一種可破壞細菌細胞壁的蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于基因工程領域的一種可破壞細菌細胞壁的蛋白。本發(fā)明可破壞細菌細胞壁的蛋白AUTO2由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列組成；其編碼基因由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明還公開了該蛋白的制備方法。與已知的lmo1521基因相比，本發(fā)明AUTO2蛋白具有更高活性，AUTO2蛋白對自身單增李斯特菌有明顯抑制作用，抑菌效果好，為食品、衛(wèi)生行業(yè)提供了新的抑菌蛋白；其次，本發(fā)明制備方法采用超聲波破碎細胞，目標蛋白存在于可溶相中，便于分離純化，避免了包涵體的產(chǎn)生；此外，本發(fā)明制備方法中蛋白含有6XHis標簽，便于采用Ni-NTA柱分離，且所得AUTO2蛋白純度高。
【專利說明】一種可破壞細菌細胞壁的蛋白及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種可破壞細菌細胞壁的蛋白，以及該蛋白 的制備方法。

【背景技術】
[0002] 細菌的細胞壁是由多糖鏈和氨基酸肽鏈組成的肽聚糖網(wǎng)狀結構，細菌自身表達的 一類蛋白能夠水解細菌細胞壁的肽聚糖結構，以滿足伴隨細菌細胞生長、分裂和鞭毛生長 時細胞壁結構的動態(tài)變化，這類蛋白統(tǒng)稱為肽聚糖水解酶。根據(jù)水解肽聚糖時水解酶切位 點的不同，又可定義為N-乙酰葡糖胺酶（N-acetylglucosaminidases)、N-乙酰胞壁酸酶 (N-acetylmuramidases)、酉先胺酶（N-acetylmuramyl-L-alanine amidases)、膚鏈內切酶 (Endopeptidases)等。這類肽聚糖水解酶因其能夠降解細菌自身的細胞壁又稱為自溶素。 自溶素參與細菌的多種生物學功能，如降解細胞壁、促使細胞分裂及調節(jié)細胞壁更新。在感 染宿主時自溶素可以協(xié)助細菌粘附并入侵宿主細胞，影響細菌在細胞內及細胞間的擴散力 并誘導免疫細胞產(chǎn)生細胞因子。自溶素的生物學功能還體現(xiàn)在生物膜、鞭毛及孢子形成、遺 傳轉化能力、蛋白分泌及自我溶解等，與細菌的致病力密切相關。
[0003] 自溶素在細菌體內表達受到時間和空間上的嚴格調控，即可保證細胞壁適度降解 滿足細菌生存及侵染宿主的要求，又不會因其過度降解引起細菌自溶。但是如果細菌中的 自溶素蛋白被過度表達，其表達產(chǎn)物保留了破壞細菌細胞壁的功能，又打破了細菌體內基 因表達時空的調控限制，就可引起細菌自溶或破壞同類的細菌。因此，利用基因工程的方法 克隆細菌的肽聚糖水解酶基因，轉到大腸桿菌中誘導原核過表達，發(fā)酵培養(yǎng)，蛋白純化，可 獲得持續(xù)高活性的肽聚糖水解酶。體外添加的肽聚糖水解酶可有效地破壞細菌細胞的正常 繁殖與生長，達到抑制細菌生長的作用。
[0004] 單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesis)是一種在環(huán)境中普遍存在 的革蘭氏陽性菌，能引起人和動物嚴重的食源性感染。目前已從中鑒定出p60、p45、Ami、 八此〇、18?^11^、1^〇0327和？1 &4等8種自溶素蛋白（李喚弟等.中華微生物學與免疫學 雜志，2013, 33(12) :964-969 ;崔煥忠等.食品科學，2012, 33(11) :290-293)。通過比對單 核細胞增生李斯特菌E⑶-e菌株（l/2a血清型）全基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)其Lm〇1521基因擁 有酰胺酶結構域，為假定的N-乙酰胞壁酸一L一丙氨酸酰胺酶功能，但是其基因的蛋白產(chǎn) 物和功能尚未被生物化學實驗證實。張紅娟（張紅娟.中國計量學院碩士學位論文，2012) 參考單增李斯特菌野生型標準菌株EGD-e(血清型l/2a)的全基因序列（NC_003210)中 lm〇1521成熟蛋白序列，從增生李斯特菌菌株LM-CMCC54002(血清型l/2a)基因組中克隆了 相應基因的ORF框，對比發(fā)現(xiàn)它與標準菌株E⑶-e(NC_003210)中l(wèi)mol521只存在一個堿基 的差異，翻譯的氨基酸序列完全相同，其表達蛋白具有低活性的水解細胞壁的功能。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種可破壞細菌細胞壁的蛋白。
[0006] 本發(fā)明另一目的在于提供編碼上述可破壞細菌細胞壁的蛋白的基因。
[0007] 本發(fā)明第三目的在于提供含有上述基因的表達載體。
[0008] 本發(fā)明第四目的在于提供上述蛋白的制備方法。
