專利名稱：具有免疫調(diào)節(jié)活性的新的親油低聚肽的制作方法
本申請是1992年7月21日申請的順序號為07/917464的申請的部分繼續(xù)申請，順序號為07/917464的申請是目前已放棄的1992年4月3日申請的順序號為07/862694的申請的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)低聚肽，其可調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)對侵入的外來物質(zhì)和微生物或惡性細(xì)胞的反應(yīng)。
更確切地說，本發(fā)明是關(guān)于胞壁?；牡挠H油脫胞壁?；碗念愃莆锖途哂杏H油烷基鏈的類似的低聚肽。
脊椎動物的免疫系統(tǒng)是用來保護(hù)機體免受寄生蟲的侵襲。這些病原體包括非細(xì)胞病毒和細(xì)胞寄生蟲，例如細(xì)菌、菌質(zhì)、真菌、單細(xì)胞原生動物和多細(xì)胞原生動物。其免疫系統(tǒng)也使有機體防御癌細(xì)胞。
免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和細(xì)協(xié)調(diào)是醫(yī)學(xué)治療的目的，在醫(yī)療狀態(tài)的治療或預(yù)防中也經(jīng)常被稱作免疫系統(tǒng)的刺激或抑制。免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是用化學(xué)藥品來實現(xiàn)，例如用由天然原料如糖蛋白合成的有機物、生物制劑或大分子化合物。
因此，免疫調(diào)節(jié)劑對防治傳染性疾病提供了一種有效方法。這些化學(xué)藥品以非特異性方式調(diào)節(jié)(刺激或抑制)免疫系統(tǒng)。免疫性的刺激在宿主防御癌的方面也是重要的，后一種情況是例如根據(jù)對免疫調(diào)節(jié)劑反應(yīng)的腫瘤巨噬細(xì)胞的活化來進(jìn)行的。免疫調(diào)節(jié)劑也可用來治療免疫系統(tǒng)紊亂如關(guān)節(jié)炎引起的疾病，它們也可以用于治療具有損傷的免疫系統(tǒng)的個體以提高它們的免疫反應(yīng)。這類病人包括外科病人、燒傷受害者、經(jīng)受放射治療或化學(xué)治療的病人和具有免疫紊亂如AIDS的病人。
通常，這些免疫損傷病人可能會受到病毒感染如細(xì)胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、帶狀皰疹、單純性皰疹、呼吸合胞體病毒(RSV)和潛在肝炎的損害。免疫調(diào)節(jié)劑可用于刺激免疫系統(tǒng)并有助于阻止病毒的傳染，免疫調(diào)節(jié)劑也可用作預(yù)防這種傳染的預(yù)防劑。
免疫系統(tǒng)的非特異性刺激也發(fā)現(xiàn)可獸醫(yī)應(yīng)用，正如，例如，用粗的分枝桿菌細(xì)胞壁制劑來治療馬的呼吸疾病所證明的那樣。
一些免疫調(diào)節(jié)劑在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。例如，弗羅因德完全輔藥(Freund′sCompleteAdjuvant)(一種殺傷的結(jié)核桿菌的油包水乳狀液)是一種公知的可提高體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑。其性質(zhì)已有許多資料證明，例如，J.Freund，Adv.Tuberc.Res.，7，130，1956。然而，該制劑是有毒的，以致它目前在人體中應(yīng)用是被禁止的，并且它在動物中的應(yīng)用也受到限制。胞壁酰二肽(MDP;N-?；邗；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺)是最小的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其可以置換存在于弗羅因德輔藥中的分枝桿菌細(xì)胞，而仍能保持免疫調(diào)節(jié)活性。MDP是細(xì)菌細(xì)胞壁的肽葡聚糖結(jié)構(gòu)的部分，它是一種獨特的剛性聚合物，該聚合物在細(xì)菌周圍形成了一個網(wǎng)。MDP具有許多免疫活性，例如，它是巨噬細(xì)胞活化劑和B-細(xì)胞促細(xì)胞分裂劑。因此，MDP作為免疫調(diào)節(jié)劑具有顯著的活性，MDP增加了對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌寄生蟲、病毒和腫瘤的免疫保護(hù)機理。MDP也在兔子中產(chǎn)生眼色素層炎(眼內(nèi)的炎癥)。通過皮下應(yīng)用MDP在鼠中也可產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎(一種自體免疫反應(yīng))，胞壁酰二肽也增加體液對許多菌苗的反應(yīng)。然而，MDP象弗羅因德輔藥一樣是有毒的。E.lederer在JournalofMedicinalChemistry，23，819，1980中指出MDP的毒性效應(yīng)包括致熱性、暫時白細(xì)胞減少、血小板溶解和對內(nèi)毒素致敏感作用。
多年來，為了制備高活性和低毒性的免疫調(diào)節(jié)劑已經(jīng)合成和評價了許多MDP類似物。以前認(rèn)為MDP分子的糖類部分對顯著的免疫調(diào)節(jié)活性是必要的，然而，如果糖類部分通過加入更多的氨基酸而取代或者被可與受體分子相互作用的另一種分子本體取代，則該糖類部分可以除去。在生物系統(tǒng)中的這種受體將是結(jié)合小分子如MDP或這種小分子的一部分的任何大分子化合物。由于結(jié)合了小分子，大分子將經(jīng)受結(jié)構(gòu)變化，這將導(dǎo)致信號傳遞。
例如，一種已知的化合物十二烷酰四肽取代N-乙?；谒崽穷悾谶@個取代過程中除了12個碳原子鏈外2個附加的氨基酸被加到現(xiàn)有的兩個碳原子上。FK156加上了兩個附加氨基酸和乳酸，“TRIGLYMYC”加上了三個附加氨基酸、甘油和霉菌酸。MDP的金剛烷類似物是用抗病毒劑金剛烷胺取代糖類。
然而，當(dāng)使用這些類似物時，遇到了一些問題。例如它們必須與油一起給藥，以便有效的刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫組分。一些已知的MDP類似物引入了一個長烷基鏈以使其具有親油性。重要的脫胞壁酰肽含有親油部分。這些部分，例如在十二烷酰四肽、FK156和“TRIGLYMYC”中發(fā)現(xiàn)的那些部分是復(fù)雜的并具有不同程度的毒性。
近來，已經(jīng)合成了幾種不太復(fù)雜的MDP類似物。例如，L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺金剛烷基酰胺和D，L-(2-金剛烷基)甘氨酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺是由抗病毒化學(xué)品金剛烷得到的結(jié)構(gòu)簡單的化合物。然而，它們不適合作為免疫調(diào)節(jié)化學(xué)藥品，因為金剛烷和由其得到的藥引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用和充血性心力衰竭。
因此，現(xiàn)在需要具有顯著免疫調(diào)節(jié)活性的化合物，該化合物是容易使用的，并具有比MDP的已知類似物更低的毒性。
本發(fā)明涉及具有免疫調(diào)節(jié)活性的新的MDP的親油脫胞壁酰型肽類似物和帶有親油烷基鏈的類似的低聚肽。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了由共價連接到一個長烷基鏈上的低聚肽組成的小的結(jié)構(gòu)簡單的分子。
我們意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長烷基鏈共價連接到MDP的二肽部分上或本發(fā)明分子的低聚肽部分上時，該長烷基鏈提高了免疫調(diào)節(jié)劑的活性。該連接可用酯或酰胺鍵來完成;酯鍵是指任何硫酯鍵和酯鍵;酰胺鍵是指任何硫代酰胺鍵和酰胺鍵。
本發(fā)明的類似物不用任何抗病毒劑取代N-乙?；谒崽穷悾膊挥迷隗w內(nèi)反應(yīng)中可與受體特異性結(jié)合的任何小分子取代N-乙?；谒崽穷?，因此，這些類似物在化學(xué)上是不復(fù)雜的，并容易合成。取代胞壁酸的結(jié)構(gòu)簡單的分子可用硬脂酸構(gòu)成。硬脂酸、十八烷醇或其它合適的長烷基鏈衍生物對人類都是無毒的，例如，十八烷醇具有的口服LD50大于15g/Kg。
因此，本發(fā)明提供一種通式(Ⅰ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑
其中Z是C＝O或C＝S;
Y是適于將烷基鏈連接到Z部分上的連接基，優(yōu)選-O-，-S-，或-NH-;和n是選自11至19的整數(shù)。
HA(如果存在)是與肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸，例如氫氯酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、或甲磺酸。
P是由酰胺或硫代酰胺鍵獨立地連接的含有2至5個氨基酸的低聚肽部分。P被稱作低聚肽部分，是因為它不包括它的氨基和酸(羧酸或硫代羧酸)末端官能團(tuán)。構(gòu)成P的氨基酸獨立地選自天然形成的L-構(gòu)型或D-構(gòu)型的氨基酸或合成的氨基酸。
天然形成的氨基酸是指以其L或D-構(gòu)型的任何氨基酸，不管其是否用于蛋白質(zhì)的形成。這些氨基酸可以，例如，選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異谷氨酰胺或鳥氨酸。
在不限制本發(fā)明范圍的情況下，合成氨基酸的實例可以包括氰甲基丙氨酸和噻唑烷-4-羧酸。
本發(fā)明還設(shè)法提供通式(Ⅱ)的含有共價連接到低聚肽的羧基末端的長烷基鏈的MDP類似物，優(yōu)選二肽免疫調(diào)節(jié)劑。
其中P是零至4;
每個Z獨立地是C＝O或C＝S;
每個r獨立地是零至2;
Y是適于將烷基鏈連接到Z部分上的連接基，優(yōu)選-O-，-S-或-NH-;
n是選自11至19的整數(shù);和X是NH2，OH或OCH3。
