一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法，以核桃青皮為原料，經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理后，采用多級萃取和HSCCC對生物堿進行分離和制備，其中，用甲醇：水比例為4∶1的混合液作提取劑，液料比為10∶1，經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理15min后，采用多級萃取后獲得氯仿甲醇水生物堿提取液；用氯仿甲醇。HSCCC法不需要固相載體，可消除由于樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，具有回收率高；可多次進樣，其分離過程都保持很穩(wěn)定，重現(xiàn)性好；可實現(xiàn)梯度洗脫和反相洗脫，亦能進行重復(fù)進樣，分離效率高，分離量較大。
【專利說明】一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物堿分離制備領(lǐng)域，尤其涉及一種從核桃青皮中分離制備生物堿的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 核桃（Juglans regia L)青皮又稱青龍衣，為核桃外部一層厚厚的未成熟的綠色 果皮。其中含有生物堿、萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、多糖類、小分子萜類等。生物堿為 一類重要的來源于生物界（以植物為主）的含氮的有機物，主要存在于植物體內(nèi)各個器官 和組織中。同科同屬植物可能含有相同結(jié)構(gòu)類型的生物堿，在植物的某種器官含量可能較 高，相對核桃其它組織。在核桃各組織中，新鮮的青皮中生物堿明顯高于其它組織。
[0003] 植物體中生物堿含量甚微，但種類眾多，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異很大。生物堿通常采取的 提取分離方法一般是根據(jù)其的溶解度來確定。除季銨堿和一些分子量較低或含極性基團較 多的生物堿外，生物堿一般均不溶或難溶于水，但大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有機溶劑。 基于這種特性，通常采用非極性溶劑、極性溶劑和混合溶劑進行提取。常見的生物堿的提取 方法有冷浸、滲漉、超聲波、索氏提取、熱回流提取等，但存在提取率低、分離不完全和純度 較低的問題。
[0004] 鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過研宄和實踐終于獲得了本創(chuàng)作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法，用以克服上述 技術(shù)缺陷。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法，以核桃 青皮為原料，經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理后，采用多級萃取和HSCCC對生物堿進行分離 和制備，其中，用甲醇：水比例為4 : 1的混合液作提取劑，液料比為10 : 1，經(jīng)超聲波微波 萃取儀輔助處理15min后，采用多級萃取后獲得氯仿甲醇水生物堿提取液；用氯仿甲醇。
[0007] 進一步地，該具體過程為：
[0008] 步驟a，以胡桃青皮為原料，加入10倍體積的甲醇：水為4 : 1的混合液，在超 聲波微波輔助萃取儀分三階段進行處理，超聲波頻率為50KHz，模式15 : 10,電機轉(zhuǎn)速 900r · mirf1;
[0009] 離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至原體積的1/10,用2mol · T1H2SO4酸化至PH為 2?3,氯仿萃取3次，將上層酸水溶液層用氨水堿化至PH為10左右，用氯仿：甲醇比例為 3 : 1的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液；
[0010] 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，留取少許用坩堝蒸干，計算提取率后用甲醇溶解；
[0011] 步驟b，薄層層析分離生物堿；稱取羧甲基纖維素鈉加適量的純水溶解，加薄層層 析硅膠，混勻后再加微晶纖維素，超聲波清洗除氣泡，圖板制片，備用；