[0009] 本發(fā)明第五目的在于提供上述蛋白在破壞細菌細胞壁方面的用途。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：
[0011] 本發(fā)明一種可破壞細菌細胞壁的蛋白，命名為AUT02,所述的蛋白由SEQ ID No :1 所示的氨基酸序列組成。
[0012] 編碼上述可破壞細菌細胞壁的蛋白的基因，命名為aut〇2,所述的基因由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列組成。
[0013] 含有上述可破壞細菌細胞壁的蛋白的基因的表達載體。
[0014] 上述表達載體中所述的載體是指pET-22b、pET-28a或pET-28c等之一種。
[0015] 上述可破壞細菌細胞壁的蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)、以單核細胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因組DNA為模 板，以lmol521-F和lmol521-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物；所述的引物為：
[0017] lmol521-F ：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG ； (SEQ ID No:3)
[0018] lmol521-R ：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
[0019] (2)、表達載體的構建：將步驟⑴中所得的PCR擴增產(chǎn)物用BamH I和Hind III 進行雙酶切，得aut〇2基因片段；然后將雙酶切后所得的aut〇2基因片段與載體pET-22b用 T4DNA連接酶連接，得連接產(chǎn)物；將所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，提取重組質粒，測 序，得含有auto2基因的重組質粒,將所得重組質粒命名為pET-22b_auto2 ;
[0020] (3)、auto2基因的原核表達：
[0021] 用熱激法將pET-22b-aut〇2重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，將 轉化后的細胞涂布在含lOOug/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)24-48h ;取陽性 單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、150?220rpm條件下培養(yǎng)4?6h，加甘油分 裝，-20°C冰箱保存；
[0022] (4)、取步驟（3)所得的轉化菌株，接種于含lOOug/mL Amp LB液體培養(yǎng)基，在 37°C、150?220rpm條件下過夜培養(yǎng)；次日按1 :80?120比例更換新鮮液體LB培養(yǎng)基， 擴大培養(yǎng)細菌〇D_到0. 5?0. 7時，添加異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)到終濃 度0. 5mmol/mL，在26?30°C、130?160rpm條件下培養(yǎng)3?6h ;收集菌液轉到離心管，在 4°C、4000?5000rpm下離心8?10min，收集沉淀細胞；
[0023] (5)、細胞破碎與增溶：
[0024] 按1:3?5(g/ml)的比例向步驟（4)所得的沉淀細胞添加 Ix裂解緩沖液，得混 合液；將混合液置于冰水混合的水浴中超聲破碎儀（超聲功率為200W，超5s停5s)中破碎 至細胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton X-100)至終濃度為 0. 1 %，置于4°C冰箱中過夜；次日在4°C、8000rpm條件下離心15min，收集上清液；
[0025] (6)、Ni-NTA樹脂純化目標蛋白：
[0026] 將步驟（5)所得上清液用0. 22um濾膜過濾，取濾液；按0. 5?1. 5 :1的體積比比 例將濾液與50% Ni-NTA混合，在4°C、水平搖床上80rpm條件下結合3h，然后裝入色譜柱， 收集流出液；用Ix漂洗緩沖液漂洗2?3個柱床體積后，更換為Ix洗脫緩沖液用量為2個 柱床體積，分步收集洗脫緩沖液加入后的流出液，SDS-PAGE電泳分析檢測流出液的蛋白組 分；收集47. 5KD單一組分蛋白的流出液，棄去其他部分流出液；
[0027] (7)、蛋白脫鹽、透析復性和冷凍保存：
[0028] 用I Ami con? Ultra-15超濾離心管濃縮步驟（6)所得的洗脫液，濃縮條件為4°C、 5000rpm離心20-30min ;收集濃縮液轉移至14kDa MWCO的透析袋，在超純水中4°C透析 24h，中間更換用超純水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷凍過夜，冷凍干燥，得提純的AUT02 蛋白凍干粉末；將所得的凍干粉末蛋白在_20°C冰箱保存。
