專利名稱：：副雞嗜血桿菌疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的內(nèi)容涉及禽類抗副雞嗜血桿菌感染的保護性疫苗，副雞嗜血桿菌抗原物質(zhì)，對該抗原特異的抗體或抗血清以及制備副雞嗜血桿菌疫苗的方法。副雞嗜血桿菌(H.paragallinarum)(以下簡稱H.P)引起雞的上呼吸道感染，稱為傳染性鼻卡他(IC)，最明顯的癥狀包括鼻道和鼻竇有漿液-粘液性鼻腔分泌物，面部水腫及結(jié)膜炎。下呼吸道如氣囊和肺也可發(fā)生感染。雖然發(fā)病率高，但自然致死率相對較低。IC常常引起非產(chǎn)蛋雞數(shù)量增多，生長減慢和產(chǎn)蛋量下降，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。另外，當(dāng)與其它病原如雞痘，雞敗血霉形體，傳染性支氣管炎，巴氏桿菌和傳染性喉氣管炎混合感染時，病情更為嚴(yán)重，病程延長，致死率增高。IC愈后雞常成為本病傳染的帶菌宿主，是雞群體中持續(xù)傳染的重要原因。目前，IC接種應(yīng)用H.P全菌，這些疫苗可以是活的弱毒株，也可以是滅活的強毒株。但活苗接種動物后，不足量的弱毒病原菌會引起接種動物發(fā)病，且有可能在整個雞群中傳播。另外，弱毒株可以恢復(fù)毒力，成為強毒株。滅活疫苗也有許多缺點，如給動物接種全菌，由于細(xì)胞壁物質(zhì)，如脂多糖(LPS)等的存在可以對動物造成副作用。H.P可區(qū)分為三個血清型，即A型、B型、C型，在每一血清型內(nèi)各個H.P株之間都存在一種交叉保護關(guān)系。但是，接種一種特異血清型的H.P菌株的禽類并不能抗另一血清型的H.P菌株的感染，也就是說，免疫是型特異性的。因此，對禽類進行有效的抗IC保護，最好是用一種含有各種H.P血清型的免疫原物質(zhì)的疫苗來進行免疫。除H.P全菌疫苗的上述缺點外，這種疫菌的另一個不足之處在于含有B型或C型全苗的疫苗對接種雞僅僅產(chǎn)生抗同型強毒株感染的部分保護。Iritani等已分離出A型H.P的絲狀血凝素并描述了其有關(guān)特性(Am.J.Vet.res.，41(1980)，2114)。這種絲狀血凝素對A型H.P感染具有抗感染保護活性。但是Iritani分離A型H.P保護性成份的方法，即用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后分離保護性物質(zhì)，不適用于C型H.P保護性物質(zhì)的分離。用這一分離程序，分離不到C型菌保護性成份?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了一種新的H.P保護性成份的分離方法，該方法可適用于所有血清型的H.P。應(yīng)用這一純化新方法得到了一種新的純H.P細(xì)胞膜成份，它包括38±3KD蛋白(經(jīng)SDS-PAGE測定)。這種38KD蛋白對禽H.P感染有高度的抗傳染保護作用。該成分基本上不含細(xì)胞和絲狀物?，F(xiàn)在的發(fā)明中所制備的疫苗為一種亞單位苗，即一種只由那些必需的，與保護作用相關(guān)的成份構(gòu)成的疫苗，這種疫苗來源于分子量約38KD的蛋白構(gòu)成的H.P細(xì)胞膜成份(38KD蛋白富集膜成份)。這種疫苗免疫雞可以有效地保護同型強毒H.P的攻擊。若把富含38KD外膜蛋白(DMP)的H.P細(xì)胞外膜成份制備的疫苗(38KDOMP制劑)接種雞，可以取得更為完全的保護作用。這種純化的38KDOMP制劑基本上不含細(xì)胞和絲狀物。本發(fā)明中H.P疫苗特性尚可進一步描述，其保護活性-對熱敏感-對胰蛋白酶敏感，且-對蛋白酶K處理敏感本發(fā)明中H.P疫苗也可由仍具免疫特性的38KDOMP片段構(gòu)成，即可作為一種免疫等價物。