專利名稱：制備人/牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子新衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)之新的分子整體衍生物的重組DNA方法，以及有關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒和DNA編碼順序。本發(fā)明新的bFGF分子變體可作為血管生成過程中野生型分子的拮抗物或超增效物。
本發(fā)明所公開的生產(chǎn)這些新分子以及野生型bFGF的方法，是基于使用已用攜帶編碼人和牛bFGF及其衍生物之核苷酸順序的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌重組菌株。
在許多重要的生物學(xué)過程，如器官發(fā)育和傷口愈合等生理過程或腫瘤生長等病理過程中出現(xiàn)毛細(xì)血管生成(DenekampJVascularendotheliumasthevulnerableelementintumors.ActaRadiol.(oncol)23p.217-225，1984;HobsonB.andDenekampJ.Endothelialproliferationintumoursandnormaltissuescontinouslabellingstudies.Br.J.Cancer49p.405-413，1984;FolkmanJTumorantiogenesis，Adv.CancerRes.43p.175-203，1985)。
雖然在形態(tài)上已確定了導(dǎo)致新血管形成的一系列變化，但有關(guān)這一過程的分子機(jī)制尚不甚明了。因為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在正常情況下形成一個靜止的單層，而且其增殖是在血管形成過程中引起的，所以這些細(xì)胞的生長控制似乎是十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?FolkmanJTumorangiogenesis，Adv.CancerRes.43p.175-203，1985;Joseph-SilversteinJ.andRifkinB.D.EndothelialCellgrowthfactorsandthevesselwall，SeminarsinThromb.andHemost.13p.504-513，1987)。
血漿中明顯缺乏內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可部分地群釋正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞的靜止性質(zhì)。
雖然在幾乎所有組織的提取物以及許多正常和腫瘤細(xì)胞系中都存在內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，但事實上在血漿卻沒有見到(JosephSilversteinJ.andRifkinB.D.Endothelialcellgrowthfactorsandthevesselwall，SeminarsinThrombandHemost.13p.504-513，1987;FolkmanJ.andKlagsbrunM.AngiogenicFactors，Science，235p.442-447，1987)。
因此，定位誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的迅速增殖可包括在對環(huán)境條件反應(yīng)中由細(xì)胞內(nèi)釋放內(nèi)皮細(xì)胞分裂素。
已明確定性的內(nèi)皮細(xì)胞分裂素是一族多肽生長因子，包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，因其對肝素有高度親合性，故也稱為肝素結(jié)合性生長因子(ThomasK.Fibroblastgrowthfactors，F(xiàn)ASEBJ.，1p434-440，1987;GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL.FibroblastgrwthfactorStructuralandbiologicalproperties，J.Cell.Physiol.，5p.15-26，1987)。
已經(jīng)由大多數(shù)中胚層或神經(jīng)外胚層分化的組織或細(xì)胞中純化了堿性FGF。
結(jié)構(gòu)研究表明，bFGF是由146個氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽，其也可以以缺失前10-20個氨基酸之氨基末端剪切的形式存在。
放射受體結(jié)合試驗和生物學(xué)檢驗證明修剪形式的FGF與天然bFGF有同樣的效力(GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL，F(xiàn)ibroblastgrowthfactor，Mol.Cell.Endocrin.46p.187-206，1986;GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL，Molecularandbiogicalcharacterizationoffibroblastgrowthfactoranangiogenicfactorwhichalsocontrolstheproliferationanddifferentiationofmesodermandneuroectodermderivedcells.，Cell.Differ.，19p.1-17，1986;ThomasK.andGimenezGallegoG.Fibroblastgrowthfactorsbroadspectrummitogenswithpotentangiogenicactivity.TrendsBiochem.Sci.11p81-84，1986)。
