專利名稱：胰島素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于人藥的領(lǐng)域，特別是涉及糖尿病的治療。更具體地說，本發(fā)明涉及人胰島素分子的類似物，使用這些類似物的方法以及含有這些胰島素類似物的藥物組合物。
糖尿病是一種代謝紊亂，其特征為機(jī)體組織不能以正常速率氧化碳水化合物。缺乏胰島素是糖尿病癥狀的最重要因素。在最近的70年期間，患有糖尿病的人們通過接受控制量的胰島素而獲得很大益處。直至80年代初期，治療糖尿病所使用的胰島素是從動(dòng)物胰、通常是牛和豬的胰中分離的。由于引用了重組DNA技術(shù)，生產(chǎn)大量的天然人胰島素以及天然和非天然存在的人胰島素類似物已成為可能。與天然人胰島素相比，這些胰島素類似物顯示出不同的物理和化學(xué)特性。
天然人胰島素在其B鏈的26位上含有酪氨酸殘基。用丙氨酸殘基代替該酪氨酸殘基后產(chǎn)生了一種類似物，Ala(B26)人胰島素，該類似物在溶液中顯示的自締合趨勢(shì)比天然人胰島素更低。該Ala(B26)人胰島素類似物也比正常人胰島素更穩(wěn)定并具有更快的作用速率。還可以用甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸代替B26位殘基。
本發(fā)明涉及通過將天然人胰島素B鏈上的第26位氨基酸由酪氨酸改變?yōu)楸彼?、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸而得到的已修飾的人胰島素的類似物。還可以改變?cè)摲肿拥奶烊蝗艘葝u素A鏈的第21位以及天然人胰島素B鏈的第1和3兩位點(diǎn)。所說胰島素類似物更穩(wěn)定并且更不易于二聚體化或自締結(jié)為更高分子量的形狀，因此相比較而言該類似物具有更快速的作用活性，同時(shí)保留了天然人胰島素的生物活性。
還公開并要求保護(hù)一種通過給需要治療的患者施用有效量的要求保護(hù)的類似物而治療高血糖癥的方法。進(jìn)一步公開并要求保護(hù)含有結(jié)合了一種或多種可藥用賦形劑的有效量的本發(fā)明胰島素類似物的藥物組合物。
為了達(dá)到本發(fā)明目的，如本文所公開及要求保護(hù)的，將下述術(shù)語及縮寫進(jìn)行如下定義。
Ala(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)楸彼釟埢?br> BHI-生物合成的人胰島素。
交聯(lián)-在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。正確交聯(lián)的天然人胰島素或胰島素類似物含有三個(gè)二硫橋鍵。第一個(gè)二硫橋鍵存在于A鏈的第6和11位的半胱氨酸殘基之間。第二個(gè)二硫橋鍵將A鏈的第7位上的半胱氨酸與B鏈第7位上的半胱氨酸相連接。第三個(gè)二硫橋鍵將A鏈的第20位上的半胱氨酸與B鏈的第19位上的半胱氨酸相連接。
Gly(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)楦拾彼釟埢?br> Ile(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)楫惲涟彼釟埢?br> Leu(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)榱涟彼釟埢?br> Pro(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)楦彼釟埢?br> SEQ ID NO1-在序列表中列出的第一個(gè)序列，該序列是具有下列順序的人胰島素A鏈類似物Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln15 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20其中Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly or Ser.
