專利名稱：使用嵌合抗原的免疫診斷檢測法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于對感染或其他病態(tài)進行診斷和預后檢測的嵌合抗原。
各種免疫診斷檢測法都是基于抗原與其相應抗體之間的結合親和力。當形成抗原-抗體復合物時，可用各種檢測系統(tǒng)，如放射性同位素、熒光標記或酶如辣根過氧化物酶來檢測復合物。
使用免疫測定技術多年來已成為標準實驗室常規(guī)。所有各種檢測法的基本原則都是使標記的抗原與預選的抗體結合，然后測定結合的復合物的量。近年來，使用單克隆抗體代替多克隆抗體，提高了測定的靈敏度和特異性。然而，使用單克隆抗體代替多克隆抗體，并不能完全解決特定檢測的特異性或靈敏度問題。在抗體抗原復合物形成之后，仍然繼續(xù)競爭分子上的特定結合位點。
許多免疫檢測法依賴于結合復合物對最初用以結合到固相載體上的同一抗體的識別。因為競爭可利用的結合位點，所以在檢測的兩個關鍵點上依賴同一抗體，會進一步降低靈敏度。另外，缺乏抗體的特異性可導致出現(xiàn)“假陽性”，尤其是在這樣一些免疫檢測中，其中正在對疾病進展的各階段進行診斷，并且，與特定疾病階段有關的抗原決定基的識別具有重要意義。為了解決這個問題，已設計了“兩位點”或“夾心”免疫測定法。在這種類型的免疫檢測法中，有兩個抗體結合到抗原表面上，其中一個是放射標記的或已有某些其他檢測分子結合到該抗體上，而另一抗體則結合到固相載體上。這樣，減少了對分子上特定結合位點的競爭。夾心法則因使用高度純化的抗體而可進一步提高特異性。
對于某些疾病，早期診斷以及鑒定疾病的階段可能是十分重要的，其中一個例子就是獲得性免疫缺陷綜合癥(愛滋病)。HIV-愛滋病及相關疾病的致病因子，是還原病毒科的一個成員。存在有幾種包括人類Ⅲ型嗜T淋巴細胞病毒(T-LymphotropicVirus，HTLV-Ⅲ)、淋巴結病病毒(LAV)和愛滋病相關還原病毒(ARV)在內(nèi)的HIV的分離物。最近發(fā)現(xiàn)定名為2型HIV的相關還原病毒與西非的愛滋病有關(Cuyaderetal.，Nature326662，1987)。
HIV基因組的分子特征表明，該病毒具有與其他還原病毒一樣的整個gag-pol-env結構(Ratneretal.，Nature313277，1985;Wain-Hobsonetal.，Cell409.1985)。此外，它至少含有5個未見于較常見的還原病毒的基因Sor、tat3、art/trs、3′orf和R。
鑒于愛滋病的嚴重性，早期并準確地診斷HIV感染，以及由血庫中檢出并除掉HIV污染的樣品，是極其重要的。Callo等人在美國專利4，520，113號中公開了使用得自HTLV-Ⅲ的抗原檢測血清中存在的抗HTLV-Ⅲ抗體。Montagnier等人在EP-A-138，667號中公開了使用特定的LAV抗原檢測病毒感染。Papas等人在美國專利申請6，664，972號(德溫特登記號85-110268/18)中公開了HTLV-Ⅰ被膜蛋白編碼順序在大腸桿菌內(nèi)的表達，以及所表達的蛋白質在檢測HTLV-Ⅰ感染中的應用。Crowl等人(Cell，41979，1985)報導了HTLV-Ⅲ被膜蛋白基因(env)的某些部分在大腸桿菌內(nèi)的表達，以及這些蛋白質在檢測HTLV-Ⅲ感染中的應用。Casey等人(J。Virol。，55417，1985)報導了一種gag基因產(chǎn)物(一種定名為p24的HTLV-Ⅲ內(nèi)部結構蛋白)的純化方法，以及該蛋白在檢測HTLV-Ⅲ感染中的應用。
本領域的許多研究者從事在細菌中表達愛滋病還原病毒的各種抗原的研究。最近構建了具有HIV特定片段順序的一些新肽，用作接觸愛滋病病毒的檢測試劑(Cosand，美國專利4，629，783號;Capon等人，EP-A-187041號)。Steimer等人(J。Virology，589，1986)描述了使用來自愛滋病還原病毒聚合酶基因(pol)的核酸內(nèi)切酶區(qū)域的重組多肽，檢測被感染者血清抗體的方法。
Chang在EP-A-185，444中描述了一種用含有編碼env基因順序的HTLV-ⅢcDNA的重組載體轉化的細胞所表達的多肽，以及這種免疫活性多肽在檢測HTLV-Ⅲ中的應用。Dowbenko等人描述了愛滋病還原病毒p24gag蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達，及其作為診斷試劑的應用。Chrayeb等人(DNA，593，1986)和Steimer等人(Virology，150283，1986)還報導了HTLV-Ⅲ核心抗原在大腸桿菌內(nèi)的合成及其與人血清的免疫反應活性。
