專利名稱：還原甲硫氨酸亞砜殘基的方法
甲硫氨酸的亞砜氧化產(chǎn)物是自然界及合成肽化學(xué)中常見的衍生物。由于所述產(chǎn)物較易形成，使它成為通常存在于大多數(shù)由天然源分離出的含有甲硫氨酸的肽中的雜質(zhì)。
最為可取的是，采用經(jīng)過提純的肽，以避免易形成亞砜的貯藏條件〔Toennies，G.，和Callan，T.P.(1939)J.Biol.Chem.129，481〕。一經(jīng)氧化，降低了的母體硫醚的親核性使氨基酸變得對其他的改性不敏感。這是其應(yīng)用于肽合成〔Iselin，B.(1961)Helv.Chim.Acta44，61〕和蛋白質(zhì)改性研究〔Tashjian，A.Ontjes，D.，和Munson，P.L.(1964)Biochem.3，1175〕的基礎(chǔ)。除了在合成時(shí)需要進(jìn)行可逆保護(hù)外，一經(jīng)提純，甲硫氨酸的氧化傾向，使眾多研究人員選用其他氨基酸代替之〔Kempe，T.Chow，F(xiàn).，Peterson，S.M.，Baker，P.Hays，W.，Opperman，G.L′Italein，J.J.，Long，G.和Paulson，B.(1986)Biotechnology4，565;Krstenansky，J.L.，Trivedi，D.，Johnson，D.，和Hruby，V.(1986)J.Am.Chem.Soc.108，1696;Schalch，D.，Reisman，D.，Emler，C.，Humbel，R.Li，C.H.Peters，M.，和Lau，E.(1984)Endocrinology115，2490〕。
對含有甲硫氨酸亞砜的肽進(jìn)行選擇性和非破壞性還原是肽化學(xué)中經(jīng)常遇到的難題〔Kessler，W.，和Iselin，B(1966)Helv.Chim.Acta49，1330〕。最常用的方法是于高溫下，采用高濃度的還原劑，例如二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇來完成還原作用〔Houghten，R.A.，和Li，C.H.(1979)Anal.Biochem.98，36〕。該反應(yīng)的速度緩慢，整個(gè)過程通常產(chǎn)生不完全的還原。另一種可供選擇的還原方法是分別在下述溶液中，用甲硫醚或苯硫基甲烷，促進(jìn)氧交換。所述溶液是HCl水溶液〔Savige，W.E.，和Fontana，A.(1977)AdvinEnzymology47，453;Shechter，Y(1986)J.Boil.Chem.261，66〕，無水HF〔Tam.J.P.，Heath，W.F.，和Merrifield.R.B.(1983)J.Am.Chem.Soc.105，6442〕，1M的三氟甲磺酸-TFA〔Fujii，N.，Kuno，S.，Otaka，A.，F(xiàn)unakoshi，S.，Takagi，K.，和Yajami，H.(1985)Chem.Pharm.Bull.，Jpn.33，4587〕。在這些情況下，還原反應(yīng)較易進(jìn)行，并能保持不同程度的二硫化物的完整性。然而，值得注意的是，暴露在具有上述性質(zhì)的一類強(qiáng)酸下可能產(chǎn)生的副作用。
在相當(dāng)一段時(shí)間里已認(rèn)識到，鹵酸可用來催化，將氧從亞砜上轉(zhuǎn)移而成硫醚〔Scorrano.G.(1973)Acc.Chem.Res.6，132〕。Savige和Fontana(見上文)首先明確地描述了采用12NHCl和甲硫醚來還原游離的(即不是蛋白質(zhì)部分)甲硫氨酸亞砜的方法;還介紹了該方法應(yīng)用于氧化的溶菌酶衍生物的成功實(shí)例，其中所產(chǎn)生的副反應(yīng)最小。他們得出結(jié)論“該反應(yīng)的條件相當(dāng)嚴(yán)格，需要采用高濃度的HCl?！弊罱?，Shechter(見上文)報(bào)道，采用甲硫醚和不定濃度的HCl，對蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸亞砜進(jìn)行類似的還原。他推斷“當(dāng)HCl的濃度為4.4-10.7M時(shí)，反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，直至完成;而當(dāng)HCl的濃度較低(即1.0M)時(shí)，還原反應(yīng)極大地減慢。”在上述兩項(xiàng)研究中，均未對次要的改性進(jìn)行高性能分析。