另外，將純化程序中自勻漿組織內(nèi)提取的方法由酸性提取改為中性提取并使用蛋白酶抑制物，已得到了一種含154個氨基酸殘基較長形式的FGF(VenoN.，BairdA.，EschF.，LingN.andGuilleminR.Isolationofanaminoterminalextendedformofbasicfibroblastgrwthfactor.Biochrm.Biophys.Res.Commun.，138p.580-588，1986;StoryM.T.，Esch.F.，ShimasakiS.，SasseJ.，JacobsS.C.andLawsonR.K.AminoterminalSequenceofalargeformofbasicfibroblastgrowthfactorisolatedfromhumanbenignprostatichyperplastictissue.BiochemBiophys.Res.Commun.142p.702-709，1987;KlagsbrunM.，SmithS.，SullivanR.，SHingY.，DavidsonS.，SmithJ.A.andSasseJ.Multipleformsofbasicfibroblastgrowthfactoramino-terminalcleavagesbytumorcell-andbraincell-derivedacidproteinases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84p.1839-1843，1987)。
已觀察到FGF的這種微觀不均一性可能是由于在細(xì)胞內(nèi)或在純化期間氨基末端附近部分水解造成的。至少有部分是這樣的。但因為各種形式似乎具有同等活性，所以這種微觀不均一性可能在生理上是無關(guān)緊要的。
在遺傳進(jìn)化中，堿性FGF似乎是極為保守的。例如，牛和人bFGF在其146個氨基酸中只有兩個不同，整個氨基酸順序同源性為98.7%(GospodarowiczD.，NeufeldG.和SchweigererL.Molecularandbiologicalcharacterizationoffibroblastgrowthfactoranangiogenicfactorwhichalsscontrolstheproliferationanddifferentiationofmesodermandneuroectodermderivedcells.，Cell.Differ.，19p.1-17，1986)。
相對于bFGF的是酸性FGF(aFGF)，它與bFGF有55%的總順序同源性。酸性FGF是一種140個氨基酸的多肽，其也可以缺失前6個氨基酸之NH2末端剪切的形式存在(Gimenez-Gallego G.，Corn G.，Hatcher V.B.and Thomas K.A.The complete amino acid sequence of human braimdericed acidic fibroblast growth factor.Biochem.Biophys.Res.Commun.138，p.611-617，1986)。
堿性FGF和酸性FGF具有兩個潛在的肝素結(jié)合區(qū)域，一個位于它們的NH2末端附近，另一個位于COOH末端附近。兩個區(qū)域可能都與FGF對肝素的強(qiáng)親合性有關(guān)(Gospodarowicz D.，Neufeld G.and Schweigerer L.Fibroblast growth factor，Mol.Cell.Endocrin.46 p.187-306，1986;Gospodarowicz D.，Neufeld G.and Schweigerer L.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factoran angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells.，Cell.Differ.，19 p.1-17，1986);BairdA.，SchubertD.，LingN.，andGuilleminR.，Receptor-andheparin-bindingdomainsofbasicfibroblastgrowthfactor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，p.2324-2328，1988)。
aFGF和bFGF的高度同源性，提示它們是由一個原始基因衍生的。最近，已經(jīng)克隆了FGF基因并已測定了bFGF和aFGF的互補(bǔ)DNA順序(AbrahamJ.A.，WhangJ.L.，TumoloA.，MergiaA.，F(xiàn)riedmanJ.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Humanbasicfibroblastgrowthfactornucleotideseguenceandgenemicorganization，EMBOJ.，5p.2523-2528，1986;AbrahamJ.A.，MergiaA.，WhangJ.L.，TumoloA.，F(xiàn)riedmanJ.，HjerrildK.A.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Nucleotidesequenceofabovinecloneencodingtheangiognicprotein，basicfibroblastgrowthfactor，Science233，p.545-548，1986;JayeM.，HowkR.，BrugessG.A..，RiccaW.，ChiuI.M.，RaveraM.W.，O′BrienS.J.，ModiW.S.，MaciagT.andDrolianW.N.HumanendothelialcellgrouwthfactorCloningnucleotidesequenceandchromosomelocalization，Science233，p.541-545，1986)。
