專利名稱：干細(xì)胞增殖因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系中分離的自分泌生長(zhǎng)因子。具體說(shuō)來(lái)是涉及干(Stem)細(xì)胞增殖因子(SCPF)的生產(chǎn)、線化及應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)以兩種形式存在，即可溶性形式及膜結(jié)合形式，后者可在少數(shù)人骨髓細(xì)胞表面上檢測(cè)到，并可刺激這些細(xì)胞的增殖。因此，SCPF可具有廣泛的應(yīng)用，包括(但不只限于)加強(qiáng)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，可用抗體除去該蛋白質(zhì)以此來(lái)控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
已有人述及生長(zhǎng)因子對(duì)以自分泌方式產(chǎn)生它們的細(xì)胞發(fā)揮其刺激作用。這些因子也可對(duì)其他靶細(xì)胞表現(xiàn)出相似的活性。然而，文獻(xiàn)中尚未描述過(guò)從神經(jīng)系統(tǒng)得到的腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)的因子。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚細(xì)胞腫瘤是很罕見(jiàn)的，占兒科實(shí)體瘤的不到3%。這些腫瘤大多發(fā)生于松果體腺和下丘腦，但也有報(bào)導(dǎo)發(fā)生在丘腦和基底神經(jīng)節(jié)的。從組織學(xué)上看，這些腫瘤最常見(jiàn)的是胚細(xì)胞腫瘤(germinomas)不太常見(jiàn)的亞型包括絨毛膜癌，胚胎生殖細(xì)胞腫瘤及混合的胚細(xì)胞腫瘤。這些類型的腫瘤一般予后都很差。
治療這些腫瘤有多種方法，對(duì)于胚細(xì)胞瘤可用外科和放射療法，對(duì)于患有非生殖細(xì)胞瘤性胚細(xì)胞腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或再發(fā)性腫瘤疾病的病人使用以增強(qiáng)鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)療法及自體骨髓移植，具有明顯療效。已報(bào)導(dǎo)轉(zhuǎn)移瘤通過(guò)腦室旁路傳播并可發(fā)生在沿分流束的任何部位。已有人報(bào)導(dǎo)代謝沉積物在頸部和肺部出現(xiàn)，但最多見(jiàn)的是這些沉積物與腦室內(nèi)膜旁路和大腦膜移植物有關(guān)。有關(guān)從顱內(nèi)胚細(xì)胞腫瘤培養(yǎng)的細(xì)胞系的報(bào)導(dǎo)不多，但已從神經(jīng)器官外的胚細(xì)胞腫瘤得到幾個(gè)細(xì)胞系。已從大鼠腫瘤中得到體外連續(xù)細(xì)胞系。已證明這些細(xì)胞系在原始多潛能細(xì)胞分化研究中有很大價(jià)值。
在人類醫(yī)藥中，能引發(fā)并調(diào)節(jié)造血機(jī)能的藥物是很重要的(McCune et al.，1988，Science 2411632)。各種疾病和免疫功能紊亂，包括惡性腫瘤，似乎都與淋巴-造血系統(tǒng)的破壞有關(guān)。其中許多紊亂通過(guò)用始祖細(xì)胞再建造血系統(tǒng)得以緩解或治愈，當(dāng)用這一方法啟動(dòng)細(xì)胞分化時(shí)將會(huì)克服病人的缺陷。在人體中，目前使用的替代治療即是骨髓移值。除在治療白血病中使用骨髓移植外，該療法目前也常常用于治療其他腫瘤生成(Epstein and Slease，1985，Surg.Ann，17125)。但這種療法可因引入侵害性操作而造成疼痛(對(duì)于供體或受體兩者)，并可能使受體發(fā)生嚴(yán)重的合并癥，特別是當(dāng)移植物對(duì)受體是異源的并出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)時(shí)。因此，GVHD的危險(xiǎn)性限制了骨髓移植法對(duì)病人的使用，否則要引起致命疾病。骨髓移植法對(duì)病人的使用治療造血功能紊亂的一種可能更為令人鼓舞的替代方法是給病人使用任何一種或合用幾種集落刺激因子(Dexter，1987，J.Cell Soi.881)。
在血細(xì)胞生成過(guò)程中，少量自身更新干細(xì)胞產(chǎn)生特定的始祖細(xì)胞譜系，然后在特別激素的控制下分并化增殖由此產(chǎn)生成熟的循環(huán)血細(xì)胞。這些激素統(tǒng)稱為集落刺激因子(CSFs)(Metcalf，1985，Science 22916;Dexter，1987，J.Cell Sci.881;Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62;Tabbara and Robinson，1991，Anti-Cancer Res.1181;Ogawa，1989，Environ.Health Presp.80199;Dexter;1989，Br.Med.Bull.45337)。隨著重組DNA技術(shù)的進(jìn)展，目前已克隆并表達(dá)了許多這樣的CSF(Souza et al.，1986，Science 23261;Gough et al.，1984，Nature.309763;Yokota et al.，1984，Proc.Natl，Acad，Sci，USA，811070;Kawasaki et al.，1985，Science 230291)?，F(xiàn)已可得到這些重組體CSF，并已開(kāi)始對(duì)其治療潛力進(jìn)行深入的研究。它們?cè)卺t(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用是廣泛的，包括用于輸血、骨髓移植、糾正免疫抑制性疾病、腫瘤治療、創(chuàng)傷愈合及激活免疫反應(yīng)等領(lǐng)域(Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62)。除誘導(dǎo)造血始祖細(xì)胞的增殖和分化外，還顯示CSF能激活成熟血細(xì)胞的許多功能(Stanley et al.，1976，J.Exp.Med.143631;Schrader et al.，1981，Proc.Natl，Acad.Sci.USA.78323;Moore et al，1980，J.Immunol.1251302;Kurland et al.，1979，Proc，Natl.Acda，Sci.USA，762326;Handman and Burgess，1979;J.Immunol.1221134;Vadas et al.，1983，Blood 611232;Vadas et al.，1983，J.Immunol.130795)，包括影響成熟造血細(xì)胞的遷移(Weibart et al.，1986，J.Immunol.1373584)。
本發(fā)明涉及干細(xì)胞增殖因子(SCPF)，其在刺激包括造血干細(xì)胞在內(nèi)之各種干細(xì)胞群體生長(zhǎng)中的應(yīng)用，以及鑒定由胚細(xì)胞腫瘤產(chǎn)生之其他生長(zhǎng)因子或細(xì)胞激活素的方法。SCPF是一種以分子量32，000道爾頓之分泌形式或37，000道爾頓之膜結(jié)合形式表達(dá)的新的自泌生長(zhǎng)因子。SCPF刺激產(chǎn)生該因子之胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系及CD34+人骨髓干細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。
本發(fā)明部分地基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系751向培養(yǎng)基中釋放自泌生長(zhǎng)因子。產(chǎn)生抗純化的32KDa蛋白質(zhì)的多克隆兔抗體(SAM.1)可識(shí)別32KDa分泌型產(chǎn)物及37KDa細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)。該抗體亦可識(shí)別人骨髓中的細(xì)胞群體，而與不到2.6%的正常(粘著耗竭的)骨髓細(xì)胞反應(yīng)。該SCPF骨髓細(xì)胞群體共表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD34。如在下文所述的工作實(shí)施例中所顯示的，SCPF不同于任何已知的骨髓集落刺激因子(CSF)，因?yàn)閷?duì)GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異的抗體均不能抑制SCPF的生物學(xué)活性。另外，SCPF也不同于C-Kit致癌基因產(chǎn)物SCF的配基，因?yàn)榭筍CPF抗體并不能中和SCF功能。
在借助實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所作的描述中，胚細(xì)胞腫瘤是從病人體內(nèi)分離的，SCPF被鑒定為由該腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的自泌生長(zhǎng)因子，并鑒定了該因子的生物化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)。有關(guān)該新的蛋白質(zhì)的廣泛應(yīng)用也包括于本文所描述的本發(fā)明之范圍內(nèi)。


圖1顯示根據(jù)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定的表型特征。用針對(duì)抗原標(biāo)志物的抗體著染751-胚細(xì)胞系，其中所說(shuō)的抗原標(biāo)志物是對(duì)非神經(jīng)-外胚層細(xì)胞(抗PAP，抗HCG)，和神經(jīng)器官胚細(xì)胞(抗細(xì)胞角蛋白(anti-cytokeratin)、vimentin、NSE、GFAP和NFP)之細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)特異性的。使用抗HLAI類作為對(duì)照。示于方框中的染色圖形指示該細(xì)胞系為能夠分化成神經(jīng)或膠質(zhì)譜系細(xì)胞的初級(jí)神經(jīng)-外胚層細(xì)胞。
圖2顯示跟蹤[35S]蛋氨酸代謝標(biāo)記的751胚細(xì)胞腫瘤上清液的SDS-PAGE凝膠所作的放射自顯影及Ambis掃描圖。上清液是在35S-脈沖-751-GC-原始胚細(xì)胞體外生長(zhǎng)24小時(shí)后收集的。從原發(fā)性皮下腫瘤中分離751-T2-nu/nu小鼠傳代細(xì)胞。從肝轉(zhuǎn)換瘤中分離751-Met nu/nu小鼠傳代細(xì)胞。Ambis掃描針對(duì)32KDa蛋白質(zhì)，并顯示32KDa蛋白質(zhì)在分泌量上不同于只在組織培養(yǎng)中傳代的小鼠腫瘤、轉(zhuǎn)移腫瘤及原始胚細(xì)胞系。
圖3顯示使用SAM.1抗體所作的37KDa凝膠純化蛋白(SCPF)的Western印跡分析。(A)對(duì)顯示37KDa蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠的考馬斯蘭染色;(B)圖3A中的凝膠的Western印跡。
圖4顯示抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。用SAM.1抗體(抗SCPF)抑制軟瓊脂膠(甲基纖維素)中的腫瘤細(xì)胞集落形成。條形圖顯示集落(絕對(duì)數(shù))抑制作用為抗體濃度之函數(shù)。NRS是以1∶20稀釋的正常兔血清。下面的圖顯示用亞甲基蘭染色的真實(shí)集落。
圖5顯示抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。該圖顯示SAM.1抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用為氚標(biāo)記之胸苷摻入(以測(cè)定DNA復(fù)制)的函數(shù)。將細(xì)胞以10，000個(gè)細(xì)胞/小井的數(shù)量加入96小井的微量滴定板中，并向各小井內(nèi)再加入不同稀釋度的抗血清。各稀釋度均設(shè)三份。培養(yǎng)48小時(shí)后用3H-胸苷(IU/井)標(biāo)記細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，此后收獲細(xì)胞并使用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性同位素的結(jié)合。數(shù)據(jù)表明，胚細(xì)胞751和真正原始骨髓細(xì)胞系(BO-BM.1)的增殖作用受到了抗體的抑制，但A251成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系則未受抑制。
圖6顯示對(duì)根據(jù)克隆生成活性CD34表達(dá)分離的人骨髓胚細(xì)胞所作的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果。
圖7顯示CD34+細(xì)胞在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中的復(fù)制情況在體外培養(yǎng)之前使用純化的SCPF誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞。
圖8顯示正常人骨髓細(xì)胞在對(duì)SCPF反應(yīng)中的增殖作用氚標(biāo)記的胸苷摻入檢測(cè)法。
圖9顯示粘附耗竭的人骨髓細(xì)胞(9A)及用SAM.1(抗-SCPF)抗體染色的臍帶血細(xì)胞(9B)的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。黑線代表FITC羊抗兔對(duì)照，蘭線代表羊抗小鼠FITC對(duì)照。I類HLC(綠線)用作陽(yáng)性對(duì)照。
圖10顯示人臍帶血細(xì)胞群體的雙染色(SAM.1和CD34)分析結(jié)果。
圖11顯示SAM.1結(jié)合于通過(guò)免疫磁性小珠分離的CD34+細(xì)胞的單色和雙色流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。(1a)羊抗兔FITC對(duì)照;(1b)用SMA.1抗體染色的CD34+細(xì)胞;(1c)用I類HLA鼠單克隆抗體染色的CD34+細(xì)胞;(2a)羊抗小鼠PE對(duì)照;(2b)用抗CD34抗體染色的CD34+細(xì)胞;(2c)羊抗小鼠FITC對(duì)照;(3b)用SAM.1(FITC)和抗CD34單克隆抗體(PE)雙染色的CD34+細(xì)胞。
圖12顯示用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析法比較單用SAM.1和抗CD34及兩者合用的結(jié)合效率。
圖13顯示使用SCPF刺激的CD34+細(xì)胞的長(zhǎng)期體外生長(zhǎng)情況。
圖14顯示對(duì)使用SCPFGate C的長(zhǎng)期培養(yǎng)中擴(kuò)充的CD34+細(xì)胞所作的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果(3種顏色)。
圖15顯示對(duì)使用SCPFGate B的長(zhǎng)期培養(yǎng)中擴(kuò)充的CD34+細(xì)胞所作的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果。
圖16顯示SCPF的骨髓克隆產(chǎn)生活性。(A)單獨(dú)CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的BFU活性;(B)不同濃度之SCPF的BFU活性;(C)與100ng/ml SCPF混合之CSF的BFU活性。數(shù)據(jù)表明，SCPF可單獨(dú)誘導(dǎo)BFU活性(B)，并且也可與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
圖17顯示SCPF的骨髓細(xì)胞克隆生成活性。(A)單用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GM活性;(B)不同濃度之SCPF的CFU-GM活性;(C)100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GM活性。數(shù)據(jù)表明SCPF能夠單獨(dú)誘導(dǎo)CFU-GM活性(B)，而且還與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
圖18顯示SCPF的骨髓細(xì)胞克隆生成活性。(A)單用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GEMM活性;(B)不同濃度之SCPF的CFU-GEMM活性;(C)與100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GEMM活性。數(shù)據(jù)表明單用SCPF不能誘導(dǎo)CFU-GEMM活性(B)，但可與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
本發(fā)明涉及干細(xì)胞增殖因子(SCPF)，用常規(guī)或重組DNA技術(shù)生產(chǎn)SCPF的方法，使用SCPF的方法，以及鑒定并分離從相似衍生的胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系中得到的SCPF家族之其他成員的方法。
