專利名稱：從有甲基-三硫代基團的化合物中制備抗腫瘤劑和抗生素的取代的二硫化衍生物及其靶形式的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及LL-33288復合物的α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ、δ和假糖苷配基組份的二硫化合物以及它們的衍生物，本發(fā)明也涉及稱為BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724抗生素的二硫化物化合物以及它們的衍生物，通過使抗生素與未取代或取代的烷基硫醇反應而制得這些衍生物。這些二硫化物化合物是有效的抗腫瘤劑。
本發(fā)明也闡述了由上列材料制得的二硫化物類似物的載體藥物配對物。配對物的載體(具靶向性的)部分可以是下列形式單克隆或多克隆抗體;它們的碎片化學或基因處理過的對應物生長因子;或類固醇。本發(fā)明包括載體藥物配對物的使用方法及其制備方法。


圖1稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的紫外光譜。
圖2稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的紅外光譜。
圖3稱由N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的質子核磁共振光譜。
圖4稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的C-13核磁共振光譜。
圖5稱為碘代LL-E33288假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的紫外光譜。
圖6稱為碘代LL-E33288假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的紅外光譜。
圖7稱為碘代LL-E33288假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的質子核磁共振光譜。
圖8稱為碘代LL-E33288假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的C-13核磁共振光譜。
1986年5月28日公開的歐洲專利公報第0182152A3號描述了稱為LL-E33288復合物的抗菌素和抗腫瘤劑族，并表明對其的專利。它們可用來制備二硫化物抗腫瘤劑，而二硫化物抗腫瘤劑也是本發(fā)明用作制備相應靶形式的一些起始物料。
歐洲專利公報第0182152 A3號闡述了LL-E33288復合物、它的組份，即LL-E33288 αBr1、LL-E33288 αI1、LL-E33288 αBr2、LL-E33288 αI2、LL-E33288 αBr3、LL-E33288 αI3、LL-E33288 αBr4、LL-E33288 βBr1、LL-E33288 βI1、LL-E33288 βBr2、LL-E33288 βI2、LL-E33288 γBr1、LL-E33288 γI1和LL-E33288 δI1，以及它們的制備方法，即采用Micromonospora echinospora ssp calichensis的新菌株或采用它們的天然突變體或派生的突變體通過需氧發(fā)酵生產出上述復合物及它的組份。歐洲專利公報第0182152 A3號也揭示了一些上列組份的可能結構式。這結構式列于表1中。
表1從自然界中分離得到的CH3-SSS-W的結構式(其中W是附在CH3-SSS-下面的取代基)
名稱 R1R2R3R4R5R6R7XE33288α12Ar1R2′H H C2H5IE33288α13Ar1H H R4′IE33288β11Ar1R2′H R4′(CH3)2CH IE33288γ11Ar1R2′H R4′C2H5IE33288δ11Ar1R2′H R4′CH3IR33288βBr1Ar1R2′H R4′(CH3)2CH BrE33288γBr1Ar1R2′H R4′C2H5BrE33288αBr2Ar1R2′H H C2H5BrE33288αBr3Ar1H H R4′BrEsperamlcln A1CH3R2′R3′(CH3)2CH H Ar2Esperamlcln A2CH3R2′R3′(CH3)2CH Ar2HEsperamlcln A1bCH3R2′R3′CH3CH2H Ar2
在于1988年8月3日公開的歐洲專利公報第027485A2號中闡述并要求保護LL-E33288復合物族中的其它組成對于制備二硫化物衍生物和本發(fā)明抗腫瘤劑的靶形式同樣是有用的。該申請闡述了LL-E33288系列中溴代-和碘代-假糖苷配基物，它們已經化學方法制得。該申請也闡述了通過硼氫化鈉還原反應使C11位上的酮還原成羥基而從所有上列的抗腫瘤抗生素中得到二氫衍生物。后面物質的結構式列于表2中。
在我們同時提交的相關申請(30，553-01)中闡述并要求保護抗腫瘤抗生素LL-E33288族中的另一些組成，這些物質對于制備本發(fā)明中抗腫瘤劑另外一些靶型也是有用的。該申請闡述了用化學方法制得的LL-E33288復合物N-?；苌锏囊恍┙M成。它們的結構式同樣列于表2中表2從表1化合物通過化學方法得到的CH3-SSS-W的結構式(其中W是附于CH3-SSS-下面的取代基)
R＝二氫或支鏈或非支鏈烷基(C1-C10)或亞烷基(C1-C10)、芳基或雜芳基、或任意地被一個或多個羥基、氨基、羧基、鹵素、低級(C1-C2)烷氧基或低級(C1-C6)硫代烷氧基所取代的烷基(C1-C6)或雜芳基-烷基(C1-C6)基團。
在本發(fā)明中某些其它的抗腫瘤化合物和抗生素化合物是有用的，即1)埃斯波霉素(esperamicin)BBM-1676，一種強有力抗腫瘤抗生素的新種類。見J.Antibiotis，38，1605(1985)中M.Konishi，et，al作I物理化學數(shù)據(jù)和部分結構式。一種新的抗腫瘤抗生素復合物，見M.Kenishiet.al.，英國專利申請GB2，141，425A，1984年5月15日。
2)新的抗腫瘤抗生素，F(xiàn)R-90045和FR-90046I.Taxonomyoftheproducingstrain.M.Iuami，et.al.，J，Antiobiotics38，835(1985)。新的抗腫瘤抗生素FR-900405和FR-90046。Ⅱ.生產、分離、特征以及抗腫瘤活性。B，Kiyotoet.al.，J.Antibiotics，38，340(1985)。
3)PD114759和PD115028，有出眾效力的新穎的抗腫瘤抗生素。Ⅰ.分離和特征。R.H.Bunge，et.al.，J，Antibiotics，37，1566(1984)。新穎的抗腫瘤抗生素PD114759和相關衍生物的生物和生化活性。D.W.Fryet.al.，InvestigationalNewDrugs，壬，3(1986)。
4)用Streptomyoessp.ATCC39363生產的新的抗生素復合物CL-1577A、CL-1577B。歐洲專利申請0，132，082，A2。
5)CL-1577D和CL-1577E抗生素抗腫瘤化合物，它們的生產及使用。美國專利4，539，203。
6)CL-1724抗生素化合物，它們的生產及使用。美國專利4，554，162。
7)從具疣的放線菌族(actinomoduraverrucosoporastrains)H964-92(ATCC39334)或AB27Y(ATCC39638)中發(fā)酵得到的新的抗腫瘤抗生素BBM-1675-A3和BBM-1675-A4。美國專利4，675，187。
8)具有抗微生物活性和抗腫瘤活性的新的N-乙?；?埃斯波霉素A1、A2和A1b衍生物。歐洲專利第289，030。
上面所有關于BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD-114659、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E和CL-1724的信息，這些列出，僅供參考。愛斯波霉素A1、A1和A1b(BBM-1675復合物)以及它們相應的N-乙酰基衍生物的完整結構已在表1和表2中列出，上列的其它抗腫瘤抗生素的物理性質表明它們與愛斯波霉素的結構相同或極其相似，都含有一個甲基三連硫基官能團。
從上面揭示的結構中可以看出，α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ1、δ和LL-E33288復合物的假糖苷配基組份、它們的二氫和N-?；鶎?、以及BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E和CL-1724抗生素以及它們的N-?；鶎镌谄浣Y構上各自包含一個甲基三連硫代基團。
已經揭示使上述任一種抗生素與非取代或取代的烷基硫醇或芳基硫醇反應結果在三硫化物部分的甲基過硫化陰離子被取代形成了穩(wěn)定的下面的二硫化物(反應式Ⅰ)。在1989年5月3日公開的歐洲專利第0313874A2號中揭示了適合于該轉化形式的其它化合物。
根據(jù)反應式Ⅰ用含巰基的有機分子將表1和2中的化合物轉化生產出用作抗生素和抗癌劑的新的化合物，在其右側中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2′、R3′、R4′、R5′、Ar1、Ar2和X的定義與表1和表2中的定義相同，Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團、二價或三價的芳基或芳雜基、二價或三價的(C1-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價或三價的芳基(C1-C18)、或雜芳烷基(C1-C18)基團、二價或三價環(huán)烷基(C1-C18)或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)，或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳雜氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、巰基或低級烷硫基團所取代;Q是氫、鹵(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷基、哌嗪基、羰基、硝基苯氧基羰基、羰醛基、低級氧基、羥基、硫羥基、低級烷基二羧酸基，或者Q是從下列基團中選出來的基團-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;只要Sp是亞乙基，Q不能是氫;如果CH-SSS-W是LL-33288α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-90046、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二價基團時，Q不能是氫、鹵(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、芳雜氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羰基。