HA(如果存在)是將與肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸，例如氫氯酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸或甲磺酸。
Q是C1-C4支鏈或無支鏈的烷基、苯基、芐基、羥甲基或天然形成的氨基酸的側(cè)鏈。
式(Ⅱ)的一具體的實例是通式(Ⅲ)的二肽免疫調(diào)節(jié)劑
其中HA、Q、P、Z、r、Y、n和X如上述定義。式(Ⅱ)的優(yōu)選具體實例是十八烷基L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-523)和十八烷基D-丙氨酰-L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-527)。
在式(Ⅱ)的另一個具體實例中，MDP的親油脫胞壁酰二肽類似物可由通式(Ⅳ)表示
其中HA、n、X和Y如上所定義。式(Ⅳ)中的兩個氨基酸殘基是手性的。如在MDP中所看到的那樣，優(yōu)選的是采用L-構(gòu)型的丙氨酸殘基和采用D-構(gòu)型的第二殘基(例如，異谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸等)。這不排除該手性的轉(zhuǎn)變，例如，丙氨酸殘基采用D-構(gòu)型，第二氨基酸采用L-構(gòu)型。然而，這兩個氨基酸在α碳上不應(yīng)具有相同的手性。本專業(yè)熟練技術(shù)人員應(yīng)知道，其中兩個丙氨酸和異谷氨酰胺氨基酸都具有D-構(gòu)型的MDP類似物不是免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明優(yōu)選的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑是十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酸D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-纈氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-絲氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鳥氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸及其任何藥物上可接受的酸加成鹽。
通常，本發(fā)明的類似物的合成是兩步進(jìn)行的。第一步是得到所需的低聚肽。肽?？蓮纳虡I(yè)供應(yīng)者得到，另外，所需的低聚肽可用任何常規(guī)方法合成，例如，如本專業(yè)所公知的，通過在偶合劑如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)存在下使氨基酸反應(yīng)而合成。
第二步是長烷基鏈前體，如十八烷醇或十八烷基胺，與制得的低聚肽反應(yīng)，該方法用于合成實施例1中的BCH-523。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的類似物可通過長烷基鏈前體與單氨基酸或低聚肽偶合，然后與一個或多個其它的氨基酸偶合以生成所需的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑而合成。該方法用于合成實施例2中的BCH-525。
在這兩種情況下，式(Ⅰ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑可制備如下a)式(Ⅴ)的化合物其中Z是C＝O或C＝S;
W是可接受的脫離基，如OH、鹵素、O-琥珀酰亞胺、三唑、咪唑或S(E)，其中E是C1-6烷基;和P′含有由酰胺或硫代酰胺鏈獨立地連接的1至5個氨基酸;該P′不包括氨基和酸末端官能團(tuán)，該氨基酸獨立地選自天然形成的、L-構(gòu)型、D-構(gòu)型或合成的氨基酸;
與下式化合物偶合，
其中n是選自11至19的整數(shù)，Y是將長烷基鏈前體與氨基酸或低聚肽連接的合適的連接基(Y優(yōu)選為-O-、-S-、或-NH-);
生成式(Ⅵ)的親油低聚肽其中P′、Z、Y和n如上定義;和b)如果需要，式(Ⅵ)的親油低聚肽的氨基末端官能團(tuán)(H2N-)與式(Ⅴ)的另一化合物的羧基或硫代羧基末端官能團(tuán)(-Z-W)進(jìn)一步偶合，得到式(Ⅰ)的所需低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑。
優(yōu)選的是，氨基酸或低聚肽與烷基鏈前體之間的偶合是在偶合劑存在下進(jìn)行。烷基鏈連接的一種優(yōu)選方法使用了羰基二咪唑。其它合適的偶合劑包括碳化二亞胺，如二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺。
在本發(fā)明的類似物的制備過程中，可以暫時地保護(hù)反應(yīng)的官能團(tuán)，例如，丙氨酰二肽(Ⅳ)的氨基末端可用氨基甲酸乙酯型基團(tuán)保護(hù)，而羧基末端可用酯基團(tuán)(例如，當(dāng)X是-OH時的芐酯)保護(hù)。適合的保護(hù)-去保護(hù)條件和方法已在合成文獻(xiàn)中敘述，并且對本專業(yè)熟練的化學(xué)工作者來說是公知的。
本發(fā)明的類似物在其合成期間和/或在其制備之后用熟練工人所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法提純。一種優(yōu)選的提純方法是硅膠色譜法，特別是可以使用快速色譜法。然而其它的色譜法，包括HPLC，也可用于產(chǎn)物類似物的提純。由于可以用適合的有機溶劑洗滌的方法，所以也可用結(jié)晶法來提純產(chǎn)物。
本發(fā)明的低聚肽在生理環(huán)境中通常具有有限的溶解性，例如在生理(0.9%)鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。因此，例如，通常觀察到在式Ⅱ中(如在異谷氨酰胺，谷氨酰胺中)當(dāng)X是-NH2時，溶解性是有限的，通常小于0.01mg/ml。如果類似物在含水介質(zhì)中是不溶的，則它們應(yīng)能夠形成具有粒徑在約150μm-1mm(18目-100目)的微粒，從而形成均勻穩(wěn)定的懸浮液。一種優(yōu)選的制劑使用60目微粒或直徑約250μm的顆粒的含水懸浮液。
本發(fā)明也涉及治療或預(yù)防哺乳動物中病毒感染的方法。哺乳動物是指包括人的任何一類高級脊椎動物。在不限制本發(fā)明范圍的情況下，病毒感染可選自細(xì)胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、帶狀皰疹、單純性皰疹、呼吸合胞體病毒(RSV)和肝炎。
上述結(jié)構(gòu)式所述的本發(fā)明的類似物可用類似于配制其它藥物肽組合物所用的那些方法來配制。因此，該類似物可以冷凍干燥的形式貯存，或作為干燥粉末，并在投藥之前在生理上可接受的媒介物中再構(gòu)成以形成懸浮液或溶液。另外，該類似物可貯存在治療媒介物中。優(yōu)選的媒介物是無菌溶液，特別是無菌緩沖溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。媒介物可含有保存劑或可用于改善該混合物的擱置穩(wěn)定性或效力的其它已知添加劑，該保存劑包括，例如乙基汞硫代水楊酸鈉或苯氧基乙醇。
為了用于治療，雖然本發(fā)明的低聚肽可以以原化學(xué)藥品的形式投藥，但最好是以存在活性組分的藥物制劑的形式投藥。
因此，本發(fā)明還提供了一種含有結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)-(Ⅳ)的低聚肽或其藥物可接受的酸加成鹽以及一種或多種藥物上可接受的媒介物和任意的其它治療和/或預(yù)防組分的藥物制劑。媒介物必須在可與制劑的其他組分配伍的意義上是“可接受的”，并對其接受者是無害的。
藥物制劑包括適于口服、直腸投藥、鼻內(nèi)投藥、局部(包括頰和舌下)投藥、陰道或腸胃外(包括肌肉、皮下、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))投藥的那些制劑或者以適于用吸入法或吹入法投藥的形式的那些制劑。該制劑可適當(dāng)?shù)匾苑稚⒌膭┝繂挝恍问椒奖愕靥峁⑶铱梢杂盟帉W(xué)專業(yè)公知的任何方法配制。所有的方法都包括步驟將活性化合物與液體媒介物或細(xì)分散的固體媒介物或這兩種媒介物結(jié)合，然后，如果需要，將產(chǎn)物成形為所需的制劑。
當(dāng)需要時，可以使用適于持續(xù)釋放活性組分的上述制劑。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑可與其他藥物活性治療試劑結(jié)合使用。這樣的結(jié)合可以是協(xié)同的，或者這些結(jié)合的試劑可同時影響許多問題。在沒必要限制本發(fā)明的范圍的情況下，設(shè)想幾個實施例。
一個實例含有本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑和抗癌化合物，例如抗代謝物、插入劑(intercalatingagents)、有絲分裂抑制劑、烷基化劑或其他細(xì)胞毒素抑制劑如二氨二氯絡(luò)鉑。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑也可與抗毒素單克隆或多克隆抗體，或細(xì)胞毒素細(xì)胞如尤其是淋巴細(xì)胞活素活化的殺傷細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞一起使用。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑也可與抗病毒試劑一起投藥。某些抗病毒化學(xué)藥品可與本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑很好的作用，這些抗病毒化學(xué)藥品可選自這樣的試劑如無環(huán)鳥苷、ganciclovir、三氮唑核苷、金剛胺(amantidine)、疊氮胸苷、磷甲酸鹽(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和carbovir?？梢韵胂蟮?，其他適合的抗病毒化學(xué)藥品可與本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合使用。這些抗病毒化學(xué)藥品對本專業(yè)熟練的化學(xué)工作者來說是已知的?？梢韵胂蟮剑@些抗病毒試劑可與本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合用于治療AIDS、肝炎、CMV和其他病毒疾病。