SEQ ID NO2-在序列表中列出的第二個(gè)序列，該序列是具有下列順序的人胰島素B鏈類似物Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr20 25其中在1位上的Xaa是Phe或Asp，在3位上的Xaa是Asn或Asp，而在26位上的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。
Val(B26)HI-一種人胰島素類似物，其中在天然人胰島素B鏈的第26位上的酪氨酸殘基已被改變?yōu)槔i氨酸殘基。
按照37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的規(guī)定，本文中使用的所有氨基酸縮寫都可以為美國(guó)專利和商標(biāo)局承認(rèn)。
本發(fā)明涉及下列通式的胰島素類似物
SEQ ID NO1
被正確地交聯(lián)至SEQ ID NO2
或該類似物的可藥用的鹽，其中在SEQ ID NO1(胰島素A鏈)的第21位上的Xaa是Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser;在SEQ ID NO2(胰島素B鏈)的第1位上的Xaa是Phe或Asp;在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn或Asp，以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。優(yōu)選的是，在SEQ ID NO1的第21上位的Xaa是Gly、Ala、Ser或Asn。在B鏈(SEQ ID NO2)的第26位上的優(yōu)選的氨基酸殘基是Ala和Gly，而在該位點(diǎn)的最優(yōu)選的殘基是Ala。在第21位上特別優(yōu)選的氨基酸是天冬酰胺。通過除去通常存在于胰島素B鏈(SEQ ID NO2)的第1位上的氨基酸殘基可以產(chǎn)生本發(fā)明的一種類似物。SEQ ID NO2的第1位上優(yōu)選的氨基酸是Phe，而在SEQ ID NO2的第3位上最優(yōu)選的殘基是Asn。本發(fā)明的特別優(yōu)選的胰島素類似物是一種在SEQ IDNO1的第21位上的Xaa為Asn，在SEQ ID NO2的第1位上的Xaa為Phe，在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa為Asn以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa為Ala的類似物。用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)生化術(shù)語，所說的特別優(yōu)選的類似物是Ala(B26)人胰島素。
在含在鋅或不含鋅的溶液中，本發(fā)明的胰島素類似物具有降低了的二聚化或其他的自締合為更高分子量形式的趨勢(shì)。由于在溶液中這些類似物通常是單體形式，因此一旦給藥就獲得快速的作用活性。
如上文所介紹的，本發(fā)明包括胰島素類似物的可藥用的鹽。優(yōu)選的這樣的鹽是鋅鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈷鹽或這些鹽的結(jié)合。
本發(fā)明的胰島素類似物可以采用各種已公認(rèn)的肽合成技術(shù)制備，包括經(jīng)典(溶液)方法、固相方法、半合成方法以及最近使用的重組DNA方法。
關(guān)于固相技術(shù)，從一種起始的、不溶的、由樹脂支撐的C-末端氨基酸依次構(gòu)建氨基酸序列。關(guān)于固相方法的技術(shù)由J.Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，F(xiàn)reeman and Co.San Francisco，1969公開。
總的說來，在固相方法中，將對(duì)應(yīng)于所需肽的C-末端的氨基酸殘基的氨基酸固定到一種不溶性樹脂支撐物上，然后從樹脂支撐的C-末端氨基酸開始形成肽鏈。依次逐個(gè)導(dǎo)入各個(gè)氨基酸直至獲得所需的氨基酸序列。另外，可以制備小肽片段并按照所需順序?qū)氲诫逆溨?。得到的肽鏈在整個(gè)合成過程中吸附在樹脂上，并且一旦完成該鏈就從樹脂上切下肽鏈。
借助于在C-末端部分的羧基和作為吸附位點(diǎn)的、存在于樹脂基質(zhì)上的特定的亞甲基基團(tuán)之間形成的酯鍵，將肽鏈吸附到聚苯乙烯樹脂上。
使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于合成肽鍵的技術(shù)將氨基酸偶合。一種方法包括將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N衍生物，這使得羧基基團(tuán)更易于與肽片段的游離N-末端氨基發(fā)生反應(yīng)。例如，通過將被保護(hù)的氨基酸與氯甲酸乙基酯、氯甲酸苯基酯、氯甲酸仲丁基酯或氯甲酸異丁基酯反應(yīng)而將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌系乃狒?。另外，可將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N活性酯如2，4，5-三氯代苯基酯、五氯代苯基酯、對(duì)硝基苯基酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、或由1-羥基苯并三唑形成的酯。