[0012] 用氯仿：甲醇比例為16 : 1的混合液作展開劑；
[0013] 步驟c，HSCCC分離制備生物堿，以甲醇作對照，對核桃青皮生物堿樣品和6種標準 生物堿；在190-400nm處用紫外可見光度計進行檢測，觀察吸收峰值，并導(dǎo)出波峰數(shù)據(jù)；
[0014] 石油醚：氯仿：甲醇：2mol · T1H2SO4K例為2 : 4 : 2 : 2V/V為溶劑體系，按 比例將4種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，室溫下靜置過夜，使用前分得上相 和下相，超聲脫氣30min以備用；
[0015] 將已超聲脫氣后的下相以ZOmLmirT1的速度泵入HSCCC分離管中，待下相充滿整 個管路，設(shè)定分離管順時針旋轉(zhuǎn)，緩慢調(diào)節(jié)主機轉(zhuǎn)數(shù)至800r · mirT1，同時以2mL · rnirT1流速 注入上相，兩相達平衡后由進樣閥進入樣品溶液，同時采集相應(yīng)的數(shù)據(jù)，通過紫外檢測檢測 流出物，按照色譜峰收集相應(yīng)的成份。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于：HSCCC技術(shù)采用了不同物化特性的溶 劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應(yīng)性，可為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不 同特性（如不同極性）的有效成分提供了有利條件。
[0017] HSCCC法不需要固相載體，可消除由于樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造 成的損失，具有回收率高；可多次進樣，其分離過程都保持很穩(wěn)定，重現(xiàn)性好；可實現(xiàn)梯度 洗脫和反相洗脫，亦能進行重復(fù)進樣，分離效率高，分離量較大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的分離與制備方法的流程示意圖；
[0019] 圖2a為本發(fā)明的苦參堿紫外光譜掃描圖；
[0020]圖2b為本發(fā)明的丁溴酸東莨堿紫外光譜掃描圖；
[0021] 圖2c為本發(fā)明的烏頭堿紫外光譜掃描圖；
[0022] 圖2d為本發(fā)明的小檗堿紫外光譜掃描圖；
[0023] 圖2e為本發(fā)明的兒茶素紫外光譜掃描圖；
[0024] 圖2f為本發(fā)明的沒食子酸紫外光譜掃描圖；
[0025] 圖3為本發(fā)明的生物堿提取液紫外光譜掃描圖；
[0026] 圖4為本發(fā)明的生物堿樣品的分離結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0027] 以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點作更詳細的說明。
[0028] 本發(fā)明以核桃青皮為原料，經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理后，采用多級萃取和 HSCCC對生物堿進行分離和制備。結(jié)果顯示：用甲醇水（4 : 1)作提取劑，液料比為10 : 1， 經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理15min后，采用多級萃取后獲得氯仿甲醇水生物堿提取液； 用氯仿甲醇（16 : 1)作展開劑，經(jīng)TLC獲得了較為清晰的多個單體圖像；HSCCC(溶劑體系： 正己烷、氯仿、甲醇、2mol.L-lH2S04,體積比為2 : 4 : 2 : 2)在313nm處對各單體進行 了收集。結(jié)論：結(jié)合紫外光譜特征，將采集到的各單體與多種生物堿標準品進行TLC圖像比 對，初步確認其中4個單體分別為沒食子酸、小檗堿、苦參堿和兒茶素。
[0029] 請參閱圖1所示，本發(fā)明的從核桃青皮中分離制備生物堿的方法的過程為：
[0030] 步驟a，以胡桃青皮為原料，加入10倍體積的甲醇：水為4 : 1的混合液，在超 聲波微波輔助萃取儀分三階段進行處理，超聲波頻率為50KHz，模式15 : 10,電機轉(zhuǎn)速 900r · mirf1。
[0031] 離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至原體積的1/10,用2mol · T1H2SO4酸化至PH為 2?3,氯仿萃取3次，將上層酸水溶液層用氨水堿化至PH為10左右，用氯仿：甲醇比例為 3 : 1的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液。