本發(fā)明的一個實施方案中描述了用于檢測針對特定抗原的抗體的免疫診斷藥盒(device)。該藥盒包括一種固相載體，與固相載體相結合的抗體及具有第一和第二抗原區(qū)的嵌合抗原，其中第一抗原區(qū)與已結合的抗體反應，但不與識別第二抗原區(qū)的抗體產(chǎn)生交叉反應。
本發(fā)明的另一實施方案是一種制備嵌合HIV抗原的方法，包括使大腸桿菌半乳糖激酶(galK)基因的一部分與HIV基因片段相融合，并將所得的融合基因片段引入一種生物體內(nèi)，然后培養(yǎng)該生物以使之表達嵌合HIV抗原。
本發(fā)明的另一實施方案描述了一種表達載體，包括一個啟動子及一個galK基因部分，后者鄰接一個不與galK起交叉反應的抗原的編碼順序。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，描述了一種檢測樣品中抗HIV抗體的方法。使樣品與結合到固相載體上的galK-HIV嵌合抗原接觸，使得只有含HIV特異性免疫球蛋白的樣品與嵌合HIV抗原結合，從而完成抗體的檢測。
本發(fā)明的嵌合抗原是一種融合蛋白，編碼該融合蛋白的順序包含編碼不能與目的蛋白產(chǎn)生交叉反應的基因產(chǎn)物的一部分大腸桿菌基因，以及與其融合的編碼目的蛋白的基因片段。目的基因片段可以是編碼與特定疾病或疾病狀態(tài)(如愛滋病、淋病、梅毒等性傳播的疾病、衣原體病或乙型肝炎)有關的蛋白質的基因片段。反映特定疾病或疾病狀態(tài)的其他特異性基因產(chǎn)物，如與特異性腫瘤、遺傳異常、其他細菌、真菌、病毒或寄生蟲性疾病(如由瘧原蟲、錐蟲、假絲酵母、畢赤酵母、沙門氏菌、假單孢菌等引起的疾病)有關的蛋白質，亦可作為融合蛋白而表達。
因為嵌合抗原的一部分特異地針對特定疾病或疾病狀態(tài)，所以用嵌合抗原來診斷或預后疾病是有利的。使用融合系統(tǒng)如大腸桿菌galk系統(tǒng)還可提供一種高水平表達嵌合抗原的方法，特別是當嵌合抗原不能由其未融合的基因片段來表達很差的情況下。嵌合抗原的galk部分可起到連接其他特異性蛋白質的“柄”的作用。由于其特異性，嵌合抗原還提供了一種純化蛋白質的有效方法?？梢允褂玫钠渌鹓alK樣“柄”包括流感NS-1蛋白質的某些部分、噬菌體λO蛋白、大腸桿菌β-半乳糖苷酶蛋白、或任何可在大腸桿菌或其他細菌、酵母、高等真核細胞等重要重組宿主內(nèi)很好表達的蛋白質。但在選擇“柄”時，必須使融合蛋白的柄部分具有免疫識別能力，但又不被樣品中的結合位點識別。
嵌合抗原在免疫診斷藥盒中是有用的，它不僅提供了對目的蛋白的高度特異性，而且提高了檢測方法的靈敏度。因為嵌合抗原的一部分不被樣品(如人或動物血液、血漿、血清、唾液、痰、排泄物或其他體液)所識別，所以目的蛋白的所有抗原決定基均可用來結合樣品。這一特性大大提高了特異性，并且是對使用特異性單克隆抗體的一種改進。使用單克隆抗體，有可能出現(xiàn)兩種單克隆抗體識別目的抗原上交疊的抗原決定基并因而競爭結合位點的情況。
由于galK柄部分所獨具的特異性，所以將嵌合抗原用于免疫診斷測定時，可以迅速地、高度特異地而且靈敏地檢查特定疾病，許多情況下還可能確定疾病的特定階段。當用于HIV抗體檢測時尤其如此，因為最近已有證據(jù)提示有或沒有抗特異性HIV抗原的抗體與疾病進展之間有某種相關性。
本發(fā)明的免疫診斷系統(tǒng)是一種俘獲免疫檢測法，其中結合到固相載體上的抗體具有特異于嵌合抗原一部分上的某些位點的結合位點。嵌合抗原能夠結合到已與固相載體結合的抗體上，同時仍留有尚未結合的所有來自特定疾病或疾病狀態(tài)致病因子的抗原部分的所有抗原決定基。與固相載體結合所必需的位點不同于用來結合樣品的位點。具體地說，嵌合抗原是這樣構建的即galK位點或所用的其他融合對象應使嵌合抗原不被待檢樣品識別。因此，衍生于疾病或疾病狀態(tài)的致病因子的嵌合抗原上的所有可利用的位點均可用于結合。
本發(fā)明的一個實施方案是使用該俘獲免疫診斷系統(tǒng)來檢測抗個別病毒蛋白的抗體和與HIV感染有關的由病毒誘導的蛋白質。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、“夾心免疫測定法”、競爭結合法和放射免疫法(RIA)等俘獲免疫檢測法中，使用了galK特異性抗體(多克隆或單克隆的)來檢測HIV的血清轉化作用(HIVSeroconversion)。俘獲檢測法的設計使得病人樣品最大限度地結合到與疾病的特定階段有關的特異性嵌合HIV抗原上，從而提供了一種快速而高度靈敏的診斷試驗。