作為本發(fā)明一個較好的實例，以名稱為LL-E33288(CH-SSS-W)的抗腫瘤抗生素中制備式為Q-Sp-SS-W的二硫化物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2;X是碘原子或溴原子;R5是氫或RCO基團(其中R是氫、CH3或單取代的芳基)，Sp和Q的定義同上。
用多種含巰基的有機分子使列于表1和表2的化合物轉化成各種二硫化物以得到新穎的抗腫瘤劑和抗生素。此外，從反應本身所得的產物可進一步引入新的側鏈產生具有生物活性的更為新穎的化合物。
本發(fā)明的化合物除了用于抗腫瘤劑和抗生素外，它們對于在細胞水平評估抗瘤活性的新模式也是有用的。上列申請和專利闡述的天然取得的抗生素不含有充分強的發(fā)色單元所以它們在細胞內的區(qū)域不能定量表示。當使天然的三硫代甲基衍生物與含巰基分子反應時可產生對于研究DNA雙鏈裂解及這類化合物的細胞定域有用的生化工具，含巰基分子另外還含有在電磁譜區(qū)域吸收或發(fā)射光而不被細胞發(fā)色團所遮掩的發(fā)色單元。相似地，通過該反應引入同位素標記也在本發(fā)明的范圍里。因此，例如，當使E-33288C1-I與7-(2-硫代乙氨基)-4-甲基香豆素反應時，得到一個衍生物它在紫外光的照射下發(fā)出強烈的熒光，從而定位化合物處于細胞小室的區(qū)域。
在本發(fā)明的具體例子中，根據(jù)反應式Ⅰ用含巰基的有機分子將表1和表2中的化合物轉變成另外用作分子探針的新組合物，其中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2′、R3′、R4′、R5′、Ar1、Ar2和X的定義與前面表1和表2的定義相同，Sp是直鏈或支鏈二價(C1-C18)基團、二價芳基或雜芳基、二價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價芳基或雜芳基烷基(C1-C18)、二價環(huán)烷基或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)以及二價(C2-C18)不飽和芳基;Q是未取代或取代的二苯并噁嗪、若丹明、喹諾酮、甲基香豆素、熒光素或吖啶的發(fā)熒光核，或者Q是含有3H、14C、35S或32P同位素作為其結構式一部分的取代基。
也已發(fā)現(xiàn)列于表1和表2化合物及反應式Ⅰ描記的化合物的甲基三連硫代單元的取代可用來引入隔離物(Sp)，明智的選擇是將靶單元引入到本申請的二硫化物衍化物中。在歐洲專利公報第0313873A號(1989年5月3日公開)中揭示了將靶單元引入到其它二硫化物衍生物中。因此，參照反應式Ⅰ，式CH3S S S-W化合物可首先與式Q-SP-SH化合物反應，(其中CH3S S S-W是名稱為LL-33288αBr1、αI1、αBr2、αBr2、αI3、αBr3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γBr2、δI1、碘代或溴代的假糖配基，它們的二氫對應物或N-乙?；鶎铩BM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的乙?；鶎锏目鼓[瘤抗生素)產生一間產物
其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團、二價或三價芳基或雜芳基、二價或三價的(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價或三價的芳烷基(C1-C18)或雜芳烷基(C1-C18)、二價或三價的環(huán)烷基烷基(C1-C18)或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、巰基或低級烷硫基所取代，如果CH3-SSS-W是作為抗腫瘤抗生素LL-E-33288，α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724的母體，Sp不能是二價基團;Q是，或可被轉化為，鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、巰基、α-鹵代乙酰氨基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3′
條件是Sp
并且W如上述表1和表2所示。
只要從反應式中得到的產物含有至少一個官能團，它能轉變成上列專利和申請的抗腫瘤抗生素的靶形式或直接與靶單元(Tu)反應形成上列專利的抗腫瘤抗生素的靶形式，就可有如下面反應流程Ⅱ所示的應用。
反應式Ⅱ其中Q、Sp和W與前面的定義相同，Tu是單克隆抗體或多克隆抗體、它的碎片、它的化學處理對應物或基因處理對應物、或是生長因子或類固醇;Y是蛋白質的側鏈氨基、羧基或巰基、從碳水化合物殘留物中衍生出來的醛或是酰氨烷基硫代基;n是從1至100的一個整數(shù);讓基團Q和Y直接進行或在以后的還原反應后進行共價反應形成Z，Z是-CONH-，-CONHN-CH-、-CONHNHCH2-，-NHCONHN＝CH-、-NHCONHNHCH2、-NHCSNHN＝CH-，-NHCSNHNHCH2-，-ON＝CH-，-NH-，-NHCH2-，-N＝CH-，-CO2-，-NHCH2CO2-，-SS-，
m是0.1至15作為例子并參照上述反應式Ⅱ，當N-乙酰基E-33288 γ21(Q＝CO2H，Sp＝-CH2CH2-)的3-巰基丙酸衍生物轉化成它的活化的羥基琥珀酰亞胺形式時，在pH7.0-9.5水緩沖溶液中及在4℃-40℃溫度間它可與賴氨酸殘基的氨基(例如，Tu＝單克隆抗體，Y＝-NH2其中n＝50-100它能從賴氨酸殘基中得到)發(fā)生作用產生抗生素的靶形式，它附屬在蛋白質骨架鏈上的無規(guī)位置上(Tu＝單克隆抗體，Z-NHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝1-10)。由于高負載常被認為不利于抗體的免疫活性，所以用該方法只對一部分賴氨酸殘基進行取代。用其它的羧基活化劑諸如各種碳化二亞胺或相關的?；B氮化物從3-巰基丙酸衍生物中也可制備相同的無規(guī)取代的免疫結合物?？商鎿Q的是，如美國專利第4，671，958號所述的，在pH4-7間的緩沖水溶液內并在4℃-40℃間的溫度下使N-乙?；鵏L-E33288 δ21的3-巰基丙酰肼衍生物(Q＝H2NNHCO-，Sp＝-CH2CH2-)與氧化的高碘酸鹽抗體(Tu＝單克隆抗體，Y＝-CHO，n＝1-15)反應時，反應只發(fā)生在醛官能團上(從位于抗體Fc端上碳氫化合物殘基雌二醇(Vic、diols)的裂解中衍生出來)產生單克隆抗體結 ，它包含取代在蛋白質骨架特定位點上的藥物(Tu＝單克隆乙 ＝CH NHNCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。為了封閉抗體上未反應的醛基團從而避免交聯(lián)，以及使易水解西佛氏堿(Schiff′s)鍵合穩(wěn)定，最好(但不是必需的)使產生的結合物首先與諸如乙酰肼或酪氨酰肼反應，然后用氰硼氫化鈉或硼氫化鈉還原產生該發(fā)明穩(wěn)定的構成物(Tu＝單克隆抗體，Z＝-CH2NHNHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。其它作為藥物構成物部分的醛活性基團也在我們發(fā)明內以產生反應式Ⅱ的產物。這類官能團最好(雖然不限于)只能在酸性水溶液條件下與醛反應的基團。在堿性條件下蛋白質賴氨酸的活性足夠強，結果它們的胺能與反應式Ⅱ產物共同競爭單克隆抗體的醛?？商鎿Q的醛活性基團是，例如，氨基脲、硫代氨基脲和O-取代的羥基胺官能團。
列于表1和表2化合物靶形式不只限于反應式Ⅱ所概括的順序。首先可將靶單元(Tu)修飾成含有一個巰基，然后根據(jù)下列反應式Ⅲ使它與表1和表2的化合物反應
其中Tu、Y、Q、Sp、W、n和m的意義如前，P是氫或2-(吡啶硫基)，如果Y是Tu的氨基酸殘基骨架上衍生出來的巰基，結合在一起的Z-Sp是共價鍵。
作為例子，參照上面反應式Ⅲ，可將單克隆抗體與3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羥基琥珀酰亞胺酯反應通過賴氨酸殘基來修飾蛋白質(Tu＝單克隆抗體，Y＝NH2，n＝50-100，Q＝-CO2Su，Sp＝-CH2-CH2-，P＝2-吡啶硫基)。與譬如二硫蘇糖醇還原反應后就生成一個中間產物(Tu＝單克隆抗體，Z＝-NHCO-，Sp＝-CHCH，m＝1-15)該中間產物可與表1和表2的化合物反應產生相應的免疫結合物。相似地，可將2-亞氨基巰基烷(2-iminothiolane)與單克隆抗體反應在蛋白質的表面直接引入巰基，而不需要還原步驟(Tu＝單克隆抗體，Z＝-NHCO-，Sp＝-(CH2)3-，m＝1-15)，該中間產物可與前面表1和表2的化合物反應。可替換的是，在單克隆抗體結構內部的巰基呈半胱氨酸殘基二聚的形式，它可直接用來參加反應式Ⅲ的反應。這類巰基傳統(tǒng)上通過酶消化和天然單克隆抗體還原反應的結合使之露出，但是，同樣可期望使用含未成對半胱氨酸殘基的單克隆抗體的遺傳變化結構。
本發(fā)明靶衍生物的較好例子是下式的蛋白質一藥物配對物
它是從一類稱為LL-E33288(CH3SSS-W)的抗腫瘤抗生素中制得的，包括用式為Q-Sp-SH的化合物取代二硫代甲基部分(其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C2-C10)基團或是二價或三價的(C2-C5)芳烷基或雜芳烷基，其中如果Sp是三價基團，則它另外還可被氨基、雜芳氨基、羥基或巰基所取代;Q是羰基、低級烷基二羧酸、酐、-CO2Su、-CON NH2，或
產生一個通式為Q-Sp-SS-W的中間產物(其中Q、Sp和W的定義同前所述)，使Q-Sp-SS-W與式為Tu-(Y)n的分子反應(其中Tu是單克隆抗體，它對人體的腫瘤相關抗原表現(xiàn)出優(yōu)良的反應性;Y是抗體上的側鏈氨基，或是通過使抗體上的碳水化合物基團氧化而形成的醛;n是1-100的整數(shù))產生下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定義如前所述，Z是使基團Q和Y直接進行或經還原后進行共價反應而形成的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-或
m是0.1-15。
許多不同的單克隆抗體(MoAbs)可用作甲基三鏈硫代抗癌化合物的靶。MoAbsLym1和Lym2可認出在成熟的B-淋巴細胞和其引起的淋巴癌上的不同抗原。在A.L.Epstein，et.al.“癌癥研究”47830(1987)述了這些MoAbs的生產及特征。雖然已注意到MoAbB72腺癌、卵巢癌和肺癌的反應，但它主要是乳腺癌和結腸癌為目標的。該抗體已在T.L.Klug，et.al.，“Int，J.Cancer”38661(1986)中進行了揭示。1986年7月3日提交的歐洲專利申請86401482.4中闡述了MoAbCT-M-01，它主要是識別乳腺腫瘤，通過使產生CT-M-01的雜交系次級克隆生產MAC-68，它可識別乳腺癌和結腸癌。在實驗部分闡述了主題化合物的中間產物以及化合物抗體配對物。但是，不能就此斷言本發(fā)明僅限于前述抗體。相反，該方法適用于所有的抗體而不管它們的分類，它們的酶促派生碎片、它們的化學處理及化學穩(wěn)定碎片以及它們相應的嵌合和人工的配對物。靶單元也不是僅限于單克隆抗體。其它蛋白質以及感受器在靶出口上的小分子，這些都在我們揭示的靶整體的范圍里。