對人和牛中cDNA克隆之核苷酸順序的分析提示，堿性FGF的初級轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物包含155個氨基酸。然而，最近Sommer等人已分離出一種在NH2末端有兩個多余氨基酸之新的157個氨基酸形式的人堿性FGF(Sommer A.，Brewer M.T.，Thompson R.C.，Moscatelli D.，Presta M.and Rifkin D.B.A form of human basic fibroblast growth fator with an extended amino terminus，Biochem.Biophys.Res.Commun.144，p.543-550，1987)。
有趣的是，這兩個氨基相應(yīng)于以前描述的人cDNA克隆中的密碼子。圖1中總結(jié)了迄今分離的或根據(jù)cDNA順序推測的堿性FGF的不同形式。圖2則顯示了155氨基酸形式之FGF的一級結(jié)構(gòu)。
如上面提到的，本發(fā)明涉及人堿性FGF的分子變體。已通過對編碼155氨基酸形式FGF之基因的位點特異性誘變獲得了這些以前在自然界中從未見到的新的分子載體。
然而，堿性FGF氨基末端的微觀不均一性及其生理學(xué)不相干性表明，本發(fā)明公開并描述的對155氨基酸形式的修飾等效于可能基于FGF的其他形式得到的同一種FGF(見下述)。
正如已經(jīng)指出的，血管形成是一個嚴(yán)格控制的過程，其保證了它在實體腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要的病理學(xué)作用。從bFGF在血管形成中所起的重要作用看，如果這種與內(nèi)源性FGF競爭的分子變體是生物學(xué)上無活性的，便可以在抗腫瘤治療中作為一種有價值的工具。
另一方面，新毛細(xì)血管生長是在控制再生、生長和發(fā)育的自動調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。因此，提高了生物學(xué)活性的bFGF類似物則可能具有許多潛在應(yīng)用價值，如用于愈合燒傷、創(chuàng)傷(包括角膜創(chuàng)傷)和外科手術(shù)切口;治療皮膚潰瘍(包括褥瘡);心臟病發(fā)作后通過加速損傷組織內(nèi)血管生成而恢復(fù)心肌血流量;以及用于治療某些肌肉骨骼損傷。
因此，本發(fā)明的目的在于設(shè)計并產(chǎn)生已改變了生物學(xué)活性之堿性FGF的重組類似物。
為了了解堿性FGF的氨基酸順序中如何改變會影響其功能性質(zhì)，可以考慮許多與堿性FGF有很高同源性的相關(guān)蛋白質(zhì)，這個蛋白質(zhì)家族包括酸性FGF以及hst和int-2這兩個最近發(fā)現(xiàn)的致癌基因產(chǎn)物(YoshidaT.，MiyagawaK.，OdagiriH.，SakamotoH.，LittleP.F.R.，TeradaM.andSugomuraT.Geromicsequenceofhst，afibroblastgrowthfactorsandtheint-2-encodedprotein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，p.7305-7309，1987;DelliBoviP.，CuratolaA.M.，KernF.G.，GrecoA.，IttmannM.andBasilicoC.AnoncogeneisolatedbyfransfectionofKaposi′ssarcomaDNAencodesagrowthfactorthatisamemberoftheFGFfamily，Cell50，p.729-737，1987)。
包括bFGF在內(nèi)的所有這些分子構(gòu)成了一個參予細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)的因子家族。圖3中比較了這些蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)順序。
當(dāng)考慮這些蛋白質(zhì)之間的同源性時，可觀察到一級結(jié)構(gòu)中的高保守區(qū)域。這些區(qū)域的保守性不僅是結(jié)構(gòu)上的，而且表現(xiàn)于這些蛋白質(zhì)間的某些功能同等性。
這些蛋白質(zhì)確實對肝素有很強(qiáng)的親合力，而且似乎在血管形成過程(可能包括支持腫瘤生長的新的毛細(xì)血管增生)中起到重要作用。
如果保守區(qū)域是這些蛋白質(zhì)具有共同特征的根源，則高度差異的順序便是這些因子有不同生物學(xué)作用的原因。因此，改變?nèi)魏胃叨炔町悈^(qū)域即可顯著地影響堿性FGF的生物學(xué)活性。
基于這些考慮，本發(fā)明人已使用基因工程技術(shù)構(gòu)建了人和牛堿性FGF的新衍生物，其一種情況是在bFGF分子的不同區(qū)域內(nèi)丟失了氨基酸順序，第二種情況是在特定位置上有氨基酸取代。應(yīng)根據(jù)幾種已知生長因子間的同源性和差異選擇修飾方法。有關(guān)分子變體的特征如下所述?？稍谶x擇的表達(dá)系統(tǒng)中獲得以重組蛋白質(zhì)形式的類似物。
當(dāng)bFGF基因在適當(dāng)生物體內(nèi)表達(dá)之前，用基因工程技術(shù)對其進(jìn)行修飾，即可達(dá)到預(yù)期的改變。bFGF基因即是指能夠通過克隆cDNA文庫或組裝合成的寡核苷酸而得到的DNA順序(ManiatisT.，F(xiàn)rischE.F.andSambrookJ.Molecularcloning，Alaboratorymanual，coldspringHarbounLaboratory，ColdSpringHarbour，NY，1982)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)bFGF及其衍生物的重組DNA方法。
分子變體的特征本發(fā)明中，“類似物”、“變體”或“衍生物”是指改變了氨基酸順序的bFGF分子。迄今已分離出的及在引言部分中描述的天然bFGF均可被改變成等價類似物。其中優(yōu)選的類似物是含155個氨基酸的變體。本發(fā)明中人和牛bFGF氨基酸順序都已經(jīng)過了修飾。新的bFGF衍生物則是以寡核苷酸定向誘變方法構(gòu)建的。
特別是本發(fā)明設(shè)計并合成了特定的寡核苷酸以造成人和牛bFGF基因內(nèi)編碼區(qū)的缺失。在“方法”部分中將詳細(xì)描述用以獲得變體的誘變技術(shù)。