[0029] 上述制備方法步驟（3)中所述的LB固體培養(yǎng)基的組成成分及其比例為：蛋白胨 l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂10g/L，去離子水補充到1L。
[0030] 上述制備方法步驟（3)中所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其比例為：蛋白胨 l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L，去離子水補充到1L。
[0031] 上述制備方法步驟（5)中所述的裂解緩沖液的組成成分為：10mM咪唑，5%的甘 油，300mM NaCl，50mM NaH2P04,0. ImM PMSF，pH8.0。
[0032] 上述制備方法步驟（6)中所述的漂洗緩沖液的組成成分及其比例為：50mM咪唑， 300mM NaCl，50mM NaH2PO4,去離子水補充到 lL，pH8.0。
[0033] 上述制備方法步驟（6)中所述的洗脫緩沖液的組成成分及其比例為：250mM咪唑， 300mM NaCl，50mM NaH2PO4,去離子水補充到 lL，pH8.0。
[0034] 上述蛋白在破壞細菌細胞壁方面的用途。
[0035] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果，（1)、本發(fā)明aut〇2基因和AUT02蛋白與標準菌株 E⑶-e(NC_003210)中l(wèi)mol521在35個堿基和3個的氨基酸上存在差異，本發(fā)明AUT02蛋 白具有更高活性。（2)、本發(fā)明AUT02蛋白對革蘭氏陽性的自身單增李斯特菌有明顯抑制作 用，其抑菌效果好，為食品、衛(wèi)生行業(yè)提供了一種新的抑菌蛋白。（3)、本發(fā)明制備方法中大 腸桿菌表達的目標蛋白是非分泌型的，低速離心收集細胞培養(yǎng)物，目標蛋白存在于細胞中， 便于高效分離得到。（4)本發(fā)明制備方法采用超聲波破碎細胞，目標蛋白存在于的可溶相 中，便于分離純化。避免了包涵體的產(chǎn)生。（5)本發(fā)明制備方法中蛋白含有6XHis標簽，便 于采用Ni-NTA柱分離即可達到純化效果。純化方法相對簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖I. auto2基因 PCR擴增電泳圖譜；其中M為Marker，1為auto2基因片段。
[0037] 圖2. AUT02蛋白水解自身細胞壁的對比電泳圖譜；其中M為蛋白分子量，1為考馬 斯亮蘭染色，2為亞甲基藍染色。
[0038] 圖3. AUT02蛋白處理Omin (對照）的單增李斯特菌活細胞顯微照片。
[0039] 圖4. AUT02蛋白處理15min的單增李斯特菌活細胞變化顯微照片。
[0040] 圖5. AUT02蛋白處理30min的單增李斯特菌活細胞變化顯微照片。
[0041] 圖6. AUT02蛋白處理90min的單增李斯特菌活細胞變化顯微照片。
[0042] 圖7.未添加 AUT02蛋白單增李斯特菌的菌落生長照片。
[0043] 圖8.添加 AUT02蛋白的單增李斯特菌的菌落生長受到抑制照片。

【具體實施方式】
[0044] 以下以具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但是不對本發(fā)明的保護范圍構 成任何限制。如無特別說明，以下實施例中所用的試劑皆為常規(guī)試劑，所用的方法皆為本領 域技術人員熟知的常規(guī)方法。下述實施例中Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、高純dNTPs、 Trans 4K DNA marker、IKb DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；T4DNA連接酶、 FastAP?堿性磷酸化酶、限制性內切酶BamH I和Hind III;AXYGEN DNA凝膠回收試劑盒、 AXYGEN PCR清潔試劑盒、AXYGEN質粒小量制備試劑盒購自澤橫生物技術有限公司；胰蛋白 胨、酵母提取物購自杭州米克生物技術公司（英國OXOID公司產(chǎn)品）；IPTG、X-Gal、CTAB、 Tris、Ni-NTA純化樹脂等購自上海生物工程有限公司。
[0045] 實施例1本發(fā)明可破壞細菌細胞壁的蛋白的制備
[0046] 按照如下方法進行：
[0047] (1)、以單核細胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因組DNA為模 板，以lm〇1521-F和lm〇1521-R為引物（由上海生工生物工程技術服務有限公司合成）進 行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物；