另一種偶合方法包括使用合適的偶合劑，如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)。其他合適的偶合劑對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員來說也是顯而易見的。參見Schroder和Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，Chapter Ⅲ，該文引入本文作為參考。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在偶合反應(yīng)過程中必須將在肽合成中使用的各個(gè)氨基酸的α-氨基保護(hù)起來以便防止涉及活性α-氨基功能的副反應(yīng)。還應(yīng)該認(rèn)識(shí)到某些氨基酸含有活性側(cè)鏈功能基(例如，巰基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羥基)，并且在起始期間以及隨后的偶合步驟中也必須保護(hù)這樣的功能基。合適的保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域熟知的。例如，參見Protective Groups In Organic Chemistry，M.McOmie，Editor，Plenum Press，N.Y.，1973和美國(guó)專利4，617，149，在此引入本文作為參考。
在選擇特定的保護(hù)基時(shí)，必須注意到某些條件。一種α-氨基保護(hù)基(1)必須使得α-氨基功能基在偶合反應(yīng)中使用的條件下是惰性的，(2)在不移走側(cè)鏈保護(hù)基以及不改變肽片段結(jié)構(gòu)的條件下，在偶合反應(yīng)后必須是容易移走的，以及(3)必須消除在偶合之前一旦活化后立即外消旋化的可能性。側(cè)鏈保護(hù)基(1)在偶合反應(yīng)中使用的條件下必須使得側(cè)鏈功能基是惰性的，(2)在移走α-氨基保護(hù)基所使用的條件下必須是穩(wěn)定的，以及(3)在所需氨基酸序列合成結(jié)束后在不改變肽鏈結(jié)構(gòu)的反應(yīng)條件下必須是容易移走的。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯然知道，已知的用于肽合成的保護(hù)基與為了移走這些基團(tuán)而使用的試劑的反應(yīng)性是不相同的。例如，某些保護(hù)基，如三苯基甲基和2-(對(duì)聯(lián)苯基)異丙氧羰基是非常不穩(wěn)定的并且能在弱酸性條件下被切割。其他的保護(hù)基，如叔丁氧羰基、叔戊氧羰基、金剛烷氧羰基以及對(duì)甲氧基芐氧羰基相對(duì)穩(wěn)定并且為了移走這些基團(tuán)需要中等強(qiáng)度酸，如三氟乙酸、鹽酸或三氟化硼的乙酸溶液。還有其他的保護(hù)基，如芐氧羰基、鹵代芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、環(huán)烷氧羰基以及異丙氧羰基甚至更相對(duì)穩(wěn)定，并且為了移走這些基團(tuán)需要更強(qiáng)的酸，如氟化氫，溴化氫或三氟乙酸化硼的三氟乙酸溶液。
在所需的肽序列合成結(jié)束后，必須從樹脂支座上切下被保護(hù)的肽，并且移走所有保護(hù)基。切割反應(yīng)和移走保護(hù)基可以同時(shí)或逐步完成。如果樹脂支座是氯甲基化的聚苯乙烯樹酯，將肽固定到樹脂上的鍵是在C-末端部分的游離羧基和在樹脂基質(zhì)上存在的許多氯甲基基團(tuán)之一之間形成的酯鍵。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的能斷裂酯鍵并且能穿過樹脂基質(zhì)的試劑可以將該固定鍵裂解。一種特別方便的方法是用液態(tài)的無水氟化氫。該試劑不僅從樹脂上切下肽，而且還能移走所有的保護(hù)基團(tuán)。因此，使用該試劑可以直接提供完全脫保護(hù)的肽。如果期望在不除去保護(hù)基團(tuán)的情況下將肽切下，則可將被保護(hù)的肽-樹脂進(jìn)行甲醇分解以得到其C-末端羧基為甲基化的被保護(hù)的肽。然后在溫和的堿性條件下水解甲基酯以得到游離的C-末端羧基。然后通過用強(qiáng)酸，如液態(tài)氟化氫處理而除去肽鏈上的保護(hù)基。進(jìn)行甲醇分解的特別有用的技術(shù)是G.Moore等人，Peptides，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman and J.Meienhofer，Eds.，John Wiley，N.Y.1977，pp.518-521公開的技術(shù)，其中在冠醚存在下用甲醇和氰化鉀處理被保護(hù)的肽-樹脂。
從樹脂上斷割被保護(hù)肽的另一種方法是進(jìn)行氨解作用或用肼處理。如果需要，將得到的C-末端酰胺或酰肼水解為游離的C-末端羧基，并且能很容易地移走保護(hù)基。
還將認(rèn)識(shí)到在從樹脂支座上裂解下被保護(hù)的肽之前或同時(shí)，應(yīng)優(yōu)先移走存在于N-末端的α-氨基基團(tuán)上的保護(hù)基。
