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大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法

文檔序號(hào):3500374閱讀:704來源:國知局
大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm全毒素的體外制備方法,依次將LTm全基因eltm、LTA、LTB兩亞基的基因eltA(+)和eltB(+)以及除去兩亞基基因序列中的信號(hào)肽序列的eltA(-)和eltB(-)分別載入五個(gè)載體中,通過各個(gè)重組質(zhì)粒工程菌的表達(dá)量的對(duì)比,篩選出高表達(dá)量的工程菌,再通過亞基的體外裝配以及裝配條件的優(yōu)化進(jìn)而高效制備LTm。本發(fā)明主要運(yùn)用LTA和LTB各亞基分別優(yōu)化表達(dá)和高效高量制備的基礎(chǔ)上在體外進(jìn)行人工組裝成整體蛋白,以克服多亞基復(fù)雜蛋白對(duì)其整體進(jìn)行基因表達(dá)效能降低的問題,從而促進(jìn)疫苗黏膜免疫佐劑的高效制備。
【專利說明】大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,更具體地講,涉及一種大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm 的體外制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 各種傳染病的不斷發(fā)生,對(duì)現(xiàn)有的疫苗提出了新的挑戰(zhàn)。比傳統(tǒng)注射疫苗更加的 方便、快捷的粘膜免疫疫苗,已成為目前國內(nèi)研究的新方向。而安全有效的粘膜免疫佐劑正 成為粘膜免疫疫苗制備的關(guān)鍵。
[0003] 皮膚、粘膜是機(jī)體抵抗外界感染的第一道防線,皮膚主要通過物理隔絕的方式來 行使其保護(hù)功能,而粘膜除了物理隔絕作用外,還通過與之相關(guān)的淋巴組織,對(duì)外來物病原 體生相應(yīng)的應(yīng)答,行使免疫作用。臨床上,大約有70 %以上的細(xì)菌、病毒和寄生蟲都是通過 粘膜入侵機(jī)體,引發(fā)疾病。
[0004] 傳統(tǒng)的免疫方式(如肌肉、皮下及皮內(nèi)注射)能夠誘發(fā)全身的免疫應(yīng)答,卻不能產(chǎn) 生有效的粘膜的局部免疫應(yīng)答,不能有效控制粘膜感染。為加強(qiáng)局部粘膜免疫,激活粘膜免 疫應(yīng)答,使疫苗發(fā)揮最大作用,通過粘膜進(jìn)行接種就顯得十分重要。與傳統(tǒng)的注射疫苗相 t匕,粘膜疫苗的接種途徑與應(yīng)用方法更為簡(jiǎn)便、快捷。粘膜疫苗可通過口服和氣霧、點(diǎn)睛、滴 鼻等方式導(dǎo)入機(jī)體,易于讓病人接受,避免了注射引起的強(qiáng)烈刺激和傷口感染;不需專業(yè)醫(yī) 護(hù)人員的操作,便于大規(guī)模接種。更重要的是粘膜疫苗可以通過誘導(dǎo)粘膜和全身的免疫應(yīng) 答來提高疫苗的免疫效果。粘膜免疫可以誘導(dǎo)局部粘膜產(chǎn)生分泌性IgA(SlgA)、IgM和IgG 等保護(hù)性抗體,并且可以誘導(dǎo)其它部位的粘膜也產(chǎn)生slgA,這是粘膜免疫保護(hù)作用的主要 機(jī)制。此外,粘膜免疫還誘導(dǎo)粘膜CTL反應(yīng),產(chǎn)生分泌IFN- γ的⑶4+T細(xì)胞,這對(duì)于病原體 侵入的預(yù)防和清除是非常重要的。
[0005] 現(xiàn)有的研究表明,絕大多數(shù)非復(fù)合抗原,如:純蛋白質(zhì)抗原經(jīng)粘膜遞送時(shí)免疫原性 較弱,持續(xù)時(shí)間短,尤其是口服途徑,只有大量和反復(fù)接種后才可能引起免疫應(yīng)答,難以取 得理想的免疫保護(hù)效果,有時(shí)還會(huì)引起免疫耐受。尋找能夠增強(qiáng)疫苗粘膜免疫原性的粘膜 佐劑就成為粘膜疫苗開發(fā)中的關(guān)鍵問題。粘膜疫苗通過粘膜佐劑的輔佐與增強(qiáng)作用,才能 獲得持久的粘膜免疫應(yīng)答,粘膜佐劑的輔佐是抗原激起粘膜免疫應(yīng)答的一個(gè)重要條件。
[0006] 大腸桿菌熱敏腸毒素(Heat-labile Enterotoxin, LT)是腸毒性大腸桿菌 (Enterotoxic Escherichia coli, ETEC)產(chǎn)生的一種毒素,能夠引起人和其它哺乳動(dòng)物的 水樣腹瀉。除了毒性之外,LT全毒素以及分別的LTA、LTB亞基能有效啟動(dòng)局部免疫及全身 的體液免疫和細(xì)胞免疫,可以顯著增強(qiáng)宿主特異性免疫應(yīng)答,是一種潛在的粘膜免疫佐劑。 研究發(fā)現(xiàn),通過定點(diǎn)突變技術(shù),改變某些位點(diǎn)氨基酸可達(dá)到降低LT毒性的目的,使其真正 能夠應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。通過突變技術(shù)獲得的一系列減毒、低毒突變體LTm,不僅降低了 LT 的毒性、而且還保留了其強(qiáng)有力的佐劑功能,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)中都取得 了良好的效果。因此,采用基因工程技術(shù)高效制備減毒且可作為粘膜免疫佐劑的LT突變體 LTm及其亞基已成為國內(nèi)外研究普遍追求的目標(biāo)。
[0007] 編碼LT的基因全長1149bp,位于野生型產(chǎn)毒性大腸桿菌的質(zhì)粒上。該基因包括 LTA信號(hào)肽(18個(gè)氨基酸)的基因54bp、編碼LTA (240個(gè)氨基酸)的基因720bp、編碼LTB 信號(hào)肽(21個(gè)氨基酸)的基因63bp及編碼LTB (103個(gè)氨基酸)的基因309bp。在編碼LTA 的基因末尾與編碼LTB信號(hào)肽基因開頭處有一個(gè)4bp的重疊閱讀框,二者以共轉(zhuǎn)錄的方式 形成mRNA。
[0008] 完整的LT六聚體毒素,由一個(gè)有毒性的A亞基(約為29KD)和五個(gè)形成環(huán)裝的無 毒的B亞基(約為11. 5KD)所組成,國外的有的學(xué)者將其形象的比喻成"月球車"。在LT全蛋 白中,A、B亞基比例是1 :5,但是這并非是A亞基和B亞基在大腸桿菌內(nèi)真實(shí)得表達(dá)水平表 達(dá)量情況。在利用同位素示蹤法摻入對(duì)A、B亞基的分泌及全毒素裝配動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn), 在細(xì)胞周質(zhì)中的比例為I. 4-1. 7A/5B,其中絕大部分的B和A結(jié)合在一起,只有55% -60% 的A和B結(jié)合,而多余的A亞基則被菌體自身降解。B亞基被合成以后一分鐘內(nèi)就被分泌到 細(xì)胞的周質(zhì)中,約80%會(huì)迅速的聚集成寡聚體。B亞基雖然離啟動(dòng)子比較遠(yuǎn),但是B亞基比 A亞基表達(dá)量高很多。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析表明,B亞基有兩組分別由三個(gè)反平行的β片層 結(jié)構(gòu)、一個(gè)N末端的α螺旋和一個(gè)長的位于中心的α螺旋組成,N末端的α螺旋通過二 硫鍵與β 5片層連接。B5聚體與A亞基相鄰面平行,而中心的α螺旋從另一面向外延伸, 形成一個(gè)由50-60為氨基酸組成的小環(huán),按這種結(jié)構(gòu)合成的肽段可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗LT的抗 體。B 5五聚體間只有相鄰的單體間有相互作用,五聚體形成后,原表面39%都會(huì)包埋起來, 有利于維持Β5五聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中心的α螺旋有25個(gè)陽離子和15個(gè)陰離子,可以 形成一個(gè)強(qiáng)的親水區(qū),雖然B 5五聚體的離子中心里親水性很強(qiáng),但是只有幾個(gè)特異性結(jié)合 的相互作用力,即空洞中心兩頭的兩個(gè)疏水鍵和一個(gè)離子鍵。
