一種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷a和苦丁苷d的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷A和D的方法，該方法以苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C.J.Tseng)藥材為原材料，經(jīng)過醇液提取，氯仿除雜，正丁醇萃取，大孔樹脂柱層析和反相高效液相精制分離及重結(jié)晶方法得到苦丁苷A(Kudinoside A)和苦丁苷D(Kudinoside D)的高純度單體化合物。本發(fā)明技術(shù)方法簡單可靠，原料易得，經(jīng)濟成本低，所得單體化合物純度高，適用于大量制備苦丁苷A和苦丁苷D。
【專利說明】-種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷A和苦丁苷D的方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及皂苷類化合物，具體涉及苦丁苷A(Kudin〇Side A)和苦丁苷 D (Kudinoside D)。

【背景技術(shù)】
[0002] 苦丁茶冬青為冬青科（Aquifoliaceae)冬青屬植物苦丁茶冬青Ilex kudingcha C. J. Tseng的干燥葉。苦丁茶冬青具有散風熱、清頭目、止頭痛等功效，用于暑月外感風寒， 內(nèi)傷生冷而致惡寒發(fā)熱、頭痛脘痞、嘔惡泄瀉等癥。在我國主要分布在西南地區(qū)（四川、重 慶、貴州、湖南、湖北）及華南地區(qū)（江西、廣東、福建、海南）等地?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦 丁茶冬青具有改善心血管系統(tǒng)、降血脂、降血壓、降血糖和提高免疫力等藥理作用。
[0003] 近年來，文獻報道苦丁茶冬青主要含三萜皂苷類、黃酮類、多酚類和揮發(fā)油類等化 學成分。1990年有學者從苦丁茶冬青中分離得到一種新的五環(huán)三萜苷元，并命名為苦丁茶 苷元，此后諸多學者在對苦丁茶冬青化學成分研究中發(fā)現(xiàn)了大量的三萜皂苷類化合物，并 通過實驗證明三萜皂苷類化合物是苦丁茶冬青最主要的活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明苦丁 茶冬青改善心血管系統(tǒng)、降血脂、降血壓等方面的藥理作用都與其三萜皂苷類成分有關(guān)。日 本學者Nishimura等從苦丁茶冬青中分離得到的三廠阜苷類化合物是乙酰輔酶膽固醇酰 基轉(zhuǎn)移酶（ACAT)抑制劑，可作為治療動脈硬化的新藥。在苦丁茶冬青皂苷類物質(zhì)對離體兔 血管作用的實驗中，KDC-TS可以使用去甲腎上腺素和氯化鈣制作的離體血管收縮模型的量 效曲線非平行右移，最大效應降低，表明KDC-TS可對抗去甲腎上腺素和氯化鈣所致血管收 縮。
[0004] 目前文獻報道用于從苦丁茶冬青中分離三萜皂苷類單體的方法主要是綜合運用 硅膠柱層析、凝膠柱層析法等多種常壓柱層析法。例如專利CN101016328B從苦丁茶冬青 中分離純化熊果酸和齊墩果酸，所采用的方法十分的復雜、步驟麻煩，而且純度僅為90%左 右；專利CN101775061A采用95%乙醇熱回流提取浸膏，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取得到 各部位浸膏，反復通過正相、反相硅膠柱色譜，葡聚糖凝膠柱色譜分離手段得到了一組苦丁 茶皂苷類化合物，包括苦丁酮A、B、D、E、F、G，苦丁皂苷LZ 11和LZ12，沒有涉及到本發(fā)明針對 的苦丁苷A和苦丁苷D。文獻報道的方法都要利用多種有機溶劑萃取及多種填料進行柱層 析進行分離純化，不僅沒有明確各步驟具體實施方法，而且所需步驟冗長、繁瑣、耗時長、產(chǎn) 量低（僅為毫克級），且純度低。目前尚未見同時針對苦丁苷A(Kudin 〇Side A)和苦丁苷 D (Kudinoside D)的快速分離純化的文獻報道，主要是兩者結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)差異小和分離難 度大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷 A(Kudinoside A)和苦丁苷D(Kudinoside D)的方法，該方法具有簡單可靠，原料易得，經(jīng)濟 成本低，所得單體化合物純度高、適應于大量制備優(yōu)點。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：