SCPF是由胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系751按膜結(jié)合及分泌形式表達(dá)新的自泌生長(zhǎng)因子。膜形式的SCPF也可在小部分CD34+人骨髓細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)。另外，SCPF刺激CD34+骨髓干細(xì)胞的增殖，表明其可用于需要加速造血細(xì)胞生長(zhǎng)的條件，即用于供骨髓移植或體內(nèi)治療調(diào)節(jié)造血功能之干細(xì)胞的培養(yǎng)物中。用抗體除去751腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中的SCPF可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞集落形成減少，此現(xiàn)象提示SCPF參予支持腫瘤細(xì)胞增殖，因而這種對(duì)SCPF活性的抑制作用可用于治療某些腫瘤。這一點(diǎn)可借助體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得以證明，其中聯(lián)合注射抗SCPF抗體和751細(xì)胞后可降低該細(xì)胞系的腫瘤生成。此外，SCPF的膜結(jié)合形式的SCPF也可作為利用抗SCPF抗體鑒定和分離多潛能骨髓干細(xì)胞小群體的細(xì)胞表面標(biāo)志。
SCPF或其片段及其衍生物在調(diào)節(jié)造血功能及治療某些胚細(xì)胞腫瘤中可具有廣泛的潛在應(yīng)用。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，可在培養(yǎng)物中產(chǎn)生其他胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系。這些腫瘤細(xì)胞可以是細(xì)胞激活素的來(lái)源，在特殊情況下對(duì)造血系統(tǒng)的細(xì)胞，而在一般情況下對(duì)各種不同組織類型之胚細(xì)胞或干細(xì)胞都具有生長(zhǎng)增強(qiáng)活性。
下文只是為描述之目的而不是以限制方式更詳細(xì)地討論本發(fā)明。為清楚起見(jiàn)，主要就特別SCPF及胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系來(lái)描述本發(fā)明。但其原理也同樣適用于得自其他胚細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的其他自泌因子。
神經(jīng)-外胚層胚細(xì)胞系據(jù)信中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚細(xì)胞腫瘤是胚胎發(fā)生中神經(jīng)嵴內(nèi)原始細(xì)胞在其遷移到其他組織部位時(shí)形成的產(chǎn)物。這樣的腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生多種作用于神經(jīng)系統(tǒng)外組織的細(xì)胞激活素(Bhandar，1988，Med，Hypoth，27291)。因此，由胚細(xì)胞腫瘤產(chǎn)生的細(xì)胞系可以是早期作用性生長(zhǎng)因子的來(lái)源，它影響包括造血系統(tǒng)細(xì)胞在內(nèi)之各種類型細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明用于詳細(xì)描述的一個(gè)例子，是由得自診斷為沿腦室腔腹支流有多發(fā)性皮下腫塊之病人體內(nèi)外科切除胚細(xì)胞腫瘤產(chǎn)生的長(zhǎng)期細(xì)胞系751。培養(yǎng)的細(xì)胞是非粘附性的，并在體外表現(xiàn)有極短的(7-8小時(shí))倍增時(shí)間。經(jīng)將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BNX小鼠體內(nèi)，小鼠在接種102個(gè)細(xì)胞后7天內(nèi)即產(chǎn)生了可見(jiàn)的皮下腫瘤，而大多數(shù)異種腫瘤在小鼠模型體內(nèi)則需經(jīng)過(guò)2-3個(gè)月，這一事實(shí)也可進(jìn)一步證實(shí)其迅速生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。
使用抗特異性細(xì)胞決定基的抗體進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，表明751細(xì)胞系代表了在經(jīng)過(guò)適當(dāng)刺激后可進(jìn)一步分化為神經(jīng)或膠質(zhì)細(xì)胞譜系的原始腦神經(jīng)-外胚層細(xì)胞系。因此可見(jiàn)，其為具有生長(zhǎng)和分化性質(zhì)的原始多潛能細(xì)胞系。751細(xì)胞并不表達(dá)包括CD34在內(nèi)的任何一種已知的白細(xì)胞表面標(biāo)志物。此外，已使用對(duì)一組致癌基因序列特異的分子探針檢測(cè)了致癌基因c-myc和c-fms的mRNA。因?yàn)橐扬@示c-fms是巨噬細(xì)胞集落刺激因子的受體，所以751細(xì)胞可能以某種方式與骨髓的始祖細(xì)胞相關(guān)。
干細(xì)胞增殖因子由實(shí)施例中所述之751細(xì)胞系產(chǎn)生的干細(xì)胞增殖因子以兩種形式存在，即分子量約32KDa的分泌形式，和分子量為37KDa的膜結(jié)合形式。經(jīng)鑒定多個(gè)SCPF異型的P.I.在大約7.0至8.0范圍內(nèi)。
使用32KDa SCPF在兔體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗血清。使用定名為SAM.1的特異性抗體以便于對(duì)751細(xì)胞產(chǎn)生的主要分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行生物化學(xué)特性鑒定。因?yàn)樵摽贵w可在Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)中與751全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中的37KDa蛋白質(zhì)反應(yīng)，故首先顯示它是對(duì)SCPF蛋白質(zhì)特異性的。這一發(fā)現(xiàn)證明，該有用蛋白質(zhì)可以32KDa分子量的分泌形式和37KDa分子量的膜形式存在，后者可包括固定于細(xì)胞上的跨膜成分。因此，上述蛋白質(zhì)可作為可溶性分子和相互作用的細(xì)胞間的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能。
為了闡明該蛋白質(zhì)(下文稱為干細(xì)胞增殖因子，SCPF)的生物學(xué)活性，在不同濃度兔抗血清存在下，用集落抑制試驗(yàn)估測(cè)751細(xì)胞的集落形成能力。結(jié)果清楚地證明抗體可抑制腫瘤細(xì)胞集落形成，進(jìn)而表明該分泌蛋白質(zhì)是一種能促進(jìn)751細(xì)胞生長(zhǎng)的自泌生長(zhǎng)因子。再者，抗體的增殖抑制效應(yīng)是對(duì)其中成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)不受抑制的胚細(xì)胞或干細(xì)胞系特異的。
純化SCPF并試驗(yàn)其刺激人骨髓細(xì)胞增殖的能力。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中顯示SCPF誘導(dǎo)了母細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而通過(guò)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法顯示其可表達(dá)CD34標(biāo)志物及I類HLA抗原。當(dāng)同樣的細(xì)胞在不存在SCPF下，作為長(zhǎng)期Gordon培養(yǎng)物生長(zhǎng)并在重組體GM-CSF存在下試驗(yàn)再鋪敷效力時(shí)，該細(xì)胞即產(chǎn)生粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及混合表型的集落。因此，SCPF能夠誘導(dǎo)CD34+骨髓細(xì)胞群體的復(fù)制，并在對(duì)繼后集落刺激因子之刺激的反應(yīng)中保持分化能力。
當(dāng)抗SCPF抗體與人骨髓細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞的小部分(但可測(cè)出的)顯示為陽(yáng)性染色。這些細(xì)胞也可表達(dá)CD34蛋白質(zhì)，已報(bào)導(dǎo)該蛋白質(zhì)是由造血干細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志物。然而，產(chǎn)生SCPF的751胚細(xì)胞腫瘤對(duì)于CD34表達(dá)顯示陰性，并且抗SCPF和抗CD34抗體在與純化的CD34+細(xì)胞結(jié)合中彼此并不發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這些發(fā)現(xiàn)證明SAM.1抗體不針對(duì)CD34標(biāo)志物而是針對(duì)膜結(jié)合形式的SCPF的。SAM.1抗體不與各種非人動(dòng)物的任何蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，因此該抗體不與得自小鼠、牛及羊骨髓的細(xì)胞反應(yīng)。
為了進(jìn)一步確定SCPF的生物學(xué)特性，在純化的異種SCPF存在下制成CD34+細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物。與對(duì)重組體IL-3或IL-6反應(yīng)中迅速擴(kuò)充的培養(yǎng)物不同，接受SCPF的培養(yǎng)物經(jīng)受了一個(gè)細(xì)胞死亡的起始期，而產(chǎn)生其后能在對(duì)SCPF反應(yīng)中增殖的殘留的CD34+細(xì)胞群體。與生長(zhǎng)于IL-3或IL-6中的培養(yǎng)物完全不同，用SCPF處理的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上似乎更為均勻。然而，用SCPF處理的培養(yǎng)物根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)產(chǎn)生兩種細(xì)胞群體。雖然兩個(gè)群體均表達(dá)CD34，但一個(gè)并不表達(dá)CD38和HLA-DR，而另一個(gè)只以低水平表達(dá)這兩種標(biāo)志物。因此，總的說(shuō)來(lái)SCPF是一種誘導(dǎo)CD34+骨髓細(xì)胞增殖而不引起分化的自泌生長(zhǎng)因子，同時(shí)這些細(xì)胞保留了它們對(duì)其他分化信號(hào)反應(yīng)的能力。因?yàn)槌CPF可導(dǎo)致CD34+細(xì)胞存活性的迅速降低，所以可知該因子并不誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
另外，當(dāng)與其他集落刺激因子結(jié)合使用時(shí)，SCPF能夠增強(qiáng)對(duì)骨髓細(xì)胞的刺激作用。然而，SCPF不同于任何已知的造血生長(zhǎng)因子，因?yàn)閷?duì)人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異的抗體不能中和SCPF的生物學(xué)活性。此外，抗SCPF抗體并不抑制最近鑒定的干細(xì)胞因子(SCF)的功能，后者已被證明為由C-Kit致癌基因編碼之受體的配基(Yokota et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.811070，williams et al.，1990，Cell 63167;Zeebo et al.，1990，Cell 63195。
SCPF編碼序列的分離可從產(chǎn)生SCPF的細(xì)胞來(lái)源得到用于制備cDNA的信使RNA(mRNA)，而SCPF的基因組序列則可從任何細(xì)胞來(lái)源得到。例如，可利用751-NA、751-LIV或751-LN細(xì)胞作為編碼SCPF之序列的來(lái)源和/或制備cDNA或基因組文庫(kù)。可使用含SCPF編碼序列的基因工程化微生物或細(xì)胞系作為用于該目的之DNA的方便來(lái)源。
可從使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生的DNA片段制備cDNA或基因組文庫(kù)?？墒褂猛从诨诘米约兓鞍踪|(zhì)氨基酸序列信息的部分SCPF序列的核苷酸探針篩選上述文庫(kù)來(lái)鑒定編碼SCPF的片段。另外，可使用抗體探針篩選用表達(dá)克隆方法產(chǎn)生的文庫(kù)如λgtll(Young and Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.801194-1198)。雖然可以利用部分編碼序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，但最好還是利用全長(zhǎng)克隆，即那些含有整個(gè)SCPF編碼區(qū)的序列。最后，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分離DNA，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南拗菩云?，?gòu)建克隆和文庫(kù)，以及篩選重組體的技術(shù)，如參見(jiàn)Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y中描述的技術(shù)。
不管選用什么方法來(lái)鑒定和克隆SCPF編碼序列，都可利用表達(dá)克隆方法來(lái)大大減少篩選的工作量。最近，有報(bào)導(dǎo)克隆和表達(dá)抗體基因的一步驟方法(McCafferty et al.，1990，Nature 348552-554;Winter and Milstein，1991，Nature 349293-299)?；谶@一技術(shù)，可將SCPF基因在相鄰于入或fd等噬菌體的衣殼蛋白基因的位點(diǎn)處克隆到載體中。攜帶SCPF基因的噬菌體在其表面上表達(dá)融合蛋白質(zhì)，從而可使用含有SCPF特異性抗體的柱選擇并分離具有結(jié)合活性的噬菌體顆粒。也可使用市售的其中利用λ-Zap-bluescript的表達(dá)克隆系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行SCPF cDNA文庫(kù)的克隆，和抗體篩選。可利用瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)鑒定正確的SCPF基因。例如，可使用cos細(xì)胞系統(tǒng)(如參Gerard & Gluzman，1986，Mol.Cell Biol.6(12)4570-4577)。
由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)便性，在本發(fā)明克隆和表達(dá)SCPF的實(shí)踐中，可使用任何已知SCPF基因的編碼類似氨基酸序列的其他DNA序列。這類改變包括不同核苷酸殘基的缺失、加入或取代而產(chǎn)生編碼相同或功能上等同基因產(chǎn)物之序列?；虍a(chǎn)物可在序列內(nèi)包含氨基酸殘基的缺失、加入或取代，導(dǎo)致沉默改變而得以產(chǎn)生生物活性產(chǎn)物?？苫谟嘘P(guān)殘基在極性，電荷，溶解度、疏水性、親水性和/或兩歧性等性質(zhì)的相似性而作出這些氨基酸的取代作用。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸的精氨酸;具有相似親水性值之不帶電荷極性頭部基因的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸?？山柚酆厦告湻磻?yīng)，使用寡核苷酸序列增加特有基因序列的拷貝數(shù)。這一方法比使用簡(jiǎn)并寡核苷酸得到的探針更具特異性。
此外，在本發(fā)明的實(shí)踐中也可使用包括結(jié)構(gòu)修飾但基本上未改變所編碼SCPF蛋白質(zhì)生物學(xué)性質(zhì)的其他DNA序列。這些修飾包括(但不只限于)SCPF中氨基酸殘基的加入、缺失或取代，以造成附加的加工位點(diǎn)和/或除去糖基化位點(diǎn)。例如，在某些蛋白質(zhì)中除去N-連接的糖基化位點(diǎn)可減少某些特別適用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的被表達(dá)產(chǎn)物上的糖基化作用。
為了表達(dá)生物學(xué)活性SCPF，可將編碼SCPF的核苷酸序列或其功能等同核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體即含為轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯已插入編碼序列所需之結(jié)構(gòu)元件的載體中?？蓪?duì)經(jīng)修飾的SCPF編碼序列的變體進(jìn)行基因工程處理，以提高被表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)生量、純度或得率。例如，可對(duì)融合蛋白或含有SCPF及異源蛋白質(zhì)之可裂解融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行工程化處理。可用親和層析法，很容易地分離出這樣的融合蛋白質(zhì)，如將其固定在對(duì)異源蛋白特異的層析柱上。若在SCPF部分和異源蛋白間造成一個(gè)裂解位點(diǎn)，即可用適當(dāng)?shù)拿富蚩善茐牧呀馕稽c(diǎn)的試劑處理后從層析柱上釋放出SCPF蛋白質(zhì)(參見(jiàn)Booth et al.，1988，Immunol.Lett.1965-70;Gardella et al.，1990，J.Biol.Chem.26515854-15859)。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu)建含有SCPF編碼序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，及體內(nèi)重組/基因技術(shù)(如參見(jiàn)Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory NY中描述的技術(shù))。