[0009] 由于LT結(jié)構(gòu)的特殊性與復(fù)雜性,利用通常的基因工程技術(shù)制備實(shí)踐證明有較大 的困難。在采用大腸桿菌作為表達(dá)宿主制備LT的過程中,LT在大腸桿菌中的表達(dá)量非常 的低,只有1-5%。有研究表明,在LT基因正常表達(dá)形成LT蛋白的過程中,不到50%的LTA 亞基與LTB亞基進(jìn)行了結(jié)合裝配成AB5形式。通過調(diào)節(jié)LTA亞基和LTB亞基的表達(dá)量上的 比例關(guān)系來達(dá)到提高LT的產(chǎn)量已成為熱點(diǎn)之一。
[0010] 雖然LT突變體在粘膜免疫研究以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和 經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但是產(chǎn)毒性大腸桿菌自身合成的野生型LT以及通過基因工程方式在大腸桿菌、 酵母或植物中表達(dá)的LT全毒素、突變體LTm或其亞單位的產(chǎn)率都較低,從而限制了 LT及其 突變體LTm的規(guī)?;a(chǎn)和臨床應(yīng)用,這是本領(lǐng)域一個(gè)亟待解決的技術(shù)難題。
[0011] 本發(fā)明通針對(duì)其特殊的基因結(jié)構(gòu),在重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程中,通過一系列的載體 構(gòu)建新策略,先分別高效表達(dá)LTA、LTB亞基,然后在體外優(yōu)化的環(huán)境中高效裝配成整體結(jié) 構(gòu),來獲得可作為疫苗佐劑的突變體LTm全毒素,較好地克服了 LTm這一多亞基復(fù)雜蛋白對(duì) 其整體進(jìn)行基因表達(dá)效能降低的問題,從而促進(jìn)疫苗黏膜免疫佐劑的有效制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法。
[0013] 本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm在制備疫苗佐劑中 的應(yīng)用。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的,本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:大腸桿菌熱敏感毒素突變 體LTm的體外制備方法,其特征在于,在重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程中,通過定點(diǎn)突變除去eltm 序列中的Nde I酶切位點(diǎn),將整段基因載入載體中,隨后將包含信號(hào)肽序列兩亞基基因 eltA(+)和eltB(+)分別載入兩個(gè)載體中,最后將不含信號(hào)肽序列兩亞基基因 eltA(-)和 eltB(-)分別放入兩個(gè)載體之中,構(gòu)建 pET24a_eltm、pET24a_eltA(+)、pET24_eltB(+)、 pET24a-eltA(_)與pET24a-eltB(_)五個(gè)重組質(zhì)粒,通過各個(gè)重組質(zhì)粒工程菌的表達(dá)量的 對(duì)比,篩選出高表達(dá)量的工程菌,再通過亞基的體外裝配以及裝配條件的優(yōu)化進(jìn)而高效制 備 LTm。
[0015] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,其中所述大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm包括單突變體 LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、 LTR192G、LTG33D ;雙突變體 LTm(K63/R72)、LTm(R192G/L211A)以及 LTB 亞單位匕五聚體。
[0016] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,所述工程菌含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET24-eltA㈠ 和 pET24a_eltB(-)。
[0017] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,體外裝配時(shí)LTA與LTB物質(zhì)的量比例為1 :6 - 1 :8。
[0018] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,體外裝配時(shí)緩沖液pH為7. 8,緩沖液中NaCl為I. 2M。
[0019] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,體外裝配時(shí)持續(xù)時(shí)間為24小時(shí)以上,組裝體系存在的溫度為 4。。。
[0020] 作為一個(gè)優(yōu)選方案,緩沖液中加入5%甘油和0. 5M的L-精氨酸。
[0021] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的,本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:大腸桿菌熱敏感毒素突變 體LTm在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于,本發(fā)明公開一種疫苗黏膜免疫佐劑大腸桿菌熱敏感毒素突變 體LTm AB5六聚體及其亞基1五聚體的制備方法。本發(fā)明以突變體LTm眾多種類中的一種, 即LTm(R192G)和一種亞基LTB為例,進(jìn)行制備方法的說明,應(yīng)理解本法也適用于其他突變 體的制備。本發(fā)明主要運(yùn)用LTA和LTB各亞基分別優(yōu)化表達(dá)和高效高量制備的基礎(chǔ)上在體 外進(jìn)行人工組裝成整體蛋白,以克服多亞基復(fù)雜蛋白對(duì)其整體進(jìn)行基因表達(dá)效能降低的問 題,從而促進(jìn)疫苗黏膜免疫佐劑的高效制備。本發(fā)明成本低、制備方法簡(jiǎn)單、制備流程短,能 夠高效獲取LTA、LTB亞基蛋白,并且能夠適應(yīng)不同生產(chǎn)規(guī)模在體外條件下獲得突變體LTm 全毒素佐劑。本發(fā)明對(duì)于突變體LTm佐劑的規(guī)?;a(chǎn)提供了一條新的途徑,通過本發(fā)明 所述的方法可以在一定程度上滿足臨床應(yīng)用以及科研實(shí)驗(yàn)的需求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為大腸桿菌熱敏感腸毒素突變體LTm各亞基高效表達(dá)及其全毒素的制備方法 整體思路,通過重組質(zhì)粒的構(gòu)建,含有重組質(zhì)粒工程菌的發(fā)酵,兩種亞基蛋白的的純化以及 AB5六聚體和B 5五聚體蛋白的體外裝配。
