專利名稱：尿烷保護(hù)的氨基酸-n-羧酸酐類的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的N-保護(hù)的氨基酸-N-羧酸酐及硫代羧酸酐類化合物(即N-尿烷保護(hù)的氨基酸-N-羧酸酐類及N-尿烷保護(hù)的N-硫代羧酸酐類)、其制備方法及其在肽、多肽及蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域中的用途。
傳統(tǒng)上的制備具有給定序列的多肽的各種方法都是非常費事的-每加上一個氨基酸基團(tuán)后，都要分離出所得到的中間體。這使得合成復(fù)雜化了，并且由于產(chǎn)率低，發(fā)生外消旋和/或其它副反應(yīng)，使制備長鏈多肽和蛋白質(zhì)幾乎成為不可能。1963年，Merrifield(J.Am.Chem.Soc，85，2149)和Letsinger與Kornet(J.Am.Chem.Soc.，85，2045)提出采用不溶性聚合物載體使肽鏈生長。用此方法(統(tǒng)稱為固相肽合成法)可以在不分離出中間體的情況下“純化”生長中的肽鏈。
迄今為止，廣泛使用的多肽合成方法-無論是傳統(tǒng)的液相法還是固相法，都要求用偶聯(lián)劑或活化劑與一種其氨基已另外保護(hù)起來的氨基酸的羧基反應(yīng)，得到羧基活化的N-保護(hù)的氨基酸。然后可以按若干種方法利用這種活化的氨基酸促使肽鏈形成。例如，使已活化的保護(hù)的氨基酸直接與氨基酸、氨基酸酯或氨基酸的酰胺的游離氨基反應(yīng)而形成肽鏈。這是許多年來肽制備中所選用的方法。活化一步可以伴隨多種可能的副反應(yīng)。例如，使用二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)作活化劑時，活化分子可能會“重排”為無活性的N-?；?。
碳化二亞胺法的另一缺點是有不溶性脲類生成。這對于固相合成是特別麻煩的，并且對固相流系統(tǒng)(SolidPhaseflowsystems)來說實際上是不能接受的。在溶液相反應(yīng)中，這些脲類還造成難以解決的純化問題。
研究人員采用下述方法，已經(jīng)部分地解決了就地活化所造成的某些問題，即，先使DCC活化的N-保護(hù)的氨基酸與醇或酚(例如對硝基苯酚、五氯苯酚、N-羥基琥珀酰亞胺等)反應(yīng)，生成“活潑酯”，分離出“活潑酯”，純化，再使之與下一個氨基酸的游離氨基偶聯(lián)。但是此方法并非沒有缺點，因為釋放出的醇或酚可能參與或促進(jìn)其它副反應(yīng)，并且活潑酯的偶聯(lián)進(jìn)行緩慢，因而需要較長的反應(yīng)時間。
另一個常用方法是制成“對稱酸酐”，即，使兩當(dāng)量N-保護(hù)的氨基酸與一當(dāng)量DCC反應(yīng)，濾出生成的DCU，然后使該“對稱酸酐”與下一個氨基酸的游離氨基偶聯(lián)。此法除需使用兩倍量的昂貴的N-保護(hù)的氨基酸外，也有因產(chǎn)生脲類而帶來的問題。
有些研究人員近來開始使用偶聯(lián)后產(chǎn)生可溶性脲類的碳化二亞胺，但這類碳化二亞胺仍可引起生成N-?；宓闹嘏欧磻?yīng)。
人們已經(jīng)提出了各種N-保護(hù)基用于肽合成，但應(yīng)用最廣的一類N-保護(hù)基是尿烷類。人們普遍認(rèn)為，尿烷類的保護(hù)作用強，引起的外消旋少，制備容易，并且儲存時穩(wěn)定?？梢灾频脤θ跛?即叔丁氧羰基)、強酸(即芐氧羰基)、極弱酸(2-(對聯(lián)苯基)異丙氧羰基)、無水堿(即9-芴基甲氧羰基)等不穩(wěn)定的(labile)尿烷保護(hù)基。
尿烷保護(hù)的氨基酸常是這樣制備使烷基、芳基或芳烷基氯甲酸酯(或其它適宜地活化的甲酸酯或碳酸酯)與氨基酸反應(yīng);反應(yīng)在堿金屬氫氧化物或碳酸鹽存在下，在水/有機溶劑混合體系(即Schotten-Baumann條件)中進(jìn)行。將反應(yīng)混合物酸化后，用有機溶劑萃取尿烷保護(hù)的氨基酸，而所有副產(chǎn)物都留在水相中。結(jié)晶后，可按上文所述將這些化合物用于形成肽鍵。
用于形成肽鏈的一類人們特別感興趣的易反應(yīng)氨基酸衍生物是所謂N-羧酸酐類或N-硫代羧酸酐類，例如
式中R、R′通常是氫或普通氨基酸的側(cè)鏈(或保護(hù)起來的側(cè)鏈)，而Z是氧或硫。
氨基酸-N-羧酸酐(應(yīng)當(dāng)理解，本說明書及所附權(quán)利要求書中所謂“N-羧酸酐”包括N-硫代羧酸酐)是眾所周知的，并且易于與大多數(shù)游離氨基反應(yīng)。用于形成肽鍵的N-羧酸酐(NCA)，甚至保護(hù)起來的NCA的主要優(yōu)點是，它們是很強的酰化劑(見Peptides，Vol.9，P83)。與DCC或N-羥基琥珀酰亞胺(OSu)酯偶聯(lián)法相比，通過NCA一般能得到更高產(chǎn)率的肽，但NCA在肽合成上并未得到廣泛應(yīng)用，原因是它缺乏控制或限制偶聯(lián)反應(yīng)的能力。NCA一旦與氨基酸的游離氨基反應(yīng)，馬上放出二氧化碳，形成也含有游離氨基的二肽。此游離氨基隨后與另一個NCA反應(yīng)，生成三肽，等等。此反應(yīng)使得氨基酸N-羧酸酐類可以廣泛用于生成聚α-氨基酸，卻在實際上使它們不能用于形成序列多肽。Hirschmann等(TheControlledSynthesisofPeptidesinAqueousMedium，Ⅷ;ThePreparationandUseofNovelα-AminoAcidN-Car，boxyanhydrides.J.A.C.S.，93∶11，1971，P.2746-2774)已成功地利用氨基酸N-羧酸酐在水-有機溶劑體系中，在小心地控制反應(yīng)混合物的溫度、PH值、鹽分以及有機溶劑的情況下制成二肽和三肽。然而由于如上所述的NCA的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)，此方法僅適用于小肽的合成。此外，在使用由這些溶液相得到的產(chǎn)物制備較大的肽之前，必須充分地提純這些產(chǎn)物。
文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了多種N-取代的氨基酸N-羧酸酐類，例如N-甲基、N-芐基、N-乙?；-硝基苯硫基、N-咕噸基、N-4，4′-二甲基二苯甲基、N-三苯甲基等取代的氨基酸-N-羧酸酐類。已有人提出將這些取代的NCA的某一些用于序列肽的合成，尤其是用于固相肽合成，但其中沒有一種被肽化學(xué)家接受而一般地用于肽合成。
Kricheldorf(Angew.Chem.Acta85，86-87，(1988))提出采用鄰硝基苯硫基(NPS)(o-nitrophenylsulfenyl)取代的NCA合成序列肽。這些取代的NCA是這樣制備的使鄰硝基苯硫基氯與一種N-羧酸酐在三乙胺存在下反應(yīng)。此后有人證明，三乙胺能促使NPS-NCA發(fā)生外消旋。另外，由于三乙胺具有使NCA發(fā)生寡聚的作用，因此必須在NPS-NCA合成中采用非常嚴(yán)格的反應(yīng)條件(即，溫度低于0℃，三乙胺必須非常緩慢地加到反應(yīng)混合物中)。Halstrom等人(Z.Physiol.Chem.355，82-84，(1974))因而提出通過使碳酰氯與NPS-氨基酸反應(yīng)來合成NPS-NCA，但產(chǎn)率卻很低(約20%)。NPS-NCA制得后難以貯存，它在縮合時易于脫去保護(hù)基，從而引起多重偶聯(lián)及其它副反應(yīng)。所得NPS保護(hù)的肽的氮還具有較大的親核性，可能發(fā)生其它縮合反應(yīng)。
Block和Cox(“Peptides，Proc.ofthe5thEurop.Symp.，Oxford，September1962”。PergamonPress1963，Ed.G.T.Young，PP.84-87)提出用N-三苯甲基氨基酸-N-羧酸酐類來合成肽，但是他們只能制成最簡單的N-三苯甲基氨基酸NCA(即甘氨酸和丙氨酸)。這些化合物是用N-三苯甲基氨基酸與碳酰氯反應(yīng)制得的。按照此法，他們還能制成N-乙酰-甘氨酸-NCA。這些研究者意識到叔丁氧羰基甘氨酸N-羧酸酐和芐氧羰基甘氨酸N-羧酸酐的潛在用途，但他們在嘗試制備這些化合物時未獲成功，并且，他們還得出了尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐類不可能制成的結(jié)論！即使所有的N-三苯甲基-NCA都能制成，然而人們熟知的是，由于三苯甲基產(chǎn)生相當(dāng)大的空間阻礙作用，各種使用三苯甲基保護(hù)的氨基酸的縮合方法的產(chǎn)率都很低。三苯甲基還對酸極為敏感，這樣就不易制得三苯甲基-NCA，并且在一般的固相操作中三苯甲基易于“脫落”。