[0048] 所述的引物為：
[0049] lmol521-F ：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG ; (SEQ ID No: 3)，
[0050] lmol521-R ：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
[0051] PCR 反應體系（50μ L):模板 2μ L，pfu 酶（5U/y L)0. 5μ L，IOXpfu Buffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 2 μ L，Imol521-F/Imol521-R(10 μ Μ) 2 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。 PCR 反應條件：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 50s，72°C 3min(2.5min)，34 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0052] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（片段大小見圖I)，然后用DNA切膠回收試劑盒回收 純化。
[0053] (2)、表達載體的構建：將步驟（1)中所得的PCR擴增產(chǎn)物用限制性內切酶BamH I和Hind III進行雙酶切；PCR產(chǎn)物雙酶切體系為（50yL):10XBamH I buffer 5yL， BamH I lyL，Hind III 2 μ L，PCR產(chǎn)物42 μ L。將酶切體系加入200 μ L離心管，充分混 勻，37°C酶切3h。反應結束后65°C 20min滅活限制性內切酶，用PCR清潔試劑盒純化目的 DNA，得aut〇2基因序列；然后將雙酶切后所得的aut〇2基因片段與載體pET-22b用T4DNA 連接酶連接，得連接產(chǎn)物；將所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α，提取pET-22b-aut〇2重 組質粒，將重組質粒轉化至BL21 (DE3)。重組載體測序，通過測序獲得aut〇2基因的堿基序 列（見SEQ ID No:2)和AUT02蛋白氨基酸序列（見SEQ ID No: 1)。將所得重組質粒命名 為pET-22b-auto2 ;由LM-CMCC54007 (血清型4b)菌株中克隆出的堿基序列與E⑶-e菌株 (NC_003210)中l(wèi)mol521基因比對，發(fā)現(xiàn)存在35個堿基差異，對應的編碼蛋白僅存在3個 氨基酸差異，分別是123位由A(丙氨酸）代替了 S (絲氨酸）、271位由S (絲氨酸）代替了 A(丙氨酸）404位由S(絲氨酸）代替了天冬酰胺；說明本發(fā)明aut〇2基因與現(xiàn)有基因完全 不同，為一個新基因。
[0054] (3)、auto2基因的原核表達
[0055] 用熱激法將pET-22b-aut〇2重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，將 轉化后的細胞涂布在含l〇〇ug/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯 化鈉 l〇g/L、瓊脂10g/L，去離子水補充至1L)中，在37°C培養(yǎng)48h ;取陽性單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C、220rpm條件下培養(yǎng)4h，加甘油分裝，-20°C冰箱保存。
[0056] (4)、取保存的轉化菌株，接種于含lOOug/mL Amp LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L、 酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L，去離子水補充至1L)，在37°C、220rpm條件下過夜培養(yǎng)，次日 按1:100比例更換新鮮液體LB培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)細菌0D_到0. 7時，添加異丙基-β -D-硫 代吡喃半乳糖苷（IPTG)到終濃度0. 5mmol/mL，在28°C、160rpm條件下培養(yǎng)5h ;收集菌液轉 到離心管，在4°C、4500rpm下離心9min，收集沉淀細胞。
[0057] (5)、細胞破碎與增溶