可將突變的基因引入可指導(dǎo)新bFGF衍生物合成的大腸桿菌表達(dá)載體內(nèi)。然后純化、定性并最后大量產(chǎn)生重組分子。
下文中將詳細(xì)描述構(gòu)成本發(fā)明主題的新的bFGF衍生物，并在圖4中作一般性的圖解說明。其相應(yīng)于155個殘基形式氨基酸編號即蛋氨基是1號殘基，絲氨酸是155號殘基。但所有已述及的bFGF都可用于構(gòu)建變體。
優(yōu)選的bFGF的衍生物是M1-bFGF，為缺失氨基酸順序中殘基27至32(Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu)的bFGF衍生物;
M2-bFGF，為缺失氨基酸順序中殘基54到58(Glu-Lys-Ser-Asp-Pro)的bFGF衍生物;
M3-bFGF，為缺失氨基酸順序中殘基70至75(Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys)的bFGF衍生物;
M4-bFGF，為缺失氨基酸順序中殘基78到83(Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu)的bFGF衍生物;
M5-bFGF，為缺失氨基酸順序中殘基110到120(Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr)的bFGF衍生物;
M6a-bFGF，為分別在128和129位的賴氨酸和精氨酸殘基被谷氨酰胺取代的bFGF衍生物;
M6b-bFGF，為119和128位的賴氨酸殘基以及118和129位的精氨酸殘基均被谷氨酰胺取代的bFGF衍生物。
分子變體的具體氨基酸順序如圖5所示。
在氨基或羧基末端加有或在兩個末端都加有附加氨基酸殘基的多肽被視為屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的。
從用DNA重組技術(shù)表達(dá)變體的技術(shù)原因看，這樣的延伸可能是必要的(CourtneyM.，JallatS.，TessierL.H.，BenaventeA.andCrystalR.G.SynthesisinE.Coliofalfal-anti-trypsinvariantsoftherapeuticpotentialforemphysemaandthrombosisNature313，p.149-151，1985;NagaiL.andThogersenH.C.Generationofβ-globinbyseguencespecificproteolysisofahybridproteinproducedinE.Coli.Nature，309，p.810-812，1984)。
另外，附加殘基可用于提高變體的藥理學(xué)效能，如通過延長其在血漿內(nèi)的循環(huán)半壽期。
建立了生產(chǎn)變體的具體方法。
為了有效地產(chǎn)生新的bFGF衍生物，我們建立了在實驗室和中試規(guī)模上制備為對不同分子進(jìn)行生物學(xué)和臨床估價所需量之變體的重組DNA方法。
該方法是基于發(fā)酵培養(yǎng)出經(jīng)基因工程技術(shù)修飾，從而可在高水平上表達(dá)突變基因之大腸桿菌的菌株。
具體生產(chǎn)程序包括1)表達(dá)bFGF的合成DNA序列的構(gòu)建用合成方法重組構(gòu)建用于表達(dá)野生型堿性FGF和其衍生物的所有順序。此可通過使用自動DNA合成儀(如AppliedBiosystem公司的380B型DNA合成儀)合成含交迭順序的寡核苷酸來完成(CaruthersM.H.Genesynthesismachines;DNAchemistryanditsuses.Science，230，p.281-285，1985)。
連接交迭寡核苷酸以形成雙股DNA鏈，并用DNA聚合酶和T4連接酶充填缺口。
直接在有意義鏈的FGF編碼順序之5′端提供了一個ATG起始信號。就155氨基酸形式的bFGF來說，我們可使用天然存在編碼第一個氨基酸殘基之蛋氨酸的ATG作為起始密碼子，這樣就沒有額外的氨基酸加到被表達(dá)之多肽的N末端(AbrahamJ.A.，WhangJ.L.，TumoloA.，MergiaA.，F(xiàn)riedmanJ.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Humanbasicfibroblastgrowthfactornwcleotidesequenceandgenomicorganization，EMBOJ.，5，p.2523-2528，1986;AbrahamJ.A.，MergiaA.，WhangJ.L.，TumoloA.，F(xiàn)riedmanJ.，HjerrildK.A.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Nucleotidesequnenceofabovinecloneencodingtheangiogenicprotein，basicfibroblastgrowthfactor，Science233，p.545-548，1986)。
另外，為提高FGF在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)，可在不改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的情況下改變其5′末端順序。更具體地說，即是按圖6所示修飾核苷酸順序。
2)表達(dá)bFGF衍生物之突變順序的構(gòu)建為得到本發(fā)明中所述的變體，可改變野生型bFGF，使之產(chǎn)生預(yù)期的缺失。為此可用位點特異性誘變方法進(jìn)行基因修飾(NorrisK.，NorrisF.，ChrisiansenL.andFiilN.Efficientsite-directedmutagenesisbysimultaneoususeoftwoprimers，NucleicAcidResearch11，5103-5112，1983)。