[0024] 圖2為基因工程菌全菌體SDS-PAGE電泳圖(M為標(biāo)準(zhǔn)分子量maker) 1 :含有重組質(zhì) 粒pET24a-eltA(+)的工程菌誘導(dǎo)前;2 :含有重組質(zhì)粒pET24a-eltB(+)的工程菌誘導(dǎo)后; 3 :含有重組質(zhì)粒pET24a-eltA(_)的工程菌誘導(dǎo)前;4 :含有重組質(zhì)粒pET24a-eltA(_)的工 程菌誘導(dǎo)6小時(shí);5 :含有重組質(zhì)粒pET24-eltB(+)誘導(dǎo)前;6 :含有重組質(zhì)粒pET24-eltB(+) 的工程菌誘導(dǎo)6小時(shí);7 :含有重組質(zhì)粒pET24a-eltB(_)的工程菌誘導(dǎo)前;8 :含有重組質(zhì)粒 pET24a-eltB(_)的工程菌誘導(dǎo)6小時(shí)。
[0025] 圖3為含有不同重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在IPTG誘導(dǎo)下LTA、LTB亞基蛋白 占全菌體蛋白的百分比(%)。含有pET24a-eltA(-)重組質(zhì)粒LTA亞基的表達(dá)量為36.6% ; 含有pET24a-eltB(_)重組質(zhì)粒LTB亞基的表達(dá)量為42. 6% ;含有pET24a-eltA(+)重組質(zhì) 粒LTA亞基的表達(dá)量為6. 3% ;含有pET24a-eltB (+)重組質(zhì)粒LTB亞基的表達(dá)量為7. 2% ; 含有pET24a-eltm質(zhì)粒LTA亞基表達(dá)量為4. 9 %,LTB亞基的表達(dá)量為3. 3 %。
[0026] 圖4為含pET24a-eltA(_)重組質(zhì)粒工程菌表達(dá)、純化LTA亞基后SDS-PAGE電泳 圖(M標(biāo)準(zhǔn)分子量maker) I :20mM咪唑蛋白洗脫液;2 :50mM咪唑蛋白洗脫液;3-9 :400mM咪 唑蛋白收集液。
[0027] 圖5為含pET24a-eltB (-)重組質(zhì)粒工程菌表達(dá)純化LTB亞基后SDS-PAGE電泳圖 (皿標(biāo)準(zhǔn)分子量!^1?51')1:2〇1111咪唑蛋白洗脫液 ;2:5〇1111咪唑蛋白洗脫液;3-9:40〇1111咪唑蛋 白收集液。
[0028] 圖6為純化后的LTA亞基western blot檢測(cè)條帶。
[0029] 圖7為純化后的LTB亞基western blot檢測(cè)條帶。
[0030] 圖8為不同比例LTA與LTB簡(jiǎn)體復(fù)性后電泳圖。(M標(biāo)準(zhǔn)分子量maker) LTA與LTB 的比例分別為 I :(1 :1) ;2 :(1 :2) ;3 :(1 :3) ;4(1 :4) ;5 :(1 :5) ;6 :(1 :6) ;7 :(1 :7)。
[0031] 圖9為組裝反應(yīng)體系中LTA、LTB亞基比例對(duì)蛋白組裝的影響電泳圖。(M標(biāo)準(zhǔn)分 子量!1^1?51')1^六與1^8的比例分別為1 :(1:7);2:(1:6) ;3:(1:5);4(1:4) ;5:(1:3);6: (1 :2) ;7 :(1 :1)8 :(2 :1)
[0032] 圖10為組裝反應(yīng)體系中溶液PH對(duì)蛋白組裝的影響。
[0033] 圖11為組裝反應(yīng)體系中溶液離子強(qiáng)度對(duì)蛋白組裝的影響。
[0034] 圖12為亞基體外裝配結(jié)果SDS-PAGE電泳圖。(M標(biāo)準(zhǔn)分子量maker) I :LTA與LTB 亞基組裝后蛋白樣品未經(jīng)過高溫煮沸處理;2 :LTA與LTB亞基組裝后蛋白樣品經(jīng)過高溫煮 沸處理;3 :LTB亞基組裝后蛋白樣品未經(jīng)過商溫煮沸處理;4 :LTB亞基組裝后蛋白樣品經(jīng) 過高溫煮沸處理。
[0035] 圖13為凝膠層析色譜分析組裝后反應(yīng)體系中蛋白成分,其中第一個(gè)峰為AB5六聚 體,第二個(gè)峰為B 5五聚體,第三個(gè)峰為LTA亞基。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無 特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途 徑得到。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例 中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如 無特殊說明,均可從常規(guī)的商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)條件,通常按照 常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次或三次以 上重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。
[0037] 實(shí)施例1.生產(chǎn)LTm(R192G)及其亞基的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 單目標(biāo)基因表達(dá)載體 pET24a_eltm、pET24a_eltA (+)、pET24_eltB (+)、 pET24a-eltA(_)與 pET24a-eltB(_)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0039] 試劑與試劑盒:DNA聚合酶DNA Polymerase Pyrobest?,限制內(nèi)切酶(Nde I、 Xho I、BamH I、Sal I、Not I)、DNA 連接試劑盒 DNA Ligation Kit Ver. 2. I,瓊脂糖凝膠 回收試劑盒 TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0,質(zhì)粒抽提試 劑盒 TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0 購置于寶生物工程有限公 司(大連)。胰化蛋白胨、酵母提取物購置于Oxoid公司(英國)。硫酸卡那霉素購自 Sigma-Aldrich公司(美國)。其他的生化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純?cè)噭?br> [0040] 質(zhì)粒與菌株:質(zhì)粒 pET_24a (+) (Novagen,美國),E. coli DH5 a (Invirogen,美國) 作為質(zhì)粒擴(kuò)增菌株。
[0041] 試劑配制:LB液體培養(yǎng)基:稱取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g,用去 離子水定容到1L,121°C高壓滅菌20min,常溫保存。
[0042] LB固體培養(yǎng)基:稱取胰化蛋白胨lg、酵母提取物0. 5g、氯化鈉 lg,瓊脂粉I. 5g,用 去離子水定容到IOOml,121°C高壓滅菌20min,常溫保存。
[0043] 硫酸卡那霉素(50 μ g/ml):稱取Ig,溶于20ml ddH20,使用0· 22 μ m的無菌濾膜過 濾除菌,分裝,_20°C保存。
[0044] TAE電泳緩沖液(50X):稱取Tris堿242g,量取冰醋酸57. lml,0. 5M EDTA (ρΗ8· 0) 100ml,加去離子水定容至1L。
[0045] 瓊脂糖凝膠(3% ):稱取3g瓊脂糖,加入TAE(IX) 100ml,加熱溶解,待冷卻60°C 左右,加入Gel Red核酸染液(100X) lml,插好梳子,倒膠。
[0046] (l)pET24a_eltm重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0047] 引物設(shè)計(jì):
[0048] 正向引物:5' GGGAATTCCATATGAAAAATATAACTTTCAT 3,(SEQ ID NO. 1)
[0049] 反向引物:5' CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCGC3'(SEQ ID NO. 2)
[0050] 正向突變引物:
[0051] GTATACAGCCCTCACCCATACGAACAGGAGGTTTCTGCGTTA(SEQ ID NO. 3)
[0052] 反向突變引物:
[0053] ACCTAACGCAGAAACCTCCTGTTCGTATGGGTGAGGGCTGTA(SEQ ID NO. 4)
[0054] 點(diǎn)突變PCR反應(yīng)體系:正向突變片段反應(yīng)體系:模板1 μ 1,正向引物1 μ 1,反向 突變引物 I U 1,dNTP Mixture (2. 5mM) 4 μ 1,10XPyrobest Buffer 115 μ 1,Pyrobest DNA Polymerase (5U/μ I) 0· 25 μ I,ddH20 37. 75 μ I,總體積 50 μ 1。
[0055] 正向突變片段反應(yīng)體系:模板1 μ 1,正向突變引物1 μ 1,反向引物1 μ 1,dNTP Mixture(2. 5mM)4 μ 1,10XPyrobest Buffer 115 μ I, Pyrobest DNA Polymerase (5U/ μ 1)0. 25 μ 1,ddH20 37. 75 μ 1,總體積 50 μ 1。
[0056] 點(diǎn)突變PCR反應(yīng)條件:1、預(yù)變性:95 °C IOmin ;2、變性:95 °C 30sec,退火: 55°C 30sec,延伸:72°C lmin,30 個(gè)循環(huán);3、再延伸:72°C 10min。
[0057] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)兩突變片段擴(kuò)增情況,并使用凝膠回收試劑盒回收兩突變片 段。
[0058] 模板延伸PCR反應(yīng)體系:正向突變片段1〇μ 1,反向突變片段1〇μ 1,dNTP Mixture (各 2. 5mM) (2. 5mM)4 μ 1,IOXPyrobest Buffer II 5 μ 1,Pyrobest DNA Polymerase (5U/μ I) 0· 25 μ I,ddH20 20. 75 μ I,總體積 50 μ 1。
[0059] 模板延伸PCR反應(yīng)條件:1、預(yù)變性:95°C IOmin ;2、變性:95°C 30sec,退火: 55°C 30sec,延伸:72°C lmin,10個(gè)循環(huán);3、再延伸:72°C lOmin。本步反應(yīng)產(chǎn)物即作為下一 步PCR反應(yīng)的模板。
[0060] 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系:模板2 μ 1,正向引物1 μ 1,反向引物1 μ 1,dNTP Mixture (各 2. 5mM) (2. 5mM)4 μ 1,10XPyrobest Buffer 115 μ I, Pyrobest DNA Polymerase(5U/ μ 1)0. 25 μ 1,ddH20 36. 75 μ 1,總體積 50 μ 1。
[0061] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段擴(kuò)增情況,在IOOObp Maker對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)目標(biāo)條 帶,使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。將回收的eltm產(chǎn)物與載體pET24a(+)分別進(jìn)行雙 酶切。
[0062] 雙酶切 PCR 回收產(chǎn)物:eltm 基因片段 15μ I ;10XH Buffer 3μ l,Nde I 1. 5μ 1, Xho I I. 5 μ 1,dd H2O 9 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0063] 雙酶切載體:pET24a(+) 10μ 1,IOXH Buffer 3μ 1,Nde I I. 5 μ I, Xho I L 5 μ 1,dd H2O 14 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0064] 將酶切后的eltm片段和pET24a(+)載體在16°C恒溫水浴條件下,連接8小時(shí)。
[0065] 連接體系:eltm片段9ul,pET24a(+)載體2ul,連接試劑盒Solution I 9ul,總體 積 20ul。
[0066] 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5 α,挑取單菌,LB培養(yǎng)基試管搖菌過夜,落通過 菌液PCR驗(yàn)證是否有目標(biāo)條帶,將驗(yàn)證的含有目標(biāo)分子量條帶的菌液送樣測(cè)序?;驕y(cè)序 正確,pET24a-eltm重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0067] (2)pET24a_eltA(+)與 pET24_eltB(+)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0068] eltA(+)含有LTA亞基野生型信號(hào)肽基因序列
[0069] 正向引物:5, GGGAATTCCATATGAAAAATATAACTTTCAT 3,(SEQ ID NO. 5)
[0070] 反向引物:5' CCGCTCGAGTAATTCATCCCGAATTCTGTTAT3'(SEQ ID NO. 6)
[0071] eltB(+)含有LTB亞基野生型信號(hào)肽基因序列
[0072] 正向引物:5'GGAATTCCATATGAATAAAGTAAAATGTTATGT 3'(SEQ ID NO. 7)
[0073] 反向引物:5, CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCGC 3,(SEQ ID NO. 8)
[0074] PCR反應(yīng)體系:模板1μ 1,正向引物1μ 1,反向引物1μ 1,dNTP Mixture(2. 5mM)4 μ 1,10XPyrobest Buffer 115 μ I, Pyrobest DNA Polymerase (5U/ μ 1)0. 25 μ 1,ddH20 37. 75 μ 1,總體積 50 μ 1。
[0075] PCR 反應(yīng)條件:1、預(yù)變性:95°C IOmin ;2、變性:95°C 30sec,退火:55°C 30sec,延 伸:72°C lmin,30 個(gè)循環(huán);3、再延伸:72°C lOmin。
[0076] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段擴(kuò)增情況,并使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。 將回收的eltA(+)、eltB(+)產(chǎn)物與載體pET24a(+)分別進(jìn)行雙酶切。
[0077] 雙酶切PCR回收產(chǎn)物:eltA(+)、eltB(+)基因片段 15μ I ;10XH Buffer 3μ l,Nde I I. 5 μ 1,Xho I I. 5 μ 1,dd H2O 9 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0078] 雙酶切載體:pET24a(+) 10μ 1,IOXH Buffer 3μ 1,Nde I I. 5 μ I, Xho I L 5 μ 1,dd H2O 14 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0079] 將酶切后的eltA(+)、eltB(+)片段分別與pET24a(+)載體在16°C恒溫水浴條件 下,連接8小時(shí)。