38KD蛋白富集膜成份的分離方法在可促進38KDOMP表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)H.P，利用酶法或機械方法破壞H.P細(xì)胞后，沉淀膜成份，然后離心，分離38KD蛋白富集膜成分。通過將上述膜成分經(jīng)密度梯度離心或用去污劑如Triton×100或肌氨酸(Sarcosine)分級溶解內(nèi)膜，然后離心，進一步分離成內(nèi)膜與外膜成份后，可分離出38KDOMP制品。分離上述成份或制劑的另一種方法就是應(yīng)用針對38KDOMP的特異抗血清(如單克隆抗體)。將H.P膜提取物加到含有38KDOMP特異抗血清的層析柱基質(zhì)上，把提取物中被吸收成份與未被吸收物質(zhì)分離開來，然后從柱基質(zhì)中釋放被吸收成份。必要時，可用已知方法將38KDOMP純化均一。例如，在不影響38KDOMP保護特性的條件下，用一種或多種去污劑萃取使38KDOMP在38KDOMP制劑中增溶，然后利用離子交換層析或分子篩層析進一步純化。同樣，可從所有血清型的H.P菌株如A型、B型、C型或相應(yīng)血清型的H.P菌株適當(dāng)?shù)胤蛛x出已純化的38KD蛋白富集成份。本發(fā)明中欲摻入疫苗中的38KDOMP可通過化學(xué)合成，從H.P細(xì)胞純化或重組技術(shù)獲得。在重組技術(shù)中，例如，可以用與抗38KDOMP的多克隆或單克隆抗體的特異反應(yīng)來篩選H.P單個克隆的染色體DNA文庫，由此鑒定編碼上述蛋白或其片段的核酸序列。將該核酸序列連接到各種有效表達(dá)的DNA序列上，即形成一種所謂的重組核酸分子，這種重組核酸分子可以導(dǎo)入到適宜的宿主中。例如，這種雜交DNA分子，可以與質(zhì)粒雜交而成，也可以與病毒核酸雜交而成。宿主細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞如細(xì)菌，也可以是真核生物細(xì)胞如哺乳類細(xì)胞。被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以用來生產(chǎn)38KDOMP，而后可以分離38KD蛋白或含有38KD蛋白的物質(zhì)，繼而制備疫苗。在另一實施方案中制備一種由非病原性微生物構(gòu)成的活載體疫苗。例如，含有克隆到非病原性微生物中的編碼38KDOMP的核酸序列或核酸片段的細(xì)菌或病毒。本發(fā)明中疫苗可以由38KD蛋白富集膜成份提取，也可由至少一種血清型的H.P38KDOMP制劑制備。也就是說，由這種成份或制劑構(gòu)成的疫苗，或由38KDOMP免疫等價物構(gòu)成的疫苗，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明的疫苗也可以是前面所述的重組DNA疫苗。本發(fā)明的疫苗最好含有一種以上的不同血清型H.P菌株的38KD富集膜成份或38KDOMP制劑。如果雞所接種的疫苗含有A、B、C三種血清型H.P菌株的膜成份或制劑，則可得到抗H.P感染最完全的保護。這種三價疫苗是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。該苗與全菌制備的疫苗相反?？梢酝耆Ｗo已免疫雞。本發(fā)明中疫苗除含有具保護活性的H.P物質(zhì)外，也可含有水溶性基質(zhì)或水懸液，并經(jīng)常與其它成份混合以增加疫苗活力和/或有效期。這些成份可以是鹽，PH緩沖液，穩(wěn)定劑(如脫脂乳或酪蛋白水解物)，乳化劑，增強免疫反應(yīng)的佐劑(如礦物油、胞壁酰二肽、氫氧化鋁、皂角苷、聚陰離子和油水兩親物質(zhì))及象硫柳汞一樣的防腐劑。