[0058] 按1:4 (g/ml)的比例向步驟（3)所得的沉淀細胞添加 Ix裂解緩沖液（裂解緩沖 液的組成成分為：10mM 咪唑，5% 的甘油，300mM NaCl，50mM NaH2P04,0. ImM PMSF pH8. 0)， 得混合液；將混合液置于冰水混合的水浴中超聲破碎儀（超聲功率為200W，超5s停5s)中 破碎至細胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton X-100)至終濃度 為0. 1%，置于4°C冰箱中，過夜增加溶解度；次日在4°C、8000rpm條件下離心15min，收集 上清液；SDS-PAGE電泳檢測，所述的AUT02蛋白的分子量為47. 5KD。
[0059] (6)、Ni-NTA樹脂純化目標蛋白
[0060] 將步驟（5)所得上清液用0. 22um濾膜過濾，取濾液；按1. 0 :1的體積比比例將濾 液與50% Ni-NTA混合，在4°C、水平搖床上80rpm條件下結合3h，然后裝入色譜柱（室溫 10-30°C )，收集流出液；用 Ix 漂洗緩沖液（50mM 咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2P04，pH8. 0)漂 洗2-3個柱床體積（除去未與金屬鎳結合或結合較弱的其它蛋白）后（可參考紫外檢測儀 檢測中至低280吸收值）；更換為Ix洗脫緩沖液（250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4, PH8.0)用量為2個柱床體積，分步收集洗脫緩沖液加入后的流出液（可參考紫外檢測儀檢 測數(shù)據(jù)280高峰吸收值），SDS - PAGE電泳分析檢測流出液的蛋白組分；收集47. 5KD單一 組分蛋白的流出液，棄去其他部分流出液。
[0061] 出）、蛋白脫鹽、透析復性和冷凍保存
[0062] 合并Ni-NTA 柱純化洗脫緩沖液（250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4, ρΗ8· 0)加 入后淋洗出含單一 AUT02蛋白的洗脫液（SDS-PAGE電泳顯示含近乎單一的47. 5KD條帶）； 用lAmicon? Ultra-15(截留分子量MWCO :10kDa)離心過濾器（GE公司產(chǎn)品，不限）濃縮洗 脫液，濃縮條件為4°C、5000rpm離心20-30min ;收集濃縮液轉移至14kDa MWCO的透析袋， 在超純水中4°C透析24h,中間更換用超純水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷凍過夜,冷凍 干燥，得提純的AUT02蛋白凍干粉末；制備的凍干粉末蛋白在-20°C冰箱保存。
[0063] 實施例2本發(fā)明AUT02蛋白水解自身單增李斯特菌細胞壁的試驗
[0064] 試驗材料：單增李斯特菌LM - CMCC54007菌株的細胞壁和實施例1制備的AUT02 蛋白。
[0065] 試驗方法：
[0066] (1)、細菌細胞壁的制備：取過夜培養(yǎng)的野生型單增李斯特菌（CMCC54007)(來 自杭州市疾控中心，本試驗室保存）離心，收集細胞沉淀，〇. 9 %的生理鹽水洗滌細胞沉 淀，KKTC煮30min (或高壓滅菌），超聲破碎（超聲功率為300W，破碎7s，停3s)細胞lh， 2000rpm，離心IOmin除去未破碎的菌體，取上清液在12000rpm下離心20min，收集沉淀，沉 淀即為粗制的細胞壁，凍干保存?zhèn)溆谩?br> [0067] (2)、按常規(guī)方法配置SDS-PAGE電泳4%的濃縮膠，在12%的分離膠中加入1. 5% (wt/vol)的單增李斯特菌的細胞壁作為底物，配制成復性SDS-PAGE電泳膠。做水解活性分 析的蛋白樣品用非還原性上樣緩沖液（250mMTris-HCl(pH6. 8),10% (w/v)SDS，0. 5% (w/ v)溴酚藍，50% (v/v)甘油）處理，4°C、20mA恒流電泳。
[0068] (3)、在同一塊添加了細胞壁底物的SDS-PAGE膠上將相同的電泳樣品點在左右不 同的區(qū)域。電泳結束后，將SDS-PAGE左右兩側切開，分別做考馬斯亮藍染色和復性處理。 考馬斯亮藍染色一側的凝膠含有分子量標記樣品。將另外一側的凝膠轉移至250ml去離 子水中，室溫、SOrpm漂洗30min，然后切除溴酚藍指示劑以下膠，將指示劑以上部分轉移至 復性緩沖液中（0.1%Triton X-100，10mM MgC12,25mM 1^8-!1(：1，口!17.5)，室溫、80印111漂 洗30min，更換新鮮的復性液中，37°C、80rpm孵育3-16h。孵育結束后用去離子水漂洗復性 膠2-3次，用0. 1 %亞甲基藍染色液（含0.01 %的Κ0Η)染色3h，用去離子水脫色8h，在凝 膠成像系統(tǒng)分析結果。此時SDS-PAGE分離膠中的細菌細胞壁被亞甲基藍染成不透明的藍 色。而含有水解細胞壁活性的AUT02蛋白，則可把凝膠中的細菌細胞壁底物水解破壞掉，產(chǎn) 生透明的區(qū)域。結果（見圖2)在實施例1制備的AUT02蛋白，添加單增李斯特菌細胞壁的 SDS-PAGE電泳板上，用考馬斯亮蘭染色，結果（見圖2,泳道1)顯示主要為47. 5kDa處的 AUT02蛋白。而經(jīng)復性孵育水解16h亞甲基藍染色，在對應的47. 5kDa處有透明區(qū)域（（見 圖2,泳道2,向左箭頭所示），說明AUT02蛋白具有水解自身細胞壁活性。