一般認(rèn)為，甲硫氨酸亞砜在無水HF或1M的三氟甲磺酸-TFA中發(fā)生還原的機(jī)理不同于其在HCl水溶液中進(jìn)行還原的機(jī)理。據(jù)信，在這些無水強(qiáng)酸中，還原程度隨著混合物的酸度而變化，并不依賴于酸性陰離子的親核性。已報(bào)道的有效還原反應(yīng)，使不希望有的改性降到了最低水平。然而，由于溶劑的苛性，要求特別處理的預(yù)防措施，這樣，其用途就受到了嚴(yán)格的限制。
本發(fā)明旨在提供一種簡易且具有高度選擇性的方法，用以處理含有甲硫氨酸亞砜殘基的蛋白質(zhì)和肽，以便有選擇地將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基。具體地說，本發(fā)明方法是采用比先有技術(shù)方法中采用的更為溫和的反應(yīng)條件，進(jìn)行還原反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種這樣的方法，即對含有一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基的肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，以便將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基。該方法包括將所述肽或蛋白質(zhì)置于基本上無水的三氟乙酸反應(yīng)介質(zhì)中，所述反應(yīng)介質(zhì)含有約0.01M至約3M的有機(jī)硫化物、約0.01M至約3M的鹵酸，所述鹵酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
如上所述，本發(fā)明涉及一種選擇性地將含有甲硫氨酸亞砜殘基的蛋白質(zhì)和肽還原成其含甲硫氨酸殘基對應(yīng)物的方法。該方法主要可用于從成熟的、具有生物活性的產(chǎn)物的氧化前體產(chǎn)生成熟的、具有生物活性的產(chǎn)物。所述氧化前體常常是由于合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽時(shí)所采用的條件而形成的。在任一反應(yīng)步驟的過程中，包括對希望得到的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行合成和提純的過程，使用甲硫氨酸殘基氧化成亞砜形式的條件是會出現(xiàn)的。如果沒有可行的方法，用于將甲硫氨酸殘基恢復(fù)成其還原態(tài)，就很難獲得大量具有適當(dāng)尺寸的理想產(chǎn)物，至少在大規(guī)模生產(chǎn)成熟產(chǎn)物時(shí)是如此。
本發(fā)明的方法于溶劑三氟乙酸中實(shí)施。雖然不是絕對必需的，但最好在基本無水的條件下實(shí)施本發(fā)明方法，因此要采用基本上無水的三氟乙酸。采用“基本上無水的”三氟乙酸，并不意味著需要采取切實(shí)的措施，以排除存在的微量水份，而僅意味著應(yīng)避免加水。
將待還原的蛋白質(zhì)或肽與有機(jī)硫化物和鹵酸一起加到三氟乙酸中?？砂慈魏未涡蚣尤胨鲈噭?。但較理想的是，先將蛋白質(zhì)或肽溶解于三氟乙酸中，此后，加入有機(jī)硫化物，接著加入鹵酸。
加到三氟乙酸中的蛋白質(zhì)或肽的量一般應(yīng)使?jié)舛冗_(dá)到約0.01mg至約100mg/ml，較理想的是約0.1mg至約20mg/ml，更理想的是約1mg至約10mg/ml。
在三氟乙酸中，使蛋白質(zhì)或肽同有機(jī)硫化物和某種鹵酸反應(yīng)。除了活性硫醚部分外，可采用眾多的有機(jī)硫化物，唯一的要求是這些有機(jī)硫化物在本發(fā)明方法的條件下應(yīng)該是惰性的。典型的硫醚的實(shí)例包括甲硫醚、乙硫醚、乙基甲基硫醚、苯硫醚、二硫蘇糖醇、半胱氨酸等。優(yōu)選的硫醚是二烷基硫醚，其中每個(gè)烷基基團(tuán)含1至3個(gè)碳原子。本發(fā)明方法中采用的最優(yōu)選硫醚是甲硫醚。