Halstroem和Kovacs(ActaChemicaScandin-avica.Ser.B1986，BYO(6)，462-465和美國專利4，267，344)也認(rèn)識到N-保護(hù)的氨氨酸N-羧酸酐類的優(yōu)點及潛在用途，并且他們能制成幾種N-取代的NCA。他們覺得這幾種N-取代的NCA能滿足肽合成的所有要求。他們能制得若干種9-呫噸基(以及相關(guān)基團(tuán))取代的氨基酸N-羧酸酐。這些化合物據(jù)稱可以這樣制備使呫噸氫醇在回流條件下，在苯甲苯、二甲苯或其它烴基苯中直接與適宜的NCA縮合;縮合中生成的水共沸除去。由于NCA對熱與水是不穩(wěn)定的，因此該法產(chǎn)率低并且產(chǎn)物中雜質(zhì)很多。這些化合物還可以通過使碳酰氯(或其等價物)與相應(yīng)的9-呫噸基-氨基酸反應(yīng)而制得;事實上，按此法已經(jīng)制成了大多數(shù)這類取代的NCA。
使用9-呫噸基-NCA合成肽時，發(fā)現(xiàn)它們反應(yīng)緩慢。在溶液中，反應(yīng)時間在50℃長達(dá)5小時;而在固相合成中，反應(yīng)時間在25℃長達(dá)24小時。這可能是由于9-呫噸基的空間阻礙作用和/或減活效應(yīng)。用9-呫噸基保護(hù)氨基所帶來的另一個問題是，偶聯(lián)反應(yīng)后生成的9-呫噸基氨基酸的氮原子仍然有親核性，它能隨后進(jìn)行縮合反應(yīng)。這些基團(tuán)在操作過程中也容易脫落。所以，到現(xiàn)在為止，這類及任何其它類型取代的氨基酸N-羧酸酐在肽合成中，尤其是在固相肽合成中還沒有得到廣泛應(yīng)用。
Kiecheldorf(Makromol，Chem.Vol.178，PP905-939，1977)介紹了一種制備甲氧羰基甘氨酸NCA和乙氧羰基甘氨酸NCA的方法。但Kricheldorf也說，由于空間阻礙，按此法不能制得側(cè)鏈不是氫的氨基酸的尿烷保護(hù)的NCA。
因此，本發(fā)明目的是提供迄今不能制得的高級氨基酸的尿烷保護(hù)的N-羧酸酐和N-硫代羧酸酐。
本發(fā)明另一目的是提供制備純質(zhì)、晶形、穩(wěn)定的尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐類和尿烷保護(hù)的N-硫代羧酸酐類的方法。
本發(fā)明還有一個目的，即提供利用純質(zhì)、晶形的尿烷保護(hù)的氨基酸-N-羧酸酐類來合成多肽的方法。與常規(guī)肽合成法相比，本發(fā)明方法的主要優(yōu)點如下1)無需預(yù)先使羧基活化，因此沒有常規(guī)的活化分子產(chǎn)生副產(chǎn)物的問題。
2)無需使用添加劑如N-羥基苯并三唑來抑制外消旋化。
3)偶聯(lián)反應(yīng)僅有的伴隨產(chǎn)物是二氧化碳。
4)這些N-保護(hù)的羧基活化的氨基酸是穩(wěn)定、易儲存、結(jié)晶形的物質(zhì)。使用這種物質(zhì)便于進(jìn)行，并且能夠簡化固相和液相肽合成，尤其是在自動肽合成器中進(jìn)行的肽合成工藝，這是因為肽鍵形成前的活化、過濾和偶聯(lián)等操作都可以省去。由于偶聯(lián)劑不產(chǎn)生副產(chǎn)物，使用這些新化合物大大有助于溶液中制得的肽的純化。
5)由本發(fā)明方法，可以在偶聯(lián)完成后，在生長的肽鏈的氨基官能團(tuán)上形成尿烷保護(hù)基，然后可用常規(guī)方法對其進(jìn)行處理。
利用具有下列結(jié)構(gòu)式的尿烷保護(hù)的氨基酸-N-羧酸酐可達(dá)到本發(fā)明的上述目的
其中R和R′或氫原子、烷基、環(huán)烷基、取代的烷基、取代的環(huán)烷基、芳基或取代的芳基，且R和R′中至少有一個不是氫原子;R″為烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基;Z為氫或硫;n為0，1，或2。
優(yōu)選的R、R′及R″基團(tuán)為具有1-12個碳原子或更多個碳原子的烷基(包括環(huán)烷基)、具有6-20個碳原子或更多個碳原子的芳基(包括具有7-20個碳原子或更多個碳原子的芳烷基和烷芳基)。合適的烷基例如有甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、丁基、叔丁基、己基、環(huán)戊基、環(huán)己基、庚基、辛基等。合適的芳基例如有苯基、甲基苯基、乙基苯基、萘基、甲基萘基、蒽基等。合適的芳烷基例如有芐基、對甲氧芐基、9-芴基甲基、苯乙基等。合適的烷芳基例如有甲苯基、乙苯基、異丙苯基等。R、R′及R″也可被氟、用氧基、叔丁氧基、羧基、酰氨基、芐氧基、羥基、取代的氨基、取代的羥基、硫、取代的硫、氯、溴等非干擾基團(tuán)取代。R和R′一般是連接在氨基酸或其類似物的α-碳原子上的保護(hù)或非保護(hù)的基團(tuán)(側(cè)鏈)。
在大多數(shù)情況下，R及R′中的一個是氫原子，而另一個是氨基酸的α-碳原子上的側(cè)鏈，這些氨基酸包括賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰氨、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、β-丙氨酸、高絲氨酸等，側(cè)鏈的例子有
如果需要的話，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)及保護(hù)基(如氨基、羥基、硫羥基及羧基保護(hù)基)保護(hù)這些側(cè)鏈。
本發(fā)明的化合物也包括這樣一些化合物，即其中R和R′均為連接在氨氨羧的α-碳原子上的側(cè)鏈。例如在異纈氨酸的情況下，R和R′中一個為-CH2CH3，另一個為甲基。
本發(fā)明的化合物也包括這樣一些化合物，即其中R和R′均為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分，例如1-氨基-環(huán)己烷羧酸的情況。
本發(fā)明的化合物也包括例如鄰氨基苯甲酸或1-氨基-2-羧基環(huán)己烷，其中R及R′的碳原子為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分。
另一方面，本發(fā)明也涉及對多肽鏈的合成進(jìn)行改進(jìn)。在肽鏈合成中，是對N-保護(hù)的氨基酸成分去保護(hù)，讓該去保護(hù)的氨基酸成分與另一個類似或不類似的活化的N-保護(hù)的氨基酸成分反應(yīng)，重復(fù)這一過程，直至得到所需多肽。本發(fā)明的改進(jìn)包括在至少一個所說的反應(yīng)中使用具有下式結(jié)構(gòu)的化合物作為活化的N-保護(hù)的氨基酸成分
式中，R、R′、Z和n的含義同上所述。
再一方面，本發(fā)明也涉及對在不溶固體支持物上的多肽鏈的固相合成法進(jìn)行改進(jìn)。在這種固相多肽鏈合成法中，N-保護(hù)的氨基酸成分通過縮合反應(yīng)被偶聯(lián)至一不溶固體支持物上，該支持物含有能與所說氨基酸成分的羧基末端反應(yīng)的取代基，將偶聯(lián)后的N-保護(hù)氨基酸成分去保護(hù)，再將另一個類似或不類似的活化N-保護(hù)氨基酸成分偶聯(lián)至所說的去保護(hù)氨基酸成分上，重復(fù)該過程直至得到所需多肽。所說的改進(jìn)包括在至少一個所說的反應(yīng)中使用具有下式結(jié)構(gòu)的化合物作為活化的N-保護(hù)的氨基酸成分
其中R、R′、Z和n如上所定義。
本發(fā)明還涉及一種制備本發(fā)明的尿烷保護(hù)的氨基酸-羧酸酐的方法，該方法包括使具有下式結(jié)構(gòu)