該方法的原理是將bFGF基因再克隆到能夠以單鏈形式得到的載體(如噬菌體載體M13)內(nèi)。該重組單鏈則與編碼所需修飾部分的互補(bǔ)性合成寡脫氧核苷酸退火。然后使用DNA聚合酶和連接酶延伸新鏈并將其連接成環(huán)形。用新產(chǎn)生的異源雙鏈DNA轉(zhuǎn)化一個使之能在其中復(fù)制并產(chǎn)生子代的細(xì)胞系，在這里攜帶野生型基因或有所需缺失之基因的噬菌體將分離為兩種不同的分子。
然后可用起始誘變寡核苷酸作探針去識別突變的基因。位點針對性誘變技術(shù)將在“方法”部分中詳細(xì)描述。
具體地說，是將編碼野生型bFGF(?；蛉说?的合成順序插入到M13載體中，并用所得單鏈作為誘變模板(NorrisK.，NorrisF.，ChristiansenL.andFiilN.Efficientsiite-directedmutagenesisbysimultaneoususeoftwoprimers，NucleicAcidResearch11，p.5103-5112，1983)。
3)野生型bFGF及其衍生物的表達(dá)為在大腸桿菌中的重組體菌株中表達(dá)bFGF的野生型和突變順序，可將這些順序插入到攜帶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯新基因之順序的表達(dá)質(zhì)粒中。更具體地說，我們使用了大腸桿菌的色氨酸啟動子和λCⅡ蛋白的核糖體結(jié)合位點區(qū)域作為調(diào)節(jié)信號(HendrixR.W.，RobertsJ.W.，StahlF.W.andWeisbergR.A.LambdaⅡ，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpringHarbour，N.Y，1983)。
啟動子Ptrp得自產(chǎn)品質(zhì)粒pDR720(Pharmacia)。Shine-DalgarnoCⅡ順序則是根據(jù)已公布的順序用化學(xué)合成方法制得的(HendrixR.W.，RobertsJ.W.，StahlF.W.andWeisbergR.A.LarnbdaⅡ，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpringHarbowr，N.Y，1983)。
圖7中圖群顯示了用于野生型bFGF及其衍生物的典型表達(dá)載體。具體地說，它是經(jīng)組裝下列片段而構(gòu)建的a)質(zhì)粒pDS20的大的EcoRⅠ-BamHⅠ片段(DuesterG.，ElfordR.M.，HolmesW.N.FusionoftheEscherichiacolileucyltransfer-RNA-IPromotertothegal-Kgene，Analysisofseguencesnecessaryforgrowthratedependentregulationcell30，p.855-964，1982);
b)質(zhì)粒pDR720的EcoRⅠ-SalⅠ片段(Pharmacia，Sweden)，其攜帶色氨酸啟動子;
c)合成的編碼CⅡ核糖體結(jié)合位點的SalⅠ-NdeⅠ寡核苷酸;
d)合成的攜帶編碼bFGF和其衍生物之野生型或突變順序的NdeⅠ-XhoⅡ(BamHⅠ-可相容的)片段。
圖6中給出了編碼野生型bFGF的優(yōu)選順序。編碼bFGF類似物的優(yōu)選順序是按圖5所示突變情況對該順序進(jìn)行修飾得到的。
對新基因表達(dá)的誘導(dǎo)和對所得重組蛋白的分析如“方法”部分所述。
4)重組分子的純化及生物學(xué)檢測可由細(xì)菌溶胞產(chǎn)物中純化重組突變體，并在與野生型bFGF平行進(jìn)行的比較實驗中檢測其生物學(xué)特征。
典型的純化方法是用超聲波破碎細(xì)胞，離心并將上清液過S-Sepharose離子交換柱。
用氯化鈉梯度洗脫蛋白質(zhì)并直接加于肝素-Sepharose親合柱上。
用氯化鈉梯度洗脫蛋白質(zhì)并用凝膠過濾法除鹽，然后凍干。如此純化的類似物即可用于生物學(xué)活性檢測。
變體的性質(zhì)、其實用性及使用方法。
本發(fā)明的新分子可用作野生型bFGF分子的拮抗物和/或增效物。
可參照Presta等人所述的方法(MolecularandCellularBiol.6，p.4060，1986)，基于增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力來估計bFGF增效活性。
可參照Baird等所述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，p.2324，1988)，基于125I-bFGF的結(jié)合抑制率來估計bFGF拮抗活性。
例如，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)以1ng/ml的劑量給予本發(fā)明縮寫為M6b的化合物時，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力提高50%，此表明其具有特別明顯的bFGF增效活性。
另如，當(dāng)存在300ng/ml本發(fā)明縮寫為M3-bFGF和M6a的變體化合物時，125I-bFGF(3ng/ml)的結(jié)合抑制率分別約為20%和70%，此即表明它們具有bFGF拮抗活性。
作為bFGF增效物，本發(fā)明的化合物可用作血管形成、細(xì)胞生長或細(xì)胞存活的促進(jìn)劑，用于組織修復(fù)，如創(chuàng)傷、燒傷、骨折、表面損傷、潰瘍的愈合，還包括心肌缺血和梗塞期間的組織修復(fù)。
作為bFGF的拮抗物，本發(fā)明的化合物可用作血管形成抑制劑，故可用于治療以新血管生成為主要病理改變的疾病，如眼視網(wǎng)膜病、神經(jīng)血管性青光眼、皮膚病如牛皮癬、慢性炎癥、濕風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及如前所述用于治療某些腫瘤，特別是可作為抑制腫瘤血管生成有價值工具用治療血管生成性腫瘤。
本發(fā)明的化合物可與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或稀釋劑結(jié)合，制成一種藥物組合物用于哺乳動物和人體。
活性物質(zhì)的實用劑量將根據(jù)病人的年齡、體重和狀態(tài)，以及給藥途徑和預(yù)期的療程而定。
