一種達托霉素雜質(zhì)rs-2高純度樣品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種達托霉素雜質(zhì)RS-2高純度樣品的制備方法。取達托霉素生產(chǎn)時上FPDA樹脂層析的預(yù)洗液，通過超濾和納濾設(shè)備處理后上硅膠層析，用異丙醇、一種水溶性有機溶劑和一種鹽的水溶液的混合溶液作為解吸液解吸硅膠，通過高壓液相色譜檢測，選擇合并其中RS-2雜質(zhì)色譜純度達到95％以上的解吸液進行納濾濃縮、脫鹽，最后進入凍干機凍干得到高純度RS-2雜質(zhì)粉末。
【專利說明】一種達托霉素雜質(zhì)RS-2高純度樣品的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵制藥領(lǐng)域，涉及一種抗生素產(chǎn)品中的相關(guān)雜質(zhì)的制備方法， 尤其涉及達托霉素相關(guān)雜質(zhì)RS-2的高純度樣品的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 達托霉素是自鏈霉菌（S.reseosporus)發(fā)酵液中提取得到一種全新結(jié)構(gòu)的環(huán)脂 肽類抗生素，它通過擾亂細胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成， 改變細胞質(zhì)膜的性質(zhì)，能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，并迅速殺死革蘭氏陽性菌。達托 霉素除了能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭氏陽性菌外，更重要的是它在體外對已呈現(xiàn)甲氧西 林（methicillin)、萬古霉素和利奈唑烷等耐藥性質(zhì)的分離菌株具有強力活性，這個特性對 于危重感染患者具有非常重要的臨床意義。
[0003] 達托霉素相關(guān)雜質(zhì)RS-2是達托霉素質(zhì)量控制中重點關(guān)注的雜質(zhì)，高純度的雜質(zhì) 樣品對RS-2雜質(zhì)研究有重要作用。
[0004] 根據(jù)"國家食品藥品監(jiān)督管理局進口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)"（標(biāo)準(zhǔn)號JX20070250)關(guān)于注 射用達托霉素的描述，將高壓液相檢測達托霉素時候，在保留時間19. 9分鐘，相對達托霉 素保留時間〇. 56的雜質(zhì)命名為RS-2。
[0005] 高壓液相檢測條件：
[0006]色譜柱：PhenomenexIB-sil250X4.6mm
[0007] 填充填料：C8,粒徑5iim
[0008] 流動相：〇?45%磷酸二氫銨pH3. 25(磷酸調(diào)節(jié)）的溶液（V):乙腈（V)=67:33
[0009]流速：1.5mL/min
[0010]檢測波長X:214nm
[0011] 其中RS-2的產(chǎn)品量為用達托霉素作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過面積歸一法計算得到的一個 方便我們衡量上柱量的相對的數(shù)值。
[0012] RS-2在達托霉素成品中含量非常低，一般不超過0. 3%，C8填料制備柱分離制備 此雜質(zhì)需要消耗大量的達托霉素成品及大量的流動相，制備成本非常高昂。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了一種方法，可以快速且成本低廉的制備高純度的RS-2。
[0014]一種達托霉素雜質(zhì)RS-2高純度樣品的制備方法，其步驟包括：
[0015] 1)收集達托霉素生產(chǎn)上FPDA樹脂層析的預(yù)洗液，用超濾機進行超濾，去除大分子 的色素及蛋白；
[0016] 2)將步驟1)超濾后的濾液用納濾機進行濃縮；
[0017] 3)將步驟2)得到的濃縮液上硅膠柱并解吸，所用解吸液包含異丙醇、一種水溶性 有機溶劑和一種鹽的水溶液，解吸液可按照每1/10柱床體積收集一瓶備用；
[0018]4)通過高壓液相色譜檢測收集到的解吸液中RS-2雜質(zhì)含量，將RS-2雜質(zhì)純度 彡95 %的解吸液合并；
[0019] 5)將合并的解吸液用納濾機進行濃縮并脫鹽，直到納濾廢水中的電導(dǎo)率 ^ 20uS/cm；
[0020] 6)將納濾濃縮液放入凍干機凍干，得到高純度的RS-2雜質(zhì)的粉末。
[0021] 上述步驟2)濃縮后的濃縮液優(yōu)選為預(yù)洗液體積的1/180?1/200。
[0022] 上述步驟3)中使用的硅膠優(yōu)選為分析純級別層析硅膠，其粒徑為200?300目； 硅膠采用異丙醇浸泡裝柱。干硅膠用量為雜質(zhì)RS-2產(chǎn)品量的2000?2010倍重量。
[0023] 上述步驟3)中，解吸液中所述一種水溶性有機溶劑優(yōu)選為甲醇或乙醇，所述一種 鹽的水溶液優(yōu)選為乙酸銨或氯化銨的水溶液。其中所述乙酸銨水溶液的濃度優(yōu)選為〇. 4? 0. 43 % (g/L，即每100mL溶液中含有0. 4?0. 43g乙酸銨），并用乙酸調(diào)節(jié)溶液pH為3. 4? 3. 6;所述氯化銨水溶液的濃度優(yōu)選為0. 24?0. 26 % (g/L)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為3. 4? 3. 6〇