[0032] 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，留取少許用坩堝蒸干，計算提取率后用甲醇溶解。
[0033] 步驟b，薄層層析分離生物堿；稱取羧甲基纖維素鈉加適量的純水溶解，加薄層層 析硅膠，混勻后再加微晶纖維素，超聲波清洗除氣泡，圖板制片，備用。
[0034] 用氯仿：甲醇比例為16 : 1的混合液作展開劑。
[0035] 步驟c，HSCCC分離制備生物堿，以甲醇作對照，對核桃青皮生物堿樣品和6種標準 生物堿（苦參堿、丁溴酸東莨堿、烏頭堿、小檗堿、兒茶素、沒食子酸）在190_400nm處用紫 外可見光度計進行檢測，觀察吸收峰值，并導(dǎo)出波峰數(shù)據(jù)。
[0036] 石油醚：氯仿：甲醇：2mol ^r1H2SO4Q : 4 : 2 : 2V/V)為溶劑體系，按比例將 4種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，室溫下靜置過夜，使用前分得上相（固定 相）和下相（流動相），超聲脫氣30min以備用。
[0037] 將已超聲脫氣后的下相（流動相）以20mL · HiirT1的速度泵入HSCCC分離管中， 待下相充滿整個管路，設(shè)定分離管順時針旋轉(zhuǎn)，緩慢調(diào)節(jié)主機轉(zhuǎn)數(shù)至800r · mirT1，同時以 2mL · HiirT1流速注入上相，兩相達平衡后由進樣閥進入樣品溶液（小于20mL，不含固體顆 粒），同時采集相應(yīng)的數(shù)據(jù)，通過紫外檢測（254nm)檢測流出物，按照色譜峰收集相應(yīng)的成 份。
[0038] 下面通過實施例進行說明。
[0039] 步驟a，生物堿的粗提取與鑒定；
[0040] 稱取20g核桃皮粉3份，加入10倍體積的甲醇：水混合液（4 : 1)，在超聲波微波 輔助萃取儀分三階段進行處理，每階段5min，共15min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度 為45°0、50°0、55°0，超聲波功率為800、850、9001，微波功率為150、200、2501，超聲波頻率 為50KHz，模式15 : 10,電機轉(zhuǎn)速900r min'離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至原體積的 1/10。用2mol · T1H2SO4酸化至PH為2?3,氯仿萃取3次，將上層酸水溶液層用氨水堿化 至PH為10左右，用氯仿：甲醇（3 : 1)萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提 取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，留取少許用坩堝蒸干，計算提取率后用甲醇溶解。
[0041] 步驟b，薄層層析分離生物堿；
[0042] 稱取羧甲基纖維素鈉 60g加適量的純水溶解，加薄層層析硅膠20g，混勻后再加微 晶纖維素 2. 5g，超聲波清洗除氣泡，圖板制片，備用。
[0043] 分別配制不同比例的不同的展開劑，氯仿：甲醇（15 : I ;15. 5 : I ;16 : 1 :; 16. 5 : 1);氯仿：乙醇（15 : 1 ;15· 5 : I ;16 : 1 : ;16· 5 : 1);環(huán)己烷：乙酸乙酯：正 丙醇：二甲基胺（30 : 25 : 0.9 : 0. 1)，經(jīng)薄層層析展開，紫外分析，確定最佳展開劑。并 將自制硅膠板與標準硅膠板及不同展開劑所得結(jié)果進行對比，確定所用硅膠板。
[0044] 在波長254nm下對薄層板進行拍照分析，對比后保存最佳展開薄層板。
[0045] 步驟c，HSCCC分離制備生物堿；
[0046] 以甲醇作對照，對核桃青皮生物堿樣品和6種標準生物堿（苦參堿、丁溴酸東莨 堿、烏頭堿、小檗堿、兒茶素、沒食子酸）在190-400nm處用紫外可見光度計進行檢測，觀察 吸收峰值，并導(dǎo)出波峰數(shù)據(jù)。