另外，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑也可與抗細(xì)菌抗生素、抗真菌藥、抗原生動物藥或其他抗微生物劑結(jié)合使用。
對哺乳動物優(yōu)選的劑量為0.1-1000mg/Kg體重的本發(fā)明類似物化學(xué)藥品，類似物的更優(yōu)選的量為10-500mg/Kg體重。該劑量將取決于接受化合物的宿主以及宿主的大小、重量和年齡。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑是用4種不同方法測驗。第一種方法例詳細(xì)說明于實施例22和表1中。該方法包括使用鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行空斑形成測定，該鼠用綿羊紅血細(xì)胞攻擊并注射本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑。然后將獲得的脾細(xì)胞在坎寧安(Cunningham)室中與新鮮綿羊紅血細(xì)胞和豚鼠補體一起溫育。當(dāng)它們表現(xiàn)出空斑形成細(xì)胞時，計算血細(xì)胞溶解的面積。表Ⅰ顯示了某些本發(fā)明的低聚肽的選擇實例的免疫調(diào)節(jié)活性的結(jié)果。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的下列低聚肽是免疫刺激劑十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰胺(BCH-523);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525);十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨?；拾彼?BCH-1315);L-丙氨酰D-異谷氨?；送榘?BCH-1316);和十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(BCH-276)。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的下列低聚肽的免疫抑制劑十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524和BCH-526)和十八烷基D-鳥氨酰L-谷氨酸(BCH-1325)。
測驗本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑的第二種方法詳細(xì)敘述于實施例23和24中。將鼠投藥50mg/Kg劑量的本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑，然后鼠死亡，取出脾并分離出脾細(xì)胞，對最終治療后放置24小時的脾細(xì)胞進(jìn)行免疫測定。使這些細(xì)胞進(jìn)行巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞功能試驗，也計算脾細(xì)胞B和T細(xì)胞?？偟母爬ㄈ缦?。
下列免疫調(diào)節(jié)劑引起巨噬細(xì)胞刺激十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰胺(BCH-523);γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524);和十八烷基D-丙氨酰-L谷氨酰胺(BCH-527)。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)和α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)引起適度的巨噬細(xì)胞抑制。自然殺傷(NK)細(xì)胞活性受到十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的刺激。γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)和十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)產(chǎn)生邊緣自然殺傷細(xì)胞的抑制。
γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)抑制B和T細(xì)胞。α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)和十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)增加B細(xì)胞數(shù)量并抑制T細(xì)胞數(shù)量。
第三種方法舉例詳細(xì)說明于實施例25和表5-6中。該方法非常類似于第二種方法。測定自然殺傷細(xì)胞(NK)的活性，并進(jìn)行巨噬細(xì)胞機能測驗，在這種情況下，在投藥之前用流行性感冒A/NWS/33感染一部分鼠，投藥的劑量為0-200mg/Kg的本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-527)引起巨噬細(xì)胞刺激并刺激自然殺傷細(xì)胞活性。
第四種方法舉例詳細(xì)說明于實施例26和表7-8-9中。該方法包括用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑對鼠預(yù)防治療，后來用CMV攻擊。觀察死亡率并計算不同器官的病毒滴度。發(fā)現(xiàn)十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)由于可防止死亡和降低組織病毒滴度而具有預(yù)防活性。
實施例1十八烷基L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-523)的合成
將1.1g，7mmole羰基二咪唑加入到溶于50ml無水四氫呋喃的BOCL-丙氨酰D-異谷氨酰胺(1.9g，6mmole游離酸)中，在氬氣流下攪拌，在室溫下將該溶液攪拌45分鐘，然后繼續(xù)在氬氣流下加入十八烷醇(2.0g，7.2mmole)。在室溫和氬氣下攪拌反應(yīng)物20小時。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去溶劑得到4.9g粗產(chǎn)物。將該固體溶于50ml氯仿中，并用0.5N鹽酸(3×40ml)、5%碳酸氫鈉(2×50ml)和水(50ml)萃取溶液。然后，有機相用無水硫酸鈉干燥，除去溶劑得到2.7g固體。用快速硅膠色譜法從該固體提純BOCL-丙氨酰D-異谷氨酰胺的十八烷基酯，色譜柱分別用1∶1己烷/二氯甲烷、二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇(1%，5%和最終10%V/V的后一種溶劑)洗脫。產(chǎn)物的收率1.2g。用300MHzNMR光譜測定法和TLC鑒定產(chǎn)物。通過將產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中，然后在室溫下吹入氯化氫氣體通過該溶液10分鐘來除去BOC保護(hù)基團(tuán)。將該混濁溶液在4℃下放置2小時，然后過濾，真空干燥該固體化學(xué)藥品。十八烷基D-丙氨酰L-異谷氨酰胺的白色鹽酸鹽的收率為1.0g，這樣由BOC二肽反應(yīng)物得到33%的收率。最終產(chǎn)物用300MHzNMR譜法和TLC(對碘和茚三酮呈陽性)證實。最終產(chǎn)物可用丙酮和/或乙醚洗滌。
實施例2十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-525)的合成
使用實施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通過十八醇(5.8g，22mmole)與BOCD-谷氨酰胺(4.4g，18mmole)酯化制備BOCD-谷胺酰氨的十八烷基酯(3.5g)。如實施例1所述，在室溫下將產(chǎn)物在二氯甲烷中加溶，接著用氯化氫鼓泡通過該溶液10分鐘從而脫除BOC保護(hù)基，得到2.7g十八烷基D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。
向懸浮于75ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的鹽酸鹽(2.2g，5mmole)中加入三乙胺(0.8ml，5.8mmole)，并在室溫下將其攪拌幾分鐘，然后向該反應(yīng)混合物中加入BOCL-丙氨酸(1.0g，5.5mmole)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ;1.6g，6.5mmole)。在室溫下該反應(yīng)物攪拌18小時，然后用冷的0.5N鹽酸(3×75ml)，5%碳酸氫鈉(2×75ml)和水(75ml)萃取。然后用無水硫酸鈉干燥有機相。除去溶劑得到2.3g固體。用快速硅膠色譜法從該固體中提純BOC-L丙氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯。用1∶1己烷/乙酸乙酯，3∶1乙酸乙酯/己烷，乙酸乙酯，和乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一種溶劑)洗脫該色譜柱。得到1.9g產(chǎn)物。該產(chǎn)物用300MHzNMR光譜和TLC鑒定。該產(chǎn)物另外也能用在二氯甲烷/乙醚中結(jié)晶來提純。在室溫下將產(chǎn)物在二氯甲烷中加溶(為除去少量的不溶物質(zhì)過濾是必要的)接著用氯化氫鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基。在4℃下將該混濁溶液存放2小時，過濾，在真空中干燥該固體。得到1.4g白色的十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用300MHzNMR光譜法和TLC確定最終產(chǎn)物。