[0080] 連接體系:eltA(+)、eltB⑴基因片段9ul,pET24a⑴載體2ul,連接試劑盒 Solution I 9ul,總體積 20ul。
[0081] 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5 a,挑取單菌,LB培養(yǎng)基試管搖菌過夜,落通過 菌液PCR驗(yàn)證是否有目標(biāo)條帶,將驗(yàn)證的含有目標(biāo)分子量條帶的菌液送樣測(cè)序?;驕y(cè)序 正確,pET24a-eltA(+)、pET24-eltB(+)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0082] (3)pET24a-eltA(_)與 pET24a-eltB(_)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0083] eltA(-)不含LTA亞基野生型信號(hào)肽基因序列
[0084] 正向引物:5'GGAATTCCATATGAATGGCGACAGATTATACCGTGCTG3'(SEQ ID NO. 9)
[0085] 反向引物:5' CCGCTCGAGTAATTCATCCCGAATTCTGTTAT,(SEQ ID NO. 10)
[0086] eltB (_)不含LTB亞基野生型信號(hào)肽基因序列
[0087] 正向引物:5, GGAATTCCATATGGCTCCCCAGACTATTAC,(SEQ ID NO. 11)
[0088] 反向引物:5, CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCGC(SEQ ID NO. 12)
[0089] PCR反應(yīng)體系:模板1 μ 1,正向引物1 μ 1,反向引物1 μ 1,dNTP Mixture (2. 5mM) 4 μ 1,10 X Pyrobest Buffer II 5μ1, Pyrobest DNA Polymerase (5U/ μ 1)0. 25 μ 1,ddH20 37. 75 μ 1,總體積 50 μ 1。
[0090] PCR 反應(yīng)條件:1、預(yù)變性:95°C IOmin ;2、變性:95°C 30sec,退火:55°C 30sec,延 伸:72°C 50sec,30 個(gè)循環(huán);3、再延伸:72°C 10min。
[0091] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段擴(kuò)增情況,并使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。 將回收的eltA(-)、eltB(-)產(chǎn)物與載體pET24a(+)分別進(jìn)行雙酶切。
[0092] 雙酶切PCR回收產(chǎn)物:eltA(-)、eltB(_)基因片段 15μ I ;10XH Buffer 3μ l,Nde I I. 5 μ 1,Xho I I. 5 μ 1,dd H2O 9 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0093] 雙酶切載體:pET24a(+) 10μ 1,10ΧΗ Buffer 3μ 1,Nde I I. 5 μ I, Xho I L 5 μ 1,dd H2O 14 μ 1,總體積 30 μ 1。
[0094] 將酶切后的eltA(-)、eltB(-)片段分別與pET24a(+)載體在16°C恒溫水浴條件 下,連接8小時(shí)。
[0095] 連接體系:eltA(-)、eltB(-)基因片段各9ul,pET24a⑴載體2ul,連接試劑盒 Solution I 9ul,總體積20ul。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5a,挑取單菌,LB培養(yǎng) 基試管搖菌過夜,落通過菌液PCR驗(yàn)證是否有目標(biāo)條帶,將驗(yàn)證的含有目標(biāo)分子量條帶的 菌液送樣測(cè)序?;驕y(cè)序正確,pET24a-eltA(-)、pET24-eltB(+)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0096] 實(shí)施例 2.重組質(zhì)粒 pET24a_eltm、pET24a_eltA (+)、pET24_eltB (+)、 pET24a-eltA(_)與 pET24a-eltB(_)蛋白的表達(dá)
[0097] 試劑與試劑盒:異丙基-B-D-硫代批喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalact opyranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素購自Sigma-Aldrich公司(美國),蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品 Premixed Protein Marker(Low),蛋白上樣緩沖液4XProtein SDS PAGE Loading Buffer, 購置于寶生物工程有限公司(大連)。其他的生化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純?cè)噭?br> [0098] 菌株和質(zhì)粒:E. coli BL21 (DE3) (Invirogen,美國)作為質(zhì)粒表達(dá)菌株。重組質(zhì)粒 pET24a_eltm、pET24a_eltA(+)、pET24_eltB(+)、pET24a_eltA(_)與 pET24a_eltB(_)為本 發(fā)明上述階段所構(gòu)建。
[0099] 試劑配制:
[0100] 5X蛋白電泳緩沖液(Tris-甘氨酸):Tris堿15. lg,甘氨酸94g,SDS 5g,加雙蒸 水定容至1L。
[0101] 15 %蛋白電泳分離膠:量取CldH2O 2. 3ml,30 %丙烯酰胺5. 0ml, Tris-HCI (ρΗ6· 8) 2. 5ml,10% SDS 100 μ 1,10% APS 100 μ 1,TEMED 100 μ 1,混合均勻。
[0102] 5% 蛋白電泳濃縮膠:量取 ddH20 3. 15ml,30 % 丙烯酰胺 0. 75ml,Tris-HCI (pH 6· 8) 0· 57ml,10 % SDS 45 μ I,10 % APS 45 μ I,TEMED 4· 5 μ I,混合均勻。
[0103] 考馬斯亮藍(lán)染色液:稱取考馬斯亮藍(lán)(R_250)2g,乙醇200ml,冰醋酸100ml,去離 子水750ml,濾紙過濾除去不溶顆粒,室溫保存。
[0104] 蛋白脫色液:量取乙醇200ml,去離子水750ml,冰醋酸50ml,混合均勻,室溫保存。
[0105] 使用質(zhì)粒抽提試劑盒將已構(gòu)建好且測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET24a_eltm、 pET24a-eltA(+)、pET24-eltB(+)、pET24a-eltA(_)與 pET24a-eltB(_)從克隆宿主菌 E. coli DH5a中抽提出來,分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。從轉(zhuǎn) 化平板上挑取單克隆,接種于含有5ml LB培養(yǎng)基(含50 μ Ι/ml卡那霉素)的試管中,37°C, 200rpm培養(yǎng)10小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液以1:100的比例轉(zhuǎn)接于含有100ml LB培養(yǎng)基(含 5(^1/1111卡那霉素)的搖瓶中,371:,200印111培養(yǎng)。待00600達(dá)到0.6時(shí)(約2.5小時(shí)), 加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度0. 5mM/ml),37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí)。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后,4°C,8000rpm 離心IOmin,棄去上清,收集菌體。