可利用各種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)SCPF編碼序列。這些系統(tǒng)包括(但不只限于)微生物，如用含有SCPF編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒型質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌;用含有SCPF編碼序列的重組體酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母;用含SCPF編碼序列的重組體病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染或用重組體質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng);用含有SCPF編碼序列的重組體病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)或用含有SCPF編碼序列的重組體病毒表達(dá)載體(如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒)轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，或?yàn)榉€(wěn)定表達(dá)目的而進(jìn)行工程化處理的轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。因?yàn)樯形赐耆C實(shí)SCPF含有碳水化合物，故可既使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)又使用提供轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后修飾的表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母或植物表達(dá)系統(tǒng)。
依據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可在表達(dá)載體中使用很多適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件之任何一種，包括結(jié)構(gòu)和可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件及轉(zhuǎn)錄終止子等(參見(jiàn)Bitter et al.，1987，Methods in Enzymology 153516-544)。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用λ噬菌體的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)等可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用得自哺乳動(dòng)物基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫因啟動(dòng)子)或得自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如反轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列;腺病毒晚期啟動(dòng)子;牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)。以重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子也可使用來(lái)提供被插入之SCPF編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)被表達(dá)之SCPF的需要許多表達(dá)載體可供選擇。例如，當(dāng)需生產(chǎn)大量SCPF時(shí)，可使用能指導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。最好是那些經(jīng)基因工程處理而含有裂解位點(diǎn)以有助于回收SCPF的載體。這樣的載體包括(但不只限于)大腸桿菌表達(dá)載體PUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)(其中SCPF編碼序列可被連接到其讀碼內(nèi)帶有l(wèi)ac Z編碼區(qū)的載體中，從而得以產(chǎn)生雜合SCPF-lac Z蛋白質(zhì))及PIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109;Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)等。
在酵母中，可選用許多含有色含結(jié)構(gòu)或可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的載體。有關(guān)綜述可參見(jiàn)Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，1988，Ed.Ausubel et al.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，Ch.13;Grant et al.，1987，Expression and Secretion Vectors，for Yeast，Methods in Enzynology，Eds.Wu & Grolssman，31987，Acad，press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544;Glover，1986，DNA Cloning，Vol.Ⅱ，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3;Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Method in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684;The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds.Strathern et al.，Cold Spring Harbor Press，Vols.Ⅰand Ⅱ?？墒褂媒Y(jié)構(gòu)酵母啟動(dòng)子，如ADH或LEU2，或GAL等可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein In，DNA Cloning，Vol.11，A Practical Approach，Ed.DM Glover，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。此外能啟動(dòng)外源DNA序列整合入酵母染色體的載體也可用。
在使用植物表達(dá)載體的情況下，可用任何一種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SCPF編碼序列的表達(dá)。例如，可使用CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子這類病毒啟動(dòng)子(Brisson et al.，1984，Nature 310511-514)，或TMV的衣殼蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6307-311);另外，也可使用RUBISCO的小亞單位這類植物啟動(dòng)子(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.31671-1680;Broglie et al，1984，Science 224838-843)，或大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B這類熱休克啟動(dòng)子(Gurley et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒、植物病毒載體及直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等方法將這些構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。有關(guān)這些技術(shù)的綜述可參見(jiàn)Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section Ⅷ，.421-463;Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
一個(gè)用于表達(dá)SCPF的可代用的表達(dá)系統(tǒng)為昆蟲(chóng)體系，在這樣的系統(tǒng)中，使用Autographa Californica核多角體病毒(AcNPV)作為載體來(lái)表達(dá)外來(lái)基因。病毒生長(zhǎng)于Spodoptera frugiperda細(xì)胞中?？蓪CPF編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)域中(例如多角體基因)，并使之處于AcNPV啟動(dòng)子的控制之下(例如多角體啟動(dòng)子)。成功地插入SCPF編碼序列將導(dǎo)致多角體基因失活并產(chǎn)生非閉合的重組體病毒(即缺少由多角體基因編碼之蛋白質(zhì)衣殼的病毒)。然后用這些重組體病毒感染在其中插入基因的被表達(dá)的Spodoptera frugiperda細(xì)胞(如參見(jiàn)Smith et al.，1983，J.Virol.46584;Smith，US Patent No.4，215，051)。
真核系統(tǒng)且更好是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)允許被表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)得以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)譯后修飾?？墒褂镁哂羞m當(dāng)加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄本、糖基化、磷酸化及利于分泌基因產(chǎn)物之細(xì)胞機(jī)制的真核細(xì)胞作為表達(dá)SCPF的宿主細(xì)胞。其中優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。這樣的宿主細(xì)胞系可包括(但不只限于)CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、-293及WI38。
可對(duì)利用重組體病毒或病毒元件指導(dǎo)表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因工程化處理。例如，當(dāng)使用腺病毒表達(dá)載體時(shí)，可將SCPF編碼序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制復(fù)合體中，如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列中，然后可通過(guò)體外或體內(nèi)重組將嵌合基因插入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域插入(如E1或E3區(qū)域)將產(chǎn)生存活的并能夠在被感染宿主內(nèi)表達(dá)SCPF蛋白質(zhì)的重組病毒(參見(jiàn)Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813655-3659)。另外，也可使用牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子(參見(jiàn)Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419;Mackett et al.，1984，J.Virol.49857-864;Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA794927-4931)。其中特別感興趣的是基于牛乳頭狀瘤病毒的載體(其具有作為染色體外元件復(fù)制的能力)(Sarver.et al.，1981，Mol.Cell.Biol.1486)。在該DNA進(jìn)入小鼠細(xì)胞后不久，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒即可復(fù)制出大約100至200個(gè)拷貝。被插入之cDNA的轉(zhuǎn)錄不需要將質(zhì)粒整合到宿主染色體內(nèi)，從而可產(chǎn)生高水平的表達(dá)。可在質(zhì)粒內(nèi)接入可選擇性標(biāo)志如neo基因，以使這些載體能用來(lái)穩(wěn)定表達(dá)。另外，可對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)行修飾，以將其用作能將SCPF基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)并用于指導(dǎo)表達(dá)的載體(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Aci.USA816349-6353)。也可使用可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，這些啟動(dòng)子包括(但不只限于)金屬硫因IIA啟動(dòng)子和熱休克啟動(dòng)子。
為長(zhǎng)期以高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，最好使用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。
與其使用含有病毒復(fù)制原點(diǎn)的表達(dá)載體，不如適當(dāng)表達(dá)控制元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列，轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷化位點(diǎn)等)及可選擇標(biāo)志控制的SCPF cDNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)志賦予選擇抗性，并使細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到它們的染色體中，同時(shí)生長(zhǎng)成能被依次克隆并擴(kuò)充成細(xì)胞系的焦點(diǎn)。例如，可在引入外來(lái)DNA后，使工程化細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中。可使用多種選擇系統(tǒng)，它們包括(但不只限于)可分別在tk，hgprt或aprt細(xì)胞中使用的單純瘡疹病毒胸苷激素(Wigler，et al.，1977，Cell 11223)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)及腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy，et al.，1980，Cell 22817)基因。另外，可使用抗代謝物抗性作為dhfr選擇的基礎(chǔ)，它賦予對(duì)氨甲蝶呤抗性(Wigler，et al.，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567;O′Hare，et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)、作為對(duì)gpt的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)、作為對(duì)neo的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗氨葡糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.1501)以及作為對(duì)hygro的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗潮霉素抗性(Santerre，et al.，1984，Gene 30147)基因。近年，已有人描述過(guò)其他可選擇性基因，即可使細(xì)胞利用吲哚以取代色氨酸的trpB，使細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸的HisD(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)以及賦予抗鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制物，2-(二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸(DFMO)抗性的ODC基因(McConlogue L.，1987，In;Current Communication in Melecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)。
SCPF的生產(chǎn)本發(fā)明涉及膜結(jié)合和分泌形式的SCPF。SCPF是由人胚細(xì)胞瘤細(xì)胞素751天然分泌的?？蓮倪B續(xù)細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中分離SCPF，并可使用各種蛋白質(zhì)純化方法純化成均一產(chǎn)物。另外，可使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法產(chǎn)生SCPF。
