非洲豬瘟病毒基因ii型毒株單克隆抗體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種非洲豬瘟病毒基因II型毒株單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。本申請(qǐng)的制備方法，包括用純化p54免疫蛋白對(duì)小鼠免疫，取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，用三種篩選抗原進(jìn)行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，再通過體內(nèi)或體外的方法制備單克隆抗體；三種篩選抗原包括，原核表達(dá)p54重組蛋白、真核表達(dá)p54重組蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示多肽。本申請(qǐng)，用三種篩選抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，特別是人工合成特別針對(duì)基因II型毒株的多肽作為篩選抗原，使制備的單克隆抗體能夠保障基因II型毒株的檢測(cè)率，減小了漏檢概率，提高了檢疫工作質(zhì)量和效率。
CCTCC No.C2014213
20141203
【專利說明】非洲豬瘟病毒基因 M型毒株單克隆抗體及制備方法和應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及單克隆抗體領(lǐng)域，特別是涉及一種特別針對(duì)非洲豬瘟病毒基因 II型 毒株的單克隆抗體，以及該單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，其臨床癥狀表現(xiàn)高熱、皮膚 充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血，致死率高達(dá)100%。但也有少數(shù)毒株感染家豬后，豬只出現(xiàn)亞 急性感染或者隱性帶毒。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織〔OIE〕將其列為A類動(dòng)物疫病，受到世界各國(guó) 的高度重視，我國(guó)尚未發(fā)生該病，我國(guó)已將此病規(guī)定為一類動(dòng)物傳染病，并作為動(dòng)物外來疫 病進(jìn)行研宄（孫懷昌.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999,21(21) :117-119)。
[0003] 近年來，非洲豬瘟已由非洲大陸橫跨到亞歐大陸的亞美尼亞、烏克蘭、俄羅斯，特 別是近年來高加索地區(qū)疫情嚴(yán)峻，對(duì)我國(guó)造成極大威脅。非洲豬瘟在西歐、南美洲和東歐的 發(fā)生已經(jīng)證實(shí)，非洲豬瘟一旦傳入將給養(yǎng)豬業(yè)帶來毀滅性的打擊。我國(guó)已將非洲豬瘟列入 2011年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃，確定新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、西藏等為重點(diǎn)監(jiān)測(cè) 省區(qū)（王宏燕，養(yǎng)豬，2011，4:81-82)。
[0004]目前尚無有效的疫苗，因此通過快速診斷非洲豬瘟抗體水平來判斷豬只的感染情 況，從而制定有效的控制和消滅措施，進(jìn)而及時(shí)準(zhǔn)確的診斷檢測(cè)和嚴(yán)格有效的封鎖撲殺等 措施是成功消滅非洲豬瘟的有效方法。非洲豬瘟抗體診斷方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA、 免疫印跡、免疫熒光等。目前，我國(guó)診斷非洲豬瘟的檢測(cè)試劑主要依賴進(jìn)口，擁有自主知識(shí) 產(chǎn)權(quán)的方法和試劑很少，加之周邊國(guó)家嚴(yán)峻的疫情形勢(shì)，我國(guó)迫切需要建立自己的檢測(cè)方 法和試劑。
[0005] 并且，現(xiàn)有的抗體診斷方法中，由于采用活病毒感染細(xì)胞來制備抗原導(dǎo)致在臨床 運(yùn)用時(shí)檢測(cè)程序無法標(biāo)準(zhǔn)化操作，且因操作活毒風(fēng)險(xiǎn)大，因此不適合推廣運(yùn)用。目前用于 檢測(cè)方法及試劑的開發(fā)多用基因工程方法表達(dá)抗原，主要集中在如p72、p54、p32、PP62、 A104R、B602L、K205R等基因的研宄，其中p72、p54等應(yīng)用較廣。而單克隆抗體的制備也主要 集中在這些結(jié)構(gòu)蛋白，由此建立的基于免疫學(xué)方法的商業(yè)試劑盒目前世界范圍內(nèi)僅四家。 但是，由于非洲豬瘟病病毒毒株間地域差異大，使得現(xiàn)有的商業(yè)試劑盒在使用過程中，容易 出現(xiàn)由某些毒株引起的非洲豬瘟病的漏檢現(xiàn)象。
[0006] 非洲豬瘟病毒基因 II型毒株是目前俄羅斯境內(nèi)流行的非洲豬瘟病毒，由于其地 緣關(guān)系，該毒株對(duì)我國(guó)具有重大威脅；而目前尚沒有特別針對(duì)該毒株的檢測(cè)試劑盒，現(xiàn)有的 商業(yè)試劑盒又存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。因此，根據(jù)我國(guó)與俄羅斯的地緣關(guān)系，為能準(zhǔn)確檢測(cè)到鄰國(guó) 俄羅斯境內(nèi)非洲豬瘟病毒，亟需一種特別針對(duì)俄羅斯境內(nèi)的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株 的檢測(cè)試劑或方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本申請(qǐng)的目的是提供一種新的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的單克隆抗體，以及 該單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 本申請(qǐng)一方面公開了一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法， 包括采用純化的p54免疫蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 制備雜交瘤細(xì)胞，然后采用三種篩選抗原對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌 抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，然后通過體內(nèi)或體外的方法制備非洲豬瘟病毒 基因 II型毒株單克隆抗體；三種篩選抗原包括，原核表達(dá)P54重組蛋白、真核表達(dá)p54重組 蛋白，以及人工合成的SeqID No. 1所不序列的多狀；