在這一俘獲檢測法中，首先將galK特異性抗體連接到固相載體(如聚苯乙烯96孔平板或小球)上并洗去雜質。然后使純化或半純化形式的galK-HIV嵌合抗原與galK抗體相互作用。洗掉所有未結合的雜質。最后，使樣品(如人血清或其他體液)與通過galK抗體結合到載體上的嵌合的HIV抗原反應，并洗掉所有未結合的材料?？捎酶鞣N方法，如熒光分光光度法、使用酶如辣根過氧化物酶的比色法、用14C或125I標記的放射標記同位素或本領域內(nèi)已知的其他檢測系統(tǒng)，來檢測與結合的嵌合HIV抗原反應的人免疫球蛋白。
上述俘獲系統(tǒng)具有三重優(yōu)點(1)不必將galK-HIV抗原嵌合體純化至均一，因為galK特異性抗體將特異地連接在嵌合抗原的氨基末端上，并在洗滌后仍能使之固著在固相載體上，這樣即可除掉存在于嵌合蛋白制劑中的所有雜質;(2)因為嵌合蛋白通過其galK“柄”部分連在固相載體上，所以存在于分子上的所有HIV抗原決定基均可被病人樣品識別。與傳統(tǒng)的俘獲ELISA法(其中用于俘獲和檢測的單克隆抗體都是針對目的抗原的)相比較，上述特征提高了檢測法的靈敏度;(3)如果樣品中的抗體特異地針對特定抗原，便將只識別嵌合抗原，從而提高了特異性。
目的HIV抗原可作為翻譯融合體而得以表達，其中HIV抗原與大腸桿菌galK基因所編碼的蛋白的氨基末端區(qū)域相融合。選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)旨在使galK基因在提高基因片段之表達水平中起到最大作用，特別是當未融合的基因片段表達很差或不能表達時，這一點尤為重要。但亦可使用其他表達系統(tǒng)，如酵母(啤酒酵母)、鏈霉菌、昆蟲細胞(如果蠅屬昆蟲細胞)及高等真核細胞(哺乳動物細胞)。
可用來在大腸桿菌內(nèi)表達本發(fā)明嵌合抗原的表達系統(tǒng)的例子有流感病毒NS1(Youngetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA806105，1983)、λ噬菌體O蛋白(Rosenbergetal.，Meth.Enzymol.101123，1983)以及大腸桿菌β半乳糖苷酶蛋白(Bartusetal.，Antim.Ag.Ch.25622，1984)。在鏈霉菌中表達包括使用大腸桿菌galK基因(Brawneretal.，Gene40191，1985)、來自鏈霉菌gal操縱子的基因(Fornwaldetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA842130，1987)，以及鏈霉菌β半乳糖苷酶基因(Burnett.etal.，Microbiology，ed.Levin，Amer.Soc.Microbiol.，Washington，D.C.，1985)。在酵母中可使用大腸桿菌galK(Rosenbergetal.，GeneticEngineering，Vol.8，ed.Setlow，PlenumPress，1986)和3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因(Chenetal.，NucleicAcidsRes.128951，1984)實現(xiàn)表達。已在哺乳動物細胞中表達了大腸桿菌galK(Schumperlietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79257，1982);這種系統(tǒng)亦可用作翻譯融合表達系統(tǒng)。
大腸桿菌是生產(chǎn)用于診斷目的的嵌合HIV抗原所選用的生物體。在大腸桿菌中確實可迅速地得以克隆和表達，而且迄今已發(fā)現(xiàn)在某些情況下，與其他生物體如哺乳動物系統(tǒng)(中國倉鼠卵細胞)或酵母相比較，在大腸桿菌中可獲得更高水平的基因表達。此外，用大腸桿菌生產(chǎn)易于進行大規(guī)模發(fā)酵和蛋白質純化。
使用galK融合系統(tǒng)可以產(chǎn)生大量特異性HIV抗原。如此表達的特異性嵌合HIV抗原可用于任何已被人們掌握的免疫診斷檢測法如Western印跡法、點/槽印跡法、直接ELISA法或其他免疫檢測法中，以檢測HIV血清轉化。
實施例1中具體描述了構建大腸桿菌galK翻譯融合載體即質粒pOTSKF33的方法?？梢允褂脤嵤├兴龅募夹g制備其他融合載體。
pOTSKF33融合載體已被用來在大腸桿菌中將幾種外來基因產(chǎn)物過量表達為嵌合蛋白，如人β球蛋白、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、糖皮質激素受體及金屬巰基組氨酸三甲內(nèi)鹽(metallothionein)。如果沒有融合，這些蛋白質則很難表達。為此，該質?？捎糜谶^量表達各種HIV的基因產(chǎn)物。