SCPF的純化可從分泌SCPF的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液純化SCPF，即從胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系或基因工程化重組宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中純化SCPF。在一特定實(shí)施方案中(參見(jiàn)下文實(shí)施例)，收集751細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基并用SDS制備性凝膠電泳法純化SCPF。也可使用抗SCPF抗體以免疫親和法純化SCPF。此外，還可使用等電聚焦法純化SCPF。
從細(xì)胞的粗培養(yǎng)基中純化SCPF的方法也可適用于純化已克隆并表達(dá)的產(chǎn)物。此外，當(dāng)以基因工程改造了SCPF編碼序列以使之編碼可裂解的融合蛋白質(zhì)時(shí)，可使用親和純化技術(shù)很容易地純化SCPF。例如，可在SCPF的羧基末端和麥芽糖結(jié)合蛋白之間以基因工程技術(shù)造成一個(gè)蛋白酶因子X(jué)a裂解識(shí)別序列?？墒褂门c直鏈淀粉(其上面結(jié)合了麥芽糖結(jié)合蛋白)結(jié)合的柱很容易地純化所得到的融合蛋白質(zhì)。然后用含麥芽糖的緩沖液從柱上洗脫SCPF融合蛋白質(zhì)，再用因子X(jué)a處理之。使裂解的SCPF通過(guò)第二個(gè)直鏈淀粉柱以除去麥芽糖結(jié)合蛋白(New England Biclals，Beverly，MA)而得以進(jìn)一步純化。使用本發(fā)明的這一技術(shù)，可在SCPF序列和第二個(gè)肽或具有可用于純化的結(jié)合伙伴的蛋白質(zhì)(如任何可制備免疫親和柱的抗原)之間對(duì)任何裂解位點(diǎn)或酶裂解底物進(jìn)行基因工程處理。
分離本發(fā)明SCPF的方法包括適用于分離蛋白質(zhì)物質(zhì)的普通方法，如包括用常見(jiàn)的蛋白質(zhì)沉淀劑處理含SCPF的樣品，然后是離子交換層析、親和層析及超濾等分級(jí)分離技術(shù)(可合用幾種方法)。如可按照美國(guó)專利4，885，236和4，882，268號(hào)中所述的方法從細(xì)胞懸液中純化SCPF。純化本發(fā)明多肽的其他方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如參見(jiàn)Current Protocols in Immunology，Coligan，et al.，eds.1992，列為本文作為參考文獻(xiàn))。
可在適當(dāng)條件下對(duì)含多級(jí)分的SCPF進(jìn)行SDS-PAGE分離，并回收含SCPF活性或相當(dāng)于SCPF分子量的凝膠片。按照Laemmli等人所述方法(Nature，227680，1970)進(jìn)行SDS-PAGE。應(yīng)明確的是在適當(dāng)范圍內(nèi)的條件改變也包括在該純化方法內(nèi)。
分離得自SDS-PAGE的含SCPF部分，并按O′Farrell(J.Biol.Chem.2504007，1975)的方法進(jìn)一步作兩徑向凝膠電泳。第一徑向是按常規(guī)方法使用寬范圍的兩性電解質(zhì)進(jìn)行等電聚焦電泳，以在凝膠上分辨出pI值在大約3.8至8.0的蛋白質(zhì)。依據(jù)所需蛋白質(zhì)的不同pI值以不同量加入PH2-11的兩性電解質(zhì)溶液。如果期望在窄PH范圍內(nèi)廣泛提高分辨率，可按2∶1的比例將窄范圍的兩性電解質(zhì)加到寬范圍兩性電解質(zhì)中。優(yōu)選使用分離pI約為5至9特別是約為7至8之蛋白質(zhì)的兩性電解質(zhì)來(lái)分辨SCPF和其相應(yīng)的異型。第二徑向凝膠一般是以10-20%丙烯酰胺凝膠使用，但亦可使用任何一種常規(guī)的板凝膠。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法如考馬斯蘭和銀染色法檢測(cè)由兩徑向凝膠電泳分辨的蛋白質(zhì)。另外，可將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到印跡轉(zhuǎn)移膜上，并用India墨水或膠質(zhì)金著染，或用Westem吸印法檢測(cè)之。優(yōu)選使用本發(fā)明的抗體以Western吸印法檢測(cè)本發(fā)明的SCPF。
也可對(duì)含多級(jí)分的SCPF進(jìn)行反相HPLC，并用例如乙腈洗脫之。所得到的基本上純的SCPF可用來(lái)進(jìn)行N末端氨基酸序列測(cè)定。在真空下干燥溶液并重新溶解在小體積乙腈(95%)+TFA(0.08%)中。然后將濃縮的樣品引入接有苯硫乙內(nèi)酰脲(PTH)分析儀的序列測(cè)定儀中。
可用生物檢測(cè)法檢驗(yàn)?zāi)z純化之細(xì)胞激活素，如本發(fā)明SCPF可用生物檢測(cè)法檢測(cè)其刺激(和/或抑制)指示物細(xì)胞系增殖的生物學(xué)活性。例如，可用ML-1或KG-1a細(xì)胞檢驗(yàn)SCPF活性。
化學(xué)合成方法也可基于其氨基酸序列，以固相化學(xué)合成技術(shù)全部或部分地產(chǎn)生SCPF分子(見(jiàn)Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.NY，pp.50-60;Stewart and Young，1984，Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chemical Co.)。這一方法也特別適用于產(chǎn)生與其一個(gè)或多個(gè)生物學(xué)活性區(qū)域相對(duì)應(yīng)的SCPF片段。
抗SCPF抗體的生產(chǎn)生產(chǎn)可識(shí)別SCPF或相關(guān)蛋白質(zhì)之多克隆及單克隆抗體也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)抗SCPF抗原決定基的多克隆抗體。為生產(chǎn)抗體，可注射SCPF蛋白或SCPF肽免疫包括(但不只限于)兔、侖鼠、小鼠、大鼠等多種宿主動(dòng)物。可根據(jù)不同種的宿主動(dòng)物，使用各種佐劑如包括(但不只限于)弗氏(完全或不完全佐劑)佐劑、氫氧化鉛等礦物質(zhì)凝膠、溶血卵磷脂等表示活性物質(zhì)、普盧蘭尼聚醇、多聚陰離子、肽、油乳劑、戚孔鑰血蘭蛋白、二硝基苯酚，以及BCG(bacille Calmette-Guerin)和Corynebacterium barvum這類適用于人的佐劑來(lái)提高免疫學(xué)反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，用純化的SCPF免疫以產(chǎn)生SCPF特異性抗體。證明其中一個(gè)這樣的抗血清(SAM.1)含有可與SCPF產(chǎn)生特異性反應(yīng)，從而抑制其以自分泌方式刺激751細(xì)胞生長(zhǎng)之活性的抗體(參見(jiàn)下文)。
可使用由培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何一種技術(shù)制備抗SCPF抗原決定基的單克隆抗體。所說(shuō)的技術(shù)包括(但不只限于)最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)描述的雜交瘤技術(shù)，以及更新的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472;Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Theragy，Alan R.Liss，Inc.pp77-96)?？墒褂猛ㄟ^(guò)切接有適當(dāng)抗原特異性之小鼠抗體分子的基因同來(lái)自人抗體分子的基因而發(fā)展的生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(參見(jiàn)Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855;Neuberger et al.，1984，Nature，312604-608;Takeda et al.，1985，Nature 314452-454)。另外，用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(US Patent 4，946，778)也可適用于產(chǎn)生單鏈抗體。
可用已知技術(shù)產(chǎn)生含有分子之結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，這些片段包括(但不只限于)可用胃蛋白酶消化抗體分子所產(chǎn)生的F(ab′)2片段，以及經(jīng)還原F(ab′)2片段的二硫橋鍵所產(chǎn)生的Fab片段。
發(fā)現(xiàn)抗SCPF抗體可用于定量和定性測(cè)定成熟、前體及亞成分形式的膜結(jié)合或分泌的SCPF，并可用于親和純化SCPF蛋白質(zhì)、闡明SCPF生物合成、代謝及功能，以及篩選編碼免疫原抗原決定基之基因序列的SCPF表達(dá)文庫(kù)。也可將抗SCPF抗體用作胚細(xì)胞或其他腫瘤的治療劑。
SCPF的應(yīng)用SCPF的功能活性和靶細(xì)胞特異性可提供廣泛體外或體內(nèi)應(yīng)用?？稍诒景l(fā)明的實(shí)踐和方法中單獨(dú)使用或與其他生物學(xué)活性生長(zhǎng)因子、抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用表現(xiàn)有生長(zhǎng)刺激活性的，包括SCPF或其片段或衍生物的任何化合物。SCPF、SCPF相關(guān)分子及其組合物可特別用于提高包括(但不只限于)造血干細(xì)胞在內(nèi)之胚細(xì)胞/干細(xì)胞的增殖能力。
目前在造血干細(xì)胞中穩(wěn)定地整合外源基因的主要障礙是已知的細(xì)胞激活素不能在沒(méi)有分化的情況下刺激這些細(xì)胞增殖。已顯示SCPF能夠誘導(dǎo)純化的CD34′細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并在長(zhǎng)期培養(yǎng)中增殖(見(jiàn)下文)?？墒褂肧CPF對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因操作，以便用于包括(但不限于)對(duì)鐮狀細(xì)胞性貧血等血液病進(jìn)行基因治療。
由于發(fā)現(xiàn)SCPF是一種由神經(jīng)-外胚層來(lái)源的細(xì)胞素產(chǎn)生的自分泌生長(zhǎng)因子，并且它也可作用于造血譜系的細(xì)胞，故提示SCPF可能是一種對(duì)不同組織來(lái)源的原始胚/干細(xì)胞特異的細(xì)胞激活素。已表明干細(xì)胞群體存在于包括腦、肝及皮膚在內(nèi)的多種器官和組織中，此外，還顯示頭發(fā)脫失與頭發(fā)濾泡細(xì)胞周圍缺乏干細(xì)胞增殖有關(guān)。因此，SCPF可用作治療那些需要干細(xì)胞群體生長(zhǎng)的病理癥狀而不管它們的組織來(lái)源如何，這樣的病理癥狀包括(但不只限于)頭發(fā)脫失。
此外，可在受體結(jié)合試驗(yàn)中使用標(biāo)記的SCPF或SCPF相關(guān)分子，或使用抗SCPF受體本身的抗體檢測(cè)表達(dá)SCPF受體的細(xì)胞?？筛鶕?jù)SCPF受體的存在和密度區(qū)分細(xì)胞，進(jìn)而提供了一種預(yù)測(cè)這些細(xì)胞對(duì)SCPF生物學(xué)活性之反應(yīng)性的方法。
鑒定來(lái)自胚細(xì)胞之細(xì)胞激活素的方法本發(fā)明闡明了鑒定和分離對(duì)各種胚/干細(xì)胞具有生物學(xué)活性之生長(zhǎng)因子或細(xì)胞激活素的新方法?？蓮耐饪撇牧系玫饺魏我环N胚細(xì)胞腫瘤并制備為實(shí)踐本發(fā)明所需的體外培養(yǎng)物?？苫诒磉_(dá)某些標(biāo)志物或?qū)δ承┥L(zhǎng)因子的反應(yīng)性來(lái)選擇細(xì)胞系，并可維持粘附和非粘附細(xì)胞群體?？墒褂每垢鞣N細(xì)胞表面和內(nèi)部細(xì)胞骨架成分(包括白細(xì)胞抗原和中間絲)的抗體，以流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定已建立之細(xì)胞系的組織譜系特征。另外，可使用分子探針檢驗(yàn)c-myc、c-fms、c-ras、c-myb、c-fos、c-sro、c-orb、c-neu、c-ros、c-sis等致癌基因的表達(dá)。
為了鑒定由已建立的細(xì)胞系產(chǎn)生的新的細(xì)胞激活素，可從代謝上標(biāo)記細(xì)胞并用SDS-PAGE法分析所分泌的蛋白質(zhì)。另外，可將培養(yǎng)物上清液加到已知在生物試驗(yàn)中對(duì)特定細(xì)胞激活素發(fā)生反應(yīng)的、用作指示物的各種類型細(xì)胞內(nèi)，以直接分析之。在用SDS-PAGE方法和/或根據(jù)生物學(xué)活性鑒定了主要蛋白質(zhì)后，可用SDS制備性凝膠、離子交換層析及等電聚焦凝膠(參見(jiàn)下文所述)等純化該蛋白質(zhì)?？捎肧DS-PAGE進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)的純度，用蛋白質(zhì)檢定法定量，并用生物檢測(cè)法進(jìn)一步證實(shí)其活性，并將其用作生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的免疫原。
可以生物檢測(cè)進(jìn)一步試驗(yàn)經(jīng)提純的蛋白質(zhì)在刺激和/或抑制各不同組織類型之各種指示物細(xì)胞系增殖的能力。也可使用親和標(biāo)記等方法，用放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)鑒定其細(xì)胞表面受體?？墒褂锰禺愋钥辜?xì)胞激活素抗體鑒定并定量膜形式和分泌形式的細(xì)胞激活素，以研究它們的生物合成途徑，親和純化蛋白質(zhì)以及免疫篩選用于對(duì)編碼序列進(jìn)行分子克隆(例如使用上文所述的方法和技術(shù))的表達(dá)文庫(kù)。
實(shí)施例1產(chǎn)生SCPF之751胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系的傳代下述實(shí)驗(yàn)表明751腫瘤細(xì)胞系代表了一個(gè)在生長(zhǎng)和細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)上表現(xiàn)有非尋常特征的極原始神經(jīng)-外胚層細(xì)胞系。該細(xì)胞系的生長(zhǎng)是目前為止未敘述的一種或多種生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的。
材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)物將751細(xì)胞系維持于添加了10%胎牛血清、∠-谷氨酰胺和抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基中。使用錐蟲(chóng)蘭排除法估測(cè)存活率及細(xì)胞濃度。將細(xì)胞濃度調(diào)到1×103個(gè)細(xì)胞/ml并接種于75cm組織培養(yǎng)瓶中，然后于含5%CO2的空氣環(huán)境下37℃保溫。
動(dòng)物由Harlan Sprague Dawley Inc.，In得到三重免疫缺陷的by/mu/xid雌性小鼠(BNX小鼠)，被圈于無(wú)菌動(dòng)物群體中。給小鼠喂以無(wú)菌Rodent Blox和酸化水a(chǎn)d libtium，并在長(zhǎng)至7-9周齡時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
體外細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)按下述方法研究751細(xì)胞系的體外生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。建立起始生長(zhǎng)曲線研究確定最佳初始細(xì)胞濃度。由此得知起始生長(zhǎng)曲線在每小井5×103、5×104和1×105個(gè)細(xì)胞。于7天內(nèi)每隔12小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有細(xì)胞計(jì)數(shù)/樣品均抽一式三份。這些初步研究結(jié)果顯示，用于所有繼后生長(zhǎng)曲線的最適細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。然后將細(xì)胞鋪敷在12小井平板中，達(dá)到終濃度(2ml體積)為5×104細(xì)胞/小井。所有計(jì)數(shù)均以12小時(shí)間隔進(jìn)行7天，并記錄百分存活率。所有細(xì)胞計(jì)數(shù)/樣品均重復(fù)三份。
體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)該細(xì)胞系移植到BNX小鼠體內(nèi)的能力。為了檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)速率，將按Log10體行系列稀釋的751-NA細(xì)胞系接種(0.1ml)BNA小鼠后肢皮下。每個(gè)稀釋度接種8只小鼠。每周兩次檢查被接種小鼠的腫瘤狀態(tài)。一旦腫瘤顯現(xiàn)后，即使用測(cè)徑器每?jī)商鞕z測(cè)腫瘤大小。通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)垂直的直徑確定腫瘤大小并將兩個(gè)值相乘以估計(jì)腫瘤面積。