本發(fā)明的Q-Su-SS-W化合物是活性的抗生素。通過標準瓊脂稀釋法能測定它們在體外對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性。將含有各種濃度抗生素的Mueller-Hinton瓊脂放在佩特里細菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中抗生素的濃度以稀釋二倍依次遞減。用Steer折轉裝置將1-5×104細菌菌落構成單位接種到瓊脂的表面。在約36℃下接種約18小時后記錄抑制菌株生長的化合物的最低濃度為那種菌株的最小抑制濃度(MIC)。
上述的二硫化物化合物是活性的抗腫瘤劑。
國家癌癥機構(NationalCancerInstitute)已制定了特定的體外試驗系統(tǒng)和草案以測試化合物作為抗瘤劑時的穩(wěn)定性。在“CaneerChemotherapyReports”第Ⅲ部分，第3卷，No.2(1972)，Geran.etal.中已經進行報告。這些草案建立了標準化篩選試驗，而這些試驗在抗腫瘤劑的試驗領域中通常是需要的。在這些系統(tǒng)中，淋巴細胞白血病P388、黑色素黑瘤B16，L1210白血病和結腸26腺癌對本發(fā)為重要。這些腫瘤作為小鼠的可移值腫瘤用于試驗。總的來說，在這些草案中用被治療過動物(T)的平均存活時間超過對照動物(C)的平均存活時間的百分增長率來顯示有效的抗腫瘤活性，它表明人類白血病和固體腫瘤有相似的結果。
淋巴細胞白血病P388試驗使用的動物是BDF雌性小鼠。每試驗組有5或6個小鼠。在第0天腹膜內注射0.5毫升含1×10淋巴細胞白血病P388的細胞的稀腹水液體來移植腫瘤，在第1天、第5天和第9天(相應于腫瘤接種)以指示的劑量用0.5毫升體積的無菌無發(fā)熱原的鹽水溶液腹腔內注射試驗化合物。給小鼠稱重并按30天記錄的規(guī)律記錄存活者。計算存活時間中值及被治療動物(T)/對照動物(C)的存活時間比率。當T/C大于或等于125時它被認為具有有效的抗腫瘤活性。結果如表3所示。
表3淋巴細胞白血病P338試驗化合物劑量存活中值T/Cx100(mg/kg)(天)%LL-E33288 γ1-1 0.005 145的丙酸二硫化物0.0025125(從實施例7中得到)LL-E33288 γ1-1 0.010 135的4-硝基苯基丙酸酯二硫化物0.005185(從實施例8中得到)0.00251500.00125130LL-E33288 γ1-1 0.010 24.5 223的7-(2-巰基乙氨基)-4-0.00528.5259甲基香豆酮二硫化物0.002526.0236(從實施例9中得到)0.0012521.01910.000618.51680.000316.5150對照-11.0-LL-E33288 γ1-1 0.005 18.0 164的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.002525.0125(從實施例10中得到)0.0012519.01730.000615.5141對照-11.0-LL-E33288 α3-1 0.040 15.0 136的3-巰基丙酰肼二硫化物0.020123(從實施例12中得到)對照-11.0-
表3(續(xù))淋巴細胞白血病P338試驗化合物劑量存活中值T/Cx100(mg/kg)(天)%N-乙?；?.08021.0175LL-E33288 γ1-1 0.040 18.0 150的3-巰基丙酰肼二硫化物0.02015.0125(從實施例13中得到)對照-12.0-LL-E33288 α2-1 0.010 16.5 230的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.00521.0183(從實施例14中得到)0.002518.51610.0012518.5161LL-E33288 γ1-1 0.005 28.5 190的3-巰基丁酰肼二硫化物0.002523.0153(從實施例16中得到)0.0012521.01400.000619.5130LL-E33288 q1-1 0.010 26.5 252的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.00518.0171(從實施例17中得到)0.002517.01620.0012516.01520.000613.01240.000314.0133LL-E33288 q1-1 0.005 24.0 200的4-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物0.002528.0233(從實施例18中得到)0.0012525.52130.000618.51540.000317.5146對照-12.0-
黑色素黑瘤B16試驗動物使用BDF雌性小鼠。每組有5或6個小鼠。在10毫升冷平衡的鹽溶液中使1克黑色素黑瘤B16均勻并取0.5毫升均勻的水液腹膜內移植每個試驗小鼠。在第1-9天(相應于腫瘤接種而言)以指定的劑量腹膜內注射試驗化合物。給小鼠稱重并按60天的規(guī)律記錄存活者。計算存活時間中值以及被治療動物(T)/對照(C)動物的存活時間比率。T/C值大于或等于125時被認為具有有效的抗腫瘤活性。
用本發(fā)明的種種方法(用來生產與表1和表2化合物結合的稱為
的單克隆抗體共軛物)能得到一些結構物，它們與靶細胞系保持了良好的免疫反應性，正如下列體外測定所述靶細胞將所有靶細胞保存在RPMI 1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基以5%Fetal Calf血清(FCS)、IST(Collaborative Research，Cat＃40351)、鏈霉素(50μg/ml)、青霉素(50國際單位/毫升)、硫酸慶大霉素(50μg/ml)和谷酰胺(0.03%)作為供給。將細胞保存在濕潤的含5%CO2，37℃的孵箱內。
Ⅰ.免疫反應測定方法Ⅰ-Elisa收集合適的靶細胞并計數(shù)，使之懸浮在對測定單克隆抗體(MoAb)最佳濃度的Dulceco′s磷酸鹽緩沖鹽溶液中。在無菌組織培養(yǎng)聚苯乙烯96-坑體板的每個坑里加入0.1毫升細胞。讓平板在1，000轉/分下離心5分鐘并彈去浮在表層的物質。讓平板空氣干燥過夜并可在4℃下貯存3個月。
通過在每個坑里加入200μl1%的明膠DPBS溶液，并將平板放在濕潤的孵箱中在37℃下孵化1小時來封閉非特定結合位點(在相似的條件下進行所有其它的孵化)。用250μl的0.05%吐溫-20DPBS溶液(洗滌溶液)將平板洗滌一次，洗滌用來自Dynatech(超級洗滌Ⅱ)的ELISA自動洗滌系統(tǒng)。在0.1%明膠-DPBS溶液中，將試驗樣品稀釋成最終濃度為3μg/mlMoAb當量。從每個3μg/ml樣品中另制備六個三倍系列的稀釋物，并將100μl-式三份地加到適當?shù)目又小５紫碌囊慌趴又环?00μ10.1%的明膠液作為背景。讓平板孵化45分鐘然后洗滌三次。將堿性磷酸酶配對的親合純化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(CappelCat＃8611-0231)以1∶125的比率在0.1%的明膠溶液中稀釋，并取100μl加至每個坑里。將平板孵化45分鐘，然后洗滌三次。將200μl磷酸對一硝基苯酯基質溶液(見下面)加到每個坑中。室溫下保持45分鐘后，通過加入50μl3MNaOH來停止反應。在從Dynatech來的自動化分光光度儀(EIAAutoreader＃EL-310)上，在405mm下讀出每個坑內含物的吸收值。
基質二乙醇胺緩沖液(10%)97毫升二乙醇胺800毫升水0.2克NaN3100毫克Mg Cl2·6H2O通過連續(xù)攪拌使試劑溶解并加入1MHCl直至pH達9.8。用水將總體積調整至1升并用0.2μ濾紙過濾滅菌。將緩沖液在4℃下黑暗中貯存。在使用前夕才將磷酸對-硝基苯酯溶于二乙醇胺的緩沖液中(必須在室溫下)使最終濃度為1mg/ml。
光密度值的計算用下列等式計算每個樣品的結合百分率(A-B)/(C-B) ×100＝結合%A＝試驗樣品的平均光密度B＝背景的平均光密度C＝濃度為3μg/ml來處理MoAb對照物的平均光密度在半對數(shù)圖的非對數(shù)軸上劃分結合%并在對數(shù)軸上劃分Mo Ab濃度。從圖中找出每個試驗樣品的BD50(即造成50%結合所需的抗體劑量)，通過下式算出免疫反應性的保留量。
(對照的Mo Ab的BD50)/(試驗樣品的BD50) ×100=保留的免疫反應活性％方法2-非直接放射免疫分析法(RIA)將適當量的在0.2毫升10%FCS培養(yǎng)基中的靶細胞分裝到4毫升聚苯乙烯試管中。使試驗樣品稀釋成在10%FCS培養(yǎng)基中的2μg/mlMo Ab當量濃度。在每個2μg/ml樣品中僅制備5個三倍系列的稀釋物，每個稀釋物0.2ml一式二份加到試管內。背景樣品僅含細胞和基質。在4℃下使細胞孵化1小時，然后用2%FCS培養(yǎng)基洗滌2次(所有RIA洗滌都用3毫升2%的FCS基質)。在每個試管內加入0.05毫升含有約500，000 CPM′S綿羊F(ab′)抗小鼠Ig G[125I](Dupont，Cat＃NEX 162-0142);使細胞在4℃下再孵化1小時，用2%FCS洗滌一次，用PBS洗滌二次。在每個試管中加入0.5毫升PBS，讓細胞打旋，轉移到清潔的試管中并在PackardGamma 500上計數(shù)1分鐘。
除了用CPM′s取代光密度單位，C＝1μg/ml(未處理MoAb對照的平均CPM′s外，用與前述ELISA等式相同的方法測定并作圖測出每個結合%值，每個樣品的保留免疫反應性%如前面討論的那樣計算。
方法3-直接RIA取適當量的在1毫升10%FCS培養(yǎng)基中的靶細胞分裝到4毫升的聚苯乙烯試管中，離心并棄去浮在上面的東西。稀釋試驗樣品使其在10%FCS培養(yǎng)基中的濃度為200μg/ml Mo Ab當量。從每個200μg/ml樣品中另制得五個五倍量系列的稀釋物，0.05ml各稀釋物兩份地加入試管中。向每個試管內加入0.05毫升125I-Mo Ab(對于每個Mo Ab和每一批應分別決定其用量)。陽性對照樣品中含有細胞、培養(yǎng)基和125I-Mo Ab。背景樣品中含有非特定的細胞、培養(yǎng)基和125I-Mo Ab。在40℃下將細胞孵化1小時，用2%FCS培養(yǎng)基洗滌一次，用PBS洗滌二次，用前述相同的方法轉移并計數(shù)。
用下式計算每個樣品125I-Mo Ab結合抑制%(A-B)/(C-B) ×100＝125I-Mo Ab結合抑制%A＝樣品的平均CPM′SB＝背景的平均CPM′SC＝陽性對照的平均CPM′S除了BD50實際上是BID50外(造成50% I-Mo Ab結合抑制所需的Mo Ab劑量)，用前面討論的方法計算劃分每個樣品保留的免疫反應性。
注解1)在放射免疫分析中加入每種試劑后馬上強力旋轉試管。
2)在每套分析中引入相當于50%未處理的MoAb對照的內部對照樣品以確證在推斷免疫反應的配對物保留中每個過程是否都是定量的。
這些分析的結果列于表4表4MoAb配對物的免疫反應性用LL-E33288 αI3未修飾Mo Ab對照物的3-巰基丙酸二硫的免疫反應性%化物的酰肼產物的非特定制備配對物(實施例6)與下列物質配對Lyml78CT-M-0181N-乙?；?LL-E33288 δI1的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實施例7)與下列物質配對制備未修飾MoAb對照物的免疫反應性%Lyml82CT-M-01100B72.3100LL-E33288 αI2的-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實施例8)與下列物質配對CT-M-0156