最初的實驗所研究的來自HIV的基因有gag、pol和env基因，因為由這些基因編碼的蛋白最容易被病人血清識別。首先將HIVgag區(qū)翻譯成長約55千道爾頓(KD)的多聚蛋白質前體，然后將該前體加工成成熟的p17、p24和p15gag結構蛋白。
據(jù)信gag-pol區(qū)可通過交疊的gag和pol讀碼之間的翻譯移碼而翻譯成大的前體(Ratneretal.，Nature313277，1985)。gag-pol前體經(jīng)翻譯后加工，產(chǎn)生成熟的gag蛋白和包括反轉錄酶及核酸內(nèi)切酶在內(nèi)的pol區(qū)產(chǎn)物。
env區(qū)被翻譯成gp160前體多肽，并在兩個或兩個以上位點被加工。第一加工過程除去長約30個氨基酸的分泌信號肽;第二加工過程則產(chǎn)生膜外gp120區(qū)及gp41區(qū)，后者系由跨膜的疏水區(qū)和接在其后的親水性胞質固著粒(anchor)組成。
pOTSKF33融合載體具有強的并可調(diào)節(jié)的PL啟動子，它鄰接galK基因的56個密碼子長的部分，后者則直接連有適于基因融合(如與HIV基因的目的片段融合)的限制位點。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當插入表達質粒(融合載體pOTSKF66)中時，galK基因的253個密碼子長的部分亦可與目的基因融合，并導致高水平表達。
當使用pAS1系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)表達時，全長galK基因產(chǎn)物高水平積聚且穩(wěn)定(Rosenbergetal.，同上)。另外，發(fā)現(xiàn)異源基因產(chǎn)物與galK基因產(chǎn)物的氨基末端融合可產(chǎn)生穩(wěn)定的融合產(chǎn)物，即該產(chǎn)物不被降解、改變或失活?？梢垣@得高水平表達，即HIV衍生的抗原可占細胞總蛋白量的10%或更多，并可望通過大規(guī)模發(fā)酵及各種純化過程來大規(guī)模生產(chǎn)這些抗原。
由大腸桿菌產(chǎn)生的特異性HIV抗原可用于刺激與HIV蛋白上特異位點反應的抗血清產(chǎn)生。因此，所構建并表達的每種嵌合抗原均可用作產(chǎn)生定位抗體的因子。產(chǎn)生多克隆抗體的能力使它也有可能用最初由Kohler和Milstein(Nature256495，1975)所述的技術或其他細胞融合或轉化技術產(chǎn)生單克隆抗體。如此產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體可用于俘獲ELISA檢測法中(如Western印跡分析、點/槽印跡分析中所述)或用于親合純化。這些抗體亦可用于對病人樣品中的HIV抗原(游離抗原、游離病毒、感染的細胞)進行直接免疫檢測。
實施例下列實施例旨在進一步闡述而不是限定本發(fā)明。
實施例1galK翻譯融合載體pOTSKF33的構建pOTSKF33衍生自pAS1表達載體(Rosenbergetal.，同上)，包含鄰接有多連接子的大腸桿菌galK基因的一部分(56個密碼子)，其中三個翻譯讀碼內(nèi)均有適于融合的限制位點，另外包含各階段的終止密碼子和某些附加的克隆位點。其構建可分幾個步驟進行步驟1將pUC19的多連接子區(qū)插入pOTS34載體中用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ消化pAS1(Devareetal.，Cell3643，1984)的衍生物pOTS34，用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)處理以產(chǎn)生平末端，用限制性核酸內(nèi)切酶SphⅠ再消化。純化5251堿基對(bp)的大的BglⅡ-SphⅠ片段，并連接到由pUC19(Yanisch-Perronetal.，Cene33103，1985)分離純化的135bpPvuⅡ-SphⅠ限制片段上。所得質粒稱為pOTS-UC。
步驟2將得自pASK的部分galK表達單位插入pOTS-UC中用XmaⅠ消化pOTS-UC，用Klenow片段處理以產(chǎn)生平末端，用HindⅢ再消化。純化大片段并連接到由pASK分離純化的2007bpBClⅠ填平的HindⅢ片段上。所得質粒稱為pOTSKF45。
pASK質粒載體是pAS1的衍生物，其中整個galK編碼順序被插入到ATG起始密碼子之后。該galK順序的5′端與已確定的順序(Deboucketal.，NucleicAcidsRes.131841，1985)不同-pASK順序ATG.GAT.CCG.GAA.TTC.CAA.GAA.AAA...