流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析用對(duì)白細(xì)胞表示標(biāo)記CD2、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD10、CD14、CD19、CD20、CD33、CD34、Ⅰ類和Ⅱ類HLA特異的單克隆抗體篩選751細(xì)胞。這些抗體可從Becton Dickinson，CA得到。按下述方法(Griebel et al.，1988)進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。離心(1，000rpm，10分鐘)751腫瘤細(xì)胞并以2×107的濃度重新懸浮于含有0.2%明膠、1mM迭氮鈉和2%正常兔血清的0.1M PBS中。將50μl細(xì)胞懸浮液加入含50μl適當(dāng)單克隆抗體的96小井平底微量滴定板中，并于4℃下保溫30分鐘。然后用冰冷的PBS-明膠將細(xì)胞洗3次，并加入用PBS-明膠按1/75稀釋的100μl FITC標(biāo)記的F(ab′)2羊抗小鼠免疫球蛋白(重和輕鏈特異性的)(Cooper Biomedical，Malvern，PA)于4℃下繼續(xù)保溫30分鐘。通過(guò)2毫微尼龍單絲篩預(yù)過(guò)濾以除去所有樣品中的細(xì)胞聚集體，然后立即進(jìn)行FACS分析(Small Parts Inc.，Miami，F(xiàn)L)。也設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照組以檢出非特異性標(biāo)記。在這些對(duì)照組中，骨髓細(xì)胞單獨(dú)與FITC標(biāo)記的F(ab′)2反應(yīng)或與異型適配的對(duì)無(wú)關(guān)抗原特異的單克隆抗體反應(yīng)。使用Becton Dickinson Fac-Scan流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析FITC標(biāo)記的751腫瘤細(xì)胞。收集從20，000個(gè)細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)以分析單克隆抗體反應(yīng)性型式。使用前方位角光散射(FALS)對(duì)90%光散射(LI900)的兩個(gè)參數(shù)分析消除FALS對(duì)熒光的印跡，并作為熒光對(duì)細(xì)胞數(shù)的直方圖給出。這些數(shù)據(jù)也作為對(duì)給定之表型標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)給出。
下列抗各種抗原的抗體均由市場(chǎng)購(gòu)得抗細(xì)胞角蛋白、抗NF200、抗NF160、抗NF68(Sigma，St.Louis，MO)、抗Vimetin(Boeringer Mannheim)、抗GFAP和抗NSE(Dakopatts，Glostrup，Denmark)。FITC連接的第二抗體試劑購(gòu)自Sigma。
結(jié)果1989年，19歲的白人婦女向其當(dāng)?shù)蒯t(yī)生主訴頭痛和眼花。經(jīng)CT掃描診斷她長(zhǎng)有大的超細(xì)胞實(shí)體瘤。對(duì)腫瘤作了部分外科切除并放入腦室內(nèi)膜(VP)支路以代之。手術(shù)后給予總劑量為5000cGY的局部放射治療。因控制了殘留的腫瘤，看上去她健康狀況良好，直到一年后她再次主訴頭痛。還發(fā)現(xiàn)她有沿VP旁路生長(zhǎng)的多發(fā)性皮下腫塊。身體檢查發(fā)現(xiàn)接近其旁路的顱骨右側(cè)有一個(gè)腫塊，沿旁路管道的胸壁上有兩個(gè)腫塊。頭部CT掃描揭示有局部復(fù)發(fā)并在其旁路附近有軟組織腫塊。另外，還發(fā)現(xiàn)她的腹部有代謝沉積物。吸出顱骨上的損傷組織，從該部分得到之細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征與胚細(xì)胞腫瘤一致。1990年2月，為進(jìn)一步確定細(xì)胞組織學(xué)，再次切除一個(gè)胸壁腫塊。對(duì)腫瘤的組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，是與原來(lái)于1989年活體組織檢查得到的小的原始細(xì)胞凸出群體相似的非胚胎細(xì)胞瘤性混合胚細(xì)胞腫瘤。
751細(xì)胞系的來(lái)源在1990年2月進(jìn)行外科手術(shù)時(shí)，將一小部分胸壁腫瘤送到實(shí)驗(yàn)室去進(jìn)行細(xì)胞分離并使之在細(xì)胞培養(yǎng)中體外生長(zhǎng)。將腫瘤分割為大約3mm的幾部分。在37℃下用凡爾生-胰蛋白酶將切碎的腫瘤有限消化10分鐘。酶處理后，沉降除去未被消化的組織，收集上清液，離心，并收獲細(xì)胞沉淀餅。將細(xì)胞沉淀餅重新懸浮并培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
每天檢查初級(jí)培養(yǎng)物，且每周換一次培養(yǎng)基。原始細(xì)胞培養(yǎng)物含有可與塑料皿粘附和不粘附的兩種細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月后，形狀不同細(xì)胞類型的數(shù)目減少到只有兩個(gè)限定的作為共培養(yǎng)物復(fù)制的群體，一個(gè)是作為粘附細(xì)胞，另一個(gè)則作為非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)。約16周時(shí)觀察該胚細(xì)胞系的培養(yǎng)物，可見(jiàn)非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)超過(guò)粘附細(xì)胞群體，成為用有限稀釋法克隆的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞類型并被定名為751-NA。已通過(guò)多細(xì)胞群體傳代，將751-NA的體外培養(yǎng)物以穩(wěn)定的形式維持于上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。為了用751-NA細(xì)胞系制備小鼠腫瘤模型，將細(xì)胞注入beige，nude，x相聯(lián)免疫缺陷(BNX)小鼠的皮下組織，并使之產(chǎn)生組織學(xué)上與原始病人腫瘤相似的胚細(xì)胞腫瘤。無(wú)菌除去BNX小鼠的皮下腫瘤，用凡爾生-胰蛋白酶處理(見(jiàn)上述參考文獻(xiàn))，并于體外培養(yǎng)中重建一新的非粘附細(xì)胞系;并稱之為751-MU。用取自肝和引流淋巴結(jié)的代謝沉積物建立另外兩種細(xì)胞系，分別稱為751-LIV和751-LN。
751細(xì)胞系的特征檢查已建立之751細(xì)胞系的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和表型特征。用生長(zhǎng)曲線分析法檢查細(xì)胞體外生長(zhǎng)并顯示出獨(dú)特生長(zhǎng)曲線，很少或沒(méi)有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但發(fā)現(xiàn)開(kāi)始時(shí)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一個(gè)短的靜止期后存活率急劇降低。在7-8個(gè)小時(shí)的對(duì)數(shù)期內(nèi)計(jì)算倍增時(shí)間，來(lái)圖解顯示生長(zhǎng)速率。
使用BNX小鼠模型估計(jì)細(xì)胞系的體內(nèi)生長(zhǎng)特征。為確定細(xì)胞在注入小鼠體內(nèi)后的生長(zhǎng)速率，將經(jīng)過(guò)一系列對(duì)數(shù)稀釋率的各種751細(xì)胞系接種到動(dòng)物后肢的皮下組織內(nèi)。每星期兩次檢查小鼠并測(cè)量腫瘤的兩個(gè)垂直直徑的大小。發(fā)現(xiàn)在接種后20天時(shí)由小到只含100個(gè)細(xì)胞的接種物而長(zhǎng)成明顯的腫瘤。接種1×102個(gè)細(xì)胞即可在僅僅7天內(nèi)而不是如大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的小鼠腫瘤模型那樣在2-3個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生腫瘤。另外，多數(shù)報(bào)導(dǎo)接種少于5×102個(gè)細(xì)胞并未長(zhǎng)成腫瘤。
根據(jù)使用抗神經(jīng)-外胚層胚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞譜系及膠質(zhì)細(xì)胞譜系之特異性細(xì)胞決定基的多克隆和單克隆抗體，對(duì)細(xì)胞所作的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來(lái)確定該細(xì)胞群體(751-NA，751-LIV，751-LN)的來(lái)源。使用下列抗體進(jìn)行這一研究使用胎盤(pán)堿性磷酸酶(PAP)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)作為檢測(cè)非神經(jīng)元細(xì)胞之胚細(xì)胞的標(biāo)志物;用細(xì)胞角蛋白和Vimentin作為神經(jīng)-外胚層來(lái)源之胚細(xì)胞的標(biāo)志物;用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為膠質(zhì)細(xì)胞譜系的標(biāo)志物;用神經(jīng)特異性烯醇酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NFP)-68，150和200作為神經(jīng)元譜系細(xì)胞的標(biāo)志物。結(jié)果表明，該細(xì)胞群體(751-NA，751-MU，751-LN)代表了能在適當(dāng)條件下形成神經(jīng)元或膠質(zhì)譜系細(xì)胞的原始腦胚細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。體外尚未培養(yǎng)出表現(xiàn)有這種表型的人來(lái)源的其他細(xì)胞系。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以確定751細(xì)胞系是否可表達(dá)任何已知的包括HPCA-1(CD34)在內(nèi)的白細(xì)胞標(biāo)志。對(duì)751胚細(xì)胞瘤所作的表達(dá)CD45，CD19，CD20，CD3，CD4，CD8，CD2，CD5，CD7，CD10，CD14，CD71和CD34的FACS分析結(jié)果表明，初原始細(xì)胞系缺少包括CD34標(biāo)志物在內(nèi)的所有白細(xì)胞標(biāo)志。
751細(xì)胞系的致癌基因表達(dá)已在許多細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中研究了原始致癌基因在細(xì)胞的惡性表型表達(dá)(體外和體內(nèi))中的作用。使用針對(duì)許多不同致癌基因的DNA探針進(jìn)行Northern分析。這些分析顯示，751細(xì)胞含有豐富的致癌基因c-myc的mRNA以及c-fms致癌基因受體。這一點(diǎn)是特別重要的，因?yàn)閏-fms致癌基因可作為巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的受體。雖然已描述了腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞上的M-CSF受體，但其存在于神經(jīng)來(lái)源的原始細(xì)胞上卻未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。然而，其可見(jiàn)于骨髓中的先祖細(xì)胞上并且是參予單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞之譜系特異性分化的生長(zhǎng)因子之一。該受體的表達(dá)即顯示了M-CSF在原始胚細(xì)胞之增殖和分化中的作用。
實(shí)施例2衍生于751細(xì)胞系的干細(xì)胞增殖因子下述實(shí)施例證明SCPF當(dāng)被分泌時(shí)分子量為32KDa，當(dāng)細(xì)胞結(jié)合時(shí)分子量為37KDa。對(duì)純化之蛋白質(zhì)所作雙向凝膠電泳表明存在多種PI在7.0至8.0之間的蛋白質(zhì)異型。
材料和方法放射標(biāo)記與聚丙烯酰胺凝膠電泳751-腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于30ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的含10%胎牛血清和抗生素(青霉素/鏈霉素)的Dulbecco氏基本培養(yǎng)基(DMEM)中，達(dá)到106細(xì)胞/m的細(xì)胞密度。一旦達(dá)到所需細(xì)胞密度后，將細(xì)胞洗滌除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在添加含有蛋氨酸和2%[35S]蛋氨酸(Amersham，IL)之25%DMEM的75%無(wú)蛋氨酸DMEM中再次培養(yǎng)并保溫。每24小時(shí)收集一次上清液，離心除去非粘附細(xì)胞，并于-20℃下保存之。然后將35S標(biāo)記的上清液加至樣品緩沖液(Tris-Hcl，2-巰基乙醇，10%甘油，2%SDS及0.001%溴酚蘭)中并于100℃加熱5分鐘。然后將樣品上樣于SDS-PAGE凝膠上并按前述方法電泳。電泳后，在TCA(10%，W/V)，冰醋酸(10%，V/V)和甲醇(30%，V/V)中固定凝膠。固定后將凝膠放在Fluoro-hance″(Research Products Inc.，Prospect IL)中繼續(xù)浸漬30分鐘。取出凝膠，放在纖維紙(預(yù)浸濕的)上并于真空下加熱(60℃)干燥。干燥后，使凝膠暴露于高速X射線場(chǎng)(Kodak X-omat AR)并于-70℃下儲(chǔ)存24-48小時(shí)，然后進(jìn)行放射自顯影并分析之。
在電泳緩沖液中溶解751細(xì)胞系的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、純化的蛋白質(zhì)及上清液，并使用Laemmeli的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)(1970)在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析。除另外指出者外，均于變性條件下完成電泳。在各實(shí)驗(yàn)中，均對(duì)分子量標(biāo)志物(Bio Rad Laboratories)進(jìn)行平行電泳并用考馬斯蘭染色。
SCPF的GEL純化培養(yǎng)后48小時(shí)從751-NA細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲無(wú)血清上清液。使用Savant濃縮器將該上清液濃縮20倍，然后分析之。將濃縮的樣品加到12%制備性SDS-PAGE上。SDS膠電泳后用0.3M CuCl3對(duì)凝膠進(jìn)行陰性染色。從凝膠中除去有用的蛋白帶，切成小片和放入含200μl洗脫緩沖液(0.25mM Tris-甘氨酸，PH8.3)的透析袋(12-14，000截留分子量)內(nèi)。然后于4℃下以100V將樣品電洗脫18小時(shí)。電洗脫后加反向電流30-40秒鐘，移出透析袋，收獲樣品并透析過(guò)夜。用SDS-PAGE法檢查所有沖洗制劑的純度，然后即可用作免疫原或用于細(xì)胞增殖試驗(yàn)中。
抗SCPF抗體的制備免疫前給New Zealand白兔抽血，并用該免疫前血液確定基線。用含有Ribi佐劑的7μg純化之SCPF多肽經(jīng)皮下給兔免疫。初次注射后兩周，再次給兔注射含有Ribi佐劑的多肽。該兔最少接受5次免疫原加Ribi佐劑皮下接種。每次接種時(shí)均給兔抽血，并用Western印跡法檢驗(yàn)血清中是否存在可與32KDa蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。將所有含高濃度對(duì)32KDa蛋白質(zhì)特異性的抗體的血清分為若干等份并于-70℃下儲(chǔ)存。
Western免疫吸印在電泳緩沖液中制備751-NA腫瘤細(xì)胞系的溶胞產(chǎn)物并使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Laemmeli，1970)解析蛋白質(zhì)。按照Towbin等人(1979)所述的技術(shù)，使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印跡裝置將存在于凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在電印跡緩沖液(25mM)Tris，(192mM)甘氨酸和(5%V/V)甲醇中PH8.3條件下平衡凝膠。并也在該緩沖液中平衡硝酸纖維素膜。平衡后，將硝酸纖維素膜放在鉑陽(yáng)極上面的濾紙上，然后在頂上鋪敷凝膠接著預(yù)浸漬濾紙。安好陰極后，于25V將樣品吸印/電泳35-40分鐘。轉(zhuǎn)移后，在含有明膠和吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-凝膠-吐溫)中將膜/印跡洗4次。將印跡與預(yù)先用PBS-吐溫稀釋的兔多克隆抗體一起保溫過(guò)夜。保溫后，在PBS-凝膠-吐溫中洗印跡4次，再與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗血清(Sigma，St.Louis，Mo)保溫1小時(shí)，然后在PBS-吐溫中洗兩次并在PBS中洗兩次。加入底物(0.05%(W/V)4-氯-1-萘酚和30%H2O2)并在暗處室溫下將印跡保溫60分鐘。顯現(xiàn)的深蘭色帶表明陽(yáng)性反應(yīng)。