[0007] -種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷A和苦丁苷D的方法，該方法由以下步驟組成：
[0008] (1)取苦丁茶粉碎并過三號篩，加入8?20倍量體積濃度不低于75%的甲醇或乙 醇溶液，采用滲漉或加熱回流法提取，回收溶劑得浸膏；將所得浸膏用蒸餾水分散，再依次 用氯仿、正丁醇萃取，回收并濃縮正丁醇萃取液至稠膏；
[0009] (2)將所得稠膏裝入大孔樹脂柱，先用5?7倍柱體積的蒸餾水洗脫除去雜質(zhì)，再 依次用6?10倍柱體積的體積濃度為30%、60 %和80%的甲醇梯度洗脫，收集體積濃度為 60%的甲醇洗脫液流分，或者依次用6?10倍柱體積的體積濃度為25%、55 %和75%乙醇 梯度洗脫，收集體積濃度為60%的甲醇洗脫液流分，回收洗脫液，得皂苷粗品；
[0010] (3)將皂苷粗品用色譜甲醇溶解，并使皂苷粗品在色譜甲醇中的濃度為0. 1? 0. 3g/mL，然后用反相高效液相色譜法進行純化；其中所述反相高效液相色譜法的色譜條件 為，色譜柱為 kromasil C18, 250 X 30mm, 5 μ m，或者為 YMC C18, 250 X 20mm, 5 μ m，UV 檢測器的 波長為230nm，流速4?20mL/min，柱溫35°C，流動相為體積濃度為65%的甲醇，或者為體 積濃度為35%的乙腈；分別收集最高峰和其后面流出的第一個主峰所對應的保留時間內(nèi) 的制備液，濃縮回收后，再用體積濃度為80%的甲醇進行重結(jié)晶，得相應的產(chǎn)物苦丁苷A和 苦丁苷D。
[0011] 上述從苦丁茶冬青中分離苦丁苷A和D的方法具有以下優(yōu)點：
[0012] 1、苦丁苷A和D兩個化合物結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)差異小和分離難度大，本發(fā)明可通過一 次提取和制備過程，同時得到高純度的苦丁苷A和D兩個化合物。
[0013] 2、苦丁苷A和D具有獨特的苦丁茶內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)，具有抑制巨噬細胞攝取LDL的活 性和抗血小板凝聚的活性，開發(fā)利用前景大。本發(fā)明可以快速制備得到克級的苦丁苷A和 D，以用于研發(fā)新藥。
[0014] 3、苦丁苷A和D均為苦丁茶冬青藥材主要成分，但目前尚無文獻報道兩個化合物 的對照品制備方法。本發(fā)明可為苦丁茶冬青藥材的質(zhì)量控制提供含量測定用的對照品，有 助于建立苦丁茶冬青藥材的質(zhì)量控制方法。
[0015] 4、本發(fā)明所選用的有機溶劑均可以回收重復使用，對環(huán)境的污染小，而且在反相 色譜制備時可以優(yōu)選甲醇-水作為洗脫系統(tǒng)，溶劑價格便宜，經(jīng)濟適用性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為下述實例1所得反相高效液相制備譜圖。
[0017] 圖2為下述實例2所得反相高效液相制備譜圖。
[0018] 圖3為下述實例3所得反相高效液相制備譜圖。
[0019] 圖4為下述實例4所得反相高效液相制備譜圖。
[0020] 圖5為下述實例1所得組分a的高效液相色譜圖。
[0021] 圖6為下述實例1所得組分a的紫外吸收曲線譜圖。
[0022] 圖7為下述實例1所得組分b的高效液相色譜圖。
[0023] 圖8為下述實例1所得組分b的紫外吸收曲線譜圖。
[0024] 圖9為下述實例1所得組分a的1H-NMR譜圖。
[0025] 圖10為下述實例1所得組分a的13C-NMR譜圖。
[0026] 圖11為下述實例1所得組分b的1H-NMR譜圖。
[0027] 圖12為下述實例1所得組分b的13C-NMR譜圖。
[0028] 圖13為苦丁茶冬青藥材中苦丁苷A和D的HPLC含量測定色譜圖。

【具體實施方式】
[0029] 實施例1
[0030] 1、分離苦丁苷A和D
[0031] (1)稱取苦丁茶冬青干燥葉500g，粉碎過三號篩，用20倍量的甲醇（IOL)滲漉提 取?；厥占状嫉玫娇喽〔瓒嘟?12g，加入300mL的蒸餾水使成分散系統(tǒng)。先用氯仿萃 取三次，每次350mL，再用水飽和正丁醇萃取3次，每次350mL。濃縮正丁醇萃取液至稠膏。