實施例3十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-527)的合成
用實施例2所述的方法，按同一比例合成十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺的鹽酸鹽(1.6g)。產(chǎn)物的NMR和TLC和實施例2的產(chǎn)物是一樣的。
實施例4α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸鹽酸鹽(BCH-526)的合成
用實施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下通過十八烷醇(4.4g，16.2mmole)與γ-芐基BOCD-谷氨酸(4.6g，13.5mmole)酯化制備γ-芐基BOCD-谷氨酸的十八烷基酯(7.2g)。在室溫下將產(chǎn)物在乙醚中加溶，接著將氯化氫大面積鼓泡通過該溶液3次每次10分鐘，從而除去BOC保護(hù)基。在4℃下存放沒有得到沉淀物，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去大部分溶劑，提濃物用己烷稀釋，再次在4℃下存放2小時，過濾收集沉淀產(chǎn)物。得到5.2gγ-芐基D-谷氨酸的十八烷基酯的鹽酸鹽。
將三乙胺(1.2ml，8.7mmole)加入到溶于75ml氯仿中的γ-芐基D-谷氨酸的十八烷基酯的鹽酸鹽(3.9g，7.5mmole)中，在室溫下攪拌該混合物幾分鐘。然后加入BOCL-谷氨酸(1.6g，8.3mmole)和EEDQ(2.4g，9.8mmole)到該反應(yīng)物中。在室溫下攪拌該反應(yīng)物18小時，完成實施例2所述的步驟，從而得到不用硅膠色譜提純就可使用的粗產(chǎn)物(4.9g)如上所述，將1.5g部分粗產(chǎn)物在二氯甲烷中加溶并用氯化氫氣體大面積鼓泡，從而除去BOC保護(hù)基，得到1.3gL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基γ-芐基酯的粘性固體。將該固體溶于75ml乙醇中并在氫氣氛下，在有300mg10%鈀/碳催化劑存在下，在室溫下將其攪拌隔夜。過濾除去催化劑，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去溶劑，在乙醚中研制殘余物，得到1.0g粗二肽。在乙腈中結(jié)晶得到630mg十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC確定最終產(chǎn)物。
實施例5γ-十八烷基L丙氨酰D-谷氨酸鹽酸鹽(BCH-524)的合成
用實施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通過十八烷醇(1.5g，5.4mmole)與BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的α-芐基酯(1.8g，4.5mmole)酯化，制備α-芐基BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基酯(875mg)。
用實施例4所述的方法，氫解除去芐基酯保護(hù)基，從而得到320mgBOCL-丙氨酰D-谷氨酸的γ-十八烷基酯。如實施例1所述在室溫下將產(chǎn)物溶于二氯甲烷中，接著用氯化氫氣鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基，得到140mgγ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC確定最終產(chǎn)物。
實施例6十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰基γ-甘氨酸鹽酸鹽(BCH-1315)的合成
將羰基二咪唑(583mg，3.6mmole)加入到溶于60ml無水四氫呋喃中的BOCL-丙氨酰D-異谷氨酰胺(955mg，3mmole的游離酸)中，并在氬氣流下攪拌。將該溶液在室溫下攪拌45分鐘，然后在氬氣流下將懸浮于無水四氫呋喃(40ml)和三乙胺(0.5ml)中的十八烷基甘氨酸鹽酸鹽(1.2g，3.3mmole)加入到反應(yīng)物中。
用甲磺酸催化酯化甘氨酸與十八烷醇來制備十八烷基甘氨酸鹽酸鹽。在室溫下在氬氣下將該懸浮液攪拌20小時。如上述實施例1所述，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去溶劑，將粗產(chǎn)物收集在二氯甲烷中并萃取。通過在溫的二氯甲烷中結(jié)晶來提純BOCL-丙氨酰D-異谷氨酰基γ-甘氨酸的十八烷基酯得到690mg灰白色固體產(chǎn)物。如實施例1所述，通過與氯化氫氣體反應(yīng)除去BOC保護(hù)基。然而，在4℃下存放后沒有沉淀物形成，因此，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去二氯甲烷，將乙醚加入到提濃物中。過濾接著用乙醚洗滌固體，得到450mg十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨?；?甘氨酸的鹽酸鹽并用NMR光譜和TLC確定。
實施例7L-丙氨酰D-異谷氨?；送榛符}酸鹽(BCH-1316)的合成
除了用十八烷基胺的游離堿(890mg，3.3mmole)取代十八烷基甘氨酸鹽酸鹽和三乙胺外，用實施例6中所述的方法，并按同一比例合成L-丙氨酰D-異谷氨酰基十八烷基胺的鹽酸鹽。最終產(chǎn)物用NMR光譜和TLC確定。
實施例8十八烷基L-纈氨酰D-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1317)的合成
將三乙胺(0.4ml，2.9mmole)加入到懸浮在50ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的鹽酸鹽(如上面實施例2所述的合成方法)(1.1g，2.5mmole)，將該混合物在室溫下攪拌幾分鐘。然后加入BOCL-纈氨酸(0.6g，2.8mmole)和EEDQ(0.8g，3.3mmole)。在室溫下攪拌反應(yīng)物18小時并且其處理如實施例2所述。該反應(yīng)得到1.6g粗的BOCL-纈氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯，并用快速硅膠色譜法提純。用2∶1己烷/乙酸乙酯，1∶1己烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯洗脫該色譜柱。然而，用在二烷甲烷和乙醚中結(jié)晶的方法也可以提純該產(chǎn)物。產(chǎn)生730mg產(chǎn)物。用NMR光譜和TLC鑒定該產(chǎn)物。在室溫下將產(chǎn)物溶于二氯甲烷中接著鼓泡氯化氫氣體通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基。然而，在4℃下存放該酸溶液沒有得到沉淀物，因此用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去二氯甲烷，在過濾后，用乙醚洗滌殘余物得到510mg十八烷基L纈氨酰D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用300MHzNMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例9十八烷基L-絲氨酰D-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1318)的合成
除了用BOCL-絲氨酸(570mg，2.8mmole水合物)取代BOCL-纈氨酸外，用實施例8所述的方法，用同一比例合成420mg十八烷基L-絲氨酰D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例10十八烷基L-蘇氨酰D-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1319)的合成
除了用BOCL-蘇氨酸(600mg，2.8mmole)取代BOCL-纈氨酸外，用實施例8中所述的方法，用同一比例合成410mg十八烷基L-蘇氨酰D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例11十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1320)的合成
除了用BOCL-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-纈氨酸外，用實施例8所述的方法，用同一比例合成750mg十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例12十八烷基D-纈氨酰L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1321)的合成
除用BOCD-纈氨酸取代其L-對映體并使用谷氨酰胺的L-對映體外，用實施例8所述的方法，按相同比例合成580mg十八烷基D-纈氨酰L-谷氨酰胺。產(chǎn)物的NMR和TLC與實施例8所述的產(chǎn)生的產(chǎn)物相同。
實施例13十八烷基D-絲氨酰L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1322)的合成
除了用BOCD-絲氨酸(560mg，2.8mmole)取代BOCL-纈氨酸并使用谷氨酰胺的L-對映體外，用上述實施例8所述的方法，根據(jù)相同比例合成680mg十八烷基D絲氨酰L-谷氨酰胺的鹽酸鹽，用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例14十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1323)的合成
除用BOCD-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-纈氨酸并用谷氨酰胺的L-對映體外，用上述實施例8所述的方法，根據(jù)同一比例合成800mg十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例15十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1326)的合成方法