的氨基酸N-羧酸酐(其中R、R′、Z和n的定義均同上)與具有下式結(jié)構(gòu)
(其中X為氯、溴、氟、疊氮基等，R″為烷基、芳基或芳烷基)的鹵代甲酸酯(或其它合適的易反應(yīng)的甲酸酯，如疊氮基甲酸酯)在無水及存在N-甲基嗎啉的條件下于惰性稀釋劑中反應(yīng)。我們意外地發(fā)現(xiàn)，在此反應(yīng)中利用惰性稀釋劑、無水條件且選擇N-甲基嗎啉作為堿可以避免N-羧酸酐發(fā)生聚合，而且能夠生產(chǎn)出到目前為止尚不能得到的高級氨基酸的尿烷保護(hù)的NCA和NTA(N-硫代羧酸酐)。
作為本發(fā)明N-尿烷保護(hù)的NCA和NTA的起始物的氨基酸N-羧酸酐(NCA)和N-硫代羧酸酐(NTA)可采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知多種方法進(jìn)行制備。如見;Euller等Biopoymers15，№.9，1869-1871(1976);Kricheldorf，Chem.Ber.104，87-91(1971);及Halstrom&Kovacs，ActaChemicaScandinavica，B40，462-465(1986)。
盡管一般地說尿烷類可以用作親核原子的保護(hù)基，但僅發(fā)現(xiàn)其中只有幾種尿烷在肽合成中具有廣泛用途，例如叔-丁氧羰基(Boc);芐氧羰基(Cbz)及9-芴基、甲氧羰基(FMOC)，因此，人們尤其對被這些保護(hù)基團(tuán)取代的氨基酸N-羧酸酐或N-硫代羧酸酐感興趣。所以，用于肽合成的非常有用的分子是被上述保護(hù)基團(tuán)之一所保護(hù)的L-α-氨基酸的NCA，如
其中R是α-氨基酸的側(cè)鏈，Z為O或S，X為甲氧基、氯等等。
如上所述，按照Block及Cox所述的方法(“PeptidesProc.ofthe5thEurop.Symp.，Oxford，September1962”，PergamonPress1963，Ed.G.T.Yong，PP84-87)，使碳酰氯與N-尿烷保護(hù)的氨基酸反應(yīng)，不能得到本發(fā)明的N-尿烷保護(hù)的NCA;同這，利用Kricheldorf所述的合成法(Makromol.Chem.，Vol.176，PP905-939，1977)也不能得到N-尿烷保護(hù)的高級氨基酸的NCA。而我們發(fā)現(xiàn)，通過使預(yù)先合成的NCA或NTA與合適的鹵代甲酸酯在無水的非干擾溶劑中(并使用叔胺作為堿)反應(yīng)，就可以制備出尿烷保護(hù)的NCA和NTA。反應(yīng)最好在低于室溫的溫度下進(jìn)行。反應(yīng)可使用四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲酚、苯、二噁烷等作為溶劑。
例如，本發(fā)明的新型尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐和N-硫代羧酸酐可以這樣制得將NCA溶解于非干擾溶劑(如甲苯)，并邊攪拌邊冷卻所得的溶液。然后立即加入滿足要求的鹵代甲酸酯(如氯甲酸芐酯)，再向混合物中加入叔胺堿(如三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉等)，它能夠促進(jìn)縮合反應(yīng)和清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的鹽酸。我們意外地發(fā)現(xiàn)，某些叔胺堿(如N-用基嗎啉和N-乙基嗎啉啉)并不促使NCA聚合。這種優(yōu)選的堿是那些其pK低至不足以促使NCA聚合，但又高至足以催化NCA與鹵代甲酸酯反應(yīng)的堿。因此，當(dāng)將這些優(yōu)選的堿之一用于縮合反應(yīng)時，并不能引起聚合反應(yīng)。既然不必?fù)?dān)心發(fā)生聚合反應(yīng)，可過量使用這些堿，通過結(jié)晶可很容易地分離出生成的尿烷保護(hù)的NCA。
由于這些發(fā)現(xiàn)，實際上任何尿烷保護(hù)的NCA(或NTA)均可以高產(chǎn)率容易地制得，僅需為除水而采取極簡單的措施。該方法可以容易地擴大規(guī)模進(jìn)行且能提供結(jié)晶程度很高的產(chǎn)物;該產(chǎn)物易于通過簡單技術(shù)(即結(jié)晶)提純，且能夠穩(wěn)定地保存(在25℃至少完全穩(wěn)定6個月或更長時間)。因此，這些物質(zhì)可經(jīng)稱重、運輸和儲存再用于肽合成，而不用擔(dān)心分解。
尿烷保護(hù)的NCA與N-取代的NCA相比，其優(yōu)越之處主要在于使用它們形成肽鍵后，所產(chǎn)生的肽的N-末端被一個普遍接受常用于肽合成的尿烷保護(hù)基所保護(hù)。這些保護(hù)基是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，它們能為正在加長的肽鏈提供最佳保護(hù)。
總之，使用尿烷保護(hù)的N-羧酸酐具有未取代NCA的所有優(yōu)點(高反應(yīng)性，沒有不需要的重排產(chǎn)物生成，CO2為唯一的副產(chǎn)物)，而沒有未取代NCA的缺點(即不穩(wěn)定性，聚合以及多重縮合)，而這些缺點使未取代的NCA只能在嚴(yán)格控制下的有水條件下使用。因此，本發(fā)明提供了一種耐儲存、高反應(yīng)性、預(yù)先活化的試劑，它在肽鍵形成的過程中僅產(chǎn)生極少的副產(chǎn)物。本發(fā)明也為縮合反應(yīng)后所得肽的N-末端氮原子提供了普遍接受的、很好理解的尿烷保護(hù)。
盡管本發(fā)明的尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐可以按照傳統(tǒng)方法用于多肽合成(即采用一系列的去保護(hù)和偶聯(lián)反應(yīng))，但它們無疑還會在固相多肽合成中得到更廣泛的應(yīng)用。在本說明書及所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“多肽”應(yīng)理解為包括肽和蛋白質(zhì)。還應(yīng)理解，本發(fā)明所企望的是一種序列肽合成法，其中使用不是尿烷保護(hù)的氨基酸-N-羧酸酐的N-保護(hù)的氨基酸，也至少使用一個本發(fā)明的尿烷保護(hù)的NCA。但實際上用于每一序列的N-保護(hù)的氨基酸成分最好是本發(fā)明的尿烷保護(hù)的NCA。
在固相多肽合成中，使用一種不溶固體支持物或基質(zhì)，最好是小球狀的。這種固體支持物可以是任何一種常用于多肽合成的固相聚合基質(zhì)，這種聚合樹脂的例子有交聯(lián)聚苯乙烯樹脂、玻璃珠、粘土、硅藻土、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚酰胺樹脂及類似的不溶固體支持物，它們或者本身含有與氨基酸成分偶聯(lián)的反應(yīng)位點，或是可被提供以這些反應(yīng)位點。
如果需要，本發(fā)明的固相多肽合成法可在流動反應(yīng)器中加壓進(jìn)行行，如美國專利4，192，798所述(在此引用以作參考)，但是超大氣壓并不是必需的。
在開始固相多肽的合成之前必須進(jìn)行幾個預(yù)備操作。首先，必須制備含有所需肽鏈的C-末端氨基酸成分的支持樹脂，這可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種方法中的任何一種來完成。許多連接在各種固體支持物上的這些N-保護(hù)的氨基酸都是商品，可按需要購買。
其余的合成所需多肽序列的操作可按下述進(jìn)行。在另一個氨基酸殘基的偶聯(lián)得以進(jìn)行之前，已在支持物上的殘基必須去保護(hù)。通過使保護(hù)的氨基酸殘基與一合適的脫保護(hù)劑接觸，可以將已在樹脂上的氨基酸殘基以及每一個后來偶聯(lián)上去的氨基酸殘基脫保護(hù)。用于此目的的脫保護(hù)劑為肽合成領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。當(dāng)然，每一具體情況下所使用的具體脫保護(hù)劑將根據(jù)氨基酸/樹脂上的保護(hù)基而定。例如，如果保護(hù)基為叔丁氧羰基，則可使用在二氯甲烷中的三氟乙酸或在合適溶劑(如二噁烷)中的鹽酸。另一方面，如果保護(hù)基為9-芴基甲氧羰基，則采用堿性條件(如DMF中的哌啶)較好。具體的脫保護(hù)劑在溶劑中的濃度也是視所使用的具體保護(hù)劑而定，但一般在約5-50%(體積)的范圍內(nèi)。