[0106] 通過SDS-PAGE全菌體蛋白電泳分析(附圖2),誘導(dǎo)后含有pET24a-e I tm重組 質(zhì)粒的工程菌幾乎看不到目標(biāo)條帶,而含有各自信號(hào)肽基因序列的pET24a-eltA(+)、 pET24-eltB(+)重組質(zhì)粒的工程菌可一看到目標(biāo)條帶,但是表達(dá)量很少,而不含有信號(hào)肽基 因序列的pET24a-eltA(_)與pET24a-eltB(_)重組質(zhì)粒的工程菌卻有極高的目標(biāo)蛋白表達(dá) 量,因此我們選擇pET24a-eltA(_)與pET24a-eltB(_)作為獲取LTA、LTB蛋白以及全毒素 體外組裝元件的菌株。
[0107] 實(shí)施例3、LTA、LTB蛋白的純化
[0108] 試劑與試劑盒:異丙基-B-D-硫代批喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactop yranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素購自Sigma-Aldrich公司(美國),Ni-NTA親和柱以及填 料購置于Biorad公司(美國),蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品Premixed Protein Marker(Low),蛋白 上樣緩沖液4XProtein SDS PAGE Loading Buffer,購置于寶生物工程有限公司(大連)。 Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購置于天根生化科技有限公司(北京)。其他的生化試劑屬于 國產(chǎn)常規(guī)的分析純?cè)噭?br> [0109] 試劑配制:組氨酸標(biāo)簽蛋白純化緩沖液:
[0110] 平衡緩沖液:50mM Tris-HCI,0. 5M NaCI,IOmM 咪唑,ρΗ7· 8。
[0111] 洗滌緩沖液:50mM Tris-HCI,0. 5Μ NaCI,IOmM 咪唑,Triton Χ-1001 %,ρΗ7· 8。
[0112] 溶解緩沖液:50mM Tris-HCI,I. 2M NaCI,IOmM 咪唑,8M 尿素,pH7. 8。
[0113] 結(jié)合緩沖液:50mM Tris-HCI,I. 2M NaCI,20mM 咪唑,8M 尿素,ρΗ7· 8。
[0114] 沖洗緩沖液:50mM Tris-HCI,I. 2Μ NaCI,50mM 咪唑,8Μ 尿素,ρΗ7. 8。
[0115] 洗脫緩沖液:50mM Tris-HCI,I. 2Μ NaCI,400mM 咪唑,8Μ 尿素,ρΗ7. 8。
[0116] 向離心后的菌體中加入平衡緩沖液,充分重懸菌體后,在冰浴的條件下進(jìn)行的菌 體超聲破碎。超聲條件:超聲功率130w,超聲3sec,間歇5sec,循環(huán)200次。待菌液破碎至澄 清狀態(tài)時(shí),可認(rèn)為破碎完全。超聲結(jié)束后4°C,12000rpm,超速離心15min,收集破碎后的上 清和沉淀,取少量樣品,通過SDS-PAGE電泳鑒定,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白主要存在于在超聲破碎液 的沉淀中,LTA蛋白和LTB蛋白主要以包涵體的形式存在,少量以可溶的形式表達(dá)。將沉淀 用包涵體洗漆緩沖液重懸,攪拌IOmin,在4°C,以12000rpm離心20min,收集沉淀;重復(fù)操 作兩遍,以除去包涵體中的膜結(jié)合蛋白與可溶性蛋白。用l〇ml-15ml包涵體溶解緩沖液重 懸沉淀,并不斷攪拌,促使包涵體溶解。待包涵體完全溶解后,將溶解液于4°C,以12000rpm 離心20min,收集上清。
[0117] 將裝有Ni-NTA親和樹脂的純化柱固定好,加入10倍體積的ddH20,沖洗除去純化 柱中的含20%乙醇的純化柱保存液。加入10倍柱體積的平衡緩沖液平衡純化柱。
[0118] 向純化柱中緩慢加入破碎后的上清液,可以觀察到蛋白會(huì)結(jié)合到純化柱上。待上 清液全部流過純化柱后,依次加入10倍柱體積的結(jié)合緩沖液與10倍柱體積的沖洗緩沖液, 以洗去純化柱上結(jié)合的其他雜蛋白。最后使用含有400mM咪唑的洗脫緩沖液將純化柱上吸 附的目標(biāo)蛋白洗脫下來,并將其收集到滅菌的EP管中,暫時(shí)保存于4°C。取少量收集樣品, 通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純化情況。通過Ni-NTA親和層析,LTA、LTB蛋白得到有效純 化,純化后的蛋白純度大于90% (附圖3、附圖4)。
[0119] 使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(考馬斯亮藍(lán)染色法),測(cè)定純化后LTA、LTB兩 種蛋白的濃度。通過測(cè)定兩種蛋白純化液在595nm處的吸光度,與使用BSA標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定繪 制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出兩種蛋白的濃度。
[0120] 實(shí)施例4、LTA、LTB免疫活性鑒定
[0121] 抗體與試劑:Anti-E· coli heat labile toxin A抗體、Anti-E· coli heat labile toxin B 抗體購置于 ABcam 公司(英國),Anti-mouse IgG、HRP-Iinked Antibody 購置于 CST公司(美國),PVDF膜購置于PALL公司(美國)WeStern及IP細(xì)胞裂解液、蛋白印跡 膜再生液、ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購置于生工生物工程股份有限公司(上海),其他的生 化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純?cè)噭?br> [0122] 試劑配制:
[0123] 轉(zhuǎn)膜緩沖液:稱取2. 9g甘氨酸,0. 37g SDS,5. 8g Tris,量取200ml甲醇溶于超純 水中,最后定各至1L,室溫保存。
[0124] 10XTBS :稱取NaCl 80g,Tris堿30g,加入800ml超純水,攪拌溶解,用調(diào)節(jié)pH到 7. 6,再補(bǔ)充蒸饋水定容至1L。
[0125] 20% Tween-20 :量取20ml Tween-20添加超純水至100ml,充分混勻,4°C保存。
[0126] TBST 緩沖液取 IOOrnl 10 X TBS,加入 900ml TBS,在加入 2. 5ml 20% Tween-20,充 分混勻,室溫保存。
[0127] 5%脫脂奶粉(封閉液):稱取5g脫脂奶粉,溶于100ml TBST緩沖液中,4°C保存。
[0128] LTA、LTB免疫印跡法