借助于重組DNA方法也可以制備本發(fā)明胰島素類似物的A和B鏈。在其制備過程中，用執(zhí)行這種合成的新的常規(guī)技術(shù)制備編碼所需的A或B鏈的肽的核苷酸序列。這些方法通常包括制備既為所需編碼序列的片段編碼又為其互補(bǔ)序列編碼的寡核苷酸。設(shè)計(jì)這些寡核苷酸以便得到該編碼序列的一個(gè)片段與互補(bǔ)序列的二個(gè)片段相重迭并且反之亦然。將這些寡核苷酸配對(duì)并連接，最后產(chǎn)生所需的基團(tuán)序列。
將該序列插入到一個(gè)克隆載體的某一位點(diǎn)上，使得該序列編碼的肽產(chǎn)物得到表達(dá)。按照Chance等人，歐洲專利公開No.0383472，(
公開日1990年8月22日)描述的方法構(gòu)建能表達(dá)胰島素原和胰島素原類似物的質(zhì)粒。整個(gè)文獻(xiàn)引入本文作為參考。
利用重組DNA技術(shù)經(jīng)類似于胰島素原的前體分子還可以制備本發(fā)明的胰島素類似物的A和B鏈。參見Frank等人，PeptidesSyntbesis-Structure-Function，Proc.Seventh Am.Pept.Symp.，Eds.D.Rich and E.Gross(1981)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
利用Chance等人，PeptidesSynthesis，Structure and FunctionProc.of Seventh American Peptide Symposium(1981)的方法可以獲得將單獨(dú)的A和B鏈，不管其如何制備，結(jié)合起來的步驟，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
下面提供的實(shí)施例作為描述本發(fā)明的手段，而本發(fā)明并不僅限于此。
實(shí)施例1Ala(B26)人胰島素利用脫五肽(B26-30)人胰島素以及合成的五肽Ala-Thr-Pro-Lys-Thr進(jìn)行酶促半合成(逆蛋白水解作用)來制備標(biāo)題胰島素類似物。通過固相肽合成法制備五肽，而基本上按照Gattner，H.G.，(1975)Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，3561397-1404描述的方法，通過胃蛋白酶水解反應(yīng)轉(zhuǎn)移序列26-30，從生物合成的人胰島素(Eli Lilly and Company，Indianapolis)衍生出脫五肽的人胰島素。
在ABI合成儀430A或ACT Ⅰ型200合成儀上合成肽。從Applied Biosystems，Inc.購(gòu)買t-Boc-Thr(Bzl)OCH2-PAM樹脂以及已保護(hù)的t-Boc-氨基酸和用于合成肽的大多數(shù)預(yù)先包裝好的試劑。通過常規(guī)的HF裂解從樹脂上切下該五肽。在90%HF和10%間甲苯酚中于0℃使裂解進(jìn)行1小時(shí)，并真空蒸發(fā)HF。用冷的無水乙醚立即沉淀肽，再用冷的無水乙醚洗滌數(shù)次，然后最終溶于10%乙酸中并凍干。
為了制備標(biāo)題胰島素類似物，將400mg的脫五肽人胰島素和730mg的合成的五肽Ala-Thr-Pro-Lys-Thr結(jié)合在36ml含有85%1，4-丁二醇和15%1M三羥甲基氨基甲烷緩沖劑的溶液中并用濃HCl將pH調(diào)節(jié)至pH7.0-7.1。將40mg胰凝乳蛋白酶在加到蛋白質(zhì)溶液中之前溶于400μl的0.01N HCl中。偶合反應(yīng)在25℃進(jìn)行4.5小時(shí)，并通過反相HPLC進(jìn)行追蹤，然后通過加入10倍體積的冷丙酮終止反應(yīng)。通過離心收集沉淀，并用醚洗滌，溶于25ml含有足夠的用于增溶的鹽酸胍的10%乙酸中，然后上樣至Sephadex G50(Superfine，5×200cm)柱上并在4℃用摩爾乙酸洗脫。合并所需的級(jí)份，并上樣至反相HPLC柱Zorbax C8(2.12×25cm)上，以2.5ml/分鐘的流速用45-70%B緩沖液線性梯度洗脫760分鐘。洗脫緩沖液是含有0.1M NaH2PO4，pH2.1的緩沖液A，以及含有50%緩沖液A和50%CH3CN的緩沖液B。在Vydac C18柱(2.12×25cm)上進(jìn)行進(jìn)一步純化并且該洗脫為45-70%B緩沖液的線性梯度，流速2.5ml/分鐘。流動(dòng)相由作為緩沖液A的0.1%TFA溶液以及作為緩沖液B的0.1%TFA/50%CH3CN組成。最后，獲得38mg的凍干蛋白，將其進(jìn)行各種分析。進(jìn)行快原子轟擊質(zhì)譜(FAB/MS)結(jié)果給出分子量為5715.6(預(yù)料為5715.4)。以天冬氨酸作為摩爾單位(理論氨基酸比例在括號(hào)內(nèi))氨基酸組成如下，
Asp，3.00(3);Thr，2.89(3);Ser，2.75(3);Glu，7.24(7);Pro，1.06(1);gly，4.00(4);Ala，2.00(2);Cys，5.24(6);Val，3.36(4);Ile，1.41(2);Leu，6.12(6);Tyr，2.83(3);Phe，2.87(3);His，2.22(2);Lys，0.99(1);Arg，1.00(1).
