專(zhuān)利名稱(chēng)：用于丙型肝炎病毒分類(lèi)的抗原肽,含有所述肽的藥盒及用所述肽進(jìn)行分類(lèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于丙型肝炎病毒分類(lèi)的抗原肽，含有這種肽的藥盒，以及用這種肽進(jìn)行分類(lèi)的方法。
非甲非乙型肝炎一般叫做丙型肝炎，是一種由一種特定病毒而不是甲型或乙肝炎病毒引起的傳染性肝炎，并且經(jīng)常導(dǎo)致慢性肝炎，而隨后，又以高比率發(fā)生肝硬變成肝癌，因此，這種疾病已成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。由于在患者或健康攜帶者體內(nèi)，病毒的表達(dá)量極少，并且由于不知道引起肝炎的病毒是否是以一種類(lèi)型是兩種或更多的類(lèi)型存在。因此，它的可辨認(rèn)的診斷是很困難的。直到最近，仍用所謂的“排除診斷”進(jìn)行非甲非乙型肝炎的診斷，該方法包括，確定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的增加水平;確定肝炎是否是由已知病毒如(可引起肝失調(diào)的)CMV和EBV引起的甲型肝炎，乙型肝炎或其它肝炎;最后，如果不是上述的疾病，則診斷為非甲非乙型肝炎。然而，由于其臨床印象與其它病毒性肝炎相似并且與沒(méi)有不正常ALT水平的健康帶菌者的鑒別相象，所以很難用排除診斷法，將非甲非乙型肝炎與其它病毒性肝炎區(qū)分開(kāi)。由于這些原因，很難預(yù)防通過(guò)輸入健康帶菌者血液引起的病毒感染，因此，可以想象，非甲非乙型肝炎占肝炎的90%以上。在日本，其患者數(shù)量達(dá)每年1百萬(wàn)。
為了改善這種情況，許多研究人員進(jìn)行了用于診斷非甲非乙型肝炎的材料的研制。而許多研制的材料只有較低的可靠性。在這些材料中，被認(rèn)為具有最高可靠性的一種材料是由在Chiron Corporation(USA)的M.Houghton等人(PCT專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO89/04669;PCT/JP90/500880)研制的材料。Chiron Corporation已經(jīng)有效地克隆了有用的病毒基因，以便了解丙型肝炎病毒(HCV，Chiron Corporation定義的)的幾乎全部基因組結(jié)構(gòu)，并研制出一種診斷用藥盒，它含有通過(guò)表達(dá)部分HCV基因得到的抗原蛋白質(zhì)。
從那時(shí)以來(lái)，在日本，用免疫篩選已經(jīng)分離了許多非甲非乙型肝炎特異性的HCV基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將HCV分類(lèi)為HCV Ⅰ類(lèi)，它與Chiron Corporation分離的HCV的核苷酸和氨基酸序列具有高度同源性;HCV Ⅱ類(lèi)，具有其較低的同源性并由此認(rèn)為是與HCV Ⅰ類(lèi)不同的一種病毒(日本專(zhuān)利申請(qǐng)No.3-189268)。當(dāng)用來(lái)自日本非甲非乙型肝炎患者的血清檢測(cè)時(shí)，已證實(shí)由Chiron Corporation銷(xiāo)售的藥盒以50到70%的紙陽(yáng)性率反應(yīng)。因此，在流行病學(xué)方面，已經(jīng)迫切需要研制具有較高精確度的診斷用試劑。
可以將上文所述的HCV分為(Chiron Corporation克隆的)Ⅰ類(lèi)和(本發(fā)明人克隆的)Ⅱ類(lèi)，Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)均是肝炎的傳染性病原體。許多研究已經(jīng)針對(duì)在病毒學(xué)和臨床病理學(xué)方面兩個(gè)類(lèi)型的HCV在臨床上彼此有怎樣的連系。其實(shí)例之一是非甲非乙型肝炎的干擾素(IFN)治療。IFN是一種抗病毒劑，據(jù)信它通過(guò)阻斷HCV的后期感染可以防止肝炎的慢性癥狀，但已經(jīng)知道，IFN對(duì)漸進(jìn)性疾病如慢性肝炎和肝硬變的治療效果只有約30%這樣低，而對(duì)急性肝炎的效果較高。Miyazaki等人(The 28th Congress of the Japanese Liver Society，General Lecture No.4，Abstuact P.75，1992)用PCR技術(shù)已發(fā)現(xiàn)，患有丙型肝炎并IFN治療明顯有效的患者已經(jīng)感染了HCV Ⅱ類(lèi)。雖然使用少量的感染血清通過(guò)PCR技術(shù)可以擴(kuò)增和檢測(cè)HCV基因，但由于這種技術(shù)的處理很復(fù)雜，所以不能用于檢測(cè)許多樣品。如果研究出一種用于篩選特異性感染上HCV Ⅰ類(lèi)或HCV Ⅱ類(lèi)-感染的患者就可能接受早期有效的IFN治療。上述方法可用檢測(cè)感染上HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)的混合感染患者。