將有機(jī)硫化物加到反應(yīng)混合物中，以產(chǎn)生約0.01M至約3M的濃度。較理想的濃度為約0.1M至約1M，更理想的濃度為約0.5M至約1M。
其余的必需試劑是鹵酸。鹵酸選自鹽酸、氫溴酸、氫碘酸。較好的鹵酸是鹽酸。反應(yīng)混合物中鹵酸的含量一般為約0.01M至約3M。較理想的是，鹵酸含量為約0.1M至約1M。在上述含量范圍內(nèi)，若被處理的蛋白質(zhì)或肽含一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，則最好在所述范圍的下限實(shí)施本發(fā)明的方法;若不存在二硫化物，則可在所述范圍的上限實(shí)施本發(fā)明的方法。
雖然，如上所述，最好在無水條件下實(shí)施所述方法，但由于加入了鹵酸，通常會在反應(yīng)混合物中摻入一定量的水份。因?yàn)樗名u酸的總量很少，并且它可通過以高濃度酸形式而摻入，所以，實(shí)際上僅有少量水被加到混合物中。按本發(fā)明的方法，這種加入量是完全可以允許的。
可在較寬的溫度范圍內(nèi)，例如一般為約4℃至約45℃，實(shí)施本發(fā)明方法。最理想的是在室溫(約20℃至約25℃)下進(jìn)行反應(yīng)。
還原反應(yīng)的發(fā)生通常相當(dāng)迅速。雖然反應(yīng)可持續(xù)很長時(shí)間，如6小時(shí)，但短至5分鐘也可完成反應(yīng)。通常，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間為約30分鐘至約90分鐘。
一旦還原反應(yīng)結(jié)束，可采用眾多公知的回收技術(shù)中的任何一種，收集所期望的產(chǎn)物。
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明的方法，并不是對發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1對H-Phe-Met(O)-Gly-Pro-Glu-Thr-NH2(FM(O)GPET-NH2)的處理將肽FM(O)GPET-NH(2.15mg)溶解于1.72ml無水三氟乙酸(TFA)中。將肽溶液分成每份80μl的十七份等分液，取其中一份等分液作為對照物。該對照物不含甲硫醚(DMS)或鹽酸(HCl)。將不同量的DMS加到其余的16份肽溶液中，使?jié)舛冗_(dá)到0.01M至1M再加入濃鹽酸，使HCl濃度達(dá)到0.01N至1N。開始時(shí)劇烈地?cái)嚢枞芤?，然后于室溫下使溶液保持靜止?fàn)?0分鐘。加入900μl0.1%的TFA水溶液，從而終止反應(yīng)。
采用Altex Ultrasphere ODS逆相柱(46×25cm)，經(jīng)高效液體色譜法(HPLC)測定化學(xué)改性的程度。在0.1% TFA水溶液中，于45℃下，通過以線性梯度增加的乙腈達(dá)到洗脫，進(jìn)行色譜法分離。根據(jù)214nm處的峰面積測定法進(jìn)行定量。經(jīng)過TFA/DMS/HCl處理的FM(O)GPET-NH2產(chǎn)生了肽，這種肽顯示出與合成的標(biāo)準(zhǔn)FMGPET-NH2相同的色譜滯留時(shí)間。研究結(jié)果顯示于以下表1中。
表1FM(O)GPET-NH2的還原作用HCl濃度，N DMS濃度，M1形成的剩余的FMGPET-NH2，% FM(O)GPET-NH2，%0001000.0109800.109501.0389.010495.01.011086.010.11184.011.012850.104960.1.0157410.10.154410.11.068331.004851.0.019401.00.19301.01.0950在無水的三氟乙酸中實(shí)施例2對GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH的處理將GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH(1.68mg)溶解于1.5ml無水三氟乙酸(TFA)中。先后將100μl甲硫醚(DMS)、10μl濃鹽酸加到900μl的肽溶液中。劇烈地混合溶液，于室溫下使之保持靜止?fàn)?。于加入鹽酸后的5、15、30、60分鐘時(shí)，各取出60μl反應(yīng)混合物溶液等分液。用氮?dú)鈱γ恳辉嚇舆M(jìn)行干燥;加0.1%TFA水溶液，將其稀釋至1.2ml。在60分鐘結(jié)束時(shí)，再次將濃HCl(7.6μl)加到其余的肽溶液(760μl)中，并再次劇烈地混合該溶液，然后于室溫下使之保持靜止?fàn)?。在開始加入HCl后的第65、75、90、120和180分鐘時(shí)，各取出60μl的等分液，如上所述，用氮?dú)飧稍?，?.1%TFA水溶液稀釋。