脫保護(hù)之后，用合適溶劑洗滌樹脂，以除去過量的脫保護(hù)劑。如果脫保護(hù)劑是一種酸，則必須用一合適堿(如在二氯甲烷等溶劑中的三乙胺)洗滌，以中和樹脂上的多肽。任何過量的三乙胺和形成的三乙基氯化銨或三氟乙酸鹽都可用一合適溶劑(如二氯甲烷或二甲基甲酰胺)反復(fù)沖洗而除去。如此制得的游離胺就可以備用于與下一個N-保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)了。
如果下一個N-保護(hù)的氨基酸是本發(fā)明的尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐，則它無需經(jīng)過活化即可直接與含有未保護(hù)的與樹脂相連的氨基酸的支持物反應(yīng)。但是，如果采用更常規(guī)的方法將N-保護(hù)的氨基酸成分偶聯(lián)，則必須首先進(jìn)行活化，即將其轉(zhuǎn)變成易反應(yīng)的形式。例如如，將該氨基酸轉(zhuǎn)變成酸酐，或用二環(huán)己基碳化二亞胺、羰基二咪唑或其它活化劑將其活化。通常，在反應(yīng)中活化的N-保護(hù)的氨基酸成分是過量使用的。
被保護(hù)的第二氨基酸成分與第一氨基酸成分偶聯(lián)之后，將連接在支持物上的保護(hù)的二肽去保護(hù)，需要時進(jìn)行中和，并在下一個氨基酸衍生物偶聯(lián)之前按前述方法沖洗。重復(fù)上述過程，直至將所需氨基酸序列全部組裝在不溶支持物上。
由于在尿烷保護(hù)的NCA偶聯(lián)過程中沒有不良的副反應(yīng)和副產(chǎn)物(CO2是唯一的副產(chǎn)物)，且由于尿烷保護(hù)的NCA很穩(wěn)定，偶聯(lián)反應(yīng)中所用過量的尿烷保護(hù)的NCA很容易回收，重結(jié)晶及重復(fù)利用，從而顯著地提高了這些物質(zhì)的效用。
所獲多肽可采用任何標(biāo)準(zhǔn)方法使之與不溶支持物分開，如用氟化氫裂解，進(jìn)行酯基交換(transesterification)、氨解等。
解離之后，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的肽非常均一，無需純化，或僅需最低限度的純化。由于副產(chǎn)物污染很少，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率之高驚人;即使需要純化，純化也可以相對容易地完成。所用純化方法最好是分配色譜法，離子交換色譜法，或者是二者的結(jié)合，對多肽合成領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，這些方法是熟知的。
實施例1在堿作用下N-羧酸酐的分解A.將纈氨酸N-羧酸酐(72mg)溶于干燥的、蒸餾過的四氫呋喃(2ml)中，加入三乙胺(30μl)。用紅外光譜測定NCA已消失。
B.將纈氨酸-N-羧酸酐(72mg)溶于四氫呋喃(2ml)，加入N-甲基嗎啉(25μl)。用紅外光譜測定NCA已消失。
A和B的結(jié)果示于附

圖1的曲線。
實施例2N-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙氨酸-N-羧酸酐A.在62-64℃下，將由L-丙氨酸(40.3g，0.45mol)和碳酰氯(275ml3M的四氫呋喃溶液，0.90mol)組成的混合物攪拌4小時。將得到的溶液冷卻至室溫，過濾，減壓蒸去揮發(fā)性組分。攪拌下，將得到的油狀物溶于100ml四氫呋喃，加入300ml己烷，再冷卻至-20℃。L-丙氨酸-N-羧酸酐的產(chǎn)量為35.79g(69%)。
B.將由N-甲基嗎啉(8.15g，80.5mmol)和甲苯(50ml)組成的溶液加到溫度為0℃的由L-丙氨酸-N-羧酸酐(8.84g，76.8mmol)、9-芴基甲氧羰基氯(19.9g，76.8mmol)和甲苯(200ml)組成的混合物中。在0℃下將反應(yīng)混合物攪拌2小時，過濾。溶液的體積減至20ml，加入100ml己烷后結(jié)晶，得到21.4g(82%)9-芴基甲氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐粗產(chǎn)物。通過與冷的異丙醚研磨將該粗產(chǎn)物提純，再從乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶。mp106-107℃;1R(CH2Cl2)1870，1801，1740cm-1;NMR(CDCl3)δ6.90-7.80(m，8H)，3.95-4.55(m，4H)，1.35(d，J＝7Hz，3H)，元素分析C19H15NO5計算值C，67.65;H，4.48;N，4.15。實測值C，67.73;H，4.65;N，4.19。
實施例3N-(9-芴基甲氧羰基)-L-亮氨酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法從L-亮氨酸制備L-亮氨酸-N-羧基酐，產(chǎn)率為78%。
B.將由L-亮氨酸-N-羧酸酐(9.2g，58.4mmol)、9-芴基甲氧羰基氯(15.1g，58.4mmol)和甲苯(125ml)組成的混合物冷卻至0℃，滴加由N-甲基嗎啉(6.5g，64mmol)和20ml甲苯組成的溶液。在0℃下將反應(yīng)混合物攪拌2.5小時，過濾，溶液的體積減至20ml。加入己烷(480ml)，將混合物通霄冷卻至-20℃，得到18.8g(85%)N-(9-芴基甲氧羰基)-L-亮氨酸-N-羧酸酐。從乙醚/二氯甲烷/己烷中重結(jié)晶，得到分析用試樣。mp118-120℃;NMR(CCl4)δ7.35-7.91(m，8H);4.72(t，J＝7Hz，2H);4.58(m，3H);4.37(t，J＝7Hz，1H);2.05(m，2H);1.09(t，J＝6Hz，6H)。元素分析C22H21NO5計算值C，69.64;H，5.58;N，3.69。實測值C，69.08;H，5.97;N，3.70。
實施例4N-α-(9-芴基甲氧羰基)-N-ε-叔-丁氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐A.將由N-ε-叔-丁氧羰基-L-賴氨酸(1.23g，5.0mmol)、三甲基氯硅烷(1.08g，10.0mmol)和四氫呋喃(50ml)組成的混合物冷卻至0℃，滴加由三乙胺(1.01g，10.0mmol)和5ml四氫呋喃組成的溶液。在0℃下將混合物攪拌2.5小時，過濾，再加到由碳酰氯(10mmol)和15ml四氫呋喃組成的溶液中。將溶液的溫度升高至60℃，攪拌2.0小時，然后在室溫下過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去揮發(fā)性組分，得到0.79g(58%(N-ε-叔-丁氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐。
B.將由N-ε-叔-丁氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐(0.79g，2.90mmol)、9-芴基甲氧羰基氯(0.75g，2.90mmol)和甲苯(25ml)組成的混合物冷卻至0℃，滴加由N-甲基嗎啉(0.32g，3.2mmol)和甲苯(5ml)組成的溶液。按實施例3B所述的方法進(jìn)行反應(yīng)，得到0.88g(66%)N-α-(9-芴基甲氧羰基)-N-ε-叔-丁氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐。乙酸乙酯/己烷;NMR(CDCl3)δ7.3-7.7(m，8H)，4.11-4.58(m，5H)，2.95-3.20(m，2H);1.90-1.98(m，2H);0.9-1.4(m，13H)。元素分析C27H30N2O7計算值C，65.57;H，6.11;N，5.67。實測值C，66.33;H，6.38;N，5.67。