表4(續(xù))MoAb配對物的免疫反應性碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實施例9)與下列物質配對CT-M-0150LL-E33288 δI1的3-巰基丁酸二硫化物的酰肼(實施例10)與下列物質配對Lyml73LL-E33288 δ31的3-巰基異戊酸二硫化物的酰肼(實施例11)與下列物質配對制備未修飾MoAb對照物的免疫反應性%Lyml64%LL-E33288 δI1的對-巰基二羥基內桂酸二硫化物的酰肼(實施例12)與下列物質配對Lyml61%本發(fā)明的單克隆抗體配對物是活性的抗癌劑。下面所述的分析用于分析體外的細胞毒性，它顯示相對于非靶細胞而言靶細胞系構成物的顯著適用性，它提供了比較與化合物非靶形式的化合物靶形式的利用方法。
細胞毒性分析體外將樣品稀釋成與母體藥物等當量濃度，即0.2或0.02μg/ml(起始濃度視待試驗的細胞系及母體藥物的效力而定)。從每個原始樣品稀釋液中另制得三份或四份五倍量的稀釋液并取出0.2毫升加到消毒的15毫升聚苯乙烯試管中。在每次分析中至少包括一個由母體藥物與不相關的Mo Ab組成的相似配對物以測定相關配對物的特異性。將105個在0.2毫升10%CFS培養(yǎng)基中的靶細胞等分加入各試管內并旋轉。另外，上述試驗用不相關細胞作為靶來進行以進一步確證相應配對物的特異性。收集到的Mo Ab對照物與在10%FCS培養(yǎng)基中收集到的Mo Ab和陽性對照樣品等當量。
將細胞在37℃下孵化7分鐘，然后用8毫升2%FCS培養(yǎng)基洗滌4次。在每個試管中加入0.1毫升10%FCS，旋轉細胞，然后在無菌的96-坑聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板的每個坑內加入0.2ml。
將平板在濕潤的37℃孵卵器中用5%CO2孵化2天。除去一半培養(yǎng)基并用含有2微居里/毫升3H胸腺嘧啶脫氧核苷(Dupont，NEN，Cat ＃ NET-027)的新鮮培養(yǎng)基而取代。繼續(xù)孵化24小時，將細胞冷凍、解凍并用PHD細胞收集器(Cambridge Technology，Inc.)收集。在Beckman LS5800閃爍記數(shù)器的第1道上使每個樣品記數(shù)1分鐘。
如下計算生長抑制%(試驗值的平均CPM)/(培養(yǎng)基對照的平均CPM) ×100＝生長%100-生長%＝抑制%在半對數(shù)圖上將抑制%劃在非對數(shù)軸上，將母體藥物濃度劃分在對數(shù)軸上。從圖上找出每個試驗樣品的IC50(引起50%抑制的母體藥物濃度)，用下式計算出細胞毒性的殘留量。
(母體藥物的IC50)/(試驗樣品的IC50) ×100=殘留的細胞毒性％將體外細胞毒性分析的結果制成下表5。
表5MoAb配對物的體外細胞毒性MoAb細胞毒性用實施例6的產物 %LL-E33288 αI3與Lyml500的酰肼配對物CT-M-01300用實施例7的%N-乙?；鵏L-E33288 δI1產物與Lyml400的酰肼配對物CT-M-01700MoAb細胞毒性用實施例8的%實施例8產物產物與CT-M-01-18的酰肼配對物用實施例9的%實施例9的產物產物與CT-M-01100的酰肼配對物用實施例10的%實施例10的產物產物與Lyml400的酰肼配對物用實施例11的%實施例11的產物產物與Lyml320
的酰肼配對物用實施例12的%實施例12的產物產物與Lyml560的酰肼配對物下列分析系統(tǒng)用來測量本發(fā)明配對物的體內活性。
在無胸腺(裸)小鼠上異種移植人體腫瘤來進行藥物-單克隆抗體配對物抗腫瘤活性的體內試驗。
從培養(yǎng)燒瓶中采集Burkitt淋巴瘤細胞(Raji)和骨髓瘤細胞(HS Sultan)并使之在試驗小鼠內皮下孵化(≥80×106Raji細胞或40×106HS Sultan細胞)。讓固體腫瘤、卵巢癌(CA73，Ovcar-3)、乳腺癌(MX-1)和結腸癌(L S174 T)在無胸腺小鼠內繁殖、切除，割成2mm3大小的碎片再皮下移植到試驗小鼠內(每只小鼠5-8個碎片)。
移植在腫瘤植入后第2、3、4、6、7或8天起，對動物每3天腹腔內分別注射藥物、單克隆抗體和藥物-單克隆抗體配對物，總共作三次或五次。用FowlerultraCALII電子卡尺在植入腫瘤的4-6周內每隔7天測量腫瘤(腫瘤的長度和寬度)。從下式算出腫瘤的質量(長度(mm)×高度(mm))/2計算每試驗組的控制百分率[治療過(T)的平均mg除以對照(C)的平均(mg)×100]，作為腫瘤生長的抑制指標。T/C值≤42%，并且存活動物率≥65%被認為具有活性。
該分析結果列于表6中。
表6體內抗腫瘤試驗結果劑量(mcq)腫瘤大小S/TMoAb藥物(T/C)控制LL-E33288 αI32.8 0.75 1.3 6/6的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lyml配對物只有LL-E33288αI3- 0.75 365 6/6只有酰肼-0.753306/6只有MoAbLym28-686/6腹腔內注射對人體Burkitt淋巴瘤細胞系RajiTC進行治療，治療在腫瘤植入后7天起開始，共進行三次注射，在腫瘤植入后28天時進行測量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMoAb藥物(T/C)控制%LL-E33288 αI30.3 2.0 0.02 6/6的3-巰基丙酸二硫化物酰肼與CT-M-01配對物只有LL-E33288 αI3- 2.0 - 0/6只有MoAbCT-M-0183-755/6長春新堿(陽性對照)-201.25/5對人體乳腺癌細胞系M×01腹腔內注射治療，腫瘤植入后2天起開始共三次，在腫瘤植入后35天進行測量。
LL-E33288 δI1的N- 50 0.22 23 7/7｛[(4-甲基香豆素-7-基)-氨基]乙?；腚装彼岫蚧锏孽ｋ屡cLyml配對物只有酰肼-0.222284/7只有MoAbLyml50-617/7混合物、酰肼加MoAb500.22567/7Lym1對人體Burkitt淋巴瘤細胞系RajiTC腹腔內注射治療在植入腫瘤后7天起開始，共三次，在腫瘤植入后的35天測量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMoAb藥物(T/C)控制%N-乙酰基LL-1251.006/6E33288 δI1的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lyml配對物只有酰肼-2.0713/6混合物，N-乙?；?251.051/6LL-E33288 δI1加上MoAbCT-M-01N-乙酰基LL--1.0462/6E33288 δI1對人體乳腺癌系MX-1靜脈注射治療在植入腫瘤后的第2天開始，共計三次，在腫瘤植入后的42天開始測量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMoAb藥物(T/C)控制%
N-乙酰基LL-371.0116/6E33288 δI1的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lyml配對物只有酰肼-1.05176/6只有N-乙?；鵏L--0.52266/6E33288 δI1只有MoAbLyml37-1786/6對人體Burkitt淋巴瘤細胞系RajiTC靜脈注射治療，植入腫瘤后第7天開始共三次，腫瘤植入后第35天進行測量。
N-乙?；鵏L-1272.7616/6E33288 δI1的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與B72.3配對物只有N-乙?；?2.0321/6LL-E33288 δI1只有MoAbB72.3127-1256/6長春新堿(陽性對照)-20236/6對人體結腸癌細胞系LS174T靜脈注射治療，在腫瘤注入后第8天開始共三次，腫瘤植入后第21天進行測量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMoAb藥物(T/C)控制%N-乙?；鵏L-1122.7405/6E33288 δI1的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與
CT-M-01配對物只有N-乙?；鵏L--2.0321/6E33288 δI1長春新堿(陽性對照)-20236/6對人體結腸癌系LS174T靜脈注射治療植入腫瘤后第8天開始，共三次，腫瘤植入后第21天進行測量。
LL-E33288 αI1的 24 1.0 0.33 2/63-巰基丙酸二硫化物的酰肼與CT-M-01配對物只有酰肼-1.0-0/6對人體乳腺癌細胞系MX-1靜脈注射治療，植入腫瘤后第2天開始，共三次，注入后第35天進行測量。
本發(fā)明將結合下列不被限制的實施例進行進一步的闡述。
實施例1LL-E33288 γI1的3-巰基丙酸二硫化物將106毫克3-巰基丙酸在1毫升乙腈中的物質加到90毫克LL-E33288 γI1在90毫升乙腈中的溶液中。旋轉溶液，然后在-20℃下貯存6天。真空除去溶劑，殘留物用10毫升硅膠(二氯甲烷內裝柱)進行色譜層析。色柱依次用50毫升二氯甲烷、50毫升含4%甲醇的二氯甲烷中及100毫升含8%甲醇的二氯甲烷進行洗脫。將最后的洗脫劑餾分蒸干得到殘留物，使之溶于輔于少量丙酮的乙酸乙酯中，向內滴加入過量己烷。收集沉淀物并干燥給出39毫克所需的產物(FABMS，M+H 1394)。
實施例2LL-E33288 γI1的對-硝基苯基3-巰基丙酸二硫化物A)3-巰基丙酸對-硝基苯酯的制備將含催化量濃硫酸在二氯甲烷中的市售的3-巰基丙酸用異丁烯處理20分鐘。然后該溶液用IN碳酸氫鈉萃取。在這之后用無水硫酸鎂干燥二氯甲烷溶液。蒸發(fā)溶液得到一種無色流動的液體，其NMR和質譜數(shù)據(jù)表明它是S-叔丁基巰基丙酸，叔丁酯。
該酯的等分部分在用6N鹽酸的二噁烷液的回流2.5小時蒸去溶劑，加入乙酸乙酯并用碳酸鈉萃取該溶液。用6N鹽酸處理碳酸鈉萃取物直至懸浮液的pH為2.0。然后懸浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液用無水硫酸鎂干燥，蒸去溶劑得到一種無色液體，其1H NMR和質譜數(shù)據(jù)表明它是S-叔丁基巰基丙酸。
在四氫呋喃中用等摩爾的對-硝基苯酚和二環(huán)己基碳化二亞胺處理4小時使該化合物轉變成對-硝基苯酯。通過過濾除去產生的二環(huán)己基脲素，蒸干濾液得油狀產物，并用中性硅膠以己烷∶二氯甲烷(50∶50)溶劑系統(tǒng)純化。純凈的對-硝基苯酯衍生物是淡黃色的、流動的油狀物質。
下列方法可以暴露游離的硫醇。將S-叔丁基巰基丙酸對-硝基苯酯溶于三氟乙酸并加入摩爾稍過量(10%)的乙酸汞。讓混合物攪拌30分鐘，然后蒸去三氟乙酸并讓殘留物溶于二甲基甲酰胺中。用硫化氫將溶液處理15分鐘，然后濾去黑色的硫化汞，減壓蒸發(fā)濾液以除去99%的二甲基甲酰胺。所得的淡褐色流體狀的液體經中性硅膠用己烷∶二氯甲烷(50∶50)純化。經1H NMR所顯示主要成分是含有少量叔丁基巰基衍生物。在串聯(lián)的二根Perkin-Elmer Pecosphere C18柱上用37.5/62.5-47.5/52.5的乙腈梯度系統(tǒng)和pH為6.5(乙酸)的0.1M乙酸銨緩沖液在12分鐘內進行高壓液相色譜分析，結果表明產物是88% 3-巰基丙酸對-硝基苯酯和10%低極性S-叔丁基巰基丙酸對-硝基苯酯。也有少量的游離對-硝基苯酚存在。