[0032] (2)將所得稠膏用214g大孔樹脂吸附，用860g大孔樹脂作為柱層析填料，先用純 水沖洗6個柱體積，然后再用甲醇-水梯度洗脫（30% - 60% - 80% )，各梯度洗脫液為 8?10個柱體積。經(jīng)TLC分析，目標化合物在60%甲醇洗脫液中，合并含目標化合物的組 分后回收溶液，得到含目標化合物的皂苷粗品24g。
[0033] (3)取上述皂苷粗品用色譜甲醇溶解成濃度為0. 2g/mL的溶液，用0. 45 μ m微孔濾 膜過濾，通過反相高效液相制備分離純化。色譜條件：色譜柱為YMC C18, 250 X 20mm，5 μ m ; 檢測波長230nm ;流速15mL/min ;柱溫30°C ;流動相為甲醇-水（65:35);進樣量為0. 4mL。 化合物a的保留時間為15. 7min，收集15. 4?17. 9min內(nèi)的制備液；化合物b的保留時間 為18. 7min，收集18.0?19. 6min內(nèi)的制備液，反相高效液相制備圖譜見圖1，減壓濃縮回 收后得到化合物a和化合物b，再分別用甲醇-水（80:20)重結(jié)晶得到單體化合物a和b。
[0034] 2、化合物a和b的純度檢測
[0035] 精密稱取適量上述化合物a和b，用色譜甲醇制備成濃度為2mg/mL的儲備液， 精密吸取IOuL通過高效液相色譜儀進行純度檢測。色譜條件：色譜柱為（kromasil C 18, 250X4. 6mm，5 μ m) ;PDA檢測器230nm波長監(jiān)測；柱溫35°C ;流速lmL/min ;流動相為甲 醇-水￠5:35)?；衔颽純度檢測結(jié)果見圖5,化合物b純度檢測結(jié)果見圖7,應用歸一化 法，按下述公式計算兩個化合物的純度，結(jié)果顯示化合物a和b的HPLC純度均大于98%。
[0036] X % = AiAAjAz) X 100%，公式中X i為待測組分i的百分含量Ai為待測組分i 的峰面積，Az為雜質(zhì)的峰面積之和。
[0037] 3、化合物a和b的結(jié)構(gòu)鑒定
[0038] 將上述兩個化合物通過紫外全波長掃描、紅外掃描和核磁共振及質(zhì)譜驗證其結(jié) 構(gòu)。其中化合物a為羽狀針晶，驗證結(jié)果為：在TLC上用10%硫酸-乙醇顯紫紅色斑點，醋 酐-濃硫酸反應呈陽性，推測可能為皂苷類成分。紅外IR(KBr) V ^:3452(31^1左右有OH強 吸收峰，并且在1729CHT1處有C = 0伸縮振動特征峰，1636CHT1有C = C伸縮振動特征峰出 現(xiàn)。ESI-MS顯示其分子量為926?；衔颽經(jīng)9%鹽酸水解，衍生化后的產(chǎn)物通過HPLC檢 測出含有葡萄糖、鼠李糖及阿拉伯糖。 1H-NMR(400MHZ，pyridine-d5)譜中共顯示8個-CH 3 信號：其中 7 個為甲基單峰質(zhì)子信號，δΗ 1.65、1.64、1.52、1.23、1. 14、0. 92、0. 88(each 3H，s)，提示該化合物可能為三萜類化合物；1個甲基雙峰質(zhì)子信號，δΗ 1.67(3H，d，J = 5. 9Hz)，為典型的鼠李糖5位所連甲基信號。低場區(qū)觀察到三個糖端基質(zhì)子信號：δ η 5. 97(1H, brs, C-I-H of Rha), 5. 14 (1H, d, J = 8. 0Hz, C-I-H of Glc), 4. 67 (1H, d, J = 5. 6Hz, C-I-H of Ara)。
[0039] 13C-NMR(100MHz，pyridine-d5)共顯示有 47 個碳信號，其中 δ。175.9 為羰基碳 信號，推斷其為成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的28位羰基碳信號，δ。146. 7和137.7為典型的烏蘇烷型三 萜C-13和C-18雙鍵碳信號，δ c 105. 1、105. 0、102. 2為3個糖端基碳的信號，δ c 88. 6為 3位與糖相連成苷的碳信號，δ。86. 1為20位碳的信號。3位所連的阿拉伯糖上基碳信號 為3。105.1、82.5、75.0、68.5、65.2，另外5。105.0、78.9、78.5、75.3、71.7、62.7為葡萄 糖上碳的信號，S c 102. 2、74. 3、72. 8、72. 8、70. 4、18. 6為鼠李糖上碳的信號。δ。74. 6和 66. 4分別為12和19位羥基取代的碳信號?；衔颽的核磁數(shù)據(jù)歸屬如下：