[0129] SDS-PAGE電泳結(jié)束后,將蛋白膠剝離,切去濃縮膠,用轉(zhuǎn)膜緩沖液洗滌3次,每次5 分鐘。裁剪與分離膠相同大小的PVDF膜及6張濾紙,PVDF膜先在甲醇中浸泡1分鐘,使其 活化,再與濾紙一起浸泡在電轉(zhuǎn)緩沖液中。依次將3張浸濕的濾紙整齊地鋪在陽極碳板上, 并用玻璃棒趕走氣泡,接著鋪上PVDF膜,再鋪上凝膠,最后再鋪上另外3張浸濕的濾紙,蓋 上負(fù)極板。打開電源,以2mA/cm 2的電流恒流轉(zhuǎn)移約1小時(shí)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,先將PVDF膜放在 TBST緩沖液中漂洗5分鐘,再放入5%的脫脂牛奶中,室溫封閉2小時(shí)。根據(jù)預(yù)染Maker的 位置,剪下PVDF膜上的目的條帶,放入己稀釋好的一抗溶液中,4°C下,輕輕搖晃孵育過夜。 孵育結(jié)束后,用TBST漂洗PVDF膜三次,每次5分鐘。將PVDF膜轉(zhuǎn)入稀釋好的二抗溶液中, 常溫水平搖晃1小時(shí)。取出PVDF膜,放入TBST的緩沖液中漂洗3次,每次5分鐘。拿出 PVDF膜,用濾紙吸掉多余液體,將含有蛋白的一面朝上,滴加己配制好的ECL試劑,暗處靜 置2分鐘。將PVDF膜放入凝膠成像儀內(nèi),選擇合適的曝光時(shí)間并拍照(附圖5、附圖6)。
[0130] 實(shí)施例5、LTm AB5全毒素以及LTB亞基B 5五聚體亞基的體外組裝
[0131] 試劑與試劑盒:透析袋(8000-14000)購置于Viskase (美國),其他的生化試劑屬 于國產(chǎn)常規(guī)的分析純?cè)噭?br> [0132] 蛋白組裝緩沖液:
[0133] 組裝緩沖液 I :50mM Tris-HCI,I. 2M NaCI,8M 尿素 ρΗ7· 8。
[0134] 組裝緩沖液 II :50mM Tris-HCI,l. 2Μ NaCI,5 % 甘油,IM L-精氨酸,4Μ 尿素 ρΗ7· 8。
[0135] 租轉(zhuǎn)緩沖液 III :50mM Tris-HCI,l. 2Μ NaCI,5%甘油,0. 5Μ L-精氨酸,2Μ 尿素 ρΗ7· 8。
[0136] 組裝緩沖液 IV :50mM Tris-HCI,0. 5Μ NaCI,5%甘油,ρΗ7· 8。
[0137] 體外人工組裝:將收集的LTA、LTB蛋白樣品按物質(zhì)的量比I :6的比例,加入9倍體 積的組裝緩沖液I,充分混合均勻。將混合均勻的蛋白液裝入透析袋中,用夾子將兩端夾緊, 放入100倍體積的組裝緩沖液II中,放置于4°C,處理8小時(shí),降低尿素的濃度,使其緩慢進(jìn) 行大分子自組裝。8小時(shí)后,將透析袋轉(zhuǎn)入100倍體積的組裝緩沖液III中,放置于4°C,處 理8小時(shí),進(jìn)一步降低尿素濃度,使其緩慢進(jìn)行大分子自組裝。8小時(shí)后,將透析袋轉(zhuǎn)入100 倍體積的組裝緩沖液IV中,放置于4°C,處理8小時(shí),完全除去蛋白溶液中的尿素,并完成最 后的組裝。
[0138] 本發(fā)明在LTm六聚體全毒素的體外組裝方面做了多組實(shí)驗(yàn),其中一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示,簡(jiǎn)單的將變性后LTA、LTB亞基按照一定比例的混合之后進(jìn)行復(fù)性,隨著反應(yīng)體系中加 入的LTB亞基的增加,能夠得到一定量的B 5五聚體,但是卻不能夠得到AB 5六聚體(附圖 8)。這組實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了,加入不同比例的LTA與LTB亞基對(duì)于形成^五聚體有極大的 影響,加入LTB亞基的量過少是不能夠形成^五聚體的,而是否能夠形成B 5五聚體對(duì)于形 成AB5六聚體是十分重要的。通過后續(xù)的實(shí)驗(yàn)的摸索,本發(fā)明在加入的LTA與LTB的物質(zhì) 的量比例之間做出了相關(guān)探索,選取LTA與LTB的比例為2:1、1 :1、1 :2、1 :3、1 :4、1 :5、1 : 6、1 :7,結(jié)果顯示,在LTA與LTB的比例為I :5-1 :7時(shí),LTA幾乎完全參與到了 AB5A聚體的 形成中去(附圖9),因此,本發(fā)明確定了組裝體系中的LTA與LTB的比例為1 :6。另外的幾 組實(shí)驗(yàn)顯示,組裝緩沖中PH和緩沖液離子強(qiáng)度也影響著緩沖體系中活性LTA、LTB亞基的量 以及多聚體的形成量。本發(fā)明分別考察了在PH7. 0-PH8. 4之間LTA與LTB比例為1 :6時(shí) 反應(yīng)體系中的可溶性蛋白的總濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在PH為7. 8-8. 0之間,反應(yīng)體系中的 總蛋白濃度最高,因此本發(fā)明確定了組裝緩沖液中的PH為7. 8。隨后。本發(fā)明考察了溶液 中離子強(qiáng)度對(duì)于溶液中總蛋白量的影響,本發(fā)明選取了離子強(qiáng)度為〇. 2mol/L-l. 6mol/L,八 個(gè)區(qū)間段,最終的結(jié)果顯示離子強(qiáng)度為I. 2mol/L時(shí),溶液中總蛋白的濃度最高,因此,本發(fā) 明選取了這一離子強(qiáng)度來配置復(fù)性緩沖液。另外組裝的持續(xù)時(shí)間與組裝體系存在的溫度也 對(duì)于多聚體的組裝有一定的影響,組裝的溫度為4°C時(shí),組裝緩沖液中LTA和LTB亞基的熱 運(yùn)動(dòng)降低,12個(gè)小時(shí)的時(shí)間不足以使多聚體形成,多聚體的形成需要24小時(shí)以上。本發(fā)明 在LTA和LTB的比例、緩沖液PH、緩沖液離子強(qiáng)度以及其他蛋白保護(hù)成分等方面進(jìn)行了的復(fù) 數(shù)次優(yōu)化,最終發(fā)現(xiàn),在LTA與LTB物質(zhì)的量比例為1 :6,緩沖液pH為7. 8,緩沖液中NaCl 為I. 2M時(shí)(附圖9、附圖10、附圖11),所獲得全毒素的濃度最高。再額外加入5%甘油,和 0. 5M的L-精氨酸后,更有利于可溶性蛋白的形成,避免無活性蛋白沉淀的形成。通過上面 一系列的優(yōu)化處理,最終獲得了具有AB 5A聚體的LTm全毒素活性結(jié)構(gòu)(附圖12),通過凝 膠層析色譜分析,其中LTm六聚體站到了總蛋白的60%以上(附圖13)。
[0139] 上述的組裝反應(yīng)體系也適用于只存在LTB亞基條件下,LTB亞基^五聚體的組裝。 獲得的B 5五聚體可以占到總蛋白量的50%以上。
[0140] 本發(fā)明所制備的LTm AB5A聚體或LTB B 5五聚體亞基可以配合相關(guān)抗原、半抗原 制備成混合制劑,可以經(jīng)皮膚、粘膜產(chǎn)生免疫效應(yīng)起到轉(zhuǎn)運(yùn)和協(xié)助抗原穿細(xì)胞膜發(fā)揮免疫 應(yīng)答作用。所述的蛋白分子主要用途為應(yīng)用于生化制藥等領(lǐng)域的經(jīng)皮膚與粘膜免疫的疫 苗,優(yōu)先應(yīng)用于"旅游者腹瀉"、各類流感粘膜疫苗、手足口病、口蹄疫等易于經(jīng)過呼吸道、消 化道、生殖道等與環(huán)境相曝露的黏膜與皮膚的傳染病疫苗。其對(duì)于消除和改善已有疾病,包 括慢性感染性疾病、腫瘤、過敏和自身免疫失調(diào)等也有一定的作用。
[0141] 本發(fā)明通過針對(duì)LTm特殊的基因結(jié)構(gòu),在重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程中,通過定點(diǎn)突變 除去eltm序列中的Nde I酶切位點(diǎn),將整段基因載入載體中,隨后又將包含信號(hào)肽序列兩 亞基基因 eltA和eltB分別載入兩個(gè)載體中,最后又將不含信號(hào)肽序列兩亞基基因 eltA 和 eltB 別放入兩個(gè)載體之中,構(gòu)建了 pET24a_eltm、pET24a_eltA(+)、pET24_eltB (+)、 pET24a-eltA(_)與pET24a-eltB(_)五個(gè)重組質(zhì)粒,通過這一系列的載體構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)了限制 其表達(dá)的因素,提高了各亞基的表達(dá)量,再通過含有pET24a-eltA(_)與pET24a-eltB(_)重 組質(zhì)粒的高表達(dá)工程菌,高效表達(dá)的LTA、LTB亞基體外裝配來獲得LT突變體全毒素。