[0010] Seq ID No. I :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
[0011] 需要說明的是，本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于采用三種篩選抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選， 其中Seq ID No. 1所示序列人工合成的多肽，是特別針對(duì)非洲豬瘟病毒基因 II型毒株而設(shè) 計(jì)的篩選抗原，因此，由其篩選出的雜交瘤細(xì)胞株所制備的單克隆抗體能夠保障基因 II型 毒株的檢出率；但是，由于不同毒株之間具有一定的共性，并且俄羅斯境內(nèi)病毒毒株也是由 其它地區(qū)或國(guó)家傳入的，因此，本申請(qǐng)的單克隆抗體只是能夠保障所有俄羅斯境內(nèi)病毒毒 株，即基因 II型毒株都能夠被檢出，避免漏檢，但不排除其它地域的其它部分毒株也可以 檢出。
[0012] 還需要說明的是，本申請(qǐng)的關(guān)鍵是采用三種篩選抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選， 尤其是創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)了一條人工合成多肽，從而使得制備的單克隆抗體能夠特別有效的檢 測(cè)基因 II型毒株；至于P54免疫蛋白的制備和純化、原核表達(dá)P54重組蛋白的制備、真核表 達(dá)P54重組蛋白的制備、制備融合雜交瘤細(xì)胞的具體條件和步驟、雜交瘤細(xì)胞的免疫篩選 等都可以參考現(xiàn)有的常規(guī)方法進(jìn)行，在此不累述。篩選獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，單克隆抗體的體內(nèi)或體外的制備方法，也可以參考現(xiàn)有的常規(guī) 方法；例如，將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射動(dòng)物，如小鼠，采集腹水，分離純化單克隆抗體；或者， 通過體外培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞收集分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0013] 經(jīng)篩選獲得的可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為雜交 瘤細(xì)胞株SZCIQASFV2,其微生物保藏號(hào)為：CCTCC No. C2014213 ;分類命名為：雜交瘤細(xì)胞 hybridoma cell ;保藏時(shí)間為：2014年12月3日；保藏單位是：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏地址是：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。
[0014] 本申請(qǐng)中，p54免疫蛋白通過以下方式獲取，將pMD18-T-p54質(zhì)粒中p54基因片段 轉(zhuǎn)入pET-52b(+)質(zhì)粒，并在大腸桿菌DH5a中進(jìn)行可溶性表達(dá)，然后提取純化表達(dá)蛋白，即 P54免疫蛋白。
[0015] 本申請(qǐng)中，原核表達(dá)p54重組蛋白為利用pET-52b(+)質(zhì)粒在大腸桿菌中原核表達(dá) 后提取純化的P54重組蛋白；真核表達(dá)p54重組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達(dá)系 統(tǒng)真核表達(dá)獲得的P54重組蛋白。
[0016] 本申請(qǐng)的另一面公開了一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，該單克隆 抗體由保藏號(hào)CCTCC No. C2014213的雜交瘤細(xì)胞株SZCIQASFV2分泌產(chǎn)生。
[0017] 需要說明的是，實(shí)際上，本申請(qǐng)的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體就是由 本申請(qǐng)的制備方法制備獲取的。
[0018] 本申請(qǐng)的再一面公開了本申請(qǐng)的單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒基因 II型毒株 檢測(cè)試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0019] 本申請(qǐng)的再一面具體公開了一種含有本申請(qǐng)的單克隆抗體的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
[0020] 在以上研宄的基礎(chǔ)上，本申請(qǐng)還提供了一種分泌本申請(qǐng)的非洲豬瘟病毒基因 II 型毒株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其保藏號(hào)為CCTCC No. C2014213。
[0021] 需要說明的是，本申請(qǐng)的分泌非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞，實(shí)際上，就是非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法中篩選獲得的可穩(wěn) 定分泌抗非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0022] 由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于：