-已確定的順序ATG.AGT.CTG.AAA.GAA.AAA...
pASK順序在ATG處含有一個BamHI位點(GGATCC)，而已確定的順序則沒有。
步驟3將攜帶翻譯終止信號的連接子引入pOTSKF45中用XmaⅠ和SalⅠ消化pOTSKF45，然后用Klenow處理產(chǎn)生平末端。然后經(jīng)用T4DNA連接酶連接，在XmaⅠ填平的和SalⅠ填平的位點之間引入5′-GTA。GGC。CTA。GTT。AAC。TAG-3′連接子，得到最終載體pOTSKF33。
實施例2galK-HIV蛋白融合基因的構建galK-p24gag融合的構建將567bp含p17gag后13個密碼子和p24gag1-177號密碼子的PvuⅡ-HindⅢ填入片段插入到pOTSKF33的XmaⅠ填入位點處，以在讀碼內(nèi)與galK的前56個密碼子融合。該片段的端點為PvuⅡ(689)和Hind(1256)(使用Ratner等(Nature313277，1985)的編號)。使用標準克隆技術由HTLV-Ⅲ(b)分離物(Hahnetal.，Nature312166，1984)的BH10克隆中分離該片段。galK-p24gag融合蛋白的氨基酸順序，使用氨基酸名稱的一字母代碼列示如下長度253個氨基酸殘基1MDPEFQEKTQSLFANAFGYPATHTIQAPGRVNLIGEHTDY NDGFVLPCAI51
GHSSQVSQNY
VHQAISPRTL NAWVKVVEEK101AFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLK ETINEEAAEW151DRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTN NPPIPVGEIY201 KRWIILGLNK IVRMYSPTSI LDIRQGPKEP FRDYVDRFYK
251 VN＊galK-p55gag融合的構建將含有P17gag(減去其前14個密碼子)、整個p24gag和p15gag前60個密碼子的1266bpClaⅠ-BglⅡ填入片段插入到pOTSKF33的StuⅠ位點處，以與galK的前56個密碼子產(chǎn)生讀碼內(nèi)融合。該片段的Ratner編號為ClaⅠ(374)和BglⅡ(1640)。galK-p55gag融合蛋白的氨基酸順序如下長度484個氨基酸殘基
galK-RTendo融合的構建將含有蛋白酶后9個密碼子、完整反轉錄酶基因及核酸內(nèi)切酶前半個基因(即1-141號密碼子)的2129bpHincⅡ-EcoRⅠ填入片段插入到pOTSKF33的SmaⅠ位點處，以與galK的前56個密碼子產(chǎn)生讀碼內(nèi)融合。此片段的Ratner編號為HincⅡ(2099)和EcoRI(4228)。
galK-RTendo融合蛋白的氨基酸順序如下長度769個氨基酸殘基
451KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPI501VGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNKGRQKVVPLTNTTNQKTELQAIYL551ALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQLIKKEKVYLA601 WVPAHKGIGG NEQVDKLVSA
IDKAQDEHEK YHSNWRAMAS651DFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKVIL701VAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTSA751 TVKAACWWAG
galK-p41env融合的構建將含有p41env基因29-129號密碼子的301bpRsaⅠ-HindⅢ填入片段插入到pOTSKF33的SmaⅠ位點處，以與galK的前56個密碼子形成讀碼內(nèi)融合。此片段的Ratner編號為RsaⅠ(7417)和HindⅢ(7718)。
galK-p41env融合蛋白的氨基酸順序如下長度160個氨基酸殘基1MDPEFQEKTQSLFANAFGYPATHTIQAPGRVNLIGEHTDYNDGFVLPCAI51
QLLSGIVQQQ NNLLRAIEAQ QHLLQLTVWG IKQLQARILA101VERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWD151
gal-p120env(N)融合的構建將含有大部分p160env的1790bpAsp718Ⅰ-HindⅢ填入片段插入到pOTSKF33的StuⅠ位點處，以與galK的前56個密碼子形成讀碼內(nèi)融合。用StuⅠ消化所得質粒并連接到所有三個讀碼中含翻譯終止信號的連接子(5′CTA。GTT。AAC。TAG3′)上。該構建體表達12-174號密碼子中p12env基因的氨基末端一半(N)。該片段的Ratner編號為Asp718Ⅰ(5928)和StuⅠ(6411)。