因此，本發(fā)明一方面是提供用于分辨丙型肝炎病毒類(lèi)型的抗原肽。
本發(fā)明另一方面是提供用這種肽分辨丙型肝炎病毒的方法。
本發(fā)明另一方面是提供一種用于分辨丙型肝炎病毒類(lèi)型的藥盒，它含有兩個(gè)結(jié)合在一起的抗原肽，它們分別與HCV Ⅰ類(lèi)和HCV Ⅱ類(lèi)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面是提供一種用該藥盒分辨丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法。
圖1表明該抗原肽C14-1，C14-1-2，C14-2和C14-2-2的氨基酸序列，以及用于檢測(cè)(在HCV分類(lèi)中所用的)肽片段(用實(shí)線表示)的抗原決定簇圖，其中星號(hào)(★)表示C14-1和C14-1-2或C14-2和C14-2-2間的同源氨基酸。
圖2表示構(gòu)建C14-2-表達(dá)載體PAT、trp、trpE、C14-2的過(guò)程。
圖3表示一個(gè)Western印跡圖片，它表明了表達(dá)的肽trpE C14-2與丙型肝炎患者血清的抗原-抗體反應(yīng)(見(jiàn)第二道)。對(duì)照是來(lái)自健康人的血清(見(jiàn)第1道)。如上文所述，通過(guò)比較其氨基酸序列間的同源性，將丙型肝炎病毒(即，HCV)大致分成Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)。在與Chiron Corporation克隆的HCV Ⅰ(參見(jiàn)PCT專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO 90/11089，PCT/JP90/500880)比較的基礎(chǔ)上，可以測(cè)定同源性，并由此將HCV分成同源性大于約80%的一類(lèi)和同源性低于約80%的一類(lèi)。前者稱(chēng)為Ⅰ類(lèi)，后者稱(chēng)為Ⅱ類(lèi)。本文中，Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)有上述定義。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分類(lèi)”是指將Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)區(qū)分開(kāi)，或劃分成Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)，并鑒別或識(shí)別是Ⅰ類(lèi)還是Ⅱ類(lèi)。
在過(guò)去幾年間，已經(jīng)分離了全長(zhǎng)的HCV克隆并已確定了其核苷酸和氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將Ⅰ類(lèi)劃分成Ⅰ型和Ⅱ型，而將Ⅱ類(lèi)分為Ⅲ型和Ⅳ型。例如，HCV Ⅰ型是由Chiron Corporation分離的“HCVⅠ”(參見(jiàn)PCT專(zhuān)利申請(qǐng)No 90/11089，PCT/JP90/500880)，HCV Ⅱ型是由Shimotono等人分離的“J”(參見(jiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87)，9524-9528(1990))，HCV Ⅲ型是由Okamoto等人分離的“J6”(參見(jiàn)J.Gen.Virol.72∶2697-2704(1991))，HCV Ⅲ型是由Okamoto等人分離的“J8”(參見(jiàn)Virology 188∶331-341(1992))。在Ⅰ型和Ⅱ型之間或Ⅲ型和Ⅳ型之間，以氨基酸序列為基礎(chǔ)的同源性大約是85%。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因，擴(kuò)增所獲得的DNA片段并大量表達(dá)DNA片段得到的各種肽中，存在著能與帶HCV Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)的丙型肝炎患者血清發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在區(qū)別兩大類(lèi)時(shí)所用的肽存在于相當(dāng)于在PCT/JP90/500880中所述的HCV Ⅰ-編碼的多肽的，氨基酸1674到1760區(qū)域，該肽區(qū)域由沿HCV基因組的NS4區(qū)域編碼。