另外，本發(fā)明疫苗也可含有感染禽類的其他細(xì)菌或病毒如支原體，新城疫病毒及支氣管炎病毒等的免疫原物質(zhì)。所制備疫苗最好對母源雞先行皮下或肌內(nèi)接種。這樣，即可以對接種雞本身產(chǎn)生主動免疫，又可對產(chǎn)蛋雞后代產(chǎn)生被動免疫。免疫產(chǎn)蛋雞抗體滴度升高，必然進入雞卵黃中，因此，傳遞給孵化的幼雞。疫苗成份及接種系統(tǒng)均可發(fā)生改變，二者取決于被保護動物的種類、年齡及重量、期望的保護期、接種方法及母源抗體主動或被動免疫是否確實的問題。對于禽類皮下或肌內(nèi)等非腸道接種，疫苗活性成份的適宜有效量約為每劑0.1-100ug，最佳范圍為0.3-1.0ug蛋白質(zhì)。如上所述的抗H.P主動免疫將主要用于對健康雞提供保護，很明顯，也可用針對其膜成份或膜制劑的抗體治療H.P感染雞?，F(xiàn)在的發(fā)明中，取有效劑量的H.P膜成份，最好與佐劑混合免疫雞，即可制備抗膜成份抗血清。必要時，對動物進行第二次追加免疫以產(chǎn)生適宜的免疫反應(yīng)，然后，給動物放血，制備抗血清?？蓪⒖寡寤蚩贵w與可藥用載體混合使用。把針對一特異血清型的H.P菌株膜成份的抗血清與其他血清型H.P菌株膜成份混合物共同保溫，對H.P膜成份非特異的抗體將吸附到加入的H.P成份上，而從孵育混合物中分離出來，由此制備針對該H.P菌膜成份特異多克隆抗血清。本發(fā)明中針對H.P膜成份或膜制劑的單克隆抗體也可以用于H.P感染雞的被動免疫。用膜成份免疫小鼠，使小鼠脾細(xì)胞體外無限繁殖，篩選出分泌有用抗體的雜交瘤，制備該單克隆抗體。上述抗血清與單克隆抗體也可用于H.P感染雞的免疫學(xué)診斷。實施例1H.P膜成份純化及雞的免疫在巧克力瓊脂上劃線培養(yǎng)H.P菌株，在使一根臘燭熄滅的空氣中37℃培養(yǎng)24小時，然后在含0.01%NADH的TPB中培養(yǎng)。取230ml濃縮的H-18(血清型C)細(xì)胞懸液(含4×1010細(xì)胞/ml40mMPBS+0.01%硫柳汞)。用BransonB12發(fā)聲儀在4℃100瓦(30秒聲處理與30秒冷卻相交替)超聲處理6分鐘。然后，未破碎的細(xì)胞離心沉淀下來(5000×g，10分鐘)，取20ml上清液在礦物油中乳化成油包水佐劑(W/O)，這種疫苗叫SUP-USO(C)，其余210ml上清液用超速離心機167，000×g超離1小時，由溶解成份中純化全部膜成份。用60ml50mMTris-HclPH8.0緩沖液重新懸浮膜沉淀(褐色)。取懸液10ml用上緩沖液稀釋3倍，在W/O佐劑中乳化，這種疫苗叫38KD蛋白富集膜成份(C)。其余50ml懸液與50mMTris-HclPH8.0+2%N-月桂酰肌氨酸鈉液按1∶1混合，室溫孵育2小時，溶解內(nèi)膜，然后，混合物再次以167，000×g超離1小時，把溶解的內(nèi)膜與外膜分離開來。用50ml50mMTris-HclPH8.0懸浮沉淀顆粒，取一小部分懸液用上緩沖液稀釋3倍，在W/O佐劑中乳化，這種疫苗叫38KDOMP制劑(C)。W/O佐劑中乳化的不同純化成份的保護率詳見表1。用0.5ml不同疫苗一次接種10周齡的市售伊莎褐雞(Isabrown)，4周后用H.P菌株H-18(C)攻毒，每種疫苗均接種6只雞。據(jù)表1所示，H.P純化膜成份尤其是純化38KDOMP制劑(C)表現(xiàn)出較高的保護率，可將之歸因于該成份激發(fā)的適宜免疫反應(yīng)所致。要制備單價38KDOMP制劑(A)疫苗，先把083(A)株在巧克力瓊脂上劃線培養(yǎng)，在使一根臘燭熄滅的空氣中37℃培養(yǎng)24小時，然后在含有0.01%NADH的TPB中培養(yǎng)。