galK-p120env(N)融合的氨基酸順序如下長度224個氨基酸殘基1MDPEFQEKTQSLFANAFGYPATHTIQAPGRVNLIGEHTDYNDGFVLPCAI51
FCASDAKAYD TEVHNVWATH ACVPTDPNPQ101EVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCT151DLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDII201 PIDNDTTSYT
galK-p120env(C)融合的構建將含有p120env的末端部分和p41env的起始部分的PvuⅡ-HindⅢ填入片段插入到pOTSKF33的StuⅠ位點處，以與galK的前56個密碼子進行讀碼內(nèi)融合。用BglⅡ消化所得質粒(部分限制)，并連接到所有三個讀碼內(nèi)含有翻譯終止信號的連接子(5′CTA。GTT。AAC。TAG3′)上。該質粒表達來自258-437號密碼子的p120env的羧基末端(C)一半。該片段的Ratner編號為PvuⅡ(6662)和BglⅡ(7198)。
galK-p120env(C)融合的氨基酸順序如下長度243個氨基酸殘基1MDPEFQEKTQSLFANAFGYPATHTIQAPGRVNLIGEHTDYNDGFVLPCAI51
PNNNTRKSIR IQRGPGRAFV TIGKIGNMRQ101AHCNISRAKWNNTLKQIDSKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNC151GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTKGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQ201 EVGKAMYAPP ISGQIRCSSN ITGLLLTRDG
galK-HIV嵌合抗原的表達將含有galK-HIV抗原融合基因的各種pOTSKF33衍生物引入大腸桿菌AR120菌株內(nèi)，并按Mott等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA8288，1985)所述方法用萘啶酮酸處理進行誘導。亦可通過溫度轉換(32℃→42℃)，在那些對可熱誘導的缺陷性原噬菌體具有溶源性的大腸桿菌菌株中，誘導這些表達載體(Young等，同上)。
實施例3galK-HIV嵌合抗原的純化p55gag將100ggalK-p55gag誘導的大腸桿菌細胞沉降物重新懸浮于500ml含0.5mg/ml溶菌酶和各0.1mg/mlDNA酶和RNA酶的p55溶解緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.5)、5mMEDTA、1mMDTT、5%(V/V)甘油及0.1%硫二甘醇)中。持續(xù)攪拌下將混合物于室溫保溫15分鐘。以下各步驟均于4℃下進行。
使混合物通過壓力為4500psi的Menton-Gaulin壓力勻漿器2-3次制成勻漿。以10，000×g將勻漿離心30分鐘。所得沉淀重新懸浮于500ml含0.2%脫氧膽酸鈉(NaDOC)和1%TritonX-100(V/V)的p55溶解緩沖液中。將該混合物攪拌15分鐘后以10，000×g離心30分鐘。
將所得沉淀重新懸浮于500ml含1%TritonX-100(V/V)和0.5MKCl的p55溶解緩沖液中，攪拌15分鐘后以10，000×g離心30分鐘。
將所得沉淀重新懸浮于250ml含8M尿素的p55溶解緩沖液中并攪拌30分鐘。經(jīng)最后離心(10，000×g，30分鐘)即得到留在上清液中的溶解的產(chǎn)物。
在Superose12(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)柱上，于2M氯化鈲存在下層析，得到經(jīng)凝膠電泳及考馬斯亮藍染色測定其純度大于90%的制品。均一物質的產(chǎn)率為大約150mg/100g冷凍的大腸桿菌沉淀。當改用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶解時，p55gag融合蛋白仍然是可溶的(約1-3mg/ml)。
p41env按上述提純p55gag融合蛋白的方法由galK-p41env誘導的細胞中純化p41env融合蛋白，不同的是在第一次離心時以低速(1，000×g，20分鐘)離心混合物，小心除去上清并以27，000×g再次離心20分鐘。