[0023] 本申請(qǐng)的制備方法，采用三種篩選抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，特別是針對(duì)非洲 豬瘟病毒基因 II型毒株設(shè)計(jì)并人工合成了一條多肽作為篩選抗原，使得制備出的單克隆 抗體能夠保障基因 II型毒株的檢測(cè)，從而可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出鄰國(guó)俄羅斯境內(nèi)非洲豬瘟病 毒，防止其傳入我國(guó)，提高了動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫及防控的工作質(zhì)量和效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中重組表達(dá)質(zhì)粒pET-52b(+)3C/LIC-p54的PCR鑒定結(jié)果；
[0025] 圖2 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo) 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果；
[0026] 圖3 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo) 表達(dá)產(chǎn)物的純化及免疫印跡分析結(jié)果；
[0027] 圖4 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中pFastBac_p54重組質(zhì)粒和Bacmid_p54重組粘粒的PCR鑒 定結(jié)果；
[0028] 圖5 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)p54重組蛋白 的Western-blot鑒定結(jié)果；
[0029] 圖6 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中非洲豬瘟病毒p54蛋白序列的比對(duì)分析結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 由于俄羅斯為我國(guó)鄰國(guó)，對(duì)流行其境內(nèi)的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的檢驗(yàn)檢 疫尤為重要；但是目前的檢測(cè)試劑盒并沒有特別針對(duì)基因 II型毒株而設(shè)計(jì)。為了保障基因 II型毒株的檢測(cè)質(zhì)量；本申請(qǐng)旨在創(chuàng)制出一株單克隆抗體，該株單抗能特別針對(duì)非洲豬瘟 病毒基因 II型毒株發(fā)生結(jié)合，保障其檢測(cè)率；以便基于該單抗制備ELISA檢測(cè)試劑、膠體金 檢測(cè)試劑等免疫學(xué)試劑來檢測(cè)非洲豬瘟病毒基因 II型毒株，用于我國(guó)邊境地區(qū)豬只疫病 的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)工作，嚴(yán)防鄰國(guó)俄羅斯非洲豬瘟疫情傳入我國(guó)。
[0031] 基于以上需求和目的，本申請(qǐng)?zhí)貏e設(shè)計(jì)并人工合成了一條特別針對(duì)非洲豬瘟病毒 基因 II型毒株的多肽，即Seq ID No. 1所示序列的多肽，用于雜交瘤細(xì)胞篩選，同時(shí)，采用 原核表達(dá)P54重組蛋白和真核表達(dá)p54重組蛋白進(jìn)行篩選，使得最終制備的單克隆抗體能 夠特別有效的對(duì)非洲豬瘟病毒基因 II型毒株進(jìn)行檢測(cè)。其中，人工合成的作為篩選抗原的 多肽，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)證實(shí)，其為基因 II型毒株所特有，理論上，可以特異性的保障基因 II型毒株的檢測(cè)，但如前面所說，由于毒株的同源性，不排除其他地域的其它部分毒株也可 以被檢出。
[0032] 在以上研宄的基礎(chǔ)上，本申請(qǐng)?zhí)峁┝朔侵挢i瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，及 其應(yīng)用?？梢岳斫?，本申請(qǐng)的單克隆抗體專門針對(duì)基因 II型毒株設(shè)計(jì)，對(duì)其具有良好的檢 測(cè)率，大大減小了漏檢的概率；因此，可以制備成試劑盒廣泛用于檢驗(yàn)檢疫工作；該試劑盒 除了含有本申請(qǐng)的單克隆抗體以外，當(dāng)然也含有其它酶聯(lián)免疫檢測(cè)的常規(guī)試劑，在此不累 述。
[0033] 下面通過具體實(shí)施例和附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅對(duì)本申請(qǐng) 進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0034] 實(shí)施例1免疫抗原的制備
[0035] 1.目的基因的擴(kuò)增與純化
[0036] 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從克隆有非洲豬瘟病毒p54基因的pMD18-T-p54質(zhì)粒中擴(kuò)增靶標(biāo) 基因；其中pMD18-T-p54質(zhì)粒由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存提 供，該質(zhì)粒中含有如Seq ID No. 10所示序列的552bp的p54基因。該引物的上游引物為 Seq ID No. 2所不序列，下游引物為Seq ID No. 3所不序列。
[0037] Seq ID No. 2 :5, -CAGGGACCCGGTTATACTATTCTCATTGCTATCG-3'
[0038] Seq ID No. 3 :5, -GGCACCAGAGCGTTCAAGGAGTTTTCTAGGTC-3'
[0039] 在引物合成公司合成以上引物后，以pMD18-T-p54質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng) 條件為 94°C lmin，58°C lmin，30cycles，72°C 5min。