除用BOCD-谷氨酸-γ-叔丁基酯(830mg，2.8mmole)取代BOCL-纈氨酸，并用谷氨酰胺的L-對映體外，用上述實施例8所述的方法，按同一比例合成800mg十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC鑒定最終產(chǎn)物。
實施例16十八烷基D-鳥氨酰L-谷氨酸鹽酸鹽(BCH-1325)的合成
在氬氣流并攪拌下向溶于100ml無水四氫呋喃中的BOC-L-谷氨酸-γ-芐基酯(3.0g，12.2mmole)中加入羰基二咪唑(2.0g，12.3mmole)。在室溫下攪拌20分鐘后，加入十八烷醇(4.0g，14.6mmole)，然后將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時。
過濾除去不溶物，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法除去溶劑得到9.1g粗產(chǎn)物。將該固體溶于100ml二氯甲烷中并用5%鹽酸(2×40ml)、5%碳酸氫鈉(2×40ml)和鹽水(40ml)萃取。用硫酸鎂干燥有機相。除去溶劑得到5.8g固體。用快速硅膠色譜提純粗產(chǎn)物。用二氯甲烷洗脫色譜柱得到4.8g產(chǎn)物。
用NMR光譜和TLC鑒定該產(chǎn)物。在室溫下將產(chǎn)物在乙醚中加溶，接著使氯化氫氣體鼓泡通過該溶液25分鐘從而除去BOC保護(hù)基。在室溫下將該反應(yīng)物攪拌1小時，然后用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)法使其體積降低約一半。將該溶液在4℃下存放2小時然后過濾，在真空中干燥該固體。
得到2.3g白色γ-芐基L-谷氨酸的十八烷基酯的鹽酸鹽。用NMR光譜和TLC確定最終產(chǎn)物。將該產(chǎn)物(5.2mmole)加入到50ml氯仿和三乙胺(0.8ml，5.8mmole)中，并在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌20分鐘。將BOC-N-&-CBZ-D-鳥氨酸(2.0g，5.7mmole)加入到反應(yīng)混合物中，接著加入EEDQ(1.4g，5.7mmole)。在室溫下將反應(yīng)物攪拌18小時，用氯仿(25ml)稀釋，并用5%鹽酸(2×30ml)，5%碳酸氫鈉(2×30ml)、鹽水(30ml)萃取，然后在硫酸鎂上干燥。結(jié)晶(3∶1乙醚/二氯甲烷)該產(chǎn)物得到3.4g純產(chǎn)物，用NMR光譜和TLC測其特性。通過在室溫下將產(chǎn)物溶于70ml乙醇中并在氫氣氛及在有750mg10%鈀/碳催化劑存在下攪拌隔夜除去芐酯保護(hù)基。過濾除去催化劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到2.1gBOCD-鳥氨酰L-谷氨酸的十八烷基酯。用NMR光譜和TLC鑒定該產(chǎn)物。通過在室溫下將產(chǎn)物溶于乙醚中，接著將氯化氫氣鼓泡通過該溶液20分鐘以除去BOC保護(hù)基。在室溫下將該反應(yīng)物保存1小時，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其體積降低約1半。在4℃下將該混濁溶液攪拌2小時，過濾，用乙醚(2×30ml)洗滌固體并在真空中干燥。得到1.7g純的十八烷基D-鳥氨酰L-谷氨酸鹽酸鹽，并用NMR光譜，高分辨質(zhì)譜和TLC鑒定該產(chǎn)物。
實施例17十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸鹽酸鹽(BCH-276)的合成
將羰基二咪唑(535mg，3.3mmole)加入到在無水二氯甲烷(40ml)和無水二甲基甲酰胺(10ml)中的BOCL-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(1.2g，3.0mmole)的溶液中。在室溫下在氬氣下將該溶液攪拌45分鐘，然后向該溶液中加入十八烷醇(976mg，3.6mmole)。在氬氣下將該反應(yīng)物攪拌20小時。旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)除去溶劑，用快速硅膠色譜法提純粗產(chǎn)物(2.5g)。用4∶1己烷/乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一溶劑)洗脫該色譜柱。
得到1.3g產(chǎn)物。用NMR光譜和TLC鑒定產(chǎn)物。通過在室溫下將產(chǎn)物在二氯甲烷中加溶，然后將氯化氫氣體鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基。在4℃下將該混濁的溶液存放2小時，過濾，在真空中干燥該固體。
得到950mg的十八烷基酪氨酰甘氨酰甘氨酸鹽酸鹽產(chǎn)物。
實施例18十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基L-丙氨酸鹽酸鹽(BCH-1365)的合成
將三乙胺(0.317ml，2.28mmole)逐滴加入到無水四氫呋喃(60ml)中的BOC-D-丙氨酰L-谷胺酰氨的十八烷基酯(1g，1.75mmole)溶液中。在氬氣流下將混合物攪拌幾分鐘，然后在二十分鐘內(nèi)加入三氟乙酐(0.32ml，2.28mmole)，在室溫下將反應(yīng)物靜置18小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并將粗產(chǎn)物溶解在二氯甲烷(30ml)中。用0.5N鹽酸(2×50ml)，5%碳酸氫鈉(2×50ml)，鹽水(2×50ml)萃取該溶液。然后用無水硫酸鈉干燥有機相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脫液的情況用快速硅膠色譜法提純粗的十八烷基酯。得到0.66g，1.19mmole，產(chǎn)率68%的產(chǎn)物。用300MHzNMR光譜和TLC(Rf＝0.4乙酸乙酯/己烷3∶7)鑒定產(chǎn)物。該產(chǎn)物另外也可用在二氯甲烷/己烷中結(jié)晶提純。通過用在實施例1中所述的方法在室溫下將產(chǎn)物(180mg，0.326mmole)溶于無水乙醚中，接著將氯化氫氣體鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基，得到123mg，0.25mmole，77%產(chǎn)率的十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸的鹽酸鹽。用NMR光譜，高分辨質(zhì)譜和TLC(Rf＝0.48，乙酸乙酯/己烷3∶7)鑒定最終產(chǎn)物。
實施例19十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基L-丙氨酸鹽酸鹽(BCH-1375)的合成
在氬氣流下將Lawesson試劑(235mg;0.58mmole)加入到在無水四氫呋喃(45ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸(320mg，0.58mmole)的溶液中。在回流下將反應(yīng)物加熱4小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并將粗產(chǎn)物溶解在二氯甲烷(45ml)中。用5%碳酸氫鈉(3×50ml)，0.5N鹽酸(2×50ml)和鹽水(2×50ml)萃取反應(yīng)物。然后用無水硫酸鈉干燥有機相。在用3∶7乙酸乙酯/己烷作為洗脫液情況下用快速硅膠色譜法提純粗物質(zhì)。得到200mg，0.352mmole，61%產(chǎn)率的產(chǎn)物。用300MHzNMR光譜和TLC(Rf＝0.52，乙酸乙酯/己烷3∶7)鑒定該產(chǎn)物。
用實施例1所述的方法，在室溫下將產(chǎn)物溶于無水乙醚中，接著將氯化氫氣體鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基，得到63mg，0.125mmole，88%產(chǎn)率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的鹽酸鹽。用NMR光譜，高分辨質(zhì)譜和TLC(Rf＝0.5710%V/V甲醇/乙酸乙酯)確定最終產(chǎn)物。
實施例20十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]L-谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1376)的合成
在完成Lawesson試劑和十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸之間的反應(yīng)過程中析出(60mg，0.1mmole)十八烷基-BOC-D丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺。用NMR光譜和TLC(Rf＝0.28乙酸乙酯/己烷3∶2)確定這個化合物。用實施例1所述的方法，在室溫下通過將該產(chǎn)物溶于無水乙醚中，接著將氯化氫氣體鼓泡通過該溶液10分鐘從而除去BOC保護(hù)基得到33mg，0.063mmole，63%產(chǎn)率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜，高分辨質(zhì)譜和TLC(Rf＝0.5420%V/V甲醇/乙酸乙酯)確定最終產(chǎn)物。另外，也可通過十八烷基-BOC-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的氰基官能團(tuán)的水解，接著脫去BOC保護(hù)基來制備BCH1376。
實施例21十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺鹽酸鹽(BCH-1373)的合成