在2M氯化鈲存在下于Superose-12柱上層析，結果表明，env融合蛋白在這些層析條件下表現(xiàn)有高分子量聚集物的行為。在8M尿素存在下于MonoS(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)柱上層析，得到純度約為90%的未結合部分。產(chǎn)率可達到約300mg/100g冷凍的大腸桿菌沉淀。當溶劑直接換成PBS時，p41env融合蛋白不能溶解。
p24gag上述兩種提取/純化方法，都得到純度約為70%的p24gag融合蛋白。p24gag融合蛋白的產(chǎn)率約為300mg/100g冷凍的、經(jīng)誘導的大腸桿菌沉淀。
因p120env(N)和(C)、以及RTendo融合蛋白也見于粗制細菌提取物的不溶部分中，所以可望使用大致相同的方法純化之。
實施例4
galK翻譯融合載體pOTSKF66的構建pOTSKF66衍生于pAS1表達載體(Rosenberg等，同上)，并包含鄰接有多連接子的一大部分大腸桿菌galK基因(253個密碼子)，在其所有三個翻譯讀碼中均有適于融合的限制位點、各期的終止密碼子以及某些附加克隆位點。
將pASK的一個761bpBamHⅠ-FspⅠ片段插入pOTSKF33的BamHⅠ位點與XmaⅠ填充位點之間，以構建該質粒。將pOTSKF66衍生物引入同一大腸桿菌菌株內(nèi)，并按誘導pOTSKF33衍生物的同樣方法(用萘啶酮酸、熱處理)誘導之。
pOTSKF66中與galK的253個密碼子于讀碼內(nèi)融合的基因片段可獲得高水平表達，與用pOTSKF33融合載體觀察到的表達水平相同。
實施例5酵母galK翻譯融合載體pCD192-SKF33的構建pCD192pCD192衍生于pYSK105(Gormanetal.，Gene4813，1986)。它可按下述兩個步驟構建步驟1用限制性核酸內(nèi)切酶NruⅠ和PvuⅡ消化pYSK105，并用T4DNA連接酶使之自身連接，以缺失1094bpNruⅠ-PvuⅡ片段。這一處理去掉了載體的唯一PvuⅡ位點，得到pYSK105-DNP。
步驟2切下攜帶galK編碼順序的pYSK105的1.2千堿基(Kb)EcoRⅠ片段，并用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)處理以填平EcoRⅠ末端。將平末端連接到具有順序
5′CCAGCTGG3′的PvuⅡ連接子上。所得質粒稱為pCD192，它將使插入唯一PvuⅡ位點的任何基因(含有ATG起始密碼子)得到CUP1定向表達。
pCD192-SKF33如所述，pCD192-SKF33衍生自pCD192酵母表達載體。pCD192-SKF33是一個以pBR322為基礎的穿梭載體，包含部分2微米復制起點、trp1選擇性標記、可用銅調(diào)節(jié)的CUP1啟動子，其后是大腸桿菌galK基因的一部分(56個密碼子)，后者鄰接有一個多連接子并在三個翻譯讀碼的任一個中均有適于融合的限制位點、各期的終止密碼子以及某些附加的克隆位點。按下述兩個步驟構建該載體步驟1pCD192的BamHⅠ、SmaⅠ/XmaⅠ、SphⅠ和SalⅠ位點的缺失用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ消化pCD192，用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)處理，產(chǎn)生平末端，并用T4DNA連接酶使之自身連接。這一處理缺失了位于pCD192中CUP1啟動子上游的286bp片段，從而除去了BamHⅠ、SmaⅠ/XmaⅠ、SphⅠ和SalⅠ位點，得到質粒pCD192-DBS。
步驟2將pOTSKF33的部分galK表達單位插入pCD192-DBS中用限制性核酸內(nèi)切酶PvuⅡ消化pCD192-DBS，在緊接CUP1啟動子下游處切斷之。將其連接到由pOTSKF33分離并純化的313bpNdeⅠ-XhoⅠ填入片段上。該片段包含ATG起始密碼子和大腸桿菌galK的56個氨基端密碼子，后者鄰接適于在所有三個翻譯讀碼內(nèi)進行融合的限制位點及各期終止密碼子。
實驗結果表明，pCD192-SKF33可用來提高那些在未融合時表達很差或不能表達的基因片段的表達水平，正如對大腸桿菌中的同一翻譯融合系統(tǒng)(pOTSKF33，實施例1)所表明的那樣。
實施例6galK-β球蛋白融合基因在酵母內(nèi)的構建和表達由pJKO6質粒(O′Donnell，ph.D.thesis，TempleUniversity，1987)中分離含有接在因子Xa蛋白酶識別順序(Ile-Glu-Gly-Arg)后面的人β球蛋白鏈全長編碼順序的1381bpNcoⅠ-XbaⅠ填入片段，并插入到pCD192-SKF33的SmaⅠ位點處，使之與galK的前56個密碼子產(chǎn)生讀碼內(nèi)融合。