[0040] 反應(yīng)結(jié)束后采用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒回收 純化目的DNA，即獲得靶標(biāo)基因。
[0041] 2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 在上述步驟獲得的靶標(biāo)基因中加入T4DNA聚合酶，22 °C孵育30min，75 °C孵育 20min，加入 3C/LIC 載體，22°C孵育 5min，加入 EDTA 后 22°C孵育 5min，構(gòu)建 pET-52b (+) 3C/ LIC-p54重組質(zhì)粒。
[0043] 3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定
[0044] 將上述步驟獲得的pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，并接種 于含100mg/L氨芐青霉素的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37°C培養(yǎng)12h，挑取單個(gè)菌落于含50mg/L氨芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序，檢測(cè)靶標(biāo)基因 的完整性。
[0045] 其中PCR鑒定分別采用了兩對(duì)引物進(jìn)行，第一對(duì)即擴(kuò)增靶標(biāo)基因的Seq ID No. 2 和Seq ID No. 3所示引物對(duì)，第二對(duì)引物為pET_52b(+)3C/LIC質(zhì)粒自帶的T7引物對(duì)。PCR鑒 定的凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，圖中，M泳道為DNAmarker，1泳道為第一對(duì)引物PCR擴(kuò)增的 電泳結(jié)果，2泳道為第二對(duì)引物PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果；可見，本例的pET-52b (+) 3C/LIC-p54 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，含有約462bp的靶標(biāo)基因，與理論預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中 含有462bp的p54基因，其序列與Seq ID No. 10所示序列相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了本例構(gòu)建的 pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質(zhì)粒含有我們所需要的p54基因。
[0046] 需要說明的是，p54基因的前端包含兩個(gè)啟動(dòng)子，而本例原核表達(dá)時(shí)只克隆了其中 一個(gè)啟動(dòng)子，即P54基因的前端90bp大小的信號(hào)肽核苷酸序列未有進(jìn)行克隆，所以第一對(duì) 即擴(kuò)增靶標(biāo)基因的Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為462bp，該基因 同樣包含了 P54蛋白的全部基因序列，只是未包含前端90bp的信號(hào)肽核苷酸序列；對(duì)本例 來說，不影響p54蛋白的原核表達(dá)。
[0047] 4.重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)
[0048] 制備BL21(DE3)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pET-52b(+)3C/LIC-p54轉(zhuǎn)化入 BL21 (DE3)細(xì)胞后，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，接種于2mL 含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至0D600值為0. 6 左右。加入終濃度為2mM的IPTG，培養(yǎng)2h后收取菌液。將培養(yǎng)液在4°C離心15min，去上 清，收集菌體。用PBS重懸沉淀，4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體， 冰上超聲破碎，4°C離心15min，收集上清。用變性不連續(xù)的SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行考馬 斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果。
[0049] 結(jié)果如圖2所示，圖中，M泳道為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-5泳道分別為0. 5mM，ImM， 2mM，4mM，8mM IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時(shí)后細(xì)菌裂解上清的分析結(jié)果；6泳 道為未加 IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時(shí)后細(xì)菌裂解上清的分析結(jié)果；7泳道為 ImMIPTG誘導(dǎo)BL21 (DE3)兩小時(shí)后細(xì)菌裂解上清的分析結(jié)果；8-12泳道分別為ImM IPTG 誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p541h，2h，3h，4h，5h后細(xì)菌裂解上清的分析結(jié)果；13泳道為未加 IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時(shí)后細(xì)菌裂解上清的分析結(jié)果；14泳道為ImMIPTG 誘導(dǎo)BL21 (DE3)兩小時(shí)后細(xì)菌裂解上清。結(jié)果顯示，本例構(gòu)建的pET-52b(+)3C/LIC-p54重 組質(zhì)粒能夠穩(wěn)定的表達(dá)所需的P54重組蛋白。
[0050] 5.表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