(B)3-巰基丙酸對-硝基苯酯與LL-E33288 γI1反應將100毫克LL-E33288 γI1溶于毫升乙腈中。將25.7毫克3-巰基丙酸對-硝基苯酯在1毫升乙腈中的溶液加進去。在-20℃下讓反應進行48小時。HPLC指示反應完全。讓溶液蒸發(fā)至干并用聲波作用使殘留物溶于4-5毫升乙酸乙酯中。讓混合物過濾，將濾液滴入45毫升攪拌著的己烷中，收集所得的淡黃色固體并減壓干燥得到93毫克由1H NMR測定的LL-E33288 γI1的丙酸對-硝基苯酯衍生物。在FABMS測定中[M+H]離子出現(xiàn)在m/z＝1515。
用50%乙腈/0.1M乙酸銨水液的C18反轉相HPLP的保留時間是18分鐘(LL-E33288 δI1是8分鐘，酯水解產物是1.5分鐘)。
實施例3LL-E33288 γI1的N-羥基琥珀酰亞氨基3-巰基丙酸二硫化物在5毫克3-巰基丙酸二硫化物(歐洲專利公報中已知的LL-E33288 γI1的類似物)在0.5毫升四氫呋喃中的溶液內，先加入0.45毫克N-羥基琥珀酰亞胺在0.1ml四氫呋喃中的溶液，后再加入1.8mg三環(huán)己基碳基二亞胺在0.2ml四氫呋喃中的溶液。讓反應在室溫下攪拌4小時，然后用大量己烷中止反應。過濾分離固體并使之溶于乙酸乙酯中。所得的溶液用鹽水洗滌三次，用硫酸鎂干燥并蒸發(fā)得到5毫克所需的產物，它為棕褐色粉末不用進一步純化。用40%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液的反轉相C18HPLC上的保留時間是15分鐘。(起始物料的保留時間是6.0分鐘)。
實施例4LL-E33288 γI1的3-巰基丙酰肼二硫化物在通氬氣下，向回流著的5.4毫升(3eq)無水酰肼在100毫升四氫呋喃溶液中，2小時里，滴加9.2毫升(83毫摩爾)3-巰基丙酸甲酯在50毫升四氫呋喃中的溶液。再讓溶液回流2小時，蒸干，然后用300毫升甲苯稀釋蒸發(fā)兩次。產物置在用5%乙酸乙酯/氯仿裝柱的硅膠塞上并用20%甲醇/氯仿液洗脫。所得的3-巰基丙酰肼是淡桃紅色油狀產物，冷卻時它固化但在室溫下融化。
將在1毫升四氫呋喃中的6.6毫克3-巰基丙酰肼加到50毫克LL-E33288 γI1在50毫升乙腈中的溶液內。加入1當量三乙胺或1當量三乙胺和1當量乙酸。讓反應在0℃下攪拌進行1小時，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上使殘留物進行色譜層析得到26毫克所需產物。FABMS，m/z＝1408(M+H);反轉相C18HPLC的保留時間＝5.0分鐘(在41%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液中)。
實施例5LL-E33288 γI1的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼狨ｋ露蚧飳?.0克(5.7毫摩爾)4-甲基-7-氨基香豆素、3.0毫升溴代乙酸乙酯(5eq)、90毫克(0.1eq)碘化鈉和30毫升二甲基甲酰胺的混合物在通氬氣下于80℃加熱5小時。讓混合物冷卻，用乙醚稀釋，用50%鹽水洗滌三次，用硫酸鎂干燥并蒸干。將粗產品溶于含1%乙酸乙酯的氯仿中并經過硅膠塞子過濾。用含有痕量氯仿的乙醚重結晶得到純凈的N-[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酸乙酯。
將10毫升1N的氫氧化鈉水溶液加到1.96克(7.5毫摩爾)上述酯在15毫升甲醇及15毫升四氫呋喃的溶液中。30分鐘后加入4毫升10%鹽酸水溶液。蒸去有機溶劑并過濾得到結晶產物，用冷乙醇然后用醚洗滌。將該物質溶于20毫升四氫呋喃和4毫升二甲基甲酰胺中。加入二環(huán)己基羰基二咪唑(1.3克，2.2eq)并讓反應攪拌進行15分鐘。然后加入半胱氨酸乙酯氫氯化物(1.6克，2.5eq)和三乙胺(1.2毫升)。再過三小時后，用含有5%二氯甲烷的醚稀釋反應液，用10%鹽酸水液洗滌一次用鹽水洗滌二次。用硫酸鎂干燥后蒸去溶劑，通過使其溶于含有微量乙醇的氯仿中，然后加入過量的醚使粗產品結晶出來。過濾結晶并干燥得到純凈的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼嵋阴ァ?br> 在通氬氣下使5毫升氯仿、20毫升甲醇和0.4毫升酰肼水合物加熱回流。向內加入550毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼嵋阴ァ；亓?小時后讓混合物冷卻并濾得固體產品，用氯仿然后用乙醚洗滌。將粗產品(它含有硫醇和二硫化物)溶于含有二硫代蘇糖醇和三乙胺的二甲基甲酰胺中。30分鐘后用過量乙醚使產品析出并通過過濾收集。用含有二硫蘇糖醇和痕量三乙胺的脫氣乙腈重結晶使物質進一步純化得到純凈的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼。
在0℃下將在1.2毫升二甲基甲酰胺中的4毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼狨ｋ录拥?2毫克LL-E33288 γI1在12毫升乙腈的溶液中。攪拌過夜后再加入0.6毫升二甲基甲酰胺中的2毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼狨ｋ?。讓反應在0℃下攪拌3天并過濾。蒸去乙腈，所得的二甲基甲酰胺用過量1∶1己烷/醚稀釋。過濾分離產物，用15-20%梯度的甲醇氯仿溶液通過硅膠色譜層析進一步純化得到3毫克所需的產品。用45%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液的反轉相C18HPLC上的保留時間為3.5分鐘(在同樣系統(tǒng)中LL-E33288 δI1是15.5分鐘)。
實施例6LL-E33288 αI3的3-巰基丙酰肼二硫化物。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的6.6毫克3-巰基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI3在9毫升乙腈的溶液中。加入1當量三乙胺或1當量三乙胺和1當量乙酸。讓反應在0℃下進行1小時，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%梯度的甲醇氯仿液通過硅膠色譜層析純化給出所需的產物。
FABMS。m/g-1251(M+H);在45%乙腈/0.1M乙酸銨的系統(tǒng)中，反轉相C18HPLC上的保留時間是2.1分鐘(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 αI55.7分鐘)。
實施例7N-乙酰基LL-E33288 γI1的3-巰基丙酰肼在-15℃時，將在85微升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到10毫克N-乙?；鵏L-E33288 γI1在10毫升乙腈中。加入1當量三乙胺。讓反應在0℃下進行2小時并蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析純化得到所需的產品。FABMS，m/z＝1450(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨在C18反轉相HPLC上的保留時間是2.5分鐘(在同樣的系統(tǒng)中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留時間是6.6分鐘)。
實施例8LL-E33288 αI2的3-巰基丙酰肼二硫化物在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq 3-巰基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI2在10毫升乙腈中去。加入1當量三乙胺。讓反應在0℃下攪拌進行，然后蒸去溶劑。用5-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析使殘留物純化得到所需的產品。FABMS，m/z＝1248(M+H);用58%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC上的保留時間是2.6分鐘(LL-E33288 αI2在相同系統(tǒng)中的保留時間是7.5分鐘)。
實施例9碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巰基丙酰肼二硫化物在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到10毫克碘代LL-E33288假糖苷配基在9毫升乙腈中。加入1當量三乙胺作為催化劑。讓反應在0℃下攪拌進行1小時，然后蒸去溶劑。用殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產物。FABMS，m/z＝1091(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC上的保留時間是2.8分鐘。(在同樣系統(tǒng)中碘代LL-E33288假糖苷配基是7.9分鐘)。
實施例10LL-E33288 γI1的3-巰基丁酰肼二硫化物將18毫升(0.26摩爾)硫代乙酸加到17.2克(0.2摩爾)巴豆酸中。在通氬氣下將該混合物回流加熱6小時。在吸氣器真空下除去過量的硫代乙酸，使所得的油溶于100毫升含200μl濃硫酸的無水乙醇中。讓該反應物回流10小時，然后在抽氣器真空下減少體積。加入己烷，依次用二份飽和的碳酸氫鈉和一份水洗滌所得的溶液。然后用硫酸鎂干燥該溶液、過濾并減少體積而成油狀產物。將該粗產物溶于含于12毫升肼的250毫升甲醇中，將所得的混合物在通氬氣下回流10小時。減少反應混合物的體積，然后用Kugelrohr快速蒸餾并用氯仿-己烷的混合物結晶得到3-巰基丁酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到5毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1當量三乙胺。讓反應在0℃下攪拌進行1小時，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度使殘留物進行色譜層析得到所需的產物。FABMS，m/e＝1422(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC上的保留時間是3.5分鐘。(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時間是13.4分鐘)。