基本上按照上面描述的同樣方法制備本發(fā)明的其他胰島素類似物。用五肽Gly-Thr-Pro-Lys-Thr作為起始材料，制備胰島素類似物Gly(B26)HI。利用五肽Val-Thr-Pro-Lys-Thr作為起始材料，制備類似物Val(B26)HI。使用五肽Leu-Thr-Pro-Lys-Thr作為起始材料，制備類似物L(fēng)eu(B26)HI。使用五肽Ile-Thr-Pro-Lys-Thr作為起始材料，制備類似物Ile(B26)HI。使用五肽Pro-Thr-Pro-Lys-Thr作為起始材料，制備類似物Pro(B26)HI。分析每一種這些類似物證明這些化合物可用作為快速作用的胰島素類似物。
實(shí)施例2篩析HPLC將各種濃度的Ala(B26)HI用DuPont Zorbax GF-250(0.94×25cm)柱進(jìn)行色譜法，用含有0.2M NaCl、20mM Na2HPO4和0.001%NaN3、pH7.5的流動(dòng)相洗脫。該柱子以1ml/分鐘流速并在24℃進(jìn)行。分配系數(shù)(Kd)與該分子的平均半徑相聯(lián)系。在等式Kd＝(Ve-Vo)/(Vi-Vo)中，Ve是樣品的洗脫體積，Vo是采用Blue Dextran洗脫而測(cè)定的被排出的體積，并且Vi是采用DL-二硫蘇糖醇洗脫而測(cè)出的內(nèi)含的體積。隨著胰島素濃度的提高，胰島素分配系數(shù)(Kd)顯著降低，表明胰島素在高濃度時(shí)趨于聚集。用丙氨酸殘基代替胰島素B26位上的酪氨酸殘基產(chǎn)生的胰島素類似物似乎能在某種條件下消除聚集并導(dǎo)致不依賴于濃度的Kd。
實(shí)施例3平衡變性作用根據(jù)Brems等，(1990)Biochemistry299289-9293所述進(jìn)行平衡變性實(shí)驗(yàn)，整個(gè)文獻(xiàn)引入本文作為參考。通過遠(yuǎn)紫外圓形二色性，同時(shí)不斷增加胍濃度而測(cè)定平衡變性作用。在3.3M鹽酸胍(GdnHCl)時(shí)，Ala(B26)HI的變性轉(zhuǎn)變開始。對(duì)于Ala(B26)HI，打開的自由能量(△G)是4.5KCal/mol，其相同于BHI。對(duì)于Ala(B26)HI，中點(diǎn)([變性的]/[天然的]＝1)的鹽酸胍濃度是5.3M，而先前由Brems等人，1991，J.Biol.Chem.，2661611-1615測(cè)定的人胰島素的相應(yīng)濃度為5.0M。
實(shí)施例4均衡的超離心采用均衡的超離心沉降法測(cè)定胰島素的聚集作用。使用在Pekar，A.H.和Frank，B.H.(1972)Biochemistry 114013-4016描述的技術(shù)檢測(cè)每種類似物的相關(guān)狀態(tài)，該文獻(xiàn)全部引入本文作為參考。將這些蛋白質(zhì)溶于50mM氯化鈉-50mM磷酸鈉緩沖液中，并將pH調(diào)至7.2。用Aviv 14 DS分光光度計(jì)(Lakewood，N.J.)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以mg/ml為基礎(chǔ)，BHI的消光系數(shù)是1.05，而Ala(B26)HI的消光系數(shù)是0.8000。對(duì)于BHI，BHI的單體分子量為5808而對(duì)于Ala(B26)HI為5716。用ZnCl2溶液將鋅加到溶液部分，該ZnCl2溶液的濃度已采用原子光譜學(xué)方法測(cè)定。鋅與蛋白質(zhì)的摩爾比始終是0.5。以Spinco Model E分析用超離心機(jī)以及6-孔鈦轉(zhuǎn)子以及光電掃描吸收光學(xué)系統(tǒng)，在22℃完成均衡沉降試驗(yàn)。使用超速技術(shù)，以便于25小時(shí)開始均衡掃描前達(dá)到均衡。對(duì)于較稀的溶液使用標(biāo)準(zhǔn)的12mm中央部件，對(duì)于濃縮的溶液使用常規(guī)制備的3mm填充炭的埃龐環(huán)氧樹脂中央部件。假定沉降作用是理想的，根據(jù)表示式Mw＝RT/(1-Vp)W2·1/r·1/c·dc/dr計(jì)算出在各種半徑時(shí)的平均分子量，其中R是氣體常數(shù)，T是絕對(duì)溫度，W是速度，r是半徑，c是濃度，p是溶劑密度。假定Ala(B26)HI與B HI具有相同部分的體積度，即0.73ml/g。將重量平均分子量除以單體分子量，并與蛋白質(zhì)的總濃度比較。Ala(B26)HI顯示比BHI低的自締合趨勢(shì)。例如，在3.5mg/ml(或100單位/ml)時(shí)，胰島素具有約為單體分子量6.5倍的重量平均分子量。Ala(B26)HI具有約為單體分子量3.2倍的重量平均分子量。在0.5摩爾鋅/摩爾蛋白質(zhì)存在時(shí)，濃度接近0.5mg/ml時(shí)，胰島素主要是六聚體，相反，Ala(B26)HI的締合作用更小。隨著蛋白質(zhì)濃度增加。Ala(B26)HI締合成上面所述種類的六聚體。