[0047] 選石油醚：氯仿：甲醇：2mol ^r1H2SO4Q : 4 : 2 : 2V/V)為溶劑體系，按比例 將4種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，室溫下靜置過夜，使用前分得上相（固 定相）和下相（流動相），超聲脫氣30min以備用。將已超聲脫氣后的下相（流動相）以 20mL · HiirT1的速度泵入HSCCC分離管中，待下相充滿整個管路，設(shè)定分離管順時針旋轉(zhuǎn)，緩 慢調(diào)節(jié)主機轉(zhuǎn)數(shù)至800r · mirT1，同時以2mL · HiirT1流速注入上相，兩相達平衡后由進樣閥 進入樣品溶液（小于20mL，不含固體顆粒），同時采集相應(yīng)的數(shù)據(jù)，通過紫外檢測（254nm) 檢測流出物，按照色譜峰收集相應(yīng)的成份。
[0048] 結(jié)果分析：
[0049] 1、中強生物堿晶體的鑒定；生物堿的沉淀反應(yīng)是利用大多數(shù)生物堿在酸性條件 下，與某些沉淀劑反應(yīng)生成弱酸不溶性復(fù)鹽或絡(luò)合物沉淀。生物堿沉淀反應(yīng)一般在稀酸水 溶液中進行。這是由于生物堿與酸成鹽易溶于水，生物堿沉淀試劑也易溶于水，且在酸水中 較穩(wěn)定，而反應(yīng)產(chǎn)物難溶于水，因而有利于反應(yīng)的進行結(jié)果的觀察。
[0050] 在生物堿的預(yù)試、提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定中常用的是生物堿的沉淀反應(yīng)和顯色反 應(yīng)。
[0051] 取含中強生物堿的粗提樣品少許，酸化處理后加碘化鉍鉀試劑觀察，有棕黃色沉 淀出現(xiàn)，表明為生物堿。
[0052] 2、生物堿的薄層層析；
[0053] 生物堿標準品的紫外光譜掃描結(jié)果，請參閱圖2a_2f所示，其為六種生物堿標準 品的紫外光譜掃描圖，表1為六種生物堿的吸收波峰。
[0054] 表1六種生物堿的吸收波峰
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種從核桃青皮中分離制備生物堿的方法，其特征在于，以核桃青皮為原料，經(jīng)超 聲波微波萃取儀輔助處理后，采用多級萃取和HSCCC對生物堿進行分離和制備，其中，用甲 醇：水比例為4 : 1的混合液作提取劑，液料比為10 : 1，經(jīng)超聲波微波萃取儀輔助處理 15min后，采用多級萃取后獲得氯仿甲醇水生物堿提取液；用氯仿甲醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從核桃青皮中分離制備生物堿的方法，其特征在于，該具體 過程為： 步驟a，以胡桃青皮為原料，加入10倍體積的甲醇：水為4 : 1的混合液，在超聲波微波 輔助萃取儀分三階段進行處理，超聲波頻率為50KHz，模式15 : 10,電機轉(zhuǎn)速900r ? mirT1; 離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至原體積的1/10,用2mol ? 17屯2304酸化至PH為2? 3,氯仿萃取3次，將上層酸水溶液層用氨水堿化至PH為10左右，用氯仿：甲醇比例為3 : 1 的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，留取少許用坩堝蒸干，計算提取率后用甲醇溶解； 步驟b，薄層層析分離生物堿；稱取羧甲基纖維素鈉加適量的純水溶解，加薄層層析硅 膠，混勻后再加微晶纖維素，超聲波清洗除氣泡，圖板制片，備用； 用氯仿：甲醇比例為16 : 1的混合液作展開劑； 步驟c，HSCCC分離制備生物堿，以甲醇作對照，對核桃青皮生物堿樣品和6種標準生物 堿；在190-400nm處用紫外可見光度計進行檢測，觀察吸收峰值，并導(dǎo)出波峰數(shù)據(jù)； 石油醚：氯仿：甲醇例為2 : 4 : 2 : 2V/V為溶劑體系，按比例將 4種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，室溫下靜置過夜，使用前分得上相和下相， 超聲脫氣30min以備用； 將已超聲脫氣后的下相以ZOmLmirT1的速度泵入HSCCC分離管中，待下相充滿整個管 路，設(shè)定分離管順時針旋轉(zhuǎn)，緩慢調(diào)節(jié)主機轉(zhuǎn)數(shù)至800r ? mirT1，同時以2mL ? mirT1流速注入 上相，兩相達平衡后由進樣閥進入樣品溶液，同時采集相應(yīng)的數(shù)據(jù)，通過紫外檢測檢測流出 物，按照色譜峰收集相應(yīng)的成份。
【文檔編號】C07D311/62GK104478878SQ201410650315
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月8日
【發(fā)明者】楊衛(wèi)民, 張?zhí)K勤, 杜京旗, 趙君, 劉寶琦 申請人:呂梁學(xué)院