更具體地說(shuō)，所發(fā)現(xiàn)的鑒別HCV Ⅰ類(lèi)時(shí)有用的抗原肽是具有SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列的C14-1肽和具有SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列的C14-1-2肽，后面的肽與C14-1肽有關(guān);并且所發(fā)現(xiàn)的鑒別HCV Ⅱ類(lèi)時(shí)有用的抗原肽是具有SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列的C14-2肽和具有SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列的C14-2-2肽，后面的肽與C14-2肽有關(guān)。這些序列也相當(dāng)于(Okamoto等人分離的)J6和J8基因組(Okamoto et al.，同上文)所編碼多肽的氨基酸1680到1764區(qū)域。在分類(lèi)中，其它有用的多肽可以是上述4種肽的片段。
因此，本發(fā)明提供了一種具有SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶2所示的氨基的序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽;和一種具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示的氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽。
用上述肽作為抗原，可以將樣品(如，血)中的HCV分為HCV Ⅰ類(lèi)或HCV Ⅱ類(lèi)。
根據(jù)本發(fā)明，可以將分別與HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)的兩種抗原肽組合在一起以形成一個(gè)藥盒，且這樣的藥盒可用于檢測(cè)感染上HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)的混合感染患者。
因此，本發(fā)明提供了一種用于鑒別丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)的藥盒，它在其分開(kāi)的幾個(gè)部分含有至少一種第一抗原肽，該肽選自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列的肽并且能夠與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，以及與所述肽具有相同功能的肽的變異體;和至少一種第二抗原肽，該肽選自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列的肽并且能夠與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，以及與所述肽具有相同功能的肽的變異體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“具有相同功能的肽變異體”是指肽，它有至少一個(gè)不同氨基酸取代了SEQ ID NO∶1，2，3或4所示氨基酸序列或其部分序列中的組成氨基酸，提供的變異體可以與上文定義的HCV Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。如在圖1中C14-1和C14-1-2之間或C14-2和C14-2-2之間進(jìn)行比較所見(jiàn)到的，氨基酸取代的實(shí)例包括具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸如Ile-Val，Leu-Ile，Val-Ala，Met-Ile，Lys-Arg，Asp-Gln，等之間的取代。
可以將本發(fā)明所用的抗原肽與另一個(gè)其它的不影響與病毒抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的惰性肽融合，或?qū)⑺鼈冞M(jìn)行化學(xué)修飾(如，肽的N-末端的酰化作用)?？乖牡牧硪粚?shí)例是其抗個(gè)體基因型抗體。