[0142] 為了使含有重組質(zhì)粒的工程菌表達(dá)出的LTA、LTB亞基氨基酸序列中N端不含有其 他氨基酸殘基,使用重疊延伸PCR技術(shù),以大腸桿菌熱敏腸毒素基因 eltm(R192G)為模板, 在不改變氨基酸組成的條件下使eltm內(nèi)部的Nde I酶切位點(diǎn)序列突變,并獲得突變后的 eltm基因片段。突變后的eltm基因片段作為模板,采用分別帶有NdeI和Xho I酶切位點(diǎn) 及5'端保護(hù)堿基的引物,按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增全毒素基因 eltm、含有各自信號(hào)肽序 列的eltA⑴和eltB⑴基因片段,以及不含有信號(hào)肽序列的的eltA(-)和eltB(-)基因 片段,獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基的基因片段。
[0143] 利用基因克隆技術(shù),通過酶切、酶連、轉(zhuǎn)換等步驟,使目標(biāo)片段載入載體pET24a(+) 中,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET24a-eltm、pET24a-eltA (+)、pET24-eltB (+)、pET24a-eltA (-)與 pET24a-eltB (-),將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)后,采用常規(guī)方法IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
[0144] 由于重組蛋白C端攜帶了 6xHis標(biāo)簽,通過鎳親和純化柱純化獲得目標(biāo)蛋白,電泳 鑒定結(jié)果顯示獲得了較高濃度及高純度的LTA和LTB蛋白。將獲得的LTA、LTB亞基在體外 人工設(shè)置的蛋白組裝環(huán)境(LTA和LTB的比例、緩沖液PH、緩沖液離子強(qiáng)度、其他蛋白保護(hù)成 分)中完成六聚體的全毒素的組裝。
[0145] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0146] 1.本發(fā)明提供了一種大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm亞單位LTA、LTB的高 效表達(dá)策略,可以使目標(biāo)蛋白的N端不含有任何多余氣基酸殘基,含有重組表達(dá)質(zhì)粒 pET24-eltA(_)和pET24a-eltB(_)的工程菌,在合適的誘導(dǎo)劑作用下可高效表達(dá)LTA、LTB 蛋白,表達(dá)強(qiáng)度占菌體總蛋白的30% -50%。
[0147] 2.本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易操作,重組蛋白攜帶6xHis標(biāo)簽,使用鎳純化柱進(jìn)行親和純 化,其純化效率及純化純度明顯高于離子交換層析或凝膠層析等方法。
[0148] 3.本發(fā)明還提供了一種新的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm六聚體全毒素的制 備方法,可以適用于LT突變體(單突變體或者多突變體),也可以應(yīng)用于AB5家族其他毒素 的制備,甚至可以推廣至多亞基大分子蛋白的制備。
[0149] 4.本發(fā)明可以通過調(diào)控LTA、LTB亞基的比例,控制組裝環(huán)境,來調(diào)節(jié)亞基單體和 多聚體的生成比例,從而實(shí)現(xiàn)人工控制蛋白的組裝。
[0150] 5.本發(fā)明獲得的突變體LTm全毒素在溶液中相比于直接通過工程菌表達(dá)獲得的 全毒素表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。由于在人工組裝的條件下,單體和多聚體已經(jīng)形成了動(dòng)態(tài)平 衡,不會(huì)出現(xiàn)由工程菌直接獲得的全毒素的大量解聚情況。蛋白在4°C放置60天,電泳條帶 顯示未發(fā)生明顯變化。
[0151] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤飾,這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在于,在重組質(zhì)粒的構(gòu) 建過程中,通過定點(diǎn)突變除去eltm序列中的Nde I酶切位點(diǎn),將整段基因載入載體中,隨 后將包含信號(hào)肽序列兩亞基基因 eltA(+)和eltB(+)分別載入兩個(gè)載體中,最后將不含 信號(hào)肽序列兩亞基基因 eltA(-)和eltB(-)分別放入兩個(gè)載體之中,構(gòu)建pET24a-eltm、 pET24a-eltA(+)、pET24-eltB(+)、pET24a-eltA(_)與 pET24a-eltB(_)五個(gè)重組質(zhì)粒,通過 各個(gè)重組質(zhì)粒工程菌的表達(dá)量的對(duì)比,篩選出高表達(dá)量的工程菌,再通過亞基的體外裝配 以及裝配條件的優(yōu)化進(jìn)而高效制備LTm。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,所述大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm包括單突變體LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、 LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G、LTG33D ;雙突變體 LTm (K63/ R72)、LTm(R192G/L211A)以及 LTB 亞單位 ^五聚體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,所述工程菌含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET24-eltA (-)和pET24a-eltB (-)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,體外裝配時(shí)LTA與LTB物質(zhì)的量比例為1 :6 - 1 :8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,體外裝配時(shí)緩沖液pH為7. 8,緩沖液中NaCl為1. 2M。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,體外裝配時(shí)持續(xù)時(shí)間為24小時(shí)以上,組裝體系存在的溫度為4°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm的體外制備方法,其特征在 于,緩沖液中加入5%甘油和0. 5M的L-精氨酸。
8. 利用權(quán)利要求1一7任一所述的制備方法制備獲得的大腸桿菌熱敏感毒素突變體 LTm在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/245GK104498520SQ201410843982
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】馬興元, 劉地, 郭華, 鄭文云, 王曉麗, 李尚潔 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)
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