實(shí)施例5受體結(jié)合在下文中的體外胰島素受體結(jié)合試驗(yàn)中，證明了本發(fā)明胰島素類似物的生理學(xué)作用。用由Gruppuso等人(1988)J.Clin.Endocrinal.Metab.67194-197描述的經(jīng)改變的方法完成人胎盤膜的制備以及結(jié)合試驗(yàn)，該文獻(xiàn)全部引入作為參考。所使用的方法是在含有100mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸、pH7.8、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、8mM葡萄糖以及0.25%牛血清蛋白的終體積為500μl的溶液中，將30至50μg的人胎盤膜蛋白與約10fmol的125I-胰島素和各種濃度的未標(biāo)記的胰島素或類似物在4℃保溫18小時(shí)。通過使用細(xì)胞收集器(Skatron，Lier，Morway)在用0.1%多聚氮丙啶(Polyethyleneimine)預(yù)處理的玻璃纖維濾器上收集上述保溫膜。通過將置換曲線應(yīng)用于一個(gè)四參數(shù)模型上而分析結(jié)合數(shù)據(jù)，該模型使用Prefit/Allfit用于測(cè)定EC50(置換半數(shù)最大結(jié)合所需的劑量)值。從四個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)表明人胰島素的EC50為0.34+/-0.05nM，而Ala(B26)HI的EC50為0.39+/-0.02nM，該Ala(B26)HI說明具有胰島素效力的89%。
實(shí)施例6動(dòng)物研究在下列體內(nèi)分析系統(tǒng)中證明本發(fā)明胰島素類似物的生理學(xué)作用。
用來自Charles River Laboratories(Portage，MI)的正常的雄性Sprague Dawley大白鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物。獲得的鼠的重量范圍為160-180g，并將其在具有受控光周期(7∶00a.m.-7∶00p.m.光照，700p.m.-7∶00a.m.停止光照)以及75°F的動(dòng)物房中喂養(yǎng)1周。用Purina rat chow 5001 ad libitum喂養(yǎng)這些動(dòng)物。在使用前將用于每個(gè)試驗(yàn)的所有大白鼠禁食16小時(shí)。第一次使用時(shí)其重約200g。在達(dá)到禁食時(shí)的重量約275g(經(jīng)過三周)時(shí)，不再使用這些動(dòng)物。在該試驗(yàn)中使用5只對(duì)照動(dòng)物和5只試驗(yàn)動(dòng)物。將蛋白質(zhì)溶于0.05N HCl(pH1.6)中以得到100μg/ml的原液。由該原液，在普通鹽水中制備了許多稀釋液，分別對(duì)大白鼠皮下注射。在給藥后0時(shí)、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)，從每個(gè)大白鼠的尾靜脈中抽取100μl的血樣。通過葡萄糖氧化酶方法(Sigma chemical Co.)以比色法測(cè)定葡萄糖。從0時(shí)開始計(jì)算每只大白鼠的血葡萄糖百分?jǐn)?shù)變化，最后結(jié)果以試驗(yàn)組的平均百分?jǐn)?shù)變化±SEM表示，該平均值用該天的對(duì)照組的平均變化值進(jìn)行校正。
用不同濃度的受試化合物進(jìn)行測(cè)試，將得到的每一劑量時(shí)葡萄糖為最低值的葡萄糖變化的百分?jǐn)?shù)繪制劑量效應(yīng)曲線。由該曲線決定ED50值，以作為產(chǎn)生半數(shù)最大低血糖效應(yīng)的蛋白質(zhì)皮下注射劑量(μg/kg)。人胰島素ED50是7.8+/-0.1(n＝3)而Ala(B26)HI的ED50是8.9+/-0.7(n＝2)。Ala(B26)HI具有胰島素效力的88%。
在豬模型系統(tǒng)上進(jìn)行的研究還證明Ala(B26)HI類似物可用作為快速作用胰島素。與人胰島素相比，在皮下注射后40-60分鐘內(nèi)幾乎吸收了二倍的Ala(B26)HI的量。
如前面所解釋的，本發(fā)明的胰島素類似物具有降低了的二聚化或其他方式自締結(jié)為更高分子量形式的趨勢(shì)。因此一旦給藥一種或多種所說類似物，活性便可以迅速起作用。通過給需要該治療的患者施用有效量的在其B鏈的第26位上含有丙氨酸殘基的胰島素類似物，本發(fā)明的胰島素類似物能有效地治療高血糖癥。本文中使用的術(shù)語“有效量”是指治療時(shí)或預(yù)防時(shí)為了降低或維持血糖濃度所需要的一種或多種本發(fā)明的胰島素類似物的量。通常該量的范圍是每天需約10單位直至約60單位或更多(或假設(shè)每mg約29單位時(shí)需約0.3至約2mg)。但是，應(yīng)明白實(shí)際給藥的胰島素類似物的量將是由內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)的情況來確定，包括治療的狀態(tài)(即高血糖癥的原因)、給藥的具體類似物、所選擇的非腸道給藥途徑、個(gè)體患者的年齡和體重以及反應(yīng)和癥狀的嚴(yán)重程度。因此，上述給出的劑量范圍并不能以任何方式限制本發(fā)明范圍。