如同38KDOMP制劑(C)的制備完全一樣，在37℃培養(yǎng)24小時后，離心細(xì)胞，逐步分離純化的38KD外膜蛋白制劑(A)。在W/O佐劑中乳化分離的OMP(A)，制備10ug/0.5ml和1ug/0.5ml的疫苗。為測定這些疫苗，以每份0.5ml劑量肌內(nèi)注射接種10周齡的市售Isabrown雞。在接種當(dāng)天與4周后采血樣并按標(biāo)準(zhǔn)方法進行血凝抑制(HI)試驗測定其血清抗體(保護活性的標(biāo)志)。表238KDOMP制劑(A)接種后雞的HI-A抗體滴度疫苗劑量HI-A滴度a10ug7587101ug55878對照00000a.5只雞為一組，接種4周后測得21og滴度值。表2結(jié)果表明，用10ug和1ug接種雞可以得到100%的保護(HI-A＞2°)。單價38KDOMP制劑(B)制備除用H.P菌株Spross(B)培養(yǎng)并作為分離38KDOMP制劑的起始物外，其它分離步驟與上所述完全相同。實施例2用三價疫苗免疫雞的保護實驗中制備了三價亞單位疫苗(W/O的佐劑)并測定了對A，B，C三血清型H.P菌株攻毒的保護活性。另外，還測定了單價H-18(C)疫苗抗異型H.P菌株083(A)和Spross(B)攻擊的保護活性。用于制備三價亞單位疫苗的083(A)，Spross(B)，H-18(C)的38KDOMP制劑完全按實施例1所述提純。每劑0.5ml三價疫苗含有每種蛋白各100ug，單價H-18(C)疫苗與實施例1中應(yīng)用的38KDOMP制劑疫苗完全相同。用0.5ml疫苗一次接種10周齡的市售Isabrown雞，4周后攻毒。7只雞為一受試組。表3三價亞單位苗和單價亞單位苗的保護率<tablesid="table2"num="002"><tablealign="center">攻毒菌株(血清型)疫苗臨床癥狀重新分離總數(shù)a保護率％陽性雞數(shù)保護率％083(A)083〃1645〃1645〃Spross(B)〃〃H-18(C)H-18〃Modesto〃〃〃083(A)Spross(B)對照三價苗對照三價苗對照三價苗對照三價苗對照三價苗單價苗〃1801801902002002119010001000100010001000070707071717701000100010008608600</table></tables>a攻毒24小時、48小時，5天后三次觀察有鼻腔分泌物的雞總數(shù)b攻毒5天后眶下囊重新分離(衛(wèi)星生長)由表3可知，H-18(C)單價疫苗接種后只能誘導(dǎo)同型保護，而三價疫苗可對所有受試菌株的攻擊產(chǎn)生完全保護。實施例338KD蛋白富集膜成份的特性A、B、C三種血清型H.P菌株(分別為083、Spross、H-18)的38KD蛋白富集膜成份與38KDOMP制劑的純化按實施例1所述進行。純化制劑按Laemmli(Nature(1070)，227.680-685)方法進行SDS-PAGE。純化制劑SDS-PAGE用CBB染色表明分子量約38KD的電泳帶是OMP制劑中的主要蛋白(圖1)。圖1表明三種不同血清型的H.P菌株083(A)(A-B)、Spross(B)(D-E)、H-18(C)(G-H)各自的SUP-USO和38KDOMP制劑的SDS-PAGE凝膠電泳圖。分子量標(biāo)志蛋白在C、F、I泳道。馬細(xì)胞色素C12.3KD馬肌紅蛋白17.2KD牛磷酸酐酶30.0KD雞蛋卵清蛋白43.0KD牛血清白蛋白66.3KD雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白78.0KD為進一步確定38KDOMP制劑保護活性的性質(zhì)，按實施例1所述提純083(A)、Spross(B)、H-18(C)的38KDOMP制劑，并進行熱處理和酶消化(胰蛋白酶與蛋白酶K)。