該醫(yī)藥組合物可經(jīng)局部、眼、口、靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥，可使用常用賦形劑以常規(guī)方法配制。
局部用藥時，可將活性成分與常用的油脂或乳化佐劑混合制成乳劑、洗劑或糊劑。局部使用的洗劑可含有10-100mg/ml活性物質(zhì)，并可每天在感染部位施用達(dá)7次。
用于滴眼時，可在緩沖液或生理鹽水或其他適當(dāng)賦形劑中配成藥水。
口服給藥時可配制成片劑或膠囊劑，其中可含有活性成分及稀釋劑，如乳糖、右旋糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉;潤滑劑如硅膠、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣，和/或聚乙二烯;粘合劑如淀粉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮;解聚劑劑淀粉、藻酸、藻酸鹽或淀粉甘醇酸鈉;發(fā)泡混合物;著色劑;甜味劑;潤滑劑如卵磷脂、多乙氧基醚、十二烷基硫酸鹽;以及一般用于醫(yī)藥配方中的非毒性、無藥理學(xué)活性的物質(zhì)。可按已知方法，經(jīng)混合、造顆、壓片、包糖衣或包膜等過程制造所說的藥物制劑。
用于肌肉內(nèi)注射的懸浮液或溶液可含有活性化合物及其藥醫(yī)上可接受的載體，如無菌水、橄欖油、油酸乙脂、二元醇如α-丙二醇，必要時還可含有適當(dāng)量的鹽酸利多卡因。
用于靜脈內(nèi)注射或輸注的溶液可含有無菌水(最好是無菌等滲鹽溶液)作為載體。
本發(fā)明的化合物可以作為其醫(yī)藥上可接受的鹽或絡(luò)合物使用。
作為鹽，可以是與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸鹽，以及有機(jī)酸如馬來酸、檸檬酸、乙酸、苯甲酸、琥珀酸、抗壞血酸和酒石酸形成的酸加成鹽。
絡(luò)合物的例子如鋅或鐵絡(luò)合物。
方法1)質(zhì)粒的構(gòu)建使用自動DNA合成儀(AppliedBiosysten，380B型)合成含有交迭順序的寡核苷酸，得到合成的DNA片段。將片段再克隆到M13載體中之后用雙脫氧法測定核苷酸順序(MessingJ.MethodsEnzymol，101，p.20-78，1983)。
使用限制性內(nèi)切酶、連接酶和聚合酶(按制造商推薦的劑量和使用方法)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞(ManiatisT.，F(xiàn)rischE.F.andSambrookJ.MolecularCloning，Alaboratrymanual，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpeingHarbour，NY，1982)。
2)誘變將編碼野生型bFGF(人或牛形式的)的合成順序再克隆到M13噬菌體載體中。按照已公開的方法(MessingJ.MethodsEnzymol.101，p.20-78，1983)培養(yǎng)單鏈形式的重組噬菌體載體。取20ng這些M13單鏈DNA在10mMTris-HCl(pH7.5)、0.1mMEDTA、50mMNaCl中于95℃下加熱5分鐘，并經(jīng)逐步冷卻至室溫與合適的寡核苷酸一起退火。然后加入下列各組分ATP加到0.4mM(終濃度);dCTP、dGTP、dTTP加到0.12mM;dATP加到0.04mM;1單位大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段及0.5單位T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)。終體積為50μl的35mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1mM EDTA、6mM MgCl2、0.006mM DTT。于15℃下保溫12小時后，用該DNA按已公開的方法(Manniatis T.，F(xiàn)risch E.F.and Sambrook J，Molecular cloning，ALaboratory manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1982)轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM101細(xì)胞。
在含有10mM MgCl2、5mM DTT和10單位T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)的70mM Tris-HCl緩沖液(pH8)中，于50μl于37℃保溫30分鐘的反應(yīng)混合物內(nèi)，使用150μCi(r-32P)ATP(New Emgland Nuclear，6000 Ci/mmol)放射標(biāo)記用以引起預(yù)期突變的寡核苷酸。然后用標(biāo)記的寡核苷酸與誘變的噬菌體DNA進(jìn)行噬班雜文。
在含有3×SSC、0.1%SDS、10×Denhardt氏液和0.2mg/ml變性鮭魚精子DNA的10mMTris-HCl緩沖液(pH8)中于65℃下雜交過夜。
在幾次變液的0.4×SSC、0.1%SDS中于65℃下將硝酸纖維素濾膜洗滌30分鐘，并對X光膠片曝光過夜。使用AmershamM13順序檢測藥盒，以Sanger氏雙脫氧核苷酸順序測定法檢測顯示陽性雜交之噬斑的核苷酸順序。
3)基因表達(dá)的誘導(dǎo)和分析用含有四環(huán)素(3μg/ml)的Luria核養(yǎng)液培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。用添加于0.4%葡萄糖、0.4%酪蛋白氨基酸和10mg/ml硫胺素的M9培養(yǎng)基誘導(dǎo)處于色氨酸啟動子控制下的基因表達(dá)。
在沒有色氨酸的M9培養(yǎng)基中生長6小時后，離心收集細(xì)胞。沉淀細(xì)菌培養(yǎng)物的等分樣品，用載樣緩沖液重新懸浮并用Laemmli所述的SDS-PAGE法分析之(LaemmliU.K.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，Nature227，p.680-685，1970)。