[0051] 將上述步驟培養(yǎng)的菌液，在4°C離心15min，去上清，收集菌體。用PBS重懸沉淀， 4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎，4°C離心15min，收 集上清。采用非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)目的蛋白的抗 原性。免疫印跡分析結(jié)果如圖3所示，圖中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品洗液，2為 目的蛋白純化樣品，3為樣品裂解液，4為目的蛋白免疫印跡分析；結(jié)果顯示，本例獲取的重 組蛋白確實(shí)為P54重組蛋白。
[0052] 6.表達(dá)產(chǎn)物的純化
[0053] 采用Ni柱親和層析方法純化冰上超聲破碎的上清液，純化產(chǎn)物即本例所需要的 免疫抗原，即P54免疫蛋白；經(jīng)檢測(cè)本例制備的p54免疫蛋白具有Seq ID No. 11所示序列。
[0054] 實(shí)施例2篩選抗原的制備
[0055] 本例采用了三種篩選抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，一是實(shí)施例1中作為免疫抗原 的原核表達(dá)P54重組蛋白，將經(jīng)過鎳柱純化后的p54免疫蛋白作為篩選抗原；二是利用人工 合成的方法合成的Seq ID No. 1所示多肽；三是利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達(dá)系統(tǒng)真核 表達(dá)P54重組蛋白，將感染重組桿狀病毒細(xì)胞超聲破碎上清作為篩選抗原。
[0056] 其中人工合成的Seq ID No. 1所示多肽是本例在比對(duì)了目前已經(jīng)公開的所有非洲 豬瘟病毒的P54蛋白序列的基礎(chǔ)上提出的，為所有基因 II型毒株共有的多肽序列，因此，其 作為篩選抗原獲得的單克隆抗體，理論上可以保障非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的檢測(cè)，避 免漏檢，對(duì)比結(jié)果如圖6所示。需要說明的是，本例制備的單克隆抗體，其目的是保障基因 II型毒株的檢測(cè)，其它毒株是否可以檢測(cè)出，并不在本例的關(guān)注范圍內(nèi)。
[0057] 抗原的具體制備如下：
[0058] Seq ID No. I ：PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT
[0059] 1.引物的合成
[0060] 根據(jù)pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達(dá)系統(tǒng)合成3組引物，第一組為p54基因擴(kuò)增引 物對(duì)，上游引物NT-T0P0-ASFV54F為Seq ID No. 4所示序列，下游引物NT-T0P0-ASFV54R 為Seq ID No. 5所示序列；第二組為對(duì)pFastBac/NT-T0P0-p54重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定 的引物對(duì)，其上游引物Polyhedrin forward primer為Seq ID No. 6所示序列，下游引物 SV40polyAreverse primer為Seq ID No. 7所不序列；第三組為對(duì)Bacmid_p54重組粘粒進(jìn) 行PCR鑒定的引物對(duì)，其上游引物pUC/M13Forward為Seq ID No. 8所示序列，下游引物pUC/ M13 Reverse 為 Seq ID No. 9 所不序列。
[0061] Seq ID No. 4 :5' -ATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3'
[0062] Seq ID No. 5 :5' -TTACAAGGAGTTTTCTAGGTCT-3'
[0063] Seq ID No. 6 :5' -AAATGATAAC CATCT CGC-3'
[0064] Seq ID No. 7 :5, -GGTAT GGCTGATTAT GATC-3'
[0065] Seq ID No. 8 :5' -CCCAG TCACGACGTT GTAAAACG-3'
[0066] Seq ID No. 9 :5, -AGCGGATAAC AATTT CACAC AGG-3'
[0067] 2. pFastBac_p54重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
[0068] 以與實(shí)施例1相同的pMD18T-p54重組質(zhì)粒作為PCR模板，用第一組引物，即p54 基因擴(kuò)增引物對(duì)p54基因進(jìn)行擴(kuò)增，用PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit 回收PCR產(chǎn)物，即獲得靶標(biāo)基因。取4 μ L靶標(biāo)基因與1 μ L pFastBac/NT-T0P0載體進(jìn)行連 接，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0069] 挑取陽(yáng)性克隆細(xì)菌，采用上述兩組引物進(jìn)行PCR鑒定：一是采用擴(kuò)增目標(biāo)基因的 引物對(duì)NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進(jìn)行PCR，即第一組引物。二是采用引物對(duì) NT-T0P0-ASFV54F和 SV40 polyA reverse primer。結(jié)果顯不，第一組引物擴(kuò)增得到約 552bp 的片段，與預(yù)期的552bp的p54基因相符；第二組引物擴(kuò)增得到片段大小約為758bp，說明 目的基因已經(jīng)連接到了載體適合位置，且連接方向正確，獲得pFastBac-p54重組質(zhì)粒。PCR 擴(kuò)增的部分凝膠電泳結(jié)果如圖4的A圖所示，其中，M為DNA Marker、泳道1和2均是第二 組引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，1為陰性菌落質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物、2為陽(yáng)性菌落質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0070] 3.重組粘粒Bacmid_p54構(gòu)建