實施例5N-芐氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐在0℃下，將由N-甲基嗎啉(1.06g，10.5mmol)和乙酸乙酯(20ml)組成的溶液滴加到由L-丙氨酸-N-羧酸酐(實施例2A制備)(0.81g，7.0mmol)、芐氧羰基氯(1.89g，10.5mmol)和乙酸乙酯(80ml)組成的混合物中。在0℃攪拌此反應(yīng)混合物1.5小時，過濾，將溶液的體積減至75ml。在攪拌下加入己烷(75ml)，然后冷卻至-20℃，得到1.20g(71%)N-芐氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐。mp101-104℃;NMR(CDCl3)δ7.33(s，5H)，5.27(s，2H)，4.60(q，J＝7Hz，1H)，1.61(d，J＝7Hz，3H)。元素分析C12H11NO5計算值C，57.83;H，4.45;N，5.62。實測值C，57.60;H，4.50;N，5.53。
實施例6N-芐氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐在0℃下，將由N-甲基嗎啉(0.76g，7.50mmol)和乙酸乙酯(10ml)組成的溶液滴加到由L-亮氨酸-N-羧酸酐(0.79g，5.0mmol)(實施例3A制備)、芐氧羰基氯(1.35g，7.50mmol)和乙酸乙酯(50ml)組成的溶液中。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物1.25小時，過濾，將溶液的體積減至5ml。加入己烷(50ml)，然后冷卻至-20℃，得到0.89g(61%)N-芐氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐。mp72-73.5℃(乙醚/己烷);NMR(CDCl3)δ7.40(s，5H)，5.33(s，2H)，4.71(t，J＝6Hz，1H)，1.80-2.04(m，3H)，0.91(m，6H)。元素分析C15H17NO5計算值C，61.84;H，5.88;N，4.81。實測值C，61.64;H，6.02;N，4.90。
實施例7N-苯氧羰基-L-纈氨酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法從L-纈氨酸制備L-纈氨酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為75%。
B.重復(fù)實施例5的操作，所不同的是用苯基氯甲酸酯代替芐基氯甲酸酯，用纈氨酸-N-羧酸酐代替亮氨酸-N-羧酸酐。結(jié)果得到N-苯氧羰基-L-纈氨酸-N-羧酸酐(產(chǎn)率78%)，mp105-106℃(氯仿/己烷);NMR(CDCl3)δ7.30(m，5H)，4.70(d，J＝3.5Hz，1H)，2.60(m，1H)，1.22(d，J＝7Hz，3H)，1.07(d，J＝7Hz，3H)，1.07(d，J＝7Hz，3H)。元素分析C12H13NO5計算值C，59.31，H，4.98;N，5.32。實測值C，59.09;H，4.91;N，5.49。
實施例8N-乙氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐重復(fù)實施例5的操作，所不同的是用乙基氯甲酸酯代替芐基氯甲酸酯。結(jié)果得到N-乙氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐(產(chǎn)率62%)。mp72-73.5℃(乙酸乙酯/己烷)，NMR(CDCl3)δ4.73(q，J＝7Hz，2H)，4.33(q，J＝7Hz，1H)，1.70(d，J＝7Hx，3H)，1.33(t，J＝7Hz，3H)。元素分析C7H9NO5計算值C，44.92;H，4.85;N，7.49。實測值C，45.08;H，5.03;N，7.33。
實施例9芐氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法從L-苯丙氨酸制備L-苯丙氨酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為53%。
B.在0℃下，向由L-苯丙氨酸-N-羧酸酐(2.5g，13mmol)、芐基氯甲酸酯(3.4g，20mmol)和乙酸乙酯(130ml)組成的溶液中滴加由N-甲基嗎啉(2.0g，20mmol)和乙酸乙酯(10ml)組成的溶液。將得到的混合物在0℃下攪拌2.5小時，然后按實施例5的方法操作，得到2.0g(48%)N-芐氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羧酸酐。mp108-109℃;NMR(CDCl3)δ7.35(s，5H，7.00(m，5H)，5.31(s，2H)，4.83(m，1H)，3.28(m，2H)。元素分析C18H17NO5計算值C，68.13;H，5.40;N，4.42。實測值C，68.11;H，5.38;N，4.20。
實施例10苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐A.O-乙基-S-黃原酸甲酯。
在4±1℃下，向由乙基黃原酸鉀(16.0g，100mmol)和水(50ml)組成的溶液中滴加硫酸二甲酯(12.6g，100mmol)。全部加完后，用二氯甲烷(2×40ml)洗滌反應(yīng)混合物，合并有機層，用硫酸鎂干燥，濃縮。將油狀殘余物溶于甲醇，濃縮后得到O-乙基-S-黃原酸甲酯，其純度足以直接在下一步中使用。
B.乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸。
向上面制備的O-乙基-S-黃原酸甲酯中加入由L-丙氨酸(8.9g，100mmol)、氫氧化鈉(4.0g，100mmol)和水(100ml)組成的溶液。將該溶液于45℃加熱2.3小時。在氮氣氛下，加入甲醇(50ml)，再將混合物于45℃下攪拌0.7小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用二氯甲烷(3×25ml)洗滌，用濃鹽酸酸化至pH＝2.5，再用乙酸乙酯(2×50ml)萃取。將合并的有機層用硫酸鎂干燥，濃縮。向得到的油狀物中加入己烷，得到9.5g(54%)乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸，為無色固體，mp74-78℃。通過于乙醚/己烷中重結(jié)晶，進(jìn)一步提純該產(chǎn)物。mp77-79℃;IR(CCl4)3397，1716cm-1。
C.L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。
在20℃下，將PBr3(5.4g，20mmol)滴加到由乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸(3.0g，17mmol)、咪唑(1.2g，17mmol)和四氫呋喃(20ml)組成的溶液中。連續(xù)攪拌，直至固體物質(zhì)分散為細(xì)致的顆粒，形成懸浮液。將反應(yīng)混合物傾入由飽和碳酸氫鈉(200ml)和乙酸乙酯(150ml)組成的混合物中。分離出有機層，用1M鹽酸(2×100ml)、飽和碳酸氫鈉(100ml)和鹽水(100ml)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮。將得到的油狀物靜置固化。固體重結(jié)晶后，得到0.75g(34%)L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。mp91-92℃;IR(CCl4)1750，1695cm-1。