另外，也可用溶菌酶或超聲波破碎細(xì)胞，并分別分析經(jīng)離心分離的可溶性和不溶性部分。電泳后用考馬氏亮蘭染色凝膠中的總細(xì)胞蛋白質(zhì)。
用抗合成肽(含bFGF衍生的順序)的多克隆兔抗血清探查Western轉(zhuǎn)移印跡。按生產(chǎn)商推薦的方法使用包含生物素化羊抗兔IgG(作為第二抗體)的VectastainABC藥盒(VectorLaboratories，Ca.USA)進(jìn)行檢測。


圖1圖示了迄今分離的不同天然形式的堿FGF。已根據(jù)cDNA核苷酸順序推斷出的含155個氨基酸的bFGF。
圖2顯示了人和牛FGF的氨基酸順序。兩順序的差異在121和137位。相當(dāng)于牛bFGF的氨基酸(不同于人形式者)用黑體符號示出。
圖3為前已公開發(fā)表的資料(YoshidaT.，MiyagawaK.，OdagiriH.，SakamotoH.，LittleP.F.R.，TeradaM.andSugimuraT.Genomicsequenceofhst，atransforminggeneencodingaproteinhomologoustofibroblastgrowthfactorsandtheint-2-encodedprotein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84p.7305-7309，1987)。
hst蛋白、人堿性FGF(hbFGF)、人酸性FGF(haFGF)及小鼠int-2蛋白的完整氨基酸順序?qū)?zhǔn)排列并互相比較。短橫線指示為有最適排列而插入的間隙。完全相同于hst順序的殘基括在方框內(nèi)，順序上方的編號以hst為準(zhǔn)。
圖4圖示了堿性FGF衍生物。編號是指155氨基酸bFGF的順序編號。涂黑的區(qū)域代表缺失的氨基酸順序。黑點代表單個氨基酸取代。
圖5并列顯示了人bFGF及其變體的完整氨基酸順序。短橫線指示缺失的氨基酸。星號代表單個氨基酸置換。
圖6為人和牛bFGF的核苷酸順序。該順序是用合成法重新構(gòu)建的，并用于表達(dá)bFGF。用星號標(biāo)示前20個氨基酸的密碼子，它們已在沒有改變相應(yīng)氨基酸殘基的情況得以修飾。編碼牛順序中兩個不同氨基酸的密碼子在相對之密碼子下方并列示出。
圖7中pDS20代表用于構(gòu)建bFGF表達(dá)質(zhì)粒的通用質(zhì)粒本底物。用bFGF基因取代galk基因，并向其中插入得自λ噬菌體的表達(dá)信號Ptrp和Shine-Dalgarno順序“CⅡ”以構(gòu)建pEC80。
本發(fā)明涉及到分離新的堿性FGF分子衍生物。所說的堿性FGF分子可以是人或牛來源的。
使用DNA重組技術(shù)制得的這些新衍生物都是155氨基酸bFGF的缺失或置換變異體。據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)，可以分離到人或牛不同形式的堿性FGF，其不同僅在于氨基末端延伸的長度。具體地說，短到126個氨基酸或長到157個氨基酸的bFGF均具有等同的活性。
本發(fā)明人已在bFGF分子的完全不同于該異源氨基末端區(qū)的區(qū)域中完成了突變。例如使用了155氨基酸形式的bFGF。因此，很顯然也可以對其他形式的bFGF，如含有126個到157個氨基酸的bFGF，進(jìn)行代表了本發(fā)明之主題的修飾。
如前所述，本發(fā)明的新分子可以作為野生型bFGF分子的拮抗物和/或超級增效物。另如上面所指出的，bFGF的拮抗物可能是抑制腫瘤血管形成的十分有價值的治療工具。而bFGF的超級增效物與天然順序相比則表現(xiàn)有改善了的藥理學(xué)性質(zhì)。
對本發(fā)明化合物之生物學(xué)活性的估計，可明確鑒別bFGF分子中某些對bFGF的生物學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)特別重要的區(qū)域。
經(jīng)鑒定這些區(qū)域，特別是衍生物M1-bFGF、M2-bFGF和，M3-FGF中缺失的區(qū)域，指示在同樣區(qū)域中進(jìn)行進(jìn)一步突變(如置換、缺失或修飾)可產(chǎn)生治療上更為有效的bFGF衍生物。
這些進(jìn)一步的突變也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如前面已述及的，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這些新的分子整體的DNA重組方法。令人感興趣的是，該方法也可成功地應(yīng)用于生產(chǎn)野生型bFGF。另外，所有這些考慮對人和牛堿性FGF順序都是有效的。
本發(fā)明說明書中公開的DNA重組方法，是基于使用用攜帶編碼預(yù)期的FGF分子之基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株而進(jìn)行的。當(dāng)然，本發(fā)明人也注意到已公開的其他DNA重組方法這一事實(IwaneM.，KurokawaT.，SasadaR.，SenoM.，NakagawaS.，IgarashiK.ExpressionofcDNAencodinghumanbasicfibroblastgrowthfactorinE.Coli，Biochem.Biophis.Res.cCommun.146，p.470-477，1987)。但本文所公開的方法就其新穎性和重組bFGF的產(chǎn)量特征來說，此前卻從未描述過。
該方法的主要特征之一是用作生產(chǎn)堿性FGF的宿主的大腸桿菌菌株的類型。事實上，菌株的類型是影響大腸桿菌中異源基因表達(dá)的主要參數(shù)之一(HarrisT.J.R.andEmtageJ.S.ExpressionofheterologousgeneinE.ColiMicrobiologicalSciences3，p.28-31，1986)。
根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)B型大腸桿菌菌株是用于生產(chǎn)重組bFGF及bFGF衍生物的十分有效的宿主。當(dāng)將相同的bFGF表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到其他大腸桿菌(K-12型、C型等)內(nèi)時，確實并不能產(chǎn)生同樣多的bFGF。