在氬氣流下將Lawesson試劑(370mg，0.91mmole)加入到溶于無水1，2-二氯乙烷(55ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(500mg，0.87mmole)的溶液中。在回流下加熱反應(yīng)物2小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并將粗產(chǎn)物溶于二氯乙烷(50ml)中。用5%碳酸氫鈉(3×50ml)，0.5N鹽酸(2×50ml)和鹽水(2×50ml)萃取該溶液。然后用無水硫酸鈉干燥有機相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脫劑下通過快速硅膠色譜法提純該粗物質(zhì)。得到378mg，0.64mmole，75%產(chǎn)率的產(chǎn)物。用NMR光譜和TLC(Rf＝0.34乙酸乙酯/己烷2∶3)鑒定該產(chǎn)物。用實施例1所述的方法，在室溫下通過將該產(chǎn)物溶于無水乙醚中，接著將氯化氫氣體鼓泡通過該溶液10分鐘除去BOC保護(hù)基，得到264mg，0.50mmole，79%產(chǎn)率的十八烷基-D-丙氨酰-L-硫代谷氨酰胺的鹽酸鹽。用NMR光譜，高分辨質(zhì)譜和TLC(Rf＝0.2620%V/V甲醇/乙酸乙酯)確定最終產(chǎn)物。
實施例22空斑形成試驗選擇本發(fā)明的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行形成抗體細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性試驗。用下面方法進(jìn)行下面試驗。
用懸浮于鹽水中的0.1%(體積/體積)綿羊血紅細(xì)胞抗原免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行系繁殖的CD1鼠。用0.5ml約2×107細(xì)胞的懸浮液腹膜內(nèi)注射給該鼠。
此后該鼠立刻用本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑懸浮液注射。該免疫調(diào)節(jié)劑的劑量為0.23ml的1mg/ml磷酸鹽緩沖鹽水中的懸浮液。注射劑量為10mg/Kg。第二次注射也是腹膜內(nèi)注射。
在注射后5天將該鼠殺死。取血樣分析免疫蛋白。用抗μ-辣根過氧化酶軛合物的酶免疫測定法進(jìn)行上述測定。取出脾，并放到含2mlHank平衡鹽溶液和10mMHepes緩沖液(HBSS-HEPES)的培養(yǎng)皿中。用鑷子緩慢地將該脾粉碎，用棉透明薄紗過濾該細(xì)胞懸浮液從而除去細(xì)胞碎片。通過加入 HBSS-HEPES使過濾后的懸浮液體積為5ml，計數(shù)細(xì)胞，稀釋該懸浮液至5×106細(xì)胞/ml最終濃度。
將2ml綿羊血紅細(xì)胞溶液移到15ml的離心管中，通過離心分離10分鐘(低速)用HBSS-HEPES洗滌三次。用HBSS-HEPES稀釋最終沉淀物至1至8根據(jù)制造者的說明書(Cedarlane，Hornby，Ontario)在使用前重新構(gòu)成豚鼠補體并用HBSS-HEPES稀釋至1∶20。
通過制備含550μl補體(1/20)，77μl綿羊紅血細(xì)胞(1/8稀釋)溶液和33μl脾細(xì)胞(5×106/ml)溶液形成660μl總體積的混合物來進(jìn)行上述測定。將200μl這種混合物放入由兩塊顯微鏡玻璃片形成的Cunningham 室中。用熔化的蠟和石油膠密封該玻片，在37℃下將該室(兩份試樣)溫育45分鐘。計數(shù)溶血的面積。溶血作用表現(xiàn)出形成抗體的細(xì)胞，也將其稱為空斑形成細(xì)胞(PFC)。結(jié)果用PFC/106脾細(xì)胞表示。其結(jié)果歸納在表1中。
實施例23自然殺傷細(xì)胞活性準(zhǔn)備三周齡的C57BL/6鼠并在處理前24-48小時對其進(jìn)行檢疫。將表2、3和4中所述5種低聚肽與0.4%羧甲基纖維素水溶液摻合。該溶液在使用前一直在4℃下存放。在其后的每一實驗中用Ribavarin(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-羧酰胺)作為對比。
用50mg/Kg/天劑量的一種試驗化合物處理動物，在最終處理后24小時將這些動物殺死，取出其脾，每一個脾懸浮在RPMI-1640介質(zhì)中并用消化腔(stomacher)(Tekmar，Cincinnati，OH)攪勻。用溶血溶解除去血紅細(xì)胞。剩下的脾細(xì)胞用RPMI1640洗滌3次，并再懸浮于含20%牛胎血清的介質(zhì)中，在用于自然殺傷(NK)和巨噬細(xì)胞機能測定及T和B細(xì)胞計算研究之前用Coulter計數(shù)器(Hialeah，F(xiàn)L)計數(shù)。
通過試驗脾細(xì)胞在通常4小時鉻釋放測定對YAC-1腫瘤細(xì)胞的溶解能力來測定鼠細(xì)胞的自然殺傷(NK)活性，作為NK指示物的鉻釋放測定表示為%鉻釋放＝(試驗的每分鐘計數(shù)(cpm)-本底物cpm)/(最大cpm-本底物cpm)結(jié)果見下面的表3。
動物一般對所有試驗的本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑有很好的耐藥力。
從用BCH化合物治療的鼠中取出的脾細(xì)胞的NK細(xì)胞活性歸納于表3中。只有BCH-527對這種活性表現(xiàn)出明顯的刺激;在兩個效應(yīng)物靶細(xì)胞比率上可看到相似的影響。在試驗中BCH-524和525邊緣抑制了NK細(xì)胞活性。從BCH-527得到的刺激可與從兩個其它免疫調(diào)節(jié)劑，即7-硫-8-氧代鳥苷和Aviron(ImuVert)得到的刺激相比。
實施例24巨噬細(xì)胞活性和T/B細(xì)胞測定用實施例22所述的方法得到有意義的鼠細(xì)胞。
利用鼠的胸腺細(xì)胞對植物凝血素(PHA)的響應(yīng)進(jìn)行白細(xì)胞介素-1(IL-1)測定來測出巨噬細(xì)胞機能，所說的響應(yīng)取決于IL-1對其的反應(yīng)性。
將以107細(xì)胞/ml濃度的鼠胸腺細(xì)胞懸浮在含有2%PHA，5%牛胎血清，0.05mM2-巰基乙醇/青霉素-鏈霉素的RPMI1640介質(zhì)中。將總計100μl的這種懸浮液加入到含一系列用于測定IL-1的上清液稀釋液的96井平底微量板的每一井中。在37℃下將這些細(xì)胞溫育72小時。在溫育的最后4小時內(nèi)，這些細(xì)胞用[3H]胸苷(1μci/井)脈動。然后將這些細(xì)胞收獲，并用直接計數(shù)器測定[H3]胸苷摻入量。
本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑對巨噬細(xì)胞機能的影響參見表2。可用在治療的鼠的脾細(xì)胞中的IL-1活性表示。在許多治療組中出現(xiàn)了很大的變化?；衔顱CH-523，524和527都有點刺激作用，而BCH-525和526具有適當(dāng)?shù)囊种谱饔谩?br>
用下面的方法計數(shù)脾細(xì)胞。對于B細(xì)胞計數(shù)，將分散的脾細(xì)胞與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠單克隆抗體抗-Ly5反應(yīng)，對于T細(xì)胞計數(shù)，將分散的脾細(xì)胞與藻紅蛋白標(biāo)記的單克隆抗體抗-Thy1.2反應(yīng)。然后將標(biāo)記的細(xì)胞用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)(EPICS-C，coultercorp.，Hialeah，F(xiàn)L)來計數(shù)。
用這些BCH化合物得到的脾T和B細(xì)胞計數(shù)數(shù)據(jù)表示于表4中。BCH-526和527顯示出增加的%B細(xì)胞而抑制T細(xì)胞。BCH-524顯示出對T和B細(xì)胞的抑制。
實施例25自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性從Simonsen試驗室(GilroyCA)得到14-16g雌性和雄性Balb/c鼠。在使用前24小時對它們進(jìn)行檢疫，并保持在WayneLabBlox和自來水中。通過鼻內(nèi)感染將流感病毒感染給被感染的鼠。從 Michigan 大學(xué)(Ann Arbor.MI)的Dr.K.W.Cochran得到流感A/NWS/33(H1N1)病毒。通過感染Madin Darby 犬腎(MDCK)細(xì)胞的會合單細(xì)胞層，并在37℃下在5%CO2中溫育，當(dāng)該病毒細(xì)胞致病作用是90-100%時的3-5天時收取這些細(xì)胞從而制備病毒庫。將病毒原種裝入安瓿并在-80℃下存放直到使用。感染后給這些鼠喝含0.006%羥四環(huán)素(Pfizer，New York，NY)的水從而控制可能的次級細(xì)菌感染。
將十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)懸浮在無菌0.4%羧甲基纖維素(CMC)溶液中，用于腹膜內(nèi)(i.p.)注射給鼠。將十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)以200，100，和50mg/Kg/天劑量使用，在相應(yīng)于病毒處理(分別注射＃1，＃2，＃3，＃4和＃5)的-1，+1，+3，+5和+7的這些天每天投藥一次。
在每一藥物劑量和正常對照下在第一次處理后的24小時測定5只鼠的脾內(nèi)的自然殺傷細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞機能。用每一劑量治療和用相似的病毒和正常對照數(shù)，在對5只感染過的和5只未感染過的鼠5種治療后那天也可進(jìn)行相似的測定。
按實施例23的描述，測定自然殺傷細(xì)胞活性。所用的脾細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的比是5∶1，25∶1，50∶1和100∶1。利用一種ELISA藥盒(GenzymeCorp.，Cambridge，MA)對鼠的IL-1進(jìn)行白細(xì)胞介素-1(IL-1)檢測從而測出巨噬細(xì)胞機能。在20μg/ml的脂多糖中溫育脾單核細(xì)胞24小時。除去上清液并用ELISA分析。
結(jié)果歸納在表5-6中可以觀察到在感染的和未感染的鼠中的十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的重要的免疫調(diào)節(jié)作用。如表5所示，在以100和50mg/Kg/天劑量用十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)4次注射后，一種很強的NK細(xì)胞活性尤其可在感染過的鼠中看到。