采用藥物組合物形式將本發(fā)明胰島素類似物施用于需要該治療(即患有高血糖癥的患者)的患者，所述組合物含有有效量的至少一種胰島素類似物并結(jié)合有一種或多種可藥用的賦形劑或載體，所述類似物在其B鏈的26位上含有一個(gè)丙氨酸殘基。為了上述目的，通常配制藥物組合物，使之含有約100單位/ml或相似濃度的有效量的胰島素類似物。這些組合物通常(但不是必需)具有非腸道給藥特性，并且可以采用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的用于非腸道產(chǎn)品的常規(guī)賦形劑或載體，通過各種技術(shù)制備。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA(1985)，在此引入該文作為參考。例如，將所需量的至少一種胰島素類似物懸浮于或溶于適于注射的無毒液體賦形劑如水介質(zhì)中，并將懸浮液或溶液進(jìn)行滅菌，可以制備適于非腸道使用的劑型，其中的類似物在其B鏈的26位上含有一個(gè)丙氨酸殘基。為了在施用前進(jìn)行混和可以附加一種小瓶或賦形劑。適用于非腸道給藥的藥物組合物使用稀釋劑、賦形劑和載體如水和易與水混合的有機(jī)溶劑如甘油、芝麻油、花生油、丙二醇水溶液、N，N′-二甲基甲酰胺等等。這樣的藥物組合物的實(shí)例包括無菌的、等滲的、水性的胰島素類似物(在B鏈的第26位含有丙氨酸殘基)的鹽溶液，并可用藥物學(xué)上可接受的緩沖劑進(jìn)行緩沖并且是無熱原的。另外，非腸道藥物制劑可以含有防腐劑如苯酚或間甲苯酚。可以使用調(diào)節(jié)最后產(chǎn)品的pH值的試劑例如氫氧化鈉或鹽酸。
還可以將本發(fā)明胰島素類似物配制成適用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物。在歐洲專利申請(qǐng)0200383 A3中詳細(xì)公開了上述組合物，引入本文作為參考。簡(jiǎn)而言之，用一種或多種可藥用的稀釋劑，藥物學(xué)上可接受量的堿金屬鹽，銨鹽，或基本上無鋅的胰島素的游離酸，并且任選地加入增強(qiáng)吸收所需量的至少一種吸收增強(qiáng)劑，一起配制這樣的組合物，所述吸收增強(qiáng)劑選自于(1)油酸或其酯或鹽，(2)液態(tài)的脫水山梨醇脂肪酸酯，(3)液態(tài)的脫水山梨醇脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物以及(4)液態(tài)的羥基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚體。
序列表(1)一般性資料(ⅰ)申請(qǐng)人Chance等人(ⅱ)發(fā)明名稱胰島素類似物(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)相應(yīng)的地址(A)地址Eli Lilly and CompanyPatent Division/DKN(B)街道Lilly Corporate Center(C)城市Indianapolis(D)州IN(E)國(guó)家USA(F)ZIP46285(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)工具類型Diskette，3.50inch，1.0Mb Storage(B)計(jì)算機(jī)Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh(D)軟件Microsoft Word(ⅵ)現(xiàn)行的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(ⅶ)以前的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?br> (B)申請(qǐng)日(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)資料(A)姓名Douglas K.Norman(B)登記號(hào)33267(C)參考/摘要編號(hào)X8667(xi)電訊資料(A)電話(317)276-2958(B)傳真(317)276-1294(C)電傳(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Variable Site(B)位置21(C)鑒別方法(D)其他資料“該氨基酸是Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser?！?xi)序列描述SEQ ID NO1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20(3)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Variable Site(B)位置1(C)鑒別方法(D)其他資料“該氨基酸是Phe或Asp。”