實施例11LL-E33288 γI1的3-巰基異戊酰肼二硫化物將9毫升(0.13摩爾)硫代乙酸加到10克(0.1摩爾)3，3二甲基丙烯酸中。將該混合物在通氬氣下回流加熱6小時。在抽氣器真空下除去過量的硫代乙酸，將所得的油狀產物溶于含有200微升濃硫酸的100毫升無水乙醇中。在加入16毫升肼前讓反應回流34小時。在通氬氣下讓所得的混合物回流24小時。讓反應混合物減少體積然后溶于鹽水和飽和碳酸氫鈉的混合物中。用一定體積的氯仿數(shù)次萃取產物。用硫酸鎂干燥合并的氯仿層、過濾并減少體積得到油狀產物。該油狀產物經快速色譜層析用甲醇-氯仿梯度純化，然后用氯仿-己烷結晶得到3-巰基異戊酰肼。
在-15℃下將在100微升乙腈中的1.5eq 3-巰基異戊酰肼加到15毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1當量三乙胺作為催化劑。讓反應在室溫下攪拌進行3小時，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析殘留物得到所需的產物。FABMS，m/z＝1436(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC的保留時間是3.9分鐘(在同樣系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時間是13.4分鐘)。
實施例12LL-E33288 γI1的對-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物將含有一滴濃硫酸的15毫升甲醇加到500毫克對-巰基二氫肉桂酸中。讓反應回流進行5小時，然后冷卻至室溫。加入肼(1.5毫升)并在通氬氣下讓所得混合物回流2小時，然后在室溫下攪拌10小時。將200毫克的二硫代蘇糖醇加入以還原尚存的二硫化物并讓反應混合物冷至-15℃。濾得所得的結晶，用醚和甲醇的混合物洗滌，然后在真空爐上干燥150°/5微米/10小時)得到對-巰基二氫肉桂酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq對-巰基二氫肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 γI1在25毫升乙腈中的物質中。殘留物在硅膠上用10-15%在氯仿中甲醇梯度進行色譜層析得到所需的產品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC上的保留時間是5.4分鐘(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時間是13.4分鐘)。
實施例13N-乙?；鵏L-E33288 γI1的3-巰基異戊酰肼二硫化物在-15℃下將在6.2毫升中的3eq 3-巰基異戊酰肼加到20毫升N-乙酰基LL-E33288 γI1在15毫升乙腈中的物質內。加入1當量三乙胺。讓反應在室溫下攪拌進行2小時，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產品。用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水液在C18反轉相HPLC上的保留時間是2.5分鐘9(在相同系統(tǒng)中N-乙?；鵏L-E33288 γI1的保留時間是6.6分鐘)。
實施例14N-乙?；鵏L-E33288 γI1的3-巰基丁酰肼二硫化物在-15℃下將在5毫升乙腈中的3eq 3-巰基丁酰肼加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物質內。加入1當量三乙胺。讓反應在室溫下攪拌進行10小時，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉相HPLC上的保留時間是7.3分鐘(在同樣系統(tǒng)中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留時間是5.6分鐘)。
實施例15N-乙酰基LL-E33288 γI1的對-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物在-15℃下將在2.0毫升乙腈中的3.0eq對-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物質內。加入1當量三乙胺。讓反應在室溫下攪拌進行2小時，然后蒸去溶劑。殘留物在硅膠上用10-15%在氯仿中的甲醇梯度進行色譜層析得到所需的產物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨在C18反轉相HPLC上的保留時間是7.3分鐘(在同樣系統(tǒng)中N-乙?；鵏L-E33288 γI1的保留時間是5.6分鐘)。
實施例16與蛋白質的非特定配對物在弱堿性條件下將實施例3所述的羥基琥珀酰胺酯共價結合到抗體上。下面是制備列于表7中的抗體配對物的一般過程?？贵w在磷酸緩沖液中的濃度為3-5毫克/毫升，該緩沖液含有0.1M氯化鈉，pH為7.5，加入5-20倍摩爾過量的實施例3產物，在室溫下攪拌反應1-4小時。蛋白質配對物經色譜分離脫鹽，聚集蛋白質通過硅膠過濾HPLC而與單體物質分開。將單體部分合并起來并濃縮。
表7用實施例3產品制得的非特定配對物MoAb藥物負載M/MLyml5.2B72.36.0B72.36.9實施例17制備特定位點配對值在T.J.Mckearn，etal.美國專利第4，671，958號中闡述了將藥物的酰肼衍生物結合到氧化抗體上的一般方法。該方法經如下所述特定修飾已用來制備與實施例4-15的產物結合的抗體配對物。表7中綜述了這些反應的產物及其特征。
(A)抗體氧化將濃度為5-10毫克/毫升抗體放在200倍體積的50mM乙酸鈉緩沖液中滲析過夜，該緩沖液的pH為5.5它含有0.1M氯化鈉(緩沖液A)。滲析后，用15mM-200mM過碘酸在0.2M乙酸鈉中的溶液使MoAb氧化。氧化反應在黑暗中4℃下攪拌進行45分鐘，在此之后使氧化的MoAb在≥5容積SephadexG-25柱上脫鹽。通過使氧化抗體與對-硝基苯肼反應并比較在280mm蛋白質的吸收以及在395mm處對-硝基苯肼的吸收來分析抗體的氧化程度。
(B)藥物酰肼配對物使氧化的MoAb與10-200倍量摩爾過量的藥物酰肼反應。將酰肼溶于二甲基甲酰胺中并加入MoAb的水溶液。為了避免MoAb析出，二甲基甲酰胺的最后體積不要超過總反應體積的10%。讓反應在室溫下攪拌進行3小時，為了防止未反應的醛交聯(lián)及相應的聚集，在加入藥物酰肼3小時加入100倍摩爾過量的阻斷劑和乙酰肼。為了穩(wěn)定在醛和藥物酰肼(腙)之間的Schiff′s堿的鍵合，通常加入10mM氰基硼氫化鈉，并讓反應多進行小時(總的配對時間4小時)使產物還原成烷基肼。配對物經色譜層析脫鹽并在pH6.5磷酸緩沖液中完全滲析(最少時間為48小時)以供貯存和試驗。
通過凝膠過濾HPLC來分析配對物中聚集物的存在，通過反轉相HPLC來分析配對物中游離藥物的存在。用抗體和藥物兩者的衰變消光系數(shù)來確定配對物中藥物的摩爾濃度從而使藥物負載能從光譜學上得到測定。
表7從實施例4的產物中制得的酰肼配對物MoAb制備藥物負載M/M
CTM-01＃13.1＃22.3＃32.9MAC-68＃11.7＃23.1＃32.4從實施例5產物中制得的酰肼配對物Lym1＃10.15＃20.76＃33.2表7(續(xù))從實施例6產物中制得的酰肼配對物MoAb制備藥物負載(M/M)Lym13.0CT-M-01＃12.4＃22.9從實施例7產物中制得的酰肼配對物Lym12.8Lym21.4B72.3＃12.1＃22.4CT-M-01＃11.6＃23.6
＃32.5＃42.4從實施例9產物中制得的酰肼配對物CT-M-014.8從實施例9產物中制得的酰肼配對物CT-M-013.0從實施例10產物中制得的酰肼配對物Lym13.7從實施例11產物中制得的酰肼配對物MoAb制備藥物負載M/MLym16.2從實施例12產物中制得的酰肼配對物Lym13.5實施例18LL-E33288 γI1的對-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物將含有一滴濃硫酸的15毫升甲醇加到500毫克(2.75毫摩爾)對-巰基二氫肉桂酸中。讓該反應物回流5小時，然后冷卻至室溫。加入肼(1.5毫升)，在通氬氣下使所得的混合物回流2小時，然后在室溫下攪拌10小時。加入200毫克的二硫代蘇糖醇以還原任何尚存的二硫化物，將反應混合物冷卻至-15℃。過濾得到所得的晶體，用醚和甲醇的混合物洗滌，然后在真空爐中(50°/5微米/10小時)干燥得到對-巰基二氫肉桂酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq對-巰基二氫肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 CI1在25毫升乙腈中的物質內。讓反應在0℃下攪拌反應10小時，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水液在C18反轉相HPLC上的保留時間是5.4分鐘(在同樣的系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時間是13.4分鐘)。
權利要求
1.一種式為Q-Sp-SS-W的取代二硫化物，其特征在于它是從式CH3SSS-W化合物制得。這種二硫化物分別稱為LL-E33288α1-Br、α-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、d1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎铮渲?br> R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH；R8是OH，R9是H，或者R8和R9結合在一起成羰基；X是碘原子或溴原子；R5是氫或RCO的基團[其中R是氫或支鏈或非支鏈的烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或雜芳基，或是芳基-烷基(C1-C5)或雜芳基-烷基(C1-C5)，所有這些都可任意被一個或多個羥基、氨基、羧基、鹵(素)、硝基、低級(C1-C3)烷氧基或低級(C1-C5)硫代烷氧基所取代]；Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或鹵代芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)基團，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷基硫代基團所取代；Q是氫、鹵素、氨基、烷氨基、二烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低級烷氧基、羥基、硫羥基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONH2、-CSNHNH2或-ONH2；如果Sp是亞乙基，Q不可是氫，當CH3-SSS-W是LL-E33288α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-1、α4-Br、β1-Br、β1-1、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-1、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PR115028、CL-1577A。CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二價鍵時，Q不可是氫、鹵(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳基氨基、雜芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