用氯化鋰(LiCl)方法(Ito et al.，Bacteriol.153163，1983)將這個含galK-β球蛋白融合的pCD192-SKF33衍生物引入啤酒酵母BR10菌株。按下述方法加入CuSO4以誘導CUP1啟動子在含葡萄糖但不含色氨酸的基本培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)含pCD192-SKF33衍生物(攜帶galK-β球蛋白融合基團)的BR10細胞至對數(shù)期。然后加入CuSO4至終濃度為0.1mM。于30℃下繼續(xù)通氣1小時后，離心收集細胞并用水洗一次。用玻璃珠破碎細胞以制備提取物，然后以SDS-PAGE及免疫印跡法(用β球蛋白特異性抗體)進行分析。結果表明，與galK的56個密碼子融合后，β球蛋白基因產(chǎn)物的表達水平比未融合時高得多。
上面的描述和實施例充分公開了本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案。對于分子遺傳學及相關領域內(nèi)的普通技術人員來說，如在下述權利要求的范圍內(nèi)對所述方法作某些改變將是顯而易見的。
權利要求
1.一種用于檢測抗某種特定抗原的抗體的免疫診斷藥盒，包括a)一種固相載體，b)一種結合到固相載體上的抗體，c)一種具有第一和第二抗原區(qū)的嵌合抗原，其中第一抗原區(qū)可與結合的抗體反應，但不與識別第二抗原區(qū)的抗體產(chǎn)生交叉反應。
2.權利要求1的藥盒，其中第二抗原區(qū)代表病原微生物、蛋白質、病毒或細胞。
3.權利要求2的藥盒，其中第一抗原區(qū)代表不能識別動物體液中結合位點的蛋白質或蛋白質片段。
4.權利要求3的藥盒，其中第二抗原區(qū)是一種衍生自與特定腫瘤、遺傳異常及細菌、真菌、病毒或寄生蟲性疾病有關的蛋白質的抗原。
5.一種制備嵌合HIV抗原的方法，包括使galk基因的一部分與HIV基因片段融合，將所得的融合基因片段引入某種生物體內(nèi)，培養(yǎng)該生物體使之表達嵌合HIV抗原。
6.權利要求5的方法，其中嵌合HIV抗原在大腸桿菌中表達時以高水平積聚且穩(wěn)定。
7.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的p24gag編碼順序融合的galK基因編碼順序編碼的。
8.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的p55gag編碼順序融合的galk基因編碼順序編碼的。
9.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的反轉錄酶-核酸內(nèi)切酶(RTendo)編碼順序融合的galk基因編碼順序編碼的。
10.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的p14env編碼順序融合的galk基因編碼順序編碼的。
11.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的p120env氨基端一半(N)編碼順序融合的galk基因編碼順序編碼的。
12.權利要求5的方法，其中嵌合抗原是由與HIV的p120env羧基端一半(C)編碼順序融合的galK基因編碼順序編碼的。
13.一種檢測樣品中抗HIV抗體的方法，包括使樣品與結合到固相載體上的galK-HIV嵌合抗原接觸，從而只有含HIV特異性免疫球蛋白的樣品結合到HIV嵌合抗原上。
14.權利要求13的方法，其中嵌合抗原借助于galK區(qū)連接到固相載體上，從而使存在于該分子上的所有HIV抗原決定基均可被樣品識別。
15.一種載體，包括一個啟動子和galK基因的一部分，后者鄰接有不與galK起交叉反應的抗原的編碼順序。
16.權利要求15的galK翻譯融合載體，稱為galK-p24 gag。
17.權利要求15的galK翻譯融合載體，稱為galK-p55 gag。
18.權利要求15的galK翻譯融合載體，稱為galK-RTendo。
19.權利要求15的galK翻譯融合載體，稱為galK-p41 env。
20.權利要求15的galk翻譯融合載體，稱為galK-p120 env(N)。
21.權利要求15的galK翻譯融合載體，稱為galK-p120 env(C)。
22.用權利要求16、17、18、19、20或21的galK翻譯融合載體轉化的大腸桿菌。
23.一種嵌合HIV抗原，包括一個HIV抗原區(qū)和一個第二抗原區(qū)，第二抗原區(qū)不與識別HIV抗原區(qū)的抗體起交叉反應。
24.按照權利要求5-12中任一項的方法制備的嵌合HIV抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對感染或其他病態(tài)進行診斷和預后檢測的嵌合抗原。本發(fā)明提供一種含有嵌合抗原的藥盒、一種制備嵌合HIV抗原的方法、一種檢測樣品中抗HIV抗體的方法及一種表達載體。
文檔編號C07K16/00GK1030645SQ8810316
公開日1989年1月25日 申請日期1988年5月28日 優(yōu)先權日1987年5月29日
發(fā)明者克里絲汀·瑪麗·迪寶克, 馬丁·羅森堡 申請人:史密絲克萊恩貝克曼公司