[0069] 實施例3 :本發(fā)明AUT02蛋白破壞單增李斯特菌活細胞試驗
[0070] 試驗樣品：單增李斯特菌活細胞（CMCC54007)(來自杭州市疾控中心，本試驗室保 存）；實施例1制備的AUT02蛋白。
[0071] 試驗方法：低速離心收集過夜培養(yǎng)的單增李斯特菌活細胞（CMCC54007)，加水解 反應緩沖液（〇· 1% Triton X-100, IOmM MgCl2, 25mM Tris-HCl，去離子水補充到 lL，pH7. 5) 調至OD6tltl = 1. 0, IO5-IO6CFU左右，作為水解底物細菌懸浮液備用。
[0072] 取用IOmM PBS緩沖液溶解實施例1制備的AUT02蛋白為濃度為15. Oug/ul的蛋白 樣品IOul與水解反應緩沖液中IO5-IO6CFU左右的單增李斯特菌活細胞懸浮液90ul混合均 勻，在37°C、IOOrpm搖床上反應90min。分別在反應Omin、15min、30min、90min時間點各取 樣5ul，立即均勻涂在載破片上烘干。采用革蘭氏染色，用Nikon顯微鏡觀察重組蛋白降解 單增李斯特菌活細胞過程中細胞形態(tài)及密度變化。結果未加 AUT02蛋白（見圖3, Omin時 對照）時，單增李斯特菌細胞菌體呈桿狀，菌體細胞密集布滿整個視野；反應15min時（見 圖4)，細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，部分短桿狀的單增李斯特菌變?yōu)榍驙?，細胞密度開始降低； 反應30min時（見圖5)，細胞密度持續(xù)降低，細胞進一步變成球狀并開始聚集；當反應至 90min時（見圖6)，幾乎看不到完整的單一桿狀菌體，細胞聚集成團狀，顯微鏡視野中幾乎 觀察不到單一的細菌菌體。說明本發(fā)明AUT02蛋白具有破壞細菌活細胞的作用。
[0073] 實施例4本發(fā)明AUT02蛋白抑制單增李斯特菌生長試驗
[0074] 試驗方法：用水解反應緩沖液（其組成成分及其比例為：0. 1 % Triton X-100, IOmM MgCl2, 25mM Tris-HCl，去離子水補充到 1L，ρΗ7· 5)制備 IO5-IO6CFU 的新鮮培 養(yǎng)的單增李斯特菌LM-CMCC54007(來自杭州市疾控中心，本實驗室保存）細胞懸浮液。實 驗組添加實施例1制備的的AUT02蛋白至終濃度為I. 5ug/ul，對照組用PBS緩沖液代替蛋 白液。反應30min時，實驗組取IOul用涂布法接種于9cm培養(yǎng)皿的BHI固體培養(yǎng)基，反應 60min時，對照組取IOul用涂布法接種于9cm培養(yǎng)皿的BHI固體培養(yǎng)基，實驗組、對照組均 設3個重復。兩組平板在恒溫培養(yǎng)箱中37°C倒置培養(yǎng)24h。
[0075] 結果未添加 AUT02蛋白的對照組（見圖7)平板菌落正常生長，而添加 AUT02蛋白 的實驗組（見圖8)平板未見菌落生長。說明經(jīng)過30min的本發(fā)明AUT02蛋白處理，AUT02 蛋白破壞了單增李斯特菌的細胞壁，使單增李斯特菌細胞失去正常的生活能力。
【權利要求】
1. 一種可破壞細菌細胞壁的蛋白，其特征在于所述的蛋白由SEQIDN〇:l所示的氨基 酸序列組成。
2. 編碼權利要求1所述的蛋白的基因，其特征在于所述的基因由SEQIDNo:2所示的 核苷酸序列組成。
3. 含有權利要求1所述的基因的表達載體。
4. 按照權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的載體是指pET-22b、pET-28a或 pET-28c之一種。
5. 上述可破壞細菌細胞壁的蛋白的制備方法，包括如下步驟： (1) 、以單核細胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因組DNA為模板， 以lmol521-F和lmol521-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物；所述的引物為： lmol521-F：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG；(SEQIDNo:3) lmol521-R：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQIDNo:4)； (2) 、將步驟（1)中所得的PCR擴增產(chǎn)物用BamHI和HindIII進行雙酶切，得aut〇2 基因片段；然后將雙酶切后所得的aut〇2基因片段與載體pET-22b用T4DNA連接酶連接，得 