從表6可以看出，十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)也是一種有效的巨噬細(xì)胞活化劑。這尤其表現(xiàn)在4次治療后。并在流感病毒感染過的動物中表現(xiàn)得更強。
實施例26抗病毒活性用鼠細(xì)胞肥大病毒(MCMV)(Smith品種)腹膜內(nèi)感染SwissWebster雌性鼠(SimonsonLabs，Gilroy，CA)，該鼠在試驗開始時重12克/只。將病毒預(yù)先滴定在鼠中并殺死80-90%的動物，盡管從一個試驗到另一個試驗死亡數(shù)有變化，但該病毒僅殺死55%的安慰劑的對照動物。相應(yīng)于病毒治療在-1，+1，+3，+5和+7天每天投藥十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)一次。將BCH-527懸浮在無菌的0.4%羧甲基纖維素溶液中。以50mg/Kg到200mg/Kg的變化劑量腹膜內(nèi)注射給動物。并在同時將0.4%的羧甲基纖維素投藥給安慰劑的對比動物。
在病毒接種后24小時開始每天一次給予ganciclovir共給予5天。用腹膜內(nèi)注射方法注射劑量為25mg/Kg的溶于生理鹽水溶液的無菌溶液。
每天記錄死亡情況共計21天，計算的平均天數(shù)考慮到死亡的鼠。通過從10%組織勻漿得到的病毒的滴定來得到組織病毒滴度。在96＃板中在C1271細(xì)胞中進(jìn)行這些滴定(Smee，D.F.，A，CollettiH.A.Alaghamandan，和L.BAllen.1989。在用鼠細(xì)胞肥大病毒的抗病毒研究中進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞株評價，Arch，Virol，107∶253-260)。用50%終點稀釋方法進(jìn)行病毒滴度計算(Reed，L.J.和M.Muench.1938。一種評估50%終點的簡單方法。Am.J.Hyg.27∶493-498)。這些結(jié)果列在表7和8中。這些結(jié)果表明在三種劑量下的免疫調(diào)節(jié)劑十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)可避免死亡并降低在鼠中的MCMV組織病毒滴度。
毒性對照用上述相同方法相同時間處理由5只未感染鼠所組成的組。每天檢查這些動物的存活情況。在最初處理之前和在最后處理后24小時測出它們的重量從而測出對重量增加的藥劑影響。結(jié)果列于表9中。
統(tǒng)計分析用兩種尾數(shù)分析法(tailed analyses)分析存活率(X2測定法用Yate校正)，死亡的平均天數(shù)(學(xué)生試驗)和病毒滴度(學(xué)生試驗)。
表1選擇的免疫調(diào)節(jié)劑對抗SRBC抗原的抗體產(chǎn)生的影響，用空斑測定法和酶免疫測定法來測定試驗選擇的酶編號A免疫調(diào)節(jié)劑B空斑測定C免疫測定D1鹽水(對比)467±93100%(100%)1BCH-5231186±323171%(254%)2鹽水(對比)358±298100%(100%)2BCH-523877±220138%(245%)3鹽水(對比)410±382100%(100%)3BCH-523826±291261%(201%)4鹽水(對比)363±396100%(100%)4BCH-523682±246160%(188%)5鹽水(對比)423±365100%(100%)5BCH-524245±9080%(58%)5BCH-526325±30082%(77%)6鹽水(對比)565±280100%(100%)6BCH-5251073±234161%(190%)7鹽水(對比)7±5100%(100%)7BCH-527479±322523%(6843%)
試驗選擇的酶編號A免疫調(diào)節(jié)劑B空斑測定C免疫測定D7BCH-523385±33465%(5500%)8鹽水(對比)496±272100%(100%)8BCH-13151012±207202%(204%)8BCH-1316759±252186%(153%)9鹽水504±407100%(100%)9BCH1317750±191189%(149%)9BCH1318613±166121%(122%)9BCH1325150±11060%(30%)10鹽水794±394100%(100%)10BCH1325456±26167%(57%)11鹽水187±139100%(100%)11BCH-276439±305160%(235%)
A試驗表明了在不同鼠中觀察到的BCH523的免疫調(diào)節(jié)劑的作用試驗1和2，近親交配C3H鼠試驗3和4，遠(yuǎn)親交配CD1和CF1鼠BBCH編號指的是選擇的免疫調(diào)節(jié)劑，523;十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰胺524;γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸526;α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸525;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺527;十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺1315;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰氨基甘氨酸1316;L-丙氨酰D-異谷氨酰氨基十八烷基胺C PFC/106脾細(xì)胞。百分?jǐn)?shù)指的是PFC相對于對比例(100%)的增加(降低)。
D百分分?jǐn)?shù)指的是用吸光率測量時1gM抗體相對于對比例(100%)的增加(降低)。
用于評價免疫調(diào)節(jié)劑的每組小鼠的數(shù)量對于對比組是7只，對于治療組是6只。
表5在正常的和流感病毒感染過的BALB/C鼠中腹膜內(nèi)投藥BCH-527的治療對自然殺傷活性的影響
a在給出的效應(yīng)物靶細(xì)胞比值下鉻釋放平均百分?jǐn)?shù)(2標(biāo)準(zhǔn)誤差)n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表6在正常的和流感病毒感染過的BALB/C鼠中BCH-527對巨噬細(xì)胞活性a的影響
a以IL-1濃度表示，n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表7BCH-527和ganciclovir在MCMV-感染的鼠中對死亡的影響
a在感染21天時或之前死亡的鼠＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表8在3和6天后BCH-527和ganciclovir對組織中MCMV滴度的影響
1細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表9BCH-527和ganciclovir對未感染鼠的死亡率和重量增加的影響
b在開始治療時的初始重量和最終治療后24小時的重量之間的差值。
權(quán)利要求
1.一種式(Ⅰ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑其中Z是C=O或C=S；Y是適于將烷基鏈連接到Z部分上的連接基；n是選自11至19的整數(shù)；HA(如果存在)是將與所述低聚肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸；和P是含有2至5個由酰胺或硫代酰胺鍵獨立地連接的氨基酸的低聚肽部分，每個氨基酸獨立地選自天然形成的、L-構(gòu)型、D-構(gòu)型或合成的氨基酸，其中所述的低聚肽部分不包括氨基和酸末端官能團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)劑，其中Y選自-O-、-S-和-NH-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)劑，其中每個氨基酸獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、異谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、纈氨酸、氰甲基丙氨酸、噻唑烷-4-羧酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)劑，其中每個氨基酸獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、異谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、鳥氨酸和纈氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)劑，其中每個氨基酸獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、異谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和酪氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的免疫調(diào)節(jié)劑，其中低聚肽部分P含有2至4個氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的免疫調(diào)節(jié)劑，其中低聚肽部分P含有2個氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述氨基酸由酰胺鍵連接。
9.一種式(Ⅱ)的低聚肽
其中p是選自零至4的整數(shù);每個Z獨立地是C＝O或C＝S;每個r獨立地是選自零至2的整數(shù);Y選自-O-、-S-或-NH-;n是選自11至19的整數(shù);X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是將與所述的低聚肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸;和Q是支鏈或無支鏈的烷基、苯基、芐基、羥甲基或任何天然形成的氨基酸的側(cè)鏈。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，n是17，X是NH2或OH。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的一種結(jié)構(gòu)式(Ⅲ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑
