
[0013] 步驟（4)中分離時(shí)所用色譜柱為Gemini 5μ C18,上樣量為IOOyL,流速為Iml/ min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。
[0014] 步驟（4)中梯度洗脫為：洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至 體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束。
[0015] 本發(fā)明立足于尋找一種天然高效的抗氧化劑，以海參蛋白為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)酸性蛋 白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗氧化 活性得以高效實(shí)現(xiàn)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于： 本發(fā)明改變了現(xiàn)有抗氧化劑的提取與運(yùn)用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化劑 所可能引起的副作用，所分離得到的海參抗氧化多肽可以取代傳統(tǒng)的合成抗氧化劑；并且 本發(fā)明還改善了我國(guó)對(duì)海參蛋白利用率偏低的情況，既可解決大量海參資源的高效利用問(wèn) 題，又能解除消費(fèi)者對(duì)抗氧化劑在食品安全方面的顧慮，對(duì)科技、經(jīng)濟(jì)和食品工業(yè)的發(fā)展具 有深遠(yuǎn)意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為海參抗氧化多肽的RP-HPLC圖譜，B峰為海參抗氧化多肽的色譜峰； 圖2為純化的海參抗氧化多肽清除DPPH自由基的"量-效"關(guān)系曲線。
[0018] 圖3為純化的海參抗氧化多肽清除ABTS自由基的"量-效"關(guān)系曲線。
[0019] 圖4為純化的海參抗氧化多肽抑制Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白多不飽和脂肪酸過(guò)氧化反 應(yīng)的"量-效"關(guān)系曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 海參抗氧化多肽的制備方法如下： (1) 海參蛋白的提取 海參蛋白質(zhì)提取工藝條件為： 將海參或海參內(nèi)臟清洗3-5次，浸提pH為7.0,提取溫度為40-80 °C，料液比為 1:4-1:8 (重量比)，提取時(shí)間為2-6 h，離心IOOOOg 20分鐘，收集上清液，經(jīng)過(guò)濾、濃縮和冷 凍干燥后得到海參蛋白。 (2) 海參蛋白的酶解 酶購(gòu)自上海生物試劑公司（中國(guó)?上海)。
[0021] 采用酸性蛋白酶酶解海參蛋白，蛋白濃度為30mg/ml，酶解條件取pH為3. 5、溫度 50°C、酶解時(shí)間為6h、酶與底物比為（3000U/g)，用2M HCl調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定，水解6h后，沸水浴 中滅酶15min，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機(jī)中，以4000r/min離心15min，取上清液備 用。
[0022] (3 )酶解產(chǎn)物的濃縮、除雜 利用納濾系統(tǒng)對(duì)蛋白酶解液進(jìn)行濃縮后，加入4倍體積乙醇沉降大分子蛋白質(zhì)， 12000r/min離心20min得上清液即為海參多肽溶液。
[0023] (4)酶解產(chǎn)物的分離 利用膜過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)海參多肽溶液進(jìn)行超濾分離，利用分子量截留范圍不同的超濾膜對(duì) 酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到不同分子量的多肽，包括彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da等 組分。
[0024] (5)酶解產(chǎn)物的純化 將得到的酶解產(chǎn)物分為3個(gè)分子量范圍不同的組分，分別為分子量大于3000Da的組 分、分子量介于1500Da和3000Da的組分、分子量小于1500Da的組分；收集具有最佳抗氧 化活性的組分，再經(jīng)過(guò)SP-Sephadex C-25陽(yáng)離子交換色譜(長(zhǎng)20cm，直徑I. 6cm)進(jìn)行分 離，以含〇?〇· 35mol/L NaCl的0· 02mol/L、ρΗ4· 5乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗 脫，流速為0. 5ml/min ;收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用Sephadex G-50 (長(zhǎng)100cm， 直徑2. 6cm)凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在215nm下 進(jìn)行測(cè)量；收集具有最佳抗氧化活性的組分，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行再進(jìn)一 步的分離，所用色譜柱為Gemini 5 μ C18,上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水（v/v)的 混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集42 %乙腈和58 %水（v/v)處的洗脫峰，得到本發(fā)明的高 純度的海參抗氧化多肽。
[0025] (6)抗氧化多肽的氨基酸序列測(cè)定 利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co-MA, U.S.A) 測(cè)定本發(fā)明的抗氧化多肽的氨基酸全序列為 malsvl。
[0026] ( 7 )抗氧化活性的測(cè)試 i DPPH自由基清除能力的測(cè)定 利用DPPH (l，l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測(cè)定法研究抗氧化多 肽。配制濃度為I X l(T5m〇l/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2mL，0. ImM的DPPH無(wú)水 乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517 nm處測(cè)定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。

【權(quán)利要求】
1. 一種海參抗氧化多肽，其特征在于：所述海參抗氧化多肽的氨基酸序列為： malsvl〇
2. -種制備如權(quán)利要求1所述的海參抗氧化多肽的方法，其特征在于：以海參肉或海 參內(nèi)臟為原料提取蛋白，然后對(duì)其進(jìn)行酶解；酶解產(chǎn)物經(jīng)濃縮除雜、分離純化、冷凍干燥得 到海參抗氧化多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述酶解條件為： pH為3. 5、溫度50°C、酶解時(shí)間為6 h、酶-底物配比為3000U/g ;所述酶為酸性蛋白酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的 方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高 效液相色譜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的 具體步驟為： (1) 首先利用膜過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離，得到不同分子量的多肽組分； (2) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S印hadex C-25陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行 分離，上樣后洗去未吸附組分，再以乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為〇. 5ml/ min，在215nm下進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用S印hadex G-50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液 為去離子水，流速為0. 5ml/min，在215nm下進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗 氧化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步的 分離，然后采用乙腈和水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為42 %乙腈和58 %水處的 洗脫峰，得到海參抗氧化多肽； (5) 利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述的 多肽組分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的組分。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述的 乙酸-乙酸鈉緩沖液濃度為0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/L NaCl。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（4)中分離時(shí) 所用色譜柱為Gemini 5 ii C18,上樣量為100 ii L，流速為lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（4)中梯度 洗脫為：洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10% 水的混合液結(jié)束。
【文檔編號(hào)】C07K1/20GK104402972SQ201410621636
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】汪少蕓, 李靈, 邵彪, 趙立娜, 方衛(wèi)東 申請(qǐng)人:福州大學(xué)