克隆生成試驗(yàn)751腫瘤細(xì)胞系能夠在含有添加了10%FBS之DMEM的甲基纖維素中形成集落(＞128個(gè)細(xì)胞/集落)。向1.0ml甲基纖維素中加入103個(gè)細(xì)胞，還向其中加入不同稀釋度的體積為100μl的抗32KDa蛋白質(zhì)的多克隆兔抗體。充分混合樣品并鋪敷于20mm Petri平皿中，然后在含5%CO2的大氣環(huán)境下于37℃接種。培養(yǎng)后48小時(shí)，使用倒置光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)集落數(shù)。
對(duì)各種集落刺激因子特異的抗體購(gòu)自Genzyme(Boston，MA)。
長(zhǎng)期培養(yǎng)物(Gordon型培養(yǎng)物)為了在體外培養(yǎng)物中長(zhǎng)期生長(zhǎng)人造血干細(xì)胞，需要由粘附細(xì)胞群體提供可溶性和細(xì)胞接觸依賴性因子。在含有無(wú)防腐劑肝素的培養(yǎng)基中收集人骨髓抽出物并稀釋到長(zhǎng)期培養(yǎng)基中，使之在25℃m2組織培養(yǎng)瓶中的終體積為8ml并含有2×107個(gè)有核細(xì)胞(Gordon et al.，1987，Exp.Hematol，15772)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基由添加了肌醇(40mg/ml)，葉酸(10mg/ml)，氫化可的松(10-6M)、2-巰基乙醇(2×10-4M)和馬血清與FBS之1∶1混合物(血清終濃度為25%)的α-MEM組成。為了有利于附著，將培養(yǎng)物置于37℃下。4天后，收集培養(yǎng)基和非粘附細(xì)胞，通過(guò)Ficoll/Hypaque離心以除去粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，并將低密度部分移回培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，然后，每隔一周用新鮮培養(yǎng)基半量置換生長(zhǎng)培養(yǎng)基和非粘附細(xì)胞，直到形成會(huì)合的粘附單層。
從長(zhǎng)期培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基和非粘附細(xì)胞并加入2ml新鮮培養(yǎng)基。然后以2000拉德照射培養(yǎng)瓶以清除粘附層內(nèi)的造血細(xì)胞。照射后，除去培養(yǎng)基并換成8ml含純化之細(xì)胞群體的新鮮培養(yǎng)基，以確定它們是否可在培養(yǎng)物中再構(gòu)成和引發(fā)骨髓細(xì)胞生成。作為對(duì)照，單用培養(yǎng)基重新配制某些長(zhǎng)期培養(yǎng)物，以證明照射是以除去所有的造血先祖細(xì)胞(陰性對(duì)照)。另外，用正常骨髓細(xì)胞重新構(gòu)成某些長(zhǎng)期培養(yǎng)物(陽(yáng)性對(duì)照)。重新配制后，每周收集半量培養(yǎng)基和非粘附細(xì)胞，計(jì)數(shù)并鋪敷在含有生長(zhǎng)因子的甲基纖維素培養(yǎng)基中。此外，在一定時(shí)間取出一個(gè)培養(yǎng)瓶并經(jīng)胰蛋白酶處理粘附細(xì)胞得到造血細(xì)胞集落分析中使用的單細(xì)胞懸液。
體外先祖細(xì)胞檢測(cè)法下述檢測(cè)法為用于檢測(cè)細(xì)胞CFU活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。
設(shè)計(jì)前集落形式單位(Pre-CFU)檢測(cè)法以檢測(cè)人骨髓中的早期造血先祖細(xì)胞(Smith et al.，1991，Blood，772122)。將分離的細(xì)胞與rIL-1α(100U/ml)和rIL-3(50ng/ml)一起保溫，培養(yǎng)7天后收集并計(jì)數(shù)。在0.36%瓊脂糖中鋪敷1×105個(gè)細(xì)胞及1000U/ml重組體GM-CSF，并于保溫14天后記錄細(xì)胞集落數(shù)(750個(gè)細(xì)胞)。
為了檢測(cè)骨髓單核細(xì)胞/紅髓樣先祖細(xì)胞(CFU-GEMM)和紅髓樣系列的先祖細(xì)胞(BFU-E)，而使用結(jié)合的CFU-GEMM/BFU-E檢測(cè)法(Aeh et al.，1981，Blood 58309)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將1×105個(gè)純化的干細(xì)胞鋪敷在培養(yǎng)基總體積為1.0ml，含有添加了5×10-5M2-巰基乙醇、30%FBS、100U/ml人rIL-3和1.0U/ml Epo及0.9%甲基纖維素之Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基的35mm直徑平皿中。將培養(yǎng)物置于含5%CO2和10%空氣氧的濕潤(rùn)大氣環(huán)境中于37℃下保溫14天。使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞集落(＞50個(gè)細(xì)胞)。
還檢測(cè)了由CFU-GM代表的早期造血先祖細(xì)胞(Iscove et al.，1971，Blood 371)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將1×105個(gè)純化的干細(xì)胞鋪敷在含有總體積為1.0ml，添加了2%FBS、0.6%L-谷氨酰胺、0.9%甲基纖維素和100U/ml人重組rIL-3之α-MEM培養(yǎng)基的35mm直徑平皿中。按上述作CFU-GEMM檢測(cè)中所述的方法保溫培養(yǎng)物并使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。
結(jié)果SCPF的生物化學(xué)特性為了顯現(xiàn)由751細(xì)胞系分泌的蛋白質(zhì)，使用[35S]蛋氨酸進(jìn)行脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)。在無(wú)蛋氨酸培養(yǎng)基中將細(xì)胞標(biāo)記12小時(shí)，然后將其置于含有蛋氨酸的冷生物培養(yǎng)基中。然后對(duì)35S標(biāo)記的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分離。發(fā)現(xiàn)一個(gè)由751腫瘤細(xì)胞分泌的主蛋白帶，顯示計(jì)算的表觀分子量(用回歸分析法)為32KDa。另外發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的最大分泌發(fā)生在培養(yǎng)后的24-36小時(shí)之間(圖2)。
用SDS-PAGE法分辨分泌多肽以分離該蛋白質(zhì)，并根據(jù)相對(duì)于分子量標(biāo)志物的適移率鑒定出32KDa多肽。一旦被鑒定后，即用電吸印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，切斷相當(dāng)于32KDa蛋白質(zhì)的區(qū)域并溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。將此蛋白質(zhì)接種到兔體內(nèi)，為產(chǎn)生的多克隆抗體傳代。
使用Western免疫吸印技術(shù)試驗(yàn)抗751-LN總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的抗體的特異性。在該系統(tǒng)中，使用Bil-Rad半干轉(zhuǎn)移裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后進(jìn)行改良的比色ELISA分析。深蘭色帶的出現(xiàn)指示陽(yáng)性帶反應(yīng)。這些檢測(cè)法顯示出可與表觀分子量(根據(jù)回歸分析結(jié)果計(jì)算的)為37KDa的單一蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的多克隆抗體(圖3)。這一結(jié)果與分泌性蛋白質(zhì)的分子量(32KDa)結(jié)合考慮，揭示(1)存在將分泌性蛋白質(zhì)輸送到細(xì)胞表面的信號(hào)序列;(2)分子上有使蛋白質(zhì)固定于膜上的跨膜成分;以及(3)該蛋白質(zhì)有兩種形式，一種是膜結(jié)合形式的(37KDa)，另一種是細(xì)胞外可溶形式的(32KDa)。兩種分子形式均可作為“生長(zhǎng)因子”，且其中膜結(jié)合形式的蛋白質(zhì)還在正常胚細(xì)胞發(fā)育期間參予細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。
SCPF對(duì)胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系的自泌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用使用抗32KDa蛋白質(zhì)的多克隆抗體，在甲基纖維素中進(jìn)行集落抑制試驗(yàn)。在前述實(shí)驗(yàn)中，751細(xì)胞在甲基纖維素中48小時(shí)內(nèi)形成多于50個(gè)細(xì)胞的集落。如果32KDa蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的自分泌因子，阻斷蛋白質(zhì)與其細(xì)胞受體的結(jié)合應(yīng)能降低細(xì)胞復(fù)制和集落的生長(zhǎng)。使用系列稀釋的兔多克隆抗32KDa抗體，將751-NA，751-MU和751-LN腫瘤細(xì)胞混入含有各不同稀釋度血清的甲基纖維素中，于37℃下保溫48小時(shí)，然后計(jì)數(shù)新形成的集落。就其相互關(guān)系來(lái)說(shuō)，抗體的1/20稀釋液抑制98%的集落形成。這一抑制作用顯示為抗體濃度依賴性的，同時(shí)當(dāng)血清稀釋度為1/120時(shí)出現(xiàn)明顯的抑制作用(＞25%)。1/20稀釋的正常兔血清并不阻斷集落形成(圖4)。此外，用3H胸苷攝入檢測(cè)法試驗(yàn)抗37KDa抗體阻止細(xì)胞增殖的能力(圖5)。該圖顯示抗體事實(shí)上確實(shí)可抑制細(xì)胞增殖，并且這一抑制作用是對(duì)胚/干細(xì)胞特異的，因?yàn)橹挥?51-Mu Met和BO Bm，I細(xì)胞受到了抑制。A251成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系則沒(méi)有受到抑制。
SCPF與人骨髓細(xì)胞群體的相互作用下文所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗SCPF抗體(SAM.1)可與骨髓細(xì)胞的一個(gè)小群體發(fā)生特異性地反應(yīng)，并且該細(xì)胞群體看來(lái)落入CD34+分隔區(qū)內(nèi)。最后，抗SCPF抗體可識(shí)別不同于CD34蛋白質(zhì)的標(biāo)志物，并且可能在描述干細(xì)胞群體中是很重要的。
鑒于751細(xì)胞的原始性質(zhì)，而且它看來(lái)是受自分泌生長(zhǎng)因子(SCPF)調(diào)節(jié)的，所以設(shè)計(jì)下述實(shí)驗(yàn)以確定純化的天然蛋白質(zhì)是否可與骨髓細(xì)胞相互作用。使用(1)骨髓-甲基纖維素克隆生成檢測(cè)法，(2)3H-胸苷摻入法，以及(3)流勸細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析這一相互作用。圖3顯不了用考馬斯蘭染色的SDS-PAGE凝膠，以及使用這些檢測(cè)法中所用之純化天然37KDa蛋白質(zhì)的SAM.1多克隆抗體得到的Western印跡。凝膠上存在一條以37KDa遷移的單一帶(圖3A)。當(dāng)與SAM.1抗體反應(yīng)后該凝膠的硝酸纖維素印跡揭示出在同一位置上的帶(圖3B)。當(dāng)在克隆生成檢測(cè)法中使用不同濃度純化之SCPF時(shí)，沒(méi)有觀察到有限定形態(tài)學(xué)的集落。
表1干細(xì)胞增殖因子的人骨髓克隆生成活性刺激劑 GM G M 胚細(xì)胞 總計(jì)r人GM-CSF 50u/ml 26/31 70/59 11/15 - 107/10510u/ml 14/20 52/41 6/5 - 72/661u/ml 5/3 6/1 1/0 12/4751條件培養(yǎng)基(×10濃度) - - - 9/7751-SCPF(天然)100μg/ml - - - 16/15/19751-SCPF(天然)10μg/ml - - - 11/13/9751-SCPF(天然)1μg/ml - - - 6/8/7對(duì)照-單加培養(yǎng)基 - ︱ - - ︱檢測(cè)法-克隆生成(甲基纖維素)-體外1×104個(gè)非粘附細(xì)胞/小井-14天檢測(cè)法然而，在這些檢測(cè)試驗(yàn)中觀察到在很松散的細(xì)胞簇內(nèi)存在胚細(xì)胞樣細(xì)胞。從克隆生成試驗(yàn)中除去這些胚細(xì)胞樣細(xì)胞-置入有或沒(méi)有基質(zhì)飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)物中并使用SCPF擴(kuò)充之。于培養(yǎng)后96小時(shí)收獲沒(méi)有基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液，使用單克隆抗體HPCA-1(抗CD34)作為陰性對(duì)照的異型對(duì)照組及作為陽(yáng)性對(duì)照的W6/32(抗人Ⅰ類HLA)單克隆抗體進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。圖6顯示這些細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果?？梢?jiàn)所有細(xì)胞均著染了W6/32抗Ⅰ類HLA，而且有很高百分比例的細(xì)胞還與抗CD34反應(yīng)，由此表明并不是所有細(xì)胞都是CE34+。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于1)在擴(kuò)充懸浮培養(yǎng)物前以克隆生成檢測(cè)中去掉了非CD34+細(xì)胞，或者(2)在懸浮培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞發(fā)生分化。但這一事實(shí)表明SCPF蛋白可與CD34+表型的細(xì)胞相互作用。置于有基質(zhì)飼養(yǎng)層之長(zhǎng)期培養(yǎng)物中的細(xì)胞(圖7)在Gordon培養(yǎng)條件下分析其連續(xù)生長(zhǎng)情況。
圖7顯示這些細(xì)胞在SCPF不存在下在長(zhǎng)期Cordon培養(yǎng)物中發(fā)生增殖?？梢?jiàn)基質(zhì)細(xì)胞對(duì)于兩種可溶性因子及細(xì)胞一細(xì)胞相互接觸以保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和存活率是很重要的。僅給基質(zhì)條件培養(yǎng)基的細(xì)胞不增殖或存活。在72小時(shí)從Gordon培養(yǎng)物中除去細(xì)胞，并于重組體GM-CSF存在下試驗(yàn)其復(fù)制效率(表2)。
表2SCPF刺激的骨髓細(xì)胞的復(fù)制效率以人重組體CM-CSF的反應(yīng)克隆類型(形態(tài)學(xué))處理/培養(yǎng)物 濃度(u/ml) 總計(jì)G GM MGordon培養(yǎng)物人r-GM-CSF 100 29 36 11 7650 23 41 9 73
養(yǎng)物進(jìn)行傳代。另一方面，SCPF處理的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活性則迅速降低，以致到第7天時(shí)只有10-15%細(xì)胞存活。然而，該殘留的CD34+細(xì)胞群體現(xiàn)已成為SCPF反應(yīng)性的，并已在培養(yǎng)物中增殖達(dá)12周。對(duì)照培養(yǎng)物(沒(méi)有生長(zhǎng)因子)維持了3周后最終死亡。接受IL-3或IL-6的細(xì)胞是呈現(xiàn)混合形態(tài)的并包含粘附和非粘附細(xì)胞。細(xì)胞離心制劑顯示該培養(yǎng)物中包含許多成熟的粒細(xì)胞及成熟的胚細(xì)胞樣細(xì)胞。這些IL-3和IL-6處理的細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)中維持達(dá)16周。SCPF處理的細(xì)胞大小更為均勻，在外觀上都是單核的和胚細(xì)胞樣的，并且是非粘附的。根據(jù)劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，可知SCPF的最適濃度在50ng/ml至10ng/ml之間。
培養(yǎng)后12周時(shí)，用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)SCPF處理的CD34+細(xì)胞是否有CD34、CD38及DR/Ⅱ類HLA表達(dá)。圖14和15所示數(shù)據(jù)說(shuō)明，根據(jù)大小，SCPF擴(kuò)充的CD34+細(xì)胞由兩個(gè)形態(tài)學(xué)群體組成。圖14(C區(qū)域)顯示有CD34+、CD38-和DR-表型的小細(xì)胞群體。大的群體(圖15，B區(qū)域)是CD34+，CD3810W和DR10W。因此可見(jiàn)，SCPF能在體外培養(yǎng)物中誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞增殖，同時(shí)保持其CD34+表型，即可使CD34+細(xì)胞增殖而不發(fā)生分化。還于培養(yǎng)后8周時(shí)試驗(yàn)SCPF擴(kuò)充之CD34+細(xì)胞和IL-3擴(kuò)充之CD34+細(xì)胞的復(fù)制效率(表3)。