采用多孔層實(shí)心球C逆相柱(.46×10cm)，經(jīng)高效液體色譜法(HPLC)測定化學(xué)改性程度。在0.1%的TFA水溶液中，于45℃下，利用以線性梯度增加的乙腈達(dá)到洗脫，進(jìn)行色譜法分離。根據(jù)214nm時(shí)的峰高測定法進(jìn)行定量。經(jīng)TFA/DMS/HCl處理的GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH產(chǎn)生出一種肽，這種肽具有與合成的標(biāo)準(zhǔn)GRF(1-45)Met27，Lys45-OH相同的液體滯留時(shí)間。研究結(jié)果顯示于以下表2中。
表2GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH的還原作用時(shí)間(分鐘) 產(chǎn)生的GRF(1-45)Met27，Lys45-OH，%5641592309860936596759790951209318088
實(shí)施例3對胰高血糖素Met(O)27的處理將胰高血糖素Met(O)27(1.32mg)溶解于660μl 1M的DMS與無水三氟乙酸(TFA)的溶液中。取30μl的等分液，用氮?dú)鈱⑵涓稍?，并?.2ml 0.1%的TFA水溶液中加溶之，得到未處理的對照物。將肽/TFA/DMS的溶液分成六份。將不同量的濃HCl和色氨酸加到各份溶液中，劇烈地混合各溶液，然后于室溫下使溶液保持靜止?fàn)?0分鐘。加入色氨酸的目的在于使胰高血糖素的25位內(nèi)色氨酸的破壞程度減至最低。從各溶液取出各60μl的等分液，迅速用氮?dú)飧稍?，?.2ml 0.1%的TFA水溶液稀釋，進(jìn)而使反應(yīng)中止。在60分鐘結(jié)束時(shí)，再次將濃HCl加到其余的肽溶液中。劇烈地?cái)嚢杌旌衔?，然后于室溫下使之保持靜止?fàn)?。在第二次加入HCl的六十分鐘后，取每一溶液的等分液各60μl，按上所述用氮?dú)飧稍铮?2ml 0.1%的TFA水溶液稀釋。采用杜邦C8逆相柱(.46×25cm)，經(jīng)高效液體色譜法(HPLC)，測定化學(xué)改性的程度。在0.1M、pH為7的磷酸銨中，于45℃，利用增加線性梯度的乙腈達(dá)到洗脫，進(jìn)行色譜法分離。根據(jù)在214nm處的峰面積測定法進(jìn)行定量。經(jīng)過TFA/DMS/HCl處理的胰高血糖素Met(O)27產(chǎn)生了一種肽，這種肽顯示出與合成的標(biāo)準(zhǔn)胰高血糖素相同的色譜滯留時(shí)間。該研究結(jié)果如以下表3所示。
表3胰高血糖素Met(O)27的還原色氨酸還原時(shí)間HCl，濃胰高血糖其余的胰高血濃度，M1，2(分) 度，N 素收率% 糖素Met(O)，%060.13810060.14080120.22820120.22511060.16871060.166710120.258110120.259110060.1751710060.17615100120.2831100120.28111以相當(dāng)于胰高血糖素的摩爾濃度表示2DMS的濃度為1M實(shí)施例4對IGF-I，Met(O)59的處理將IGF-I，Met(O)59(0.90mg)溶解于0.90ml的無水三氟乙酸(TFA)中。將該肽溶液分成8份每份100μl的等分液。用氮?dú)鈱悠?、2、7和8干燥，然后進(jìn)行處理。除了將編號為偶數(shù)的試樣轉(zhuǎn)化成半胱氨?；撬猁}外，還使每對試樣(即1和2，3和4，5和6，7和8)都經(jīng)相同的處理，然后測定。將不同量的無水TFA、甲硫醚(DMS)和濃鹽酸加到試樣中。劇烈地混合該溶液，然后于室溫下使之保持靜止?fàn)?。在第一次加入鹽酸的30分鐘后，再次將濃鹽酸加到其中一些試樣中。在30分鐘或60分鐘結(jié)束時(shí)，通過用0.1%的TFA水溶液稀釋，或?qū)χ行匀芤哼M(jìn)行亞硫酸根絡(luò)分解(sulfitolysis)，使所有試樣的反應(yīng)中止。