胰蛋白酶可以把蛋白質(zhì)分解成陽性電荷的氨基酸殘基(即賴氨酸殘基、精氨酸殘基)、蛋白酶K是一種很強的酶，可以把大部分蛋白質(zhì)分離成小的肽段，加熱到100℃雖然氨基酸鏈保持完整，但卻使大部分蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)展開(大部分是不可逆的)。為進行酶消化，可將2mg蛋白質(zhì)與200ug酶在1ml40mMPBS中37℃保溫1.5小時。對照制劑除不加酶外方法相同。為了獲得熱變性蛋白，可用2mg蛋白質(zhì)在1ml40mMPBS中100℃加熱10分鐘。由每0.5ml劑量含50ug蛋白構(gòu)成的水包油(O/W)乳化液制備疫苗，并測定其抗同型菌攻擊的保護活性。取10周齡的市售Isabrown雞一次接種該疫苗，4周后攻毒。每一攻毒組含6只雞(表4)。由保護性實驗可知，保護活力對熱處理和酶處理敏感，這一處理可大大降低所有三種血清型的保護能力。權(quán)利要求1.保護家禽免遭副雞嗜血桿菌感染的疫苗，其特征在于，該疫苗基本上沒有細(xì)胞和絲狀物質(zhì)，該疫苗是由含有約38KD蛋白或其免疫等價物的副雞嗜血桿菌細(xì)胞的膜部分得到的，38KD蛋白是以SDS-PAGE測定的。2.按照權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，它是由具有38KD蛋白作為主要的蛋白成分的外膜制劑制備的。3.按照權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，它是由至少2個不同血清型的副雞嗜血桿菌細(xì)胞的膜部分制得的。4.按照權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，它是由血清型A、B和C的副雞嗜血桿菌細(xì)胞的膜部分得到的。5.按照權(quán)利要求1-4所述的疫苗，其特征在于，它另外還含有至少一種感染家禽的其他微生物或致免疫的物質(zhì)。6.按照權(quán)利要求1-5所述的疫苗，其特征在于，它含有佐劑。7.副雞嗜血桿菌抗原物質(zhì)，其特征在于，它是含有約38LD蛋白(以SDS-PAGE測得)或其免疫等價物的副雞嗜血桿菌細(xì)胞的膜部分，該抗原物質(zhì)基本上沒有細(xì)胞和絲狀物質(zhì)。8.權(quán)利要求7所述的抗原物質(zhì)，其特征在于，它是具有38KD蛋白作為主要蛋白成分的外膜制劑。9.與權(quán)利要求7或8所述副雞嗜血桿菌抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗體或抗血清。10.含有權(quán)利要求9所述抗體或抗血清的藥用制劑。11.制備權(quán)利要求1所述疫苗的方法，其特征在于，使副雞嗜血桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后從其中提取出含有約38KD蛋白的膜物質(zhì)，并加工成具有免疫活性的制劑。12.保護家禽免遭副雞嗜血桿菌感染的方法，其特征在于，給動物服用有效劑量的權(quán)利要求1-6所述的疫苗。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于保護家禽免遭副雞嗜血桿菌感染的疫苗。用含有38KD外膜蛋白的副雞嗜血桿菌細(xì)胞的膜部分接種的雞可以抗感染，得到很好的保護。文檔編號C07K14/285GK1059471SQ9110866公開日1992年3月18日申請日期1991年9月4日優(yōu)先權(quán)日1990年9月5日發(fā)明者安·亞·克·亞可布斯申請人:阿克佐公司