2.根據(jù)權利要求1所述的式Q-Sp-S S-W(從式CH3S S S-W的化合物中制得)的取代二硫化物，其特征在于其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;X是碘原子或溴原子;R5是氫或是RCO基團(其中R是氫、CH3或單取代的芳基);Sp和Q的定義同上。
3.一種式
的載體藥物配對物，其特征在于它是從式CH3-S S S-W的化合物制得，其中CH3-S S S-W是名稱為LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎铩BM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎锏目鼓[瘤抗生素，其中W的定義如前所述，它包括使CH3S S S-W與通式Q-Sp-SH的化合物反應，其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷硫基，如果CH3-S S S-W是母體抗腫瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-1、α2-Br、α2-1、α3-Br、α3-1、α4-Br、β1-Br、β1-1、β2-Br、β2-1、γ1-Br、γ1-1、δ1-1、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PP115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL1577E或CL-1724本身，Sp不能是二價;Q是，或可被隨之轉變成鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、硫羥基、α-鹵代乙酰氧基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、、-NHCONHNH2、、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3、
產生了一種式為Q-Sp-SS-W的中間產物，其中Q、Sp和W的定義與前相同，使Q-Sp-SS-W與式為Tu(Y)n的分子反應，(其中載體Tu定義為單克隆或多克隆抗體、它的碎片、它的化學處理或基因處理的對應物，或是生長因子或類固醇;Y是蛋白質的側鏈氨基、羧基或硫羥基，從糖蛋白糖類殘基中衍生出來的醛基或是酰氨基烷硫基團;n是從1～100的整數(shù))產生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定義同前，Z是基團Q和Y直接進行或在連續(xù)還原后進行共價反應而形成的，Z是-CONH-、-CONHNHCH-、-NHCONHN＝CH2-、-NHCONHNH＝CH-、-NHCONHNHCH2-、、-NHCSNHN＝CH-、、-NHCSNHNHCH2-、-ON＝CH-、-NH-、-NHCH2-、-N＝CH-、-CO2-、-NHCH2CO2-、-SS-、
m是0.1～15。
4.根據(jù)權利要求3所述的式為
的蛋白質-藥物配對物，其特征在于它是從名稱為LL-E33288(CH3SSS-W)一類的抗腫瘤抗生素中制得的，它包括用式Q-Sp-SH化合物取代二硫代甲基部分，(其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C2-C10)基團或是二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C2-C5)，其中如果Sp是三價基團，它可另外被氨基、雜芳基氨基、羥基或硫羥基所取代;Q是，或可被隨之轉化為羧基、低級烷基二羧基酐、-CONHNH2或
產生一個通式Q-Sp-SS-W的中間產物，(其中Q、Sp和W的定義同前)，使Q-Sp-W與式Tu-(Y)n的分子反應，(其中Tu是對人體腫瘤抗原反應敏感的單克隆抗體，Y是抗體上的側鏈氨基，或是通過使抗體的糖基氧化成的醛基，n是1～100的整數(shù))產生下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定義與前面的相同，Z是基團Q和Y直接共價反應或在連續(xù)還原后進行共價反應而形成的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-或是
m是0.1～15。
5.制備式Q-Sp-SS-W的取代二硫化合物的方法，其特征在于它是從式為CH3-SSS-W的化合物制得。該二硫化物分別稱為LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?、BBM-1675，F(xiàn)R-900405，F(xiàn)R-900406，PD114759、PD115028、CL-1577A。CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙酰基對應物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H，或者R8和R9一起是羰基;X是碘原子或溴原子;R5是氫或是基團RCO(其中R是氫或支鏈或非支鏈的烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或雜芳基、或是芳基-烷基(C1-C5)或雜芳基、烷基(C1-C5)，所有這些可任意被一個或多個羥基、氨基、羧基、鹵素、硝基、低級(C1-C3)烷氧基、或低級(C1-C5)硫代烷氧基所取代;Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價的(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷硫基所取代;Q是氫、鹵素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低級烷氧基、羥基、硫羥基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亞乙基，則Q不可為氫;如果CH3-SSS-W是LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724，且Sp是二價時，Q不可為氫、鹵素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳雜氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基;該方法包括在乙腈和四氫呋喃的混合物或在乙腈和二甲基甲酰胺的混合物中，在-20℃～+40℃溫度下，最好在1當量的叔胺堿或者在1當量叔胺堿和1當量有機羧酸混合物的存在下，使從上面得到的一種甲基三硫化物抗腫瘤抗生素與適當取代的硫醇反應1小時至6天。
6.制備式CH3-SSS-W化合物的靶衍生物的方法
(其中CH3-SSS-W是抗腫瘤抗生素LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙酰基對應物)，其特征在于它包括在乙腈中在1當量三乙胺或1當量三乙胺和1當量乙酸存在下在-10℃～-30℃溫度下使CH3-SSS-W與或Q-Sp-SH反應1～48小時，其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或芳雜基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或者二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳雜氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷基硫代基所取代，如果當CH3-SSS-W是抗腫瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α3-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724母體時，則Sp不可是二價;Q是鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、低級烷基二羧基醛基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、NHCSNHNH2、-ONH2或
將式為Q-Sp-SS-W的中間產物分離出來，(其中Q、Sp和W的定義同前)，然后在pH6.5～9的緩沖水溶液中在4～40℃下直接反應或在水溶性碳化二亞胺存在下使式Q-Sp-SS-W(其中Sp和W的定義同前，Q是鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基或低級烷基二羧醛基)與式Tu-(Y)n的分子反應(其中Tu是單克隆或多克隆抗體、它的碎片、它的化學處理或基因處理對應物或生長因子或類固醇，Y是側鏈的氨基或羧基官能團;n是1～100)，產生化合物
其中Tu、Sp、W、n和Y的定義同前，m是1～15，Z是由基團Q和Y共價反應而形成的，它是-CONH-、-NH-、
-N＝CH-或是-CO-;或者在諸如碳化二亞胺的羧基活化劑存在下使式Q-Sp-SS-W(Sp和W的定義同前，Q是羧酸)化合物與N-羥基琥珀酰亞胺、2，3，5，6-四氟苯酚、五氟苯酚或4-硝基苯酚反應產生式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是
并在pH6.5～9之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃間的溫度下與Tu-(Y)n的分子(其中Tu和n的定義同前，Y是側鏈氨基)進行反應產生式為
的化合物，其中Tu、Sp、Y和n的定義同前，m是1～15，Z是在Q和Y間共價反應而形成的并定義為-CONH-;或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是-CONHNH)與硝酸在乙腈水溶液中反應產生式Q-Sp-SS-W的化合物，(其中Sp和W的定義同前，Q是-CON3)，使之與式Tu-(Y)n反應(其中Tu、Y和n的定義同前)產生下式化合物
其中Tu、Z、Sp、W、m、Y和n的定義同前;-或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是羥基)與α-鹵代乙酸酐反應產生一個Q是α-鹵代乙酰氧基的化合物，在pH4.5和7之間的緩沖水溶液條件下在4～40℃之間溫度下使α-鹵代乙酰氧基-Sp-SS-W或式為Q-Sp-SS-W(其中Sp和W定義同前，Q則如下式所示
化合物與一摩爾式Tu-(Y)n反應(其中Tu的定義同前、Y是蛋白質的側鏈硫醇或是在Tu的胺上引入的酰氨基烷硫基，它是通過先用諸如3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羥基琥珀酰亞胺酯試劑然后用諸如二硫蘇糖醇還原而引入的;或是用2-亞氨基巰基烷(2-imunothlane)在Tu的胺上引入一個酰氨基烷基硫基。n是1～10)產生下式化合物