本方法的第二個特征是與在編碼不同bFGF分子的基因內(nèi)導(dǎo)入某些“最適密碼子”。事實上，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，為了提高表達(dá)水平，在不改變氨基酸順序的情況下修飾一定數(shù)目的DNA密碼子是必要的。本發(fā)明說明書中公開的順序(見圖6)是優(yōu)選的DNA編碼順序。
用作宿主的菌株類型和最適密碼子這兩個特征構(gòu)成了本發(fā)明用于生產(chǎn)bFGF及其突變型之DNA重組方法的新穎性方面。適用于生產(chǎn)堿性FGF的這兩方面的特征，在迄今為止的科學(xué)文獻(xiàn)中從未提到或發(fā)表過。
權(quán)利要求
1.制備選自下列一組中之堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物的DNA重組方法a)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物；其特征在于缺失氨基酸殘基27至32(Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；b)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于缺失氨基酸殘基54至58(Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；c)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于缺失氨基酸殘基70至75(Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；d)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于缺失氨基酸殘基78至83(Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；e)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于缺失氨基酸殘基110至120(Asn-ASn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；f)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于用谷氨酰胺(Gln)殘基取代氨基酸殘基128(Lys)129(Arg)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF；以及g)一種人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物，其特征在于用谷氨酰胺(Gln)殘基取代所有氨基酸殘基118(Arg)、119(Lys)、128(Lys和129(Arg)，上述氨基酸殘基的序號相當(dāng)于155氨基酸形式的人或牛堿性FGF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備人或牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子衍生物的方法，所說的衍生物包括具有根據(jù)權(quán)利要求1之突變的其他天然形式的人或牛bFGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備任何前述權(quán)利要求所述的bFGF衍生物的方法，其中所說的衍生物還在氨基和/或羧基末端包含附加的氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備前述權(quán)利要求所述之bFGF衍生物的方法，其中所說的衍生物有或沒有糖苷側(cè)鏈。
5.用于表達(dá)基因組DNA、cDNA、合成的或經(jīng)修飾的基因之表達(dá)質(zhì)粒pFC80，其中所說的基因編碼天然或經(jīng)修飾的人或牛bFGF氨基酸順序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)質(zhì)粒，其至少包含一個對一種抗生素具有抗性的基因或任何其他可選擇的標(biāo)志。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的表達(dá)質(zhì)粒，它用于表達(dá)編碼權(quán)利要求1之衍生物的基因。
8.B型大腸桿菌菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求1之重組衍生物。
9.利用權(quán)利要求5的質(zhì)粒和B型大腸桿菌菌株生產(chǎn)權(quán)利要求1的衍生物。
10.如圖6所示的DNA編碼順序。
11.基于結(jié)合使用B形大腸桿菌菌株及圖6所示的DNA順序以生產(chǎn)人和牛bFGF的重組DNA方法。
12.基于結(jié)合使用B形大腸桿菌菌株和圖6所示的DNA順序以生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1之衍生物的DNA重組方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)衍生物。這些bFGF衍生物可在血管形成過程中用作野生型分子的拮抗物和/或超級增效物。可使用已用攜帶編碼人和牛bFGF及其衍生物之核苷酸順序的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株制備這些衍生物以及野生型bFGF。
文檔編號C07K14/00GK1041181SQ89107069
公開日1990年4月11日 申請日期1989年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月16日
發(fā)明者波爾功造尼·勞拉, 伊薩奇·安東尼拉, 沙米恩道斯·帕洛, 考埃特·奇里斯 申請人:法米塔利亞·卡洛·阿巴有限責(zé)任公司