連接產(chǎn)物；將所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，提取重組質粒，測序，得含有aut〇2基因 的重組質粒，將所得重組質粒命名為pET-22b-auto2 ; (3) 、用熱激法將pET-22b-aut〇2重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)， 將轉化后的細胞涂布在含100ug/mLAmp的LB固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)24-48h;取陽 性單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、150?220rpm條件下培養(yǎng)4?6h，加甘油分 裝，-20°C冰箱保存； (4) 、取步驟（3)所得的轉化菌株，接種于含100ug/mLAmpLB液體培養(yǎng)基，在37°C、 150?220rpm條件下過夜培養(yǎng)；次日按1 :80?120比例更換新鮮液體LB培養(yǎng)基，擴大 培養(yǎng)細菌〇D6(l(l到0. 5?0. 7時，添加異丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)到終濃度 0. 5mmol/mL，在26?30°C、130?160rpm條件下培養(yǎng)3?6h;收集菌液轉到離心管，在4°C、 4000?5000rpm下離心8?10min，收集沉淀細胞； (5) 、按1:3?5(g/ml)的比例向步驟（4)所得的沉淀細胞添加lx裂解緩沖液，得混 合液；將混合液置于冰水混合的水浴中超聲破碎儀（超聲功率為200W，超5s停5s)中破碎 至細胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇單辛基苯基醚（TritonX-100)至終濃度為 0. 1%，置于4°C冰箱中過夜；次日在4°C、8000rpm條件下離心15min，收集上清液； (6) 、將步驟（5)所得上清液用0. 22um濾膜過濾，取濾液；按0. 5?1. 5 :1的體積比比 例將濾液與50%Ni-NTA混合，在4°C、水平搖床上80rpm條件下結合3h，然后裝入色譜柱， 收集流出液；用lx漂洗緩沖液漂洗2?3個柱床體積后，更換為lx洗脫緩沖液用量為2個 柱床體積，分步收集洗脫緩沖液加入后的流出液，SDS-PAGE電泳分析檢測流出液的蛋白組 分；收集47. 5KD單一組分蛋白的流出液，棄去其他部分流出液； (7) 、用Amicon?Ultra-15超濾離心管濃縮步驟（6)所得的洗脫液，濃縮條件為4°C、 5000rpm離心20-30min;收集濃縮液轉移至14kDaMWC0的透析袋，在超純水中4°C透析 24h，中間更換用超純水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷凍過夜，冷凍干燥，得提純的AUT02 蛋白凍干粉末；將所得的凍干粉末蛋白在_20°C冰箱保存。
6. 按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟（3)中所述的LB固體培養(yǎng)基的 組成成分及其比例為：蛋白胨l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂10g/L，去離子水補 充到1L;所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其比例為：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化 鈉l〇g/L，去離子水補充到1L。
7. 按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟（5)中所述的裂解緩沖液的組 成成分為：1〇禮咪唑，5%的甘油，30〇1111似(：1，5〇1111恥11 2?04,0.11111?]\074118.0。
8. 按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟（6)中所述的漂洗緩沖液的組 成成分及其比例為：50mM咪唑，300mMNaCl，50mMNaH2P04，去離子水補充到lL，pH8. 0。
9. 按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟（6)中所述的洗脫緩沖液的組 成成分及其比例為：250mM咪唑，300mMNaCl，50mMNaH2P04，去離子水補充到lL，pH8. 0。
10. 權利要求1所述的蛋白在破壞細菌細胞壁方面的用途。
【文檔編號】C07K14/195GK104402979SQ201410696091
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權日:2014年11月26日
【發(fā)明者】李素芳, 潘家榮, 李喚弟, 張紅娟, 管峰 申請人:中國計量學院