25 14 27 8 465 4 19 2 251 - 11 2 13只加培養(yǎng)基 1 2 1 4看來(lái)，在集落檢測(cè)中誘導(dǎo)，然后在Gordon培養(yǎng)物中擴(kuò)充的細(xì)胞能夠?qū)M-CSF反應(yīng)，并形成粒細(xì)胞(G)、單核細(xì)胞(M)及混合的GM細(xì)胞的集落，從而表明它們能夠經(jīng)受譜系分化而成為骨髓樣細(xì)胞。在3H胸苷摻入試驗(yàn)中檢測(cè)到的骨髓細(xì)胞的增殖還表明，SCPF誘導(dǎo)了骨髓來(lái)源之細(xì)胞增殖(圖8)。
從上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SCPF可與骨髓細(xì)胞的群體相互作用，因?yàn)橐旬a(chǎn)生了抗SCPF的多克隆兔抗體(SAM.1)，并且SCPF是細(xì)胞結(jié)合形成的，故進(jìn)行骨髓細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析以確定與SCPF相互作用之骨髓細(xì)胞的表型性質(zhì)。使用粘附耗竭的人骨髓細(xì)胞，并以人臍帶血作為新的造血干細(xì)胞的來(lái)源，試驗(yàn)SAM.1識(shí)別人骨髓細(xì)胞的能力。圖9顯示SAM.1可與骨髓(2.5%)和臍帶血(1.96%)內(nèi)的很小細(xì)胞群體結(jié)合。在限定這一細(xì)胞群體的嘗試中，使用抗CD34藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗體和SAM.1熒光素異硫氰酸酯(FITC)系統(tǒng)進(jìn)行雙色FACS分析(圖10)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及以前的發(fā)現(xiàn)，可知751細(xì)胞并不表達(dá)CD34，因而SAM.1不是針對(duì)CD34標(biāo)志物本身的，顯然SAM.1能識(shí)別共表達(dá)CD34標(biāo)志物和SCPF的細(xì)胞群體。
顯示CD34+和SCPF+的細(xì)胞群體代表了1.65%總的被檢細(xì)胞群體(圖10)。還用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)了SAM.1識(shí)別小鼠、牛及羊骨髓內(nèi)細(xì)胞群體的能力。所有這些例子中，SAM.1不能識(shí)別任何一個(gè)來(lái)自這些非人的骨髓的有意義的細(xì)胞群體。
使用抗SCPF抗體對(duì)純化的CD34+細(xì)胞進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)研究。使用與抗CD34單克隆抗體偶聯(lián)的免疫磁性小球從正常人骨髓中分離出了CD34+群體并儲(chǔ)存于液氮以備流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)用(Kessler et al.，1987，Blood 70321)?；趩魏碗p色分析，可知SAM.1能識(shí)別CD34選擇的細(xì)胞群體(圖11)。此外，SAM.1和抗CD34之間沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性作用(圖12)。在這些實(shí)驗(yàn)中，CD34+細(xì)胞或單與SAM.1或與SAM.1/抗CD34的混合物一起保溫。從圖12中可以看出，抗CD34并不干擾SAM.1與這些細(xì)胞結(jié)合的能力。重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)，但改為將CD34+細(xì)胞單與抗CD34或與SAM.1/抗CD34的混合物一起保溫。如圖12A所示，SAM.1不干擾抗CD34抗體的結(jié)合。這一結(jié)果再次表明，SAM.1抗體可識(shí)別不同的細(xì)胞表面抗原。
使用SCPF建立CD34+細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物在外加純化之天然SCPF的情況下引發(fā)CD34+細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物。還包括不加任何外源生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)物，以及加有100U/ml白介素3(IL-3)和100U/ml白介素6(IL-6)的培養(yǎng)物。將純化的CD34+細(xì)胞以200，000細(xì)胞/ml的濃度加入24小井平板的各小井內(nèi)，并加入適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子。加入不同濃度(1ng/ml至10ng/ml)的純化的SCPF。每隔3天換培養(yǎng)基并加入外源生長(zhǎng)因子。每天檢查所有培養(yǎng)物以估計(jì)細(xì)胞的存活性和生長(zhǎng)狀態(tài)。
這些研究的結(jié)果總結(jié)于圖13中。接受IL-3或IL-6的培養(yǎng)物迅速擴(kuò)增，且?guī)缀醪淮嬖诓换罴?xì)胞，到第7天，對(duì)所需培表3對(duì)干細(xì)胞增殖因子和人重組體IL-3有反應(yīng)性之CD34+細(xì)胞的復(fù)制效率細(xì)胞φ處理r-IL-3 r-GM-CSF100§ 50 25 5 100 50 25 5CD34+擴(kuò)充的 r-IL-3 12↑ 7 1 0 9 6 3 -(8周)CD34+擴(kuò)充的 SCPF 162 109 92 41 145 114 62 31(8周)CD34+擴(kuò)充的 IL-6 18 11 6 - 15 12 4 -(8周)↑所記錄的集落數(shù)φ103個(gè)細(xì)胞/小井§單位/ml這些數(shù)據(jù)再次提示在IL-3存在下增殖的細(xì)胞復(fù)制效率很差(使用重組體IL-3和GM-CSF)。另一方面，于IL-3和GM-CSF存在下，SCPF處理的CD34+細(xì)胞則有很好的復(fù)制效率，由此再次表明了SCPF擴(kuò)充之細(xì)胞的原始性質(zhì)。因?yàn)镃D34+細(xì)胞于去掉SCPF后4-5天內(nèi)即死亡，可見(jiàn)SCPF并不能于CD34+細(xì)胞施加任何惡性表型。
就該生長(zhǎng)因子與骨髓干細(xì)胞作為初級(jí)信號(hào)相互作用的能力所進(jìn)行的研究表明，SCPF能夠誘導(dǎo)BFU和CFU-GM集落(圖16和17)。SCPF看來(lái)并不能誘導(dǎo)CFU-GEMM。然而，該因子能夠提高集落刺激因子混合物(GM-CSF，IL-3和EPO)的活性，從而顯著增加對(duì)BFU(圖16A和C)、CFU-GM(圖17A和C)及CFU-GEMM(圖18A和C)集落的CSF活性。
SCPF誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期下述實(shí)驗(yàn)分析SCPF和IL-3誘導(dǎo)純化CD34+骨髓細(xì)胞復(fù)制的能力。結(jié)果證明，當(dāng)單獨(dú)給予SCPF和IL-3時(shí)，兩者均可刺激細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。當(dāng)將兩種細(xì)胞激活素結(jié)合加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可對(duì)增加Gα期細(xì)胞的百分比產(chǎn)生加合作用(表4)。
表4用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法和Propidium Iodine法檢測(cè)的SCPF對(duì)CD34+細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的誘導(dǎo)作用
$100μ/ml r Hu-IL-3§100ng/mlSCPF抗體抑制研究下述研究工作旨在檢驗(yàn)人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異性多克隆抗體在甲基纖維素骨髓集落檢測(cè)法中中和SCPF誘導(dǎo)的胚細(xì)胞集落形成上的應(yīng)用(表5)。
表5特異性抗體對(duì)SCPF集落形成活性的抑制作用SCPF/胚細(xì)胞集落數(shù)細(xì)胞 抗體 處理100ng/ml 50ng/ml 25ng/mlBM2+ 24 16 8抗GM-CSFN/A - 23 14 9BM + 21 13 6抗G-CSFN/A - 19 14 4BM + 26 14 5抗M-SCFN/A - 19 16 7BM + 19 11 5抗IL-3N/A - 17 10 5BM + 8 2 0SAM.1N/A - 26 15 8單用IL IL-3(20ng GM(20 GM(20ng-3(20 /ml)+SCF ng/ml) /ml)+SCFng/ml) (25ng/ml) 單用 (25ng/ml)BM + 24φ59 31 92SAM.1M/A - 22 63 33 86a使用1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行克隆生成檢測(cè)b所觀察到的總集落數(shù)數(shù)據(jù)表明這些多克隆抗體均不能中和由SCPF誘導(dǎo)的胚細(xì)胞集落，而SAM.1則能夠中和它們的誘導(dǎo)作用。然而，SAM.1抗體卻不能抑制GM-CSF和IL-3的人干細(xì)胞因子(SCF)增強(qiáng)效應(yīng)。這表明SCPF不同于已知的CSF，因?yàn)镾AM.1抗體并不抑制SCF的功能，SCPF在功能上看來(lái)不同于SCF。
兩向凝膠電泳化學(xué)試劑，丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，尿素，過(guò)硫酸銨、N，N，N，N-四甲基乙二胺和AG501-Xg分析純混合的柱床樹(shù)脂均購(gòu)自BiO-Rad(Rockville Centre，NY)。Pharmalyte pH3-10和Biolyte pH3-10兩性電解質(zhì)和分子量標(biāo)準(zhǔn)品(Mr20，100，胰蛋白酶抑制劑，大豆;24，000，胰蛋白酶原;29，000，碳酸酐酶;36，000，甘油醛-3-磷酸脫氫酶;45，000，白蛋白，卵;66，000，白蛋白，牛;97，400，磷酸化酶B;116，000，β-半乳糖苷酶)均購(gòu)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo)。BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑購(gòu)自Pierce(Rockford，IL)。所有其他化學(xué)試劑均為分析純并分別購(gòu)自Fisher Scientific或Sigma Chemical Co.。
第一徑向。在內(nèi)徑為0.3cm底部封有石臘的11cm玻璃試管中制備等電聚焦凝膠(IEF)(O′Farrell，J.Biol.Chem.，2504009，1975)。分兩步驟制備含有4%丙烯酰胺，9M尿素，2%Nonidet P-40和2%兩性電解質(zhì)的試管凝膠。首先，混合下列成分并于AG501-X8樹(shù)脂存在下(45mg/ml混合物)輕輕攪拌約10分鐘，這些成份為2.5ml丙烯酰胺儲(chǔ)備溶液(38%(W/V)丙烯酰胺和于水中的2%(W/V)N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺)，5.0ml10%(W/V)Nonidet P-40(加在水中)，13.75g尿素和3.75ml水。然后通過(guò)玻璃棉塞過(guò)濾該丙烯酰胺混合物以除去樹(shù)脂。第二步，將4.23ml丙烯酰胺混合物和5%PH3-10兩性電解質(zhì)(50%Pharmalytes和50%Biolytes)，適當(dāng)體積的溶解的蛋白質(zhì)樣品及去離子水(加至總體積4，98ml)相混合以制得用于各蛋白質(zhì)的凝膠。除氣約2分鐘后，加入5.0μl新制備的10%(W/V)過(guò)硫酸銨和3.5μlN，N，N，N-四甲基乙二胺。凝膠迅速成型(0.76ml凝膠混合物/管)，用去離子水復(fù)蓋，并使之聚合3小時(shí)。所有蛋白質(zhì)均以13，000×g離心3分鐘，然后加到凝膠混合物中。
將試管放入下方小室(陽(yáng)極)含0.01M磷酸且上方小室(陰極)含脫過(guò)氣的0.02M氫氧化鈉的Bio-Rad 155型凝膠電泳槽內(nèi)。使用350V恒定電壓于室溫等電聚焦18小時(shí)。等電聚焦完成后，連接充滿空氣的注射器/裝到試管基底端的橡膠管并稍微加壓以自玻璃試管內(nèi)輕輕擠出凝膠。使用表面電極(Bio-Rad)檢測(cè)IEF pH梯度。然后在5.0ml平衡緩沖液(2.3%十二烷基磺酸鈉，5%β-巰基乙醇和10%(V/V)甘油加于0.062M Tris-Hcl中，PH6.8)將凝膠輕輕攪動(dòng)10分鐘，或在乙醇/干冰浴中很快冷凍并儲(chǔ)存于-70℃下備用。
第二徑向。按照Laemmli所述的方法，在加有4%丙烯酰胺堆積膠的10%凝膠(厚1.5mm，長(zhǎng)14.5cm)上以板SDS-PAGE法分離樣品。將包埋在1%瓊脂糖(溶于平衡緩沖液中)中的第一徑向IEF凝膠和分子量標(biāo)準(zhǔn)品使用1%瓊脂糖(溶在0.125M Tris-Hcl中PH6.8)連接到堆積膠上。使用100mA/凝膠的恒定電流于室溫(20-25℃)下進(jìn)行電泳，直到染料跑完凝膠的大約100%長(zhǎng)度。
固定和染色在甲醇/乙酸/水(40/10/50)中固定第二徑向板凝膠內(nèi)的分離的蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用考馬斯蘭染色固定的凝膠，或按下述改良方法進(jìn)行銀染色。染色前，在3次更換的20%乙醇中將固定的凝膠最少洗1小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)方法(Merril，et al.，Methods Ezymol.，104441，1984)進(jìn)行染色。在恒定輕輕攪拌下使凝膠著染30-45分鐘。然后在兩次更換的20%乙醇中將已染色的凝膠洗總共20分鐘后，進(jìn)行顯色。將凝膠放入乙醇/乙酸/水(20/10/70)中終止顯色。使凝膠在Kodak Rapid Fixer(膠片強(qiáng)度)中放置2-5分鐘以除去本底染色。然后用3次更換的水將凝膠洗總共30分鐘，再在Kodak海波清洗劑中洗5分鐘以除去凝膠中的固定劑。在3次更換的20%乙醇中洗最少1小時(shí)，以從凝膠中除去海波清洗劑。最后，于室溫下在兩片Bio Gel Wrap(Bio Design，Inc.，Carmel，NY)之間包裹各凝膠以干燥已染色的凝膠。
染色凝膠的照片按照制造高的說(shuō)明書(shū)用Kodak電泳復(fù)制膠片制取銀染色凝膠的直接印制品。該膠片顯現(xiàn)出見(jiàn)于凝膠中之蛋白質(zhì)的永久記錄，并可借助光源盒顯現(xiàn)出越過(guò)幾個(gè)凝膠的蛋白質(zhì)圖形的光學(xué)匹配。在少數(shù)的情況下，使用Kodak Ektapan4×5英寸膠片對(duì)凝膠照像并印到16×20英寸Orthofilm上。所得到的印制品顯示蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為印在干凈的膠片上的大黑點(diǎn)。這些印制品的大版面易于檢查，并因直接在印制品上得到蛋白質(zhì)圖形差別的精確記錄而引人注目。
SCPF活性的生物檢測(cè)法以增殖檢測(cè)法，由CD34+細(xì)胞系(ML-1)使用[3H]-甲基胸苷([3H]Tdr)摻入來(lái)檢測(cè)從SDS-PAGE凝膠(1-D或2-D)洗脫的蛋白質(zhì)中是否存在SCPF(該方法是由我們實(shí)驗(yàn)室建立的)。另外，也可用其他CD34+細(xì)胞如KG-1a CD34+細(xì)胞(ATCC CCL 246.1)檢測(cè)試驗(yàn)制劑的SCPF活性。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，在每小井100μl體積含有10%FBS和L-谷氨酰胺的Iscovas改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基中將1×108個(gè)ML-1細(xì)胞接種于園底96小井微量滴定板的小井內(nèi)。將2倍系列稀釋的假定的SCPF蛋白質(zhì)制劑加入(100μl/小井)一式三個(gè)小井內(nèi)。然后在含5%CO2(在空氣中)的濕大氣環(huán)境下于37℃將培養(yǎng)物保溫48小時(shí)。保溫后，用1μCi[3H]Tdr/小井將培養(yǎng)物標(biāo)記時(shí)間為培養(yǎng)的最后16-18小時(shí)。用液閃計(jì)數(shù)法定量放射性同位素?fù)饺肓?。?和7分別顯示了使用KG-1a和ML1細(xì)胞進(jìn)行生物分析所得到的[3H]胸苷摻入量。試驗(yàn)自SDS-PAGE，37KDa蛋白質(zhì)分離的2倍稀釋的假定SCPF(見(jiàn)上文)，[3H]胸苷摻入的試驗(yàn)結(jié)果顯示制劑中存在SCPF生物活性(與對(duì)照組比較)。
使用SDS-PAGE上鑒定的37KDa蛋白質(zhì)中分離的制劑進(jìn)行2-D凝膠電泳。用考馬斯蘭染色后，在2-D凝膠上鑒定出多個(gè)SCPF異型。將凝膠切成小塊并移出8個(gè)含蛋白質(zhì)的凝膠片。按前述方法從這8片凝膠中洗脫蛋白質(zhì)。在各凝膠片中洗脫的蛋白質(zhì)上進(jìn)行生物分析。[3H]胸苷的摻入與見(jiàn)于4號(hào)凝膠片中的異型制得的蛋白質(zhì)制劑相關(guān)(表8，CPM中所示的數(shù)據(jù))。在4號(hào)凝膠片中鑒定的SCPF異型用表面電極分析測(cè)得代表PH7.0至8.0之間的蛋白質(zhì)。該級(jí)分中的生物活性證明了如在生物檢測(cè)中對(duì)細(xì)胞激活素進(jìn)行兩倍稀釋所看到的經(jīng)曲稀釋效應(yīng)。
使用SAM.1抗體進(jìn)行Western印跡分析，以進(jìn)一步證實(shí)表8中鑒定的生物活性數(shù)據(jù)。將按上述方法跑兩徑向凝膠(PH梯度凝膠和繼后的分子量凝膠)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素或PVDF濾膜上，并使用作為第一抗體的SAM.1和作為第二抗體的堿性磷酸酶共軛的羊抗兔LgG(輕和重鏈)(BioRad)按標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)進(jìn)行雜交。數(shù)據(jù)表明，抗體與PH范圍為7.0-8.0(此范圍與表現(xiàn)有SCPF生物活性的蛋白質(zhì)相符)的蛋白質(zhì)強(qiáng)烈反應(yīng)。