[0040] iH-MffiUOOMHz.pyridine-cQJHS.gTdH.brs.C-l-HofRhahS.SUlH， brt, H-ll), 5. 14(1H, d, J = 8. 0Hz, C-I-H of Glc), 4. 67 (1H, d, J = 5. 6Hz, C-I-H of Ara), I. 67 (3H, d, J = 5. 9Hz, C-5-CH3 of Rha), I. 65 (3H, s, CH3), I. 64 (3H, s, CH3), I. 52 (3H, s, CH3)，I. 23 (3H, s, CH3)，I. 14 (3H, s, CH3)，0· 92 (3H, s, CH3)，0· 88 (3H, s, CH3)。（圖 9)
[0041] 13CMMR(100MHz，pyridine-d5):S c175.9(C-28)，146.7(C-13)，137.7(C-18) ,105. I (Ara C_l)，105. 01 (Glc C_l)，102. 2 (Rha C_l)，88. 6 (C_3)，86. I (C-20)，82. 5 ( Ara C-3) ,78.9 (Glc C-5) ,78.5 (Glc C-3) ,75.3 (Glc C-2) ,75.0 (Glc C-2) ,74.6 (Ara C-2)，74. 6 (C-19) ,74.3 (Rha C-4) ,72.8 (Rha C-3) ,72.8 (Rha C-2) ,71.7 (Glc C-4)，70. 4 (Rha C-5) ,68.5 (Ara C-4) ,66.4 (C-12) ,65.2 (Ara C-5) ,62.7 (Glc C-6) ,56.6 (C-5)，45. 3 (C-9)，44. 5 (C-17)，44. 3 (C-14)，42. I (C-8)，40. 0 (C-4)，39. 6 (C-I)，37. 3 (C-l 0)，35. 9 (C-7)，33. 2 (C-22)，29. 3 (C-15)，29. I (C-Il)，28. 8 (C-2)，28. 4 (C-21)，27. 0 (C-23 )，26. 6 (C-16)，25. 6 (C-29)，23. 9 (C-27)，19. 9 (C-30)，18. 9 (C-26)，18. 9 (C-6)，18. 6 (Rha C-6)，17. 3 (C-24)，17. I (C-25)。（圖 10)
[0042] 由上述數(shù)據(jù)可確定化合物a為苦丁苷A，化學結(jié)構(gòu)式為：
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種從苦丁茶冬青中分離苦丁苷A和苦丁苷D的方法，該方法由以下步驟組成： (1) 取苦丁茶粉碎并過三號篩，加入8?20倍量體積濃度不低于75%的甲醇或乙醇溶 液，采用滲漉或加熱回流法提取，回收溶劑得浸膏；將所得浸膏用蒸餾水分散，再依次用氯 仿、正丁醇萃取，回收并濃縮正丁醇萃取液至稠膏； (2) 將所得稠膏裝入大孔樹脂柱，先用5?7倍柱體積的蒸餾水洗脫除去雜質(zhì)，再依次 用6?10倍柱體積的體積濃度為30 %、60 %和80 %的甲醇梯度洗脫，收集體積濃度為60 % 的甲醇洗脫液流分，或者依次用6?10倍柱體積的體積濃度為25%、55 %和75%乙醇梯度 洗脫，收集體積濃度為60%的甲醇洗脫液流分，回收洗脫液，得皂苷粗品； (3) 將皂苷粗品用色譜甲醇溶解，并使皂苷粗品在色譜甲醇中的濃度為0. 1?0. 3g/ mL,然后用反相高效液相色譜法進行純化；其中所述反相高效液相色譜法的色譜條件為，色 譜柱為吐〇1^8丨1(：18,250\30111111，511111，或者為￥]\?：(：18,250\20111111，511111，淠檢測器的波長 為230nm，流速4?20mL/min，柱溫35°C，流動相為體積濃度為65%的甲醇，或者為體積濃 度為35%的乙腈；分別收集最高峰和其后面流出的第一個主峰所對應的保留時間段的制 備液，濃縮回收后，再用體積濃度為80%的甲醇進行重結(jié)晶，得相應的產(chǎn)物苦丁苷A和苦丁 苷D。
【文檔編號】C07J71/00GK104402965SQ201410691043
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】趙鐘祥, 楊滔, 周聯(lián), 向松濤, 張蕾, 朱錦萍, 楊寶, 譚慶龍 申請人:廣州中醫(yī)藥大學