采用杜邦C8Reliance逆相柱(.6×4cm)，經(jīng)高效液體色譜法(HPLC)測定化學(xué)改性程度。在0.1M、pH為7的磷酸銨中，于45℃下，通過增加線性梯度的乙腈達(dá)到洗脫，進(jìn)行色譜法分析。根據(jù)214nm處的峰面積測定法進(jìn)行定量。經(jīng)過TFA/DMS/HCl處理的IGF-I，Met(O)59產(chǎn)生一種肽，這種肽顯示出與合成的標(biāo)準(zhǔn)IGF-I相同的色譜滯留時(shí)間。下面的表4顯示了研究結(jié)果。
表4IGF-I Met(O)59的還原樣品TFAHCl濃DMS濃時(shí)間還原作IGF-I編號μl度，M度，M(分鐘)用，%收率，%110 0 0 0 0 -210 0 0 0 0 -3 100 .1 1 30 80 6724 100 .1 1 30 80 6935 100 .2 1 60 93 5626 100 .2 1 60 97 8637 0 4.4 .5 30 6.9 ＜128 0 4.4 .5 30 10 4.531對照物2鑒定為二硫化物3鑒定為S-磺酸鹽(在亞硫酸根絡(luò)分解后)
權(quán)利要求
1.一種處理含有一種或多種甲硫氨酸亞砜殘基的肽和蛋白質(zhì)以便將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基的方法，該方法包括使所述的肽或蛋白質(zhì)置于基本上無水的三氟乙酸反應(yīng)介質(zhì)中，所述介質(zhì)含有約0.01M至約3M的有機(jī)硫化物、約0.01M至約3M的鹵酸，所述鹵酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)或肽的濃度為約0.01mg/ml至約100mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中蛋白質(zhì)或肽的濃度為0.1mg/ml至20mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)方法，其中有機(jī)硫化物是二烷基硫醚，其中每一烷基基團(tuán)含1至3個(gè)碳原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中有機(jī)硫化物為甲硫醚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的方法，其中在反應(yīng)混合物中的有機(jī)硫化物的濃度為0.1M至1M。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在反應(yīng)混合物中的有機(jī)硫化物的濃度為0.5M至1M。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的方法，其中的鹵酸為鹽酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的方法，其中在反應(yīng)混合物中的鹵酸的濃度為約0.1M至約1M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將肽和蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸亞砜殘基還原成甲硫氨酸殘基的方法。該方法的特征在于將所述的肽或蛋白質(zhì)置于基本上無水的三氟乙酸反應(yīng)介質(zhì)中，該介質(zhì)含有約0.1M至約3M的有機(jī)硫化物、約0.01M至約3M的鹵酸，所述的鹵酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
文檔編號C07K1/06GK1031538SQ8810623
公開日1989年3月8日 申請日期1988年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月24日
發(fā)明者理查德·丹尼斯·迪馬奇, 哈倫·比爾·朗 申請人:伊萊利利公司