[0071] 將10 μ L重組質(zhì)粒pFastBac_p54轉(zhuǎn)化E. coli DH IOBac感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化完后 往EP管中加入900 μ L LB培養(yǎng)液，37°C搖床225rpm培養(yǎng)4h。以室溫，LB培養(yǎng)液按1 :10、 I :100和I :1000三種濃度稀釋菌液，分別涂布在含有50 μ g/mL卡那霉素（以下簡(jiǎn)稱K+)、 7 μ g/mL慶大霉素（以下簡(jiǎn)稱G+)、10 μ g/mL四環(huán)素（以下簡(jiǎn)稱Tet+)、100 μ g/mL的X-Gal 和40 μ g/mL的IPTG的LB篩選平板上，37°C倒置培養(yǎng)48h。挑取至少10個(gè)白斑，接種到上 述組成的篩選平板上，劃線分單菌落，37°C倒置培養(yǎng)過夜，確認(rèn)是否仍為白斑。最終確定為 白斑的菌落重新接種到20mL的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液含有K+、G+和Tet+，37°C搖床225rpm 培養(yǎng)過夜。同時(shí)將Bacmid-CAT和Bacmid-HTA做同樣的操作，分別設(shè)為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。 取出1份菌液，采用大質(zhì)粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提 取Bacmid，其余菌液4°C保存。用兩組引物進(jìn)行PCR鑒定：一是采用第一組引物，即擴(kuò)增目 標(biāo)基因的引物對(duì)NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進(jìn)行PCR ;二是采用第三組引物， 即引物對(duì)PUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分凝膠電泳 圖如圖4的B圖所示，其中M為DNA Marker、3為第一組引物即引物對(duì)NT-T0P0-ASFV54F 和NT-T0P0-ASFV54R的擴(kuò)增產(chǎn)物、4為第三組引物即引物對(duì)pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse的擴(kuò)增產(chǎn)物、5為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，第一組引物擴(kuò)增得到約552bp的片段，與 預(yù)期的552bp的p54基因相符；第三組引物擴(kuò)增得到大小約為2988bp的片段，說明p54基 因已經(jīng)連接到了桿狀病毒載體上。鑒定完成后將4°C保存的余下菌液制備成甘油菌并凍存 在-80。。。
[0072] 4.重組桿狀病毒AcNPV_p54的獲得
[0073] 按 Cellfectin? II Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，將 Bacmid_p54， Bacmid-CAT，Bacmid-HTA脂質(zhì)化。脂質(zhì)化后轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，同時(shí)把沒有轉(zhuǎn)染Bacmid DNA 的正常Sf9昆蟲細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照。把細(xì)胞置28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約72h，期間注意觀 察細(xì)胞病變情況。大約36小時(shí)后細(xì)胞出現(xiàn)病變，72小時(shí)左右80%細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞 培養(yǎng)上清，其中含有重組桿狀病毒。上清再感染正常細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況，72小時(shí)左右 80%細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集上清和細(xì)胞。將感染重組桿狀病毒的細(xì)胞超聲破碎，提取上清作為 篩選抗原。
[0074] 對(duì)篩選抗原進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果圖圖5所示，圖中，M為蛋白質(zhì)marker、 1為正常sf9細(xì)胞蛋白、2為p54重組蛋白；結(jié)果顯示，上清液中含有預(yù)期的真核表達(dá)p54重 組蛋白
[0075] 實(shí)施例3單克隆抗體的制備
[0076] 1.動(dòng)物免疫
[0077] 將實(shí)施例1中制備的純化p54免疫蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合并乳化，皮下 注射7周齡BALB/c雌鼠，每只0. 2 μ g。14d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳 化，皮下多點(diǎn)注射。21d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳化，皮下多點(diǎn)注射。 在計(jì)劃和SP2/0細(xì)胞融合前3d進(jìn)行不加任何佐劑的加強(qiáng)免疫注射。
[0078] 2.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的建立
[0079] 取效價(jià)高的免疫小鼠，將其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按10 : 1比例混合，常規(guī) PEG融合法制備雜交瘤細(xì)胞。采用實(shí)施例2中制備的篩選抗原進(jìn)行間接ELISA方法檢測(cè)每 孔雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，并設(shè)大腸桿菌、Sf9細(xì)胞蛋白作為篩選抗原的陰性對(duì)照。