D.苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐在0℃下，向由L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐(0.49g，3.8mmol)和50ml乙酸乙酯組成的溶液中加入苯基氯甲酸酯(0.95g，6.1mmol)，然后在0℃滴加由N-甲基嗎啉(0.57g，5.6mmol)和乙酸乙酯(10ml)組成的溶液。在0℃下攪拌得到的混合物3小時，過濾并濃縮，得到白色半固體。將該半固體溶于20ml乙酸乙酯中，加入己烷(150ml)，將該混合物冷卻至-20℃，得到0.55g(62%)苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。mp110-111℃;NMR(CDCl3)δ7.18(m，5H)，4.83(q，1H，J＝7Hz)，1.71(d，3H，J＝7Hz);IR(CH2Cl2)1810，1740(雙峰)，1715(肩峰)。元素分析C11H9NO4S計算值C，52.58;H，3.61;N，5.58;S，12.76。實測值C，52.75;H，3.72;N，5.36;S，12.98。
實施例11N-(9-芴基甲氧羰基)-O-叔丁基-L-蘇氨酸-N-羧酸酐A.按實施例4A所述的方法用三甲基氯甲硅烷從O-叔丁基-L-蘇氨酸制備O-叔丁基-L-蘇氨酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為57%。
B.在0℃下，將由N-甲基嗎啉(0.49g，4.8mmol)和8ml甲苯組成的溶液滴加到由O-叔-丁基-L-蘇氨酸-N-羧酸酐(0.80g，4.0mmol)、9-芴基甲氧羰基氯(1.0g，4.0mmol)和甲苯(50ml)組成的溶液中。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌3小時，過濾，減壓蒸除揮發(fā)性組分。殘余物從乙醚/己烷中結(jié)晶，得到1.0g(60%)N-(9-芴基甲氧羰基)-O-叔-丁基-L-蘇氨酸-N-羧酸酐。mp124-127℃;NMR(CDCl3)δ7.08-7.78(m，8H)，4.05-4.61(m，4H)，1.18(s，9H)，1.16(d，3H，J＝7Hz)。元素分析C24H25NO6計算值C，68.07;H，5.95;N，3.31。實測值C，67.89;H，5.96;N，3.28。
實施例12乙氧羰基-α-氨基異丁酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法制備α-氨基異丁酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為67%。
B.重復(fù)實施例8B的操作，所不同的是用α-氨基異丁酸-N-羧酸酐代替L-丙氨酸-N-羧酸酐，得到乙氧羰基-α-氨基異丁酸-N-羧酸酐(產(chǎn)率為16%)。mp68-70℃(氯仿/己烷);NMR(CCl4)δ4.59(d，2H，J＝7Hz)，2.00(s，6H)，1.65(t，3H，J＝7Hz)。元素分析C8H11NO5計算值C，47.76;H，5.51;N，6.96。實測值C，47.67;H，5.51;N，7.14。
實施例13N-叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐于-50℃下，向由叔丁醇(1.25g，16.9mmol)、碳酰氯(3.4ml于二噁烷中的5M溶液，17mmol)和80ml乙酸乙酯組成的溶液中滴加N-甲基嗎啉(3.4g，34mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌0.5小時。加入于乙酸乙酯(10ml)中的L-丙氨酸-N-羧酸酐(0.23g，2.0mmol)，于-50℃下攪拌此混合物0.75小時。加入N-甲基嗎啉(1.0g，10mmol)，再于-50℃下繼續(xù)攪拌0.75小時。濾去固體，濃縮溶液，與己烷研磨后得到產(chǎn)物。從甲苯中重結(jié)晶后得到0.28g(65%)N-叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐。mp103-104.5℃;NMR(CDCl3)δ4.71(q，1H，J＝7Hz)，1.80(d，3H，J＝7Hz)，1.70(s，9H)。元素分析C8H13NO5計算值C，50.23;H，6.09;N，6.51。實測值C，56.66;H，6.36;N，6.38。
實施例14N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法制備O-芐基-L-絲氨酸-N-羧酸酸，產(chǎn)率為68%。
B。重復(fù)實施例13的操作，所不同的是用O-芐基-L-絲氨酸-N-羧酸酐代替L-丙氨酸-N-羧酸酐，得到N-(叔-丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為52%。mp98-99.5℃;NMR(CCl4)δ7.30(m，5H)，4.64(m，3H，芐基CH2和NCA環(huán)質(zhì)子)，4.09(dd，1H，J＝15，5Hz)，3.88(dd，1H，J＝15，5Hz)，1.65(s，9H);元素分析C15H19NO6計算值C，59.80;H，5.96;N，4.36。實測值C，59.71;H，6.25;N，4.05。
實施例151-氨基-1-環(huán)己烷羧酸-N-羧酸酐的苯氧羧基衍生物A.按實施例2A所述的方法從1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸制備1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為50%。
B。在0℃下，向由于A中制備的N-羧酸酐(0.85g，5.0mmol)、苯基氯甲酸酯(1.2g，7.5mmol)和乙酸乙酯(30ml)組成的溶液中加入由N-甲基嗎啉(0.76g，7.5mmol)和8ml乙酸乙酯組成的溶液。在0℃下將此反應(yīng)混合物攪拌2小時，過濾，濃縮。將得到的白色半固體從乙醚/二氯甲烷/己烷中重結(jié)晶，得到0.92g(66%)標(biāo)題所示N-羧酸酐。mp156.5-158℃;NMR(CDCl3)δ7.28(m，5H)，1.20-3.10(m，10H)。元素分析C15H15NO5計算值C，62.27;H，5.23;N，4.84。實測值C，62.03;H，5.22;N，4.77。
實施例16N-(9-芴基甲氧羰基)-L-亮氨酸-N-羧酸酐A.按實施例2A所述的方法從L-亮氨酸制備L-亮氨酸-N-羧酸酐，產(chǎn)率為78%。
B.將由L-亮氨酸-N-羧酸酐(9.2g，58.4mmol)和干燥的、蒸餾過的乙酸乙酯(150ml)組成的混合物冷卻至-10℃，然后用5分鐘滴加由三乙胺(9ml，64mmpl)和20ml乙酸乙酯組成的溶液。停止冷卻，攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。加入少量于二烷中的氯化氫(4.4M，5ml)以保證所有的三乙胺被中和。過濾反應(yīng)混合物，減壓除去溶劑。將得到的粗產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，過濾，加入己烷后結(jié)晶，得到產(chǎn)物。
再經(jīng)三次小心操作的結(jié)晶后，得到3.6g(16%)N-(9-芴基甲氧羰基)-L-亮氨酸-N-羧酸酐。分析數(shù)據(jù)與實施例3中所得化合物基本相同。
實施例17L-亮氨酰-L-纈氨酸將與對-烷氧芐基醇酯化的9-芴基甲氧羰基L-纈氨酸與2%高聯(lián)聚苯乙烯衍生物(0.25g，0.13mmol纈氨酸)置于一個固相肽合成器中。加入5ml二甲基甲酰胺，將得到的漿狀物振蕩30分鐘。除去二甲基甲酰胺，用10%的于二甲基甲酰胺中的哌啶溶液處理溶脹的樹脂兩次(用5ml處理5分鐘，再用5ml處理15分鐘)，除去9-15芴基甲氧羰基保護(hù)基。用二甲基甲酰胺(4×5ml)洗滌樹脂，再與于二甲基甲酰胺(6ml)中的9-芴基甲氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐(145mg，0.38mmol)反應(yīng)45分鐘。按上述方法除去芴基甲氧羰基保護(hù)基，用二甲基甲酰胺(3×5ml)和二氯甲烷(3×5ml)洗滌樹脂。通過用二氯甲烷/三氟乙酸(6ml，1/1)處理45分鐘將得到的二肽從樹脂中除去。除去溶液，用二氯甲烷(3×5ml)和甲醇(2×5ml)洗滌樹脂。減壓蒸發(fā)合并的溶液和洗滌液，得半固體，將該半固體溶于蒸餾水中并過濾。冷凍干燥水溶液，將得到的固體與乙醚(3×)一起研磨以除去樹脂污染物，減壓干燥后得到L-亮氨酰-L-纈氨酸，產(chǎn)率大于90%。用高效液相色譜分析(流速1.5ml/min，于215nm測定，30%甲醇于0.5M高氯酸中)，通過與一已知標(biāo)準(zhǔn)品(保留時間8.49分鐘)共洗脫確證該二肽。測定純度大于97%，所有的雜質(zhì)為樹脂。沒有檢測到D-亮氨酰-L-纈氨酸(保留時間32分鐘)(檢測極限小于0.1%)。