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Variable Site(B)位置3(C)鑒別方法(D)其他資料“該氨基酸是Asn或Asp?！?ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Variable Site(B)位置26(C)鑒別方法
(D)其他資料“該氨基酸是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro”。
(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr20 25 30
權(quán)利要求
1.正確地交聯(lián)在SEQ ID NO∶2上的通式SEQ ID NO∶1的胰島素類似物，或其可藥用的鹽，其中在SEQ ID NO∶1的第21位上的Xaa選自于Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser，在SEQ ID NO∶2的第1位上的Xaa選自于Asp或Phe，在SEQ ID NO∶2的第3位上的Xaa選自于Asp或Asn，以及在SEQ ID NO∶2的第26位上的Xaa選自于Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素類似物，其中SEQ ID NO1的第21位上的Xaa是Asn。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰島素類似物，其中SEQ ID NO2的第1位上的Xaa是Phe。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰島素類似物，其中SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胰島素類似物，其中SEQ ID NO2的第26位上的Xaa中Ala。
6.一種藥物制劑，包括存在于一種可藥用的稀釋劑中的正確地交聯(lián)至SEQ ID NO2上的通式SEQ ID NO1的胰島素類似物，或其可藥用的鹽，其中在SEQ ID NO1的第21位上的Xaa選自Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser，SEQ ID NO2的第1位上的Xaa選自于Asp或Phe，SEQ ID NO2的第3位上的Xaa選自Asp或Asn，以及SEQ ID NO2的第26位上的Xaa選自Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物制劑，其中在SEQ ID NO1的第21位上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO2的第1位上的Xaa是Phe，在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn，以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是選自Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所說的藥物制劑，其中SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是Ala。
9.一種制備如權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所說的胰島素類似物的方法，該方法包括將SEQ ID NO1化合物與SEQ ID NO2化合物交聯(lián)在一起。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法制備的胰島素類似物。
全文摘要
在B鏈的第26位上含有Ala、Gly、Val、Leu、IIe或Pro殘基，并且任選地在其他位點(diǎn)進(jìn)行了改變的人胰島素類似物。該類似物具有改變了的理化特性和藥學(xué)動(dòng)力學(xué)特性。由于這些類似物是穩(wěn)定的并且具有較低的自締合趨勢(shì)而可用于治療高血糖癥。
文檔編號(hào)C07K14/62GK1094059SQ93112839
公開日1994年10月26日 申請(qǐng)日期1993年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月18日
發(fā)明者R·E·錢斯, 范利 申請(qǐng)人:伊萊利利公司