[0080] 取同時(shí)滿足實(shí)施例2中的三種篩選抗原間接ELISA結(jié)果強(qiáng)陽(yáng)性的孔，采用有限稀 釋法進(jìn)行亞克隆，連續(xù)5次的雜交瘤細(xì)胞稀釋和連續(xù)5次的單克隆抗體測(cè)試，并且最后3次 抗體測(cè)試，全部陽(yáng)性率孔穴達(dá)100 %，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0081] 3.單克隆抗體的制備
[0082] 取10周齡BALB/c雌鼠，腹腔注射液體石蠟，每只0. 5mL，l周后向腹腔注射 5父106個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。7-10(1后小鼠腹部明顯脹大，收集腹水并以200017^11離心 5min，上清液即為含抗非洲豬瘟p54蛋白單克隆抗體的腹水，即本例的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，一 80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0083] 4.單克隆抗體亞類的鑒定
[0084] 將用Sigma公司的單抗亞類鑒定試劑盒內(nèi)的試劑恢復(fù)至室溫，在裝有試紙卡的小 試管中先加入500 μ L緩沖液，再加500 μ L收集的小鼠腹水，輕輕晃動(dòng)小試管使試紙卡充分 浸沒。再加入ImL抗小鼠抗體膠體金結(jié)合物，保持試紙卡有字的一面始終浸在液體中，于室 溫下輕輕晃動(dòng)小試管，直到出現(xiàn)小點(diǎn)。經(jīng)鑒定，該株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為IgGl 亞類，與預(yù)期相符。
[0085] 5.單克隆抗體特異性鑒定
[0086] 分別米用豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、口蹄疫病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病病毒的 全病毒蛋白包被ELISA板，作為檢測(cè)抗原，采用本例制備的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單 克隆抗體作為被檢抗體，經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果顯示本例制備的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體與上述常見豬病病原均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。
[0087] 實(shí)施例4單克隆抗體的應(yīng)用
[0088] 采用實(shí)施例3所獲得的單克隆抗體建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒 不同地區(qū)來源毒株感染的豬只陽(yáng)性血清。具體實(shí)驗(yàn)如下：
[0089] 1.包被抗原的制備
[0090] 采用實(shí)施例1制備的純化抗原，測(cè)定蛋白濃度，用于包被ELISA板。
[0091] 2.單克隆抗體的制備
[0092] 采用上述制備的單克隆抗體，并標(biāo)記上辣根過氧化物酶（HRP)，一 80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0093] 3.競(jìng)爭(zhēng)ELISA操作程序
[0094] 包被：將6中所制備的P54抗原用包被液稀釋至2. 5 μ g/mL，分別加入到96孔酶 標(biāo)板中，每孔l〇〇yL，置4°C冰箱過夜，或37°C作用lh。
[0095] 洗板：取出酶標(biāo)板棄去液體，每孔加洗液200 μ L，洗板，共三次。最后一次倒置拍 干。
[0096] 封閉：每孔加封閉液100 μ L，37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)完成后洗板。
[0097] 加樣：樣品和弱陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照用稀釋液作1 :5稀釋，混勻，分別加 入ELISA反應(yīng)板，每孔50 μ L ;37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)完成后洗板。
[0098] 加酶標(biāo)單抗：將酶標(biāo)單抗稀釋成工作濃度，混勻。每孔加50 μ L，震蕩混勻。37°C 作用30min。作用完成后洗板。
[0099] 加底物液：每孔加100 μ L底物液，37°C作用lOmin。
[0100] 終止反應(yīng)：取出反應(yīng)板，每孔快速加入50 μ L終止液，在30min內(nèi)測(cè)其OD值。
[0101] 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光值。
[0102] 4.競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法結(jié)果判定閾值確定
[0103] 為確定競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)方法判定陰陽(yáng)性結(jié)果的臨界值，本實(shí)驗(yàn)采用20份陰性血清 作為被檢血清，按上述競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)程序進(jìn)行試驗(yàn)，然后測(cè)定每份血清的OD值。按照下 列公式計(jì)算該20份血清的阻斷率，即PI值：
[0104] PI (% ) = (1-樣品血清平均OD值/陰性血清對(duì)照平均OD值）xlOO%
[0105] 計(jì)算20份血清的平均PI值以及其標(biāo)準(zhǔn)差S ;按平均PI值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差S的值 作為陽(yáng)性結(jié)果判定臨界值；按平均PI值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差S的值作為陰性結(jié)果判定臨界值； 位于兩者間則判定為可疑樣品。