其中Tu、Sp、W和n的定義同前，Z是基團Q和Y共價反應而形成
n是0.1～10;或者，在pH4.0和6.5之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃溫度下使式Q-Sp-SS-W化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是-NH、-CONHNH、-NHCONHNH、-NHCSNHNH或-ONH)與式為Tu-(Y)n的分子(其中Tu的定義同前，Y是在堿土過磺酸鹽存在下使Tu上糖類殘基氧化而成的醛基，n是1～20)產生下式化合物
(其中Tu、Sp、W、Y和n的定義同前，Z是Q和Y共價反應而形成的，它是-ON＝CH-、-N＝CH-、-CONHN＝CH、-NHCONHN＝CH-或-NHCSNHN＝CH-、m是0.1～15);或者在pH4.0和6.5之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃下馬上用乙酰肼或酪氨酸肼處理下式化合物Tu-Z-Sp-SS-W)m(Y)n-m(其中Tu、Z、Sp、W、Y、n和m的定義同上)產生下式化合物Tu-(Z-Sp-SS-W)m(Y)n-m(其中Tu、Z、Sp、W、n和m的定義同上，Y是-CH NHCOCH3或
以及在pH為4.9～6.5的緩沖水溶液中，在4～40℃溫度下，使該化合物與氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉反應產生下式化合物其中Tu、Sp、W、m和n的定義同上，Z是-NH-CH2-、-CONHNHCH2-、-NHCONHNHCH2-或-NHCSNHNHCH2-，Y是-CH2NHNHCOCH3或者
7.一種治療恒溫動物細菌感染的方法，其特征在于它包括給所述的動物使用式為Q-Sp-SS-W的二硫化取代類似物的有效抗菌劑量，這種二硫化取代類似物從式為CH3-SSS-W化合物制備，分別稱為LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ2-I、δ1-I、溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎铩BM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎铮渲?，
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H或者R8和R9一起是羰基;X是碘或溴原子;R5是氫或基團RCO(其中R是氫或支鏈或非支鏈烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或雜芳基或是芳基-烷基(C1-C5)或雜芳基-烷基(C1-C5)，這些都可任意被一個或多個羥基、氨基、羧基、鹵素、硝基、低級(C1-C5)烷氧基或低級(C1-C5)硫代烷氧基所取代;Sp是直鏈或支鏈二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或芳雜基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中，如果Sp是三價基團，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳雜氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷基硫代基團所取代;Q是氫、鹵素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基，哌嗪子基、羧基、硝基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低級烷氧基、羥基、硫羥基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亞乙基時，Q不可是氫，當CH-SSS-W是E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二價時，Q不能是氫、鹵(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
8.一種在哺乳動物中抑制腫瘤生長的方法，它包括給所述的哺乳動物使用式為Q-Sp-SS-W的二硫化取代物的抗腫瘤有效量該二硫代取代物從式為CH-SSS-W從化合物制得，并分別稱為LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?。BBM-16757。FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎?，其中
R5是CH3，C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H或者R8和R9一起是羰基;X是碘或溴原子;R5是氫或基團RCO(其中R是氫或支鏈或非支鏈烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或雜芳基或是芳基-烷基(C1-C1)或雜芳基-烷基(C1-C5)，這些都可任意被一個或多個羥基、氨基、羧基、鹵素、硝基、低級(C1-C3)烷氧基或低級(C1-C5)硫代烷氧基所取代，Sp是直鏈或支鏈二價或三價(C3-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基、其中，如果Sp是三價基團它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷基硫基團所取代;Q是氫、鹵素、氨基、烷氨苯、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低級烷氧基、羥基、硫羥基、低級烷基二羰基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亞乙基時，Q不可是氫、當CH3-SSS-W是LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114709、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二價時，Q不能是氫、鹵(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
9.一種在哺乳動物中抑制腫瘤生長的方法，其特征在于它包括給哺乳動物使用式為
產物的抗腫瘤劑量，它是從式CH3-SSS-W的化合物中制得，其中CH3-SSS-W是名稱為LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?，BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎锏目鼓[瘤抗生素，它包括使CH3-SSS-W與通式Q-Sp-SH的化合物反應，(其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價或三價環(huán)烷基或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或是二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價基團，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、羧基、低級烷氧基、羥基、硫羥基或低級烷硫基，如果CH3-SSS-W是抗腫瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1724的母體，Sp不能是二價;Q是，或可被隨之轉變成鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、硫羥基、α-鹵代乙酰氧基、低級烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3
產生了一種式為Q-Sp-SS-W的中間產物，其中Q、Sp和W的定義與前相同。使Q-Sp-SS-W與式為Tu-(Y)m的分子反應，(其中Tu定義為單克隆或多克隆抗體、它的碎片，它的化學處理或基因處理的對應物，或是生長因子或類固醇;Y是蛋白質的側鏈氨基、羧基或硫羥基，從糖蛋白糖類殘基中衍生出來的醛基或是酰氨基烷基硫代基團;n是從1～100的整數(shù))產生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定義同前，Z是基團Q和Y直接進行或在還原后進行共價反應的而形式的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-、NHCONHN＝CH-、-NHCONHNHCH2-、-NHCSNHN＝CH-、-NHCSNHNHCH2-、-OH＝CN、-NH-、-NHCH2-、-N-CH-、-CO2-、-NHCH2CO2-、-SS-、
m是0.1～15、
10.體內抗原位點處傳遞化合物的方法，包括給哺乳動物使用式
的蛋白質-藥物配對物的有效抗腫瘤劑量，它是從稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1(CH3SSS-W)的抗腫瘤抗生素中制得，N-乙?；鵏L-E33288 δI1(CH3SSS-W)具有a)圖1所示的紫外光譜;b)圖2所示的紅外光譜;c)圖3所示的質子核磁共振光譜;以及d)圖4所示的C-13核磁共振光譜;或從稱為碘代LL-E33288假糖苷配基的抗腫瘤抗生素中制得，磺代LL-E33288假糖苷配基(CH3SSS-W)具有a)圖5所示的紫外光譜;b)圖6所示的紅外光譜;c)圖7所示的質子核磁共振光譜;以及d)圖8所示的碳-13核磁共振光譜;包括用式為Q-Sp-S的化合物取代二硫代甲基部分(其中Sp是直鏈或支鏈的二價或三價(C2-C5)基團或是二價或三價芳基-或雜芳基-烷基(C2-C5)，其中如果Sp是三價基團，它可另外被氨基、雜芳氨基、羥基或硫醇基所取代;Q是，或可被接下去轉化成羧基、低級烷基二羧酸酐、-CHNHNH2或
產生通式為Q-Sp-SS-W的中間產物(其中Q、Sp和W的定義如前所述)使Q-Sp-SS-W與式為Tu-(Y)n的分子反應，(其中Tu是對人體腫瘤抗原反應敏感的單克隆抗體，Y是抗體的側鏈氨基，或是將抗體的糖基團氧化而成的醛基，n是1～100的整數(shù))產生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定義同前，Z是將基團Q和Y直接共價反應或還原反應后共價反應而形成的，Z是-CHNH-、-CONHN＝CH、-CONHNHCH2-或
m是0.1～15。
全文摘要
本發(fā)明闡述了抗腫瘤劑和抗生素的二硫化物類似物，它們稱為LL-E33288復合物；以及一種從二硫化物類似物中形成的載體-藥物配對物和從配對物中形成的載體-藥物的靶形式的方法。
文檔編號C07H15/20GK1046333SQ9010210
公開日1990年10月24日 申請日期1990年4月14日 優(yōu)先權日1989年4月14日
發(fā)明者喬治·A·伊萊斯苔德, 威廉·詹姆斯·麥克加侖, 馬丁·萊昂·薩西弗, 菲利普·R·漢曼, 洛伊·M·西門, 詹尼斯·厄普斯拉克斯 申請人:美國氰胺公司