實施例18L-亮氨酰-L-纈氨酸重復(fù)實施例17的操作，所不同的是以二氯甲烷(5ml)代替二甲基甲酰胺作溶劑，使9-芴基甲氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐與L-纈氨酸的游離胺在樹脂上反應(yīng)。結(jié)果與實施例17相似。
實施例19L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酸(FMOC方法)按實施例16的方法制備L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酸。從樹脂上分離并用乙醚洗滌后，得到三肽白色固體，產(chǎn)率大于88%。采用實施例16所述的條件，通過該產(chǎn)物與已知標(biāo)準(zhǔn)品共洗脫(保留時間16.28分鐘)，用高效液相色譜分析確證產(chǎn)物。沒有檢測到L-亮氨酰-L-纈氨酸和L-丙氨酰-L-纈氨酸(檢測極限小于0.1%)。
實施例20L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酸(Boc方法)將與甲基化的2%交聯(lián)聚苯乙烯酯化的叔-丁氧羰基-L-纈氨酸(即Merryfieldresin)(0.50g，0.23mmol纈氨酸)放在一個固相肽合成器中。加入二氯甲烷(5ml)，將漿狀物振蕩30分鐘。除去溶劑，用二氯甲烷/三氟乙酸(1/1，6ml)處理樹脂30分鐘以除去叔-丁氧羰基保護(hù)基。用二氯甲烷(3×5ml)洗滌樹脂，用于二氯甲烷中的10%三乙胺(5ml)中和，用二氯甲烷洗滌(3×5ml)，然后與由叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐(200mg，1.0mmol)與二氯甲烷(5ml)組成的溶液反應(yīng)45分鐘。用二氯甲烷(3×5ml)洗滌得到的保護(hù)的二肽樹脂。樹脂再次按上述方法解封，洗滌，中和并洗滌。向樹脂中加入于二氯甲烷(6ml)中的叔-丁氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐(240mg，1.0mmol)，將混合物振蕩45分鐘。除去溶液，用二氯甲烷(3×5ml)、甲醇(3×5ml)和二氯甲烷(3×5ml)洗滌樹脂，在高真空下干燥。在0℃下，使叔-丁氧羰基保護(hù)的三肽樹脂與液體氟化氫反應(yīng)30分鐘。除去氟化氫，在高真空下干燥殘余物。將肽溶于水中，濾去樹脂。冷凍干燥溶液，得到一定量純凈的L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酸。高效液相色譜分析結(jié)果與實施例18相似。
實施例21L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(完全保護(hù)法)A。在0℃下，向于四氫呋喃(20ml)中的L-苯丙氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽(1.07g，2.5mmol)加入N-甲基嗎啉(0.25g，2.5mmol)。在0℃下攪拌該混合物0.5小時，加入N-芐氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐(0.50g，2.0mmol)。在0℃將該反應(yīng)混合物攪拌2小時，加入水(20ml)和二氯甲烷(50ml)。分離水層和有機層，用二氯甲烷(25ml)洗滌水層，合并有機層，用0.5MHCl(2×50ml)、10%碳酸氫鈉(50ml)和水(2×50ml)洗滌，用MgSO4干燥，濃縮。加入己烷后出現(xiàn)結(jié)晶，得到0.66g(72%)N-芐氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸芐基酯。mp118.5-119℃;NMR(CDCl3)δ7.64(s，1H)，6.82-7.39(m，6H)，5.04(s，2H)，5.00(s，2H)，4.58-4.92(m，2H)，3.07(d，j＝6Hz，2H)1.29(d，j＝7Hz，3H)。
B.在20℃下，將由N-芐氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸芐基酯(0.50g，1.1mmol)、10%披鈀炭(0.1g)和乙醇(150ml)在Parr加氫器中振蕩6.5小時。過濾反應(yīng)混合物，用水(100ml)洗滌濾液。濃縮溶液，得到0.26g(100%)L-丙氨酰-L-苯丙氨酸。高效液相色譜證明，其純度大于99%，且沒有發(fā)現(xiàn)外消旋體。
實施例22L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(部分保護(hù)法)A。在0℃下，向由L-苯丙氨酸(0.33g，2.0mmol)0.20M碳酸鉀(20ml)和乙腈(30ml)組成的溶液中滴加由N-芐氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐(0.45g，1.8mmol)和乙腈(5ml)組成的溶液。在0℃下攪拌該混合物40分鐘，用乙酸乙酯(50ml)和1M鹽酸(10ml)稀釋。分離水層和有機層，用乙酸乙酯(2×35ml)萃取水層。合并有機層，用鹽水(30ml)，0.5M鹽酸(2×50ml)和水(2×50ml)洗滌，用MgSO4干燥，濃縮。殘余物從氯仿/己烷中重結(jié)晶，得到0.26g(39%)N-芐氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸。mp121-122℃ NMR(DMSO-d6)δ12.71(s，1H)，8.06(m，1H)，7.30(m，5H)，5.01(s，2H)，4.43(m，1H)，4.06(m，1H)，2.99(m，2H)，11.19(d，2H，j＝7Hz)。
B.在20℃下，將由N-芐氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(0.208g，0.562mmol)、10%披鈀炭(0.1g)和95%乙醇(50ml)組成的混合物于Parr加氫器中振蕩16小時。過濾反應(yīng)混合物，用水(100ml)洗滌濾液。濃縮合并的溶液，得到0.122g(92%)L-丙氨酰-L-苯丙氨酸，為白色固體。高效液相色譜分析表明，其純度大于99.5%，沒有發(fā)現(xiàn)外消旋體。
權(quán)利要求
1.制備具有下式結(jié)構(gòu)的尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐的方法
式中R和R′為氫、烷基、環(huán)烷基取代的環(huán)烷基、芳基或取代的芳基，R″為烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；Z為氧或硫，n為0、1或2，該方法包括使具有下式結(jié)構(gòu)的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐
(式中R和R′的含義同上述)與具有下式結(jié)構(gòu)的鹵代甲酸酯