[0106] 5.競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法應(yīng)用于檢測(cè)田間樣本
[0107] 取來源于包括俄羅斯等不同國(guó)家的20份陽(yáng)性血清樣品，其中包括5份俄羅斯境內(nèi) 的基因 II型毒株感染豬只的陽(yáng)性血清樣品，按上述操作規(guī)程及判定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。
[0108] 6 結(jié)果
[0109] 6. 1競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法臨界值及判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0110] 本實(shí)驗(yàn)采用20份本地陰性血清作為被檢血清，該20份血清經(jīng)西班牙INGENASA公 司的非洲豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陰性血清，按上述優(yōu)化好的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法試 驗(yàn)程序進(jìn)行試驗(yàn)，然后測(cè)定每份血清的OD值。計(jì)算20份血清的平均PI值以及其標(biāo)準(zhǔn)差S。 按平均PI值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差S的值作為陽(yáng)性結(jié)果判定臨界值；按平均PI值加上2倍標(biāo)準(zhǔn) 差S的值作為陰性結(jié)果判定臨界值；位于兩者間則判定為可疑樣品，具體結(jié)果如表1所示。
[0111] 表1臨界值計(jì)算結(jié)果
[0112]

【權(quán)利要求】
1. 一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括采用純 化的p54免疫蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤 細(xì)胞，然后采用三種篩選抗原對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟 病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，然后通過體內(nèi)或體外的方法制備非洲豬瘟病毒基因 II型 毒株單克隆抗體；所述三種篩選抗原包括，原核表達(dá)P54重組蛋白、真核表達(dá)p54重組蛋白， 以及人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述p54免疫蛋白通過以下方式獲 取，將pMD18-T-p54質(zhì)粒中p54基因片段轉(zhuǎn)入pET-52b(+)質(zhì)粒，并在大腸桿菌DH5a中進(jìn) 行可溶性表達(dá)，然后提取純化表達(dá)蛋白，即P54免疫蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述原核表達(dá)p54重組蛋白為利用 pET-52b(+)質(zhì)粒在大腸桿菌中原核表達(dá)后提取純化的p54重組蛋白；所述真核表達(dá)p54重 組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)獲得的p54重組蛋白。
4. 一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體由保藏 號(hào)CCTCC No. C2014213的雜交瘤細(xì)胞株SZCIQASFV2分泌產(chǎn)生。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體由權(quán)利要求1-3 任一項(xiàng)所述的方法制備。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒基因 II型毒株檢測(cè)試 劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
7. -種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中 含有權(quán)利要求4或5所述的單克隆抗體。
8. -種分泌非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其保藏號(hào)為CCTCC No.C2014213。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括采用純化的p54免疫蛋白對(duì)小 鼠進(jìn)行免疫，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，然后采用三種篩 選抗原對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，對(duì)三種篩選抗原均為強(qiáng)陽(yáng)性的樣品進(jìn)行有限稀釋法 細(xì)胞亞克隆，連續(xù)若干次的雜交瘤細(xì)胞稀釋和連續(xù)若干次的單克隆抗體測(cè)試，并且最后三 次抗體測(cè)試全部陽(yáng)性率孔穴達(dá)100%的雜交瘤細(xì)胞，即獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒基 因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞； 所述三種篩選抗原包括，原核表達(dá)P54重組蛋白、真核表達(dá)p54重組蛋白，以及人工合 成的Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
【文檔編號(hào)】C07K16/08GK104497136SQ201410736095
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】曹琛福, 花群義, 呂建強(qiáng), 張彩虹, 劉建利, 宗卉, 唐金明, 楊俊興, 阮周曦, 陶虹 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心