可使用SAM.1或其他SCPF特異性抗體以標(biāo)準(zhǔn)的免疫親和技術(shù)(Current Protocols in Immunology，Chapter8，Coligen，et al.，eds.，1992)將從2-D凝膠上不連續(xù)斑點(diǎn)得到的SCPF進(jìn)行純化為均質(zhì)形式。從免疫親和基質(zhì)上洗脫SCPF，然后按上述方法進(jìn)行等電聚焦，但最好在一個(gè)較窄的PH范圍(PH6-8)內(nèi)進(jìn)行。然后可根據(jù)上述生物學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)將凝膠中分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行SCPF生物活性篩選。
表6SCPF生物學(xué)檢測(cè)KG-1a細(xì)胞μg/ml SCPF(37KDa制劑)-三份樣品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 120,196 118,351 73,472 41,700 39,748S.D.(+/-) 36,890 13,105 13,060 7,733 1,2810.031 0.016 0.008 0.004 0.002 對(duì)照CPM 39,052 40,874 40,586 40,530 41,852 44,884S.D.(+/-) 5,019 3,308 3,350 3,175 2,392 7,499
表7SCPF生物學(xué)檢測(cè)ML-1細(xì)胞μg/ml SCPF(37KDa制劑)-三份樣品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 115,151 99,383 90,586 89,309 49,462S.D.(+/-) 7,737 7,332 2,702 4,593 1,6590.031 0.016 0.008 0.004 0.002 對(duì)照CPM 54,680 53,180 50,606 54,161 53,432 48,020S.D.(+/-) 5,099 4,107 1,101 1,799 1,076 4,120表8CEL級(jí)部(1-D)-對(duì)ML細(xì)胞系的SCPF生物學(xué)檢測(cè)回收之蛋白質(zhì)的稀釋度-三份樣品的平均值CPM 1:3 1:6 1:12 1:24 1:48 1:96 1:192 對(duì)照組*片1-CPM 4115 1501 6177 4891 5934 4191 4377 0片2-CPM 6853 3568 5837 5216 5306 5976 5493片3-CPM 229 4358 3427 4310 3625 5012 1313片4-CPM 13454 9386 8631 8214 8722 1600 0片5-CPM 0 884 6936 0 0 0 2353片6-CPM 1302 0 3251 1817 948 636 0片7-CPM 0 0 0 0 2606 4480 3587片8-CPM 5209 0 0 1209 0 4650 2162＊ 對(duì)照組平均CPM-45，020±4，120(S.D.)
檢測(cè)與其他生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用以分離自人尸體脊椎體的骨髓中免疫選擇ML-1 CD34+細(xì)胞。接觸細(xì)胞激活素前和后用CD34-PE、CD38-FITC和Cr-PerCP著染免疫選擇的CD34+細(xì)胞，在1.0ml加或不加各種細(xì)胞激活素(單一或合并的)的Dulbecco氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)2×105個(gè)CD34+細(xì)胞(見(jiàn)表9和10)。培養(yǎng)前和培養(yǎng)后6天計(jì)數(shù)細(xì)胞。然后用SCPF抗體，SAM.1著染細(xì)胞并進(jìn)行FACS分析。根據(jù)側(cè)散射和PE熒光記錄光柵中通過(guò)的CD34+細(xì)胞。根據(jù)向前的光散射來(lái)鑒定兩個(gè)不同大小的CD34+細(xì)胞群體(大的和小的)。分析這些細(xì)胞的CD38和Dr表達(dá)。表9和10中分別給出大和小CD34+細(xì)胞群體的數(shù)據(jù)。
這些結(jié)果顯示SCPF和IL-3當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)能夠刺激細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。SCPF和IL-3結(jié)合則具有加成效果，并可能對(duì)于增加大CD34+細(xì)胞及小CD34+細(xì)胞的總數(shù)有協(xié)同作用。
細(xì)胞系的寄存物產(chǎn)生SCPF的751細(xì)胞系已寄存在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD);并給予了下列登記號(hào)細(xì)胞系751-NA-15;登記號(hào)CRL 10092本發(fā)明并不只限已敘述的特定實(shí)施方案限定的范圍，這些實(shí)施方案旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明的個(gè)別方面，而任何功能上等同的細(xì)胞系、DNA構(gòu)建體或因子均包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了本文所揭示并描述的內(nèi)容外，根據(jù)上面所作描述和附圖，對(duì)本發(fā)明所作的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。這些修改將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求之范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.包含有下述特性之多肽的干細(xì)胞增殖因子(a)刺激人骨髓干細(xì)胞的增殖；(b)結(jié)合能抑制(a)之干細(xì)胞增殖作用的SAM.1抗體；以及(c)在結(jié)合和中和IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的抗體存在下刺激人骨髓干細(xì)胞的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子，其中多肽是用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量為32千道爾頓的可溶性多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子，其中多肽含有跨膜區(qū)并且用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得其分子量為37千道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子，其中人骨髓干細(xì)胞表達(dá)CD34。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子，其由胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的干細(xì)胞增殖因子，其中胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系是神經(jīng)-外胚層來(lái)源的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的干細(xì)胞增殖因子，其中胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系是751-NA-15，寄存在ATCC寄存登記號(hào)為CRL 10092。
8.與權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子免疫特異結(jié)合的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其為單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體，該抗體中和干細(xì)胞增殖因子的生物學(xué)活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體，其為單克隆抗體。
12.產(chǎn)生權(quán)利要求1之干細(xì)胞增殖因子的方法，該方法包括(a)以指導(dǎo)基因表達(dá)之調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下，培養(yǎng)含有編碼權(quán)利要求1之干細(xì)胞增殖因子的核苷酸序列的細(xì)胞，從而由該培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)生物學(xué)活性干細(xì)胞增殖因子;以及(b)從培養(yǎng)物中回收生物學(xué)活性干細(xì)胞增殖因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中培養(yǎng)的細(xì)胞是胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系是神經(jīng)-外胚層來(lái)源的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系是在ATCC的保藏登記號(hào)為CRL 10092的751-NA-15細(xì)胞系。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中培養(yǎng)的細(xì)胞是用處于調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下編碼干細(xì)胞增殖因子的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的基因工程宿主細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中重組載體還包含編碼可選擇性標(biāo)志的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中干細(xì)胞增殖因子是從培養(yǎng)基中回收的。
21.刺激人骨髓干細(xì)胞增殖的方法，該方法包括使骨髓細(xì)胞與權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子接觸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中骨髓干細(xì)胞是CD34+。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，是在培養(yǎng)物中實(shí)際操作。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，是在體內(nèi)實(shí)際操作。
25.抑制由權(quán)利要求1的干細(xì)胞增殖因子刺激的腫瘤細(xì)胞增殖的方法，包括將腫瘤細(xì)胞與能結(jié)合和中和干細(xì)胞增殖因子的抗體或抗體片段接觸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，是在培養(yǎng)物中實(shí)際操作。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，是在體內(nèi)實(shí)際操作。
28.生產(chǎn)衍生于胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞激活素的方法，所說(shuō)的細(xì)胞激活素刺激人干細(xì)胞的增殖，該方法包括(a)培養(yǎng)含有編碼細(xì)胞激活素之核苷酸序列的細(xì)胞，所說(shuō)的編碼序列處于指導(dǎo)基因表達(dá)之調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下，以便由培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)生物學(xué)活性細(xì)胞激活素;以及(b)從培養(yǎng)物中回收生物學(xué)活性細(xì)胞激活素。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中培養(yǎng)的細(xì)胞是胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中培養(yǎng)的細(xì)胞是用處于調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下編碼細(xì)胞激活素的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的基因工程化細(xì)胞。
31.包括有下列特性之多肽的干細(xì)胞增殖因子(a)刺激人干細(xì)胞的增殖;以及(b)在結(jié)合并中和權(quán)利要求1之干細(xì)胞增殖因子、IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的活性的抗體存在下，刺激人干細(xì)胞的增殖。
32.分離的編碼權(quán)利要求1之干細(xì)胞增殖因子的多核苷酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA，cDNA或RNA。
34.包含權(quán)利要求32之多核苷酸序列的生物學(xué)功能表達(dá)載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的載體，其中載體是質(zhì)粒。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的載體，其中載體是病毒。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的載體，其中病毒是RNH病毒。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的載體，其中病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒。
39.用權(quán)利要求34的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞，其中宿主是原核細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞，其中宿主是真核細(xì)胞。
42.檢測(cè)被檢對(duì)象體內(nèi)與干細(xì)胞增殖因子相關(guān)之疾病的方法，該方法包括使權(quán)利要求8的抗體與懷疑患有干細(xì)胞增殖因子相關(guān)疾病之被檢對(duì)象的樣品接觸，并檢測(cè)抗體的結(jié)合。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中疾病選自白血病、再生障礙性貧血、神經(jīng)元病變、嚴(yán)重的復(fù)合免疫缺乏癥及脾功能亢進(jìn)這一組疾病。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中檢測(cè)是體內(nèi)檢測(cè)。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中檢測(cè)是體外檢測(cè)。
46.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中抗體是有可檢標(biāo)記的。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)志選自放射性同位素，熒光化合物，生物發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物及酶這一組物質(zhì)。
48.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中骨髓細(xì)胞進(jìn)一步與細(xì)胞激活素接觸。
49.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中細(xì)胞激活素選自IL-3、IL-6和SCF這一組。
50.在ATCC的寄存登記號(hào)為CRL 10091的胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離自人胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系的自分泌生長(zhǎng)因子，具體是涉及干細(xì)胞增殖因子(SCPF)的生產(chǎn)，純化和應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)以可溶性及細(xì)胞結(jié)合兩種形式存在，其可在少數(shù)人骨髓細(xì)胞的表面上檢測(cè)到并可刺激這些細(xì)胞的增殖。因此，SCPF可具有廣泛的應(yīng)用，包括(但不只限于)增加造血干細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，用抗體除去該蛋白質(zhì)可用于控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C07K16/22GK1081715SQ9310521
公開(kāi)日1994年2月9日 申請(qǐng)日期1993年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月6日
發(fā)明者M·J·P·羅曼, C·E·巴格威爾, P·D·羅曼 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)有限公司