(式中X為鹵素，R″的含義同上述)在惰性稀釋劑中，在無水條件及有叔胺堿存在的條件下反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R″為有1～20個碳原子的烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R″為低級烷基或取代的低級烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中R″為叔丁基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R″為芳基或取代的芳基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中R″為苯基或取代的苯基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R″為芳烷基或取代的芳烷基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中R″為芐基或取代的芐基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中對甲氧基芐基。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中R″為9-基甲基或取代的9-基甲基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任一項的方法，其中R與R′中至少有一個是已保護(hù)或未保護(hù)的氨基酸的側(cè)鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是丙氨酸側(cè)鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是精氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的精氨酸的側(cè)鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是天冬氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的天冬氨酸的側(cè)鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是天冬酰胺或適當(dāng)保護(hù)起來的天冬酰胺的側(cè)鏈。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是半胱氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的半胱氨酸的側(cè)鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是胱氨酸側(cè)鏈。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是谷氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的谷氨酸的側(cè)鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是谷氨酰胺或適當(dāng)保護(hù)起來的谷氨酰胺的側(cè)鏈。
20.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是組氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的組氨酸的側(cè)鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是異亮氨酸側(cè)鏈。
22.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是適當(dāng)保護(hù)起來的賴氨酸的側(cè)鏈。
23.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是亮氨酸側(cè)鏈。
24.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是甲硫氨酸側(cè)鏈。
25.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是正亮氨酸側(cè)鏈。
26.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是適當(dāng)保護(hù)起來的鳥氨酸的側(cè)鏈。
27.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是苯丙氨酸側(cè)鏈。
28.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是絲氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的絲氨酸的側(cè)鏈。
29.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是蘇氨酸或適當(dāng)保護(hù)起來的蘇氨酸的側(cè)鏈。
30.如權(quán)利要求11所述方法，其中R或R′是色氨酸或適當(dāng)保護(hù)的色氨酸的側(cè)鏈。
31.如權(quán)利要求11所述方法，其中R或R′是酪氨酸或適當(dāng)保護(hù)的酪氨酸的側(cè)鏈。
32.如權(quán)利要求11所述方法，其中R或R′是纈氨酸側(cè)鏈。
33.如權(quán)利要求11的方法，其中R或R′是高絲氨酸或適當(dāng)保護(hù)的高絲氨酸的側(cè)鏈。
34.一種合成多肽鏈的方法，其中是讓被保護(hù)的氨基酸成分與相似或不相似的另一個氨基酸成分反應(yīng)，重復(fù)這一過程直至獲得所需多肽，其特征在于使用具有下列通式的化合物作為至少一個上述反應(yīng)中的被保護(hù)的氨基酸成分
其中R和R′為氫原子、烷基、芳基、取代烷基或取代芳基;R″為烷基、芳基、取代烷基或取代芳基;Z為氧原子或硫原子;n為0、1或2。
35.在可溶或不溶支持物上的多肽的固相合成法，其中被保護(hù)的氨基酸成分是通過縮合反應(yīng)而被偶聯(lián)至含有可與所說氨基酸成分的羧基末端反應(yīng)的取代基團(tuán)的支持物上;將偶聯(lián)的被保護(hù)氨基酸成分去保護(hù)，如果需要，進(jìn)行中和;將相似或不相似的另一個保護(hù)的氨基酸成分偶聯(lián)至所說的去保護(hù)的氨基酸成分上;重復(fù)該過程，直至獲得所需多肽，其特征在于，在至少一個所說反應(yīng)中使用具有下列通式的化合物作為被保護(hù)的氨基酸成分
其中R和R′為氫原子、烷基、環(huán)烷基、取代的烷基、取代的環(huán)烷基、芳基或取代的芳基;R″為烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基;Z為氧原子或硫原子;n為0、1或2。
36.合成多肽鏈的方法，其中使被保護(hù)的氨基酸成分與相似的或不相似的另一個氨基酸成分反應(yīng)，重復(fù)該過程，直至獲得所需多肽，其特征在于在至少一個上述反應(yīng)中使用一種化合物作為被保護(hù)的氨基酸成分，而該化合物是按照權(quán)利要求1～33中任何一項所述的方法制備的。
37.如權(quán)利要求1～33中任一項所述的方法，其中叔胺堿為N-甲基嗎啉。
38.如權(quán)利要求1～33中任一項及權(quán)利要求37所述的方法，其中尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐反應(yīng)產(chǎn)物是通過結(jié)晶來回收。
全文摘要
制備具有式(I)的尿烷保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐的方法；式(I)中R和R′為氫、烷基、環(huán)烷基取代的環(huán)烷基、芳基或取代的芳基；R″為烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；Z為氧或硫；n為0、1或2；該方法包括使氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐與鹵代甲酸脂在惰性稀釋劑中，在無水條件及有叔胺堿存在的條件下反應(yīng)。
文檔編號C07K5/06GK1040793SQ8910133
公開日1990年3月28日 申請日期1989年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1988年3月11日
發(fā)明者威廉·D·福勒, 米歇爾·飛利普·科恩, 弗里德·R·納德, 莫利·高德曼 申請人:生物研究公司