其中p是選自零至4的整數(shù);每個Z獨立地是C＝O或C＝S;r是選自零至2的整數(shù);Y選自-O-、-S-或-NH-;n是選自11至19的整數(shù);X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是將與所述的低聚肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸;和Q是C1-C4支鏈或無支鏈的烷基、苯基、芐基、羥甲基或任何天然形成的氨基酸的側(cè)鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，X是NH2或OH，n是17。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的一種結(jié)構(gòu)式(Ⅳ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑
其中Y選自-O-、-S-或-NH-;n是選自11至19的整數(shù);X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是將與所述的低聚肽形成生理上可接受的鹽的有機或無機酸;和Q是C1-C4支鏈或無支鏈的烷基、苯基、芐基、羥甲基或任何天然形成的氨基酸的側(cè)鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑，其中n是17，X是NH2，Y是-O-。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的免疫調(diào)節(jié)劑，其中r是1。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑選自十八烷基L-丙氨酰D-異谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-纈氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-絲氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鳥氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-α-氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]L-谷氨酰胺、十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺，及其任何藥物上可接受的酸加成鹽。
17.一種藥物組合物含有產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性的有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的化合物和藥物上可接受的媒介物。
18.一種藥物組合物含有產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性的有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求6的化合物和藥物上可接受的媒介物。
19.一種藥物組合物含有產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性的有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求8的化合物和藥物上可接受的媒介物。
20.一種藥物組合物含有產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性的有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求9至16之任一項的化合物和藥物上可接受的媒介物。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物還含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物還含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物還含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物還含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24之任一項的藥物組合物，其中所述的抗病毒化合物選自無環(huán)鳥苷、gancyclovir、三氮唑核苷、金剛胺(amantidine)、疊氮胸苷、磷甲酸鹽(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和Carbovir。
26.一種治療或預(yù)防哺乳動物的病毒感染的方法，包括投藥抗病毒劑量的根據(jù)權(quán)利要求18、19、21、22、23和24之任何一項的藥物組合物的步驟。
27.一種治療或預(yù)防哺乳動物的病毒感染的方法，包括投藥抗病毒劑量的根據(jù)權(quán)利要求25的藥物組合物的步驟。
28.一種治療或預(yù)防哺乳動物的病毒感染的方法，包括投藥抗病毒劑量的根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物的步驟。
29.一種治療或預(yù)防哺乳動物的病毒感染的方法，包括投藥抗病毒劑量的根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的病毒感染選自CMV和流行性感冒感染。
31.根據(jù)權(quán)利要求27至29之任一項的方法，其中所述的病毒感染選自CMV和流行性感冒感染。
32.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
33.根據(jù)權(quán)利要求27至29之任一項的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
34.一種制備式(Ⅰ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑的方法其中Z是C＝O或C＝S;Y是適于將烷基鏈連接到Z部分上的連接基;n是選自11至19的整數(shù);HA(如果存在)是將與所述低聚肽形成可接受的鹽的有機或無機酸;和P是含有2至5個由酰胺或硫代酰胺鍵獨立地連接的氨基酸的低聚肽部分;所述的氨基酸獨立地選自天然形成的、L-構(gòu)型、D-構(gòu)型或合成的氨基酸;其中所述的低聚肽部分隔斷氨基和羧酸末端官能團(tuán);該方法包括步驟a)式(Ⅴ)化合物其中W是可接受的脫離基團(tuán);和P′含有1至5個由酰胺或硫代酰胺鍵獨立地連接的氨基酸，所述的氨基酸獨立地選自天然形成的、L-構(gòu)型、D-構(gòu)型或合成的氨基酸，其中P′隔斷氨基和酸末端官能團(tuán);與下式化合物偶合其中，n是選自11至19的整數(shù);生成式(Ⅵ)的親油低聚肽其中P′、Z、Y或n如上定義;和b)如果需要，通過它們各自的H2N-氨基和Z-W末端官能團(tuán)使式(Ⅵ)與式(Ⅴ)的另一種化合物進(jìn)一步偶合，得到式(Ⅰ)的低聚肽免疫調(diào)節(jié)劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中W獨立地選自O(shè)H、鹵素、O-琥珀酰胺、三唑、咪唑和S(E)，其中E是C1-6烷基。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中W是OH。
37.根據(jù)權(quán)利要求34至36之任一項的方法，其中Y選自-O-、-S-和-NH-。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至36之任一項的方法，其中所述方法在偶合劑存在下進(jìn)行。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述方法在偶合劑存在下進(jìn)行。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基團(tuán)在加入所述的偶合劑之前先化學(xué)保護(hù)。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基團(tuán)在加入所述的偶合劑之前先化學(xué)保護(hù)。
42.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的低聚肽部分P含有2至4個氨基酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中P′的每個氨基酸獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、異谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、纈氨酸、氰甲基丙氨酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
45.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的、小的和結(jié)構(gòu)簡單的免疫調(diào)節(jié)低聚肽。本發(fā)明的低聚肽具有一個長的親油烷基鏈。這些免疫調(diào)節(jié)低聚肽在治療人和動物的疾病中可與抗病毒或抗癌試劑結(jié)合使用。還公開了免疫調(diào)節(jié)化學(xué)藥品的合成方法。
文檔編號C07K5/06GK1083073SQ9310573
公開日1994年3月2日 申請日期1993年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月3日
發(fā)明者C·彭尼, B·澤卡里爾 申請人:生物化學(xué)藥物有限公司