[0024] 異丙醇和所述水溶性有機溶劑、鹽的水溶液按一定比例混合成解吸液，在本發(fā)明 的一些具體實施例中，按體積比它們的混合比例為：異丙醇：乙醇：乙酸銨水溶液=(9? 10) : (11?13) : (6?8);或者異丙醇：甲醇：氯化銨水溶液=(9?10) : (8?10) : (5? 7)。
[0025] 上述步驟5)中脫鹽的方法為：當(dāng)所有解吸液都收入納濾機后，向其中加入pH= 4. 4?4. 6的醋酸水溶液，直到納濾廢水中的電導(dǎo)率< 20iiS/cm，停止加醋酸水溶液。納濾 后濃縮液體積控制在100?200mL為佳。
[0026] 本發(fā)明提供的達托霉素雜質(zhì)RS-2高純度樣品的制備方法工藝簡單，相比于現(xiàn)有 技術(shù)通過制備柱分離的方法節(jié)約了大量成本。

【具體實施方式】
[0027] 以下通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本 領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明 的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0028] 在上硅膠柱前，將含有RS-2雜質(zhì)的樹脂預(yù)洗液進行如下處理：收集生產(chǎn)達托霉素 時第一次FPDA樹脂預(yù)洗液10000L;先用超濾機超濾，濾液用納濾機納濾，得到深棕紅色溶 液50L。高壓液相色譜檢測納濾得到的濃縮液中RS-2雜質(zhì)含量為14. 623%。以下實施例 硅膠層析的物料均由此得到。
[0029] 實施例1.
[0030] 稱取200?300目的分析純級層析硅膠4500g，用異丙醇浸泡裝柱，靜置5小時。
[0031]取含有2. 24gRS-2雜質(zhì)的納濾濃縮液上柱，上柱完成后用解吸液進行解吸，解吸 流量lBV/h，l/10BV(柱床體積）收集一瓶。解吸液為：異丙醇（V):乙醇（V) : 0.4%乙酸 銨水溶液（V) =9:11:6,用高壓液相色譜檢測收集瓶中解吸液，合并RS-2雜質(zhì)含量>95% 的解吸液。
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種達托霉素雜質(zhì)RS-2高純度樣品的制備方法，包括以下步驟： 1) 收集達托霉素生產(chǎn)上FPDA樹脂層析的預(yù)洗液，用超濾機進行超濾； 2) 將步驟1)超濾后的濾液用納濾機進行濃縮； 3) 將步驟2)得到的濃縮液上硅膠柱并解吸，所用解吸液包含異丙醇、一種水溶性有機 溶劑和一種鹽的水溶液； 4) 通過高壓液相色譜檢測收集到的解吸液中RS-2雜質(zhì)含量，將RS-2雜質(zhì)純度> 95% 的解吸液合并； 5) 將合并的解吸液用納濾機進行濃縮并脫鹽，直到納濾廢水中的電導(dǎo)率< 20 ii S/cm ; 6) 將納濾濃縮液放入凍干機凍干，得到高純度的RS-2雜質(zhì)的粉末。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)納濾機濃縮后的濃縮液為預(yù) 洗液體積的1/180?1/200。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)使用的硅膠為分析純級別層 析硅膠，其粒徑為200?300目；硅膠采用異丙醇浸泡裝柱。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)干硅膠用量按重量計為雜質(zhì) RS-2產(chǎn)品量的2000?2010倍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述一種水溶性有機溶劑 為甲醇或乙醇；所述一種鹽的水溶液為乙酸銨或氯化銨的水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述乙酸銨水溶液的濃度為0. 40? 0. 43%，pH3. 4?3. 6 ;所述氯化銨水溶液的濃度為0. 24?0. 26%，pH3. 4?3. 6。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所用解吸液為按體積比異丙 醇：乙醇：乙酸銨水溶液=(9?10) : (11?13) : (6?8)的混合溶液；或者是按體積比異 丙醇：甲醇：氯化銨水溶液=(9?10) : (8?10) : (5?7)的混合溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)中脫鹽的方法為：當(dāng)所有 解吸液都收入納濾機后，加入pH = 4. 4?4. 6的醋酸水溶液，直到納濾廢水中的電導(dǎo)率 < 20ii S/cm，停止加醋酸水溶液。
【文檔編號】C07K1/34GK104387444SQ201410667505
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】何勇崴, 謝云, 張洪蘭 申請人:北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大方正集團有限公司, 北大醫(yī)療產(chǎn)業(yè)集團有限公司