有效的肽片段實(shí)例(但不限于下述的)包括具有下列序列的片段SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44位氨基酸(在圖1中稱(chēng)為“1-Y”)，37到62(1-2)位氨基酸或它們的組合;SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44(1-Y)，37到62(1-Z)，53到74(1-B)，64-87(1-A)位氨基酸或其組合;SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中的20到44(Z-Y)，37到62(2-Z)或其組合;以及SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44(2-Y)，37到62(2-Z)，53到74(2-B)，64-87(2-A)或其組合。本文中，術(shù)語(yǔ)“組合”是指至少兩個(gè)片段序列如20-62，20-74導(dǎo)的結(jié)合。
用重組DNA技術(shù)或肽合成技術(shù)可以制備該抗原肽。
用經(jīng)典的重組DNA技術(shù)制備該抗原肽的方法包括下列步驟構(gòu)建一個(gè)攜帶DNA片段的可復(fù)制表達(dá)載體，該DNA片段編碼具有SEQ ID NO∶1，2，3或4所示氨基酸序列或其部分序列的肽;
將表達(dá)載體摻入宿主細(xì)胞以得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞;
在適合于表達(dá)DNA片段的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞;和回收所需的肽。
下面是構(gòu)建表達(dá)載體的實(shí)例將編碼所需肽的DNA片段連接到常規(guī)質(zhì)粒(如，PUC119)中，然后擴(kuò)增。用兩種限制內(nèi)切酶雙重消化所得質(zhì)粒后，分離得到的DNA片段并用瓊脂糖凝膠電泳純化。另一方面，用相同的內(nèi)切酶雙重消化適宜的表達(dá)載體如PAT.trp.trpE(參見(jiàn)JP-A-1-215，289)，然后用相似的方法純化所得的載體片段。將該載體片段與上述DNA片段連接起來(lái)，得到所需的表達(dá)載體，它可以表達(dá)HCV Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)特異性抗原(參見(jiàn)下文陳述的實(shí)施例)。
可用的表達(dá)啟動(dòng)子可以來(lái)自大腸桿菌，噬菌體，病毒等，如色氨酸合成酶操縱子(trp)啟動(dòng)子，乳糖操縱子(lac)啟動(dòng)子，入噬菌體PL或PR啟動(dòng)子，醇脫氫酶啟動(dòng)子，和SV40啟動(dòng)子。在表達(dá)載體的DNA中可存在選擇標(biāo)記序列如抗生素抗性基因;復(fù)制起點(diǎn);轉(zhuǎn)錄終止因子;核糖體結(jié)合位;等。
可使用的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的實(shí)例包括一般的微生物如大腸桿菌，枯草桿菌和酵母;昆蟲(chóng)細(xì)胞;植物細(xì)胞;和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核生物，特別是大腸桿菌。用將表達(dá)載體摻入宿主細(xì)胞的常規(guī)方法可以完成轉(zhuǎn)化。若用細(xì)菌細(xì)胞(如，大腸桿菌)作為宿主細(xì)胞，使用氯化銣(Hanhan，DNA CloningA practical approach，IRC ress(1985)或氯化鈣(Mandel，M and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53∶159.162(1970))的直接摻入法是優(yōu)選的。若使用高等生物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則使用病毒載體的插入法是優(yōu)選的。
接著，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞細(xì)便生產(chǎn)所需的肽。來(lái)自宿主細(xì)胞的抽需肽可以如下純化聲處理破碎宿主細(xì)胞后，離心分離不溶的部分，該部分含有丙型肝炎病毒cDNA編碼的肽或含其它肽(如，trpE)與它的融合肽，用含脲緩沖液從該部分中溶解重組肽，然后使該肽經(jīng)離了交換柱層析(如，Q-Sepharose)進(jìn)行部分純化。為了進(jìn)一步純化該…重組肽，可以使用如凝膠過(guò)濾(如;HiLoad Superdex)這樣的步驟。
另外，可以用包括液相法和固相法的常規(guī)肽合成技術(shù)(參見(jiàn)Lectures on Biochemical Experiment I，“Protein Chemistry IVChemical modifications and Peptide syntheses，”pp.207-495，1977，ed.by the Japanese Biochemical Society)制備本發(fā)明的肽。通常，如果所需的肽是長(zhǎng)肽，則首先在合成樹(shù)脂相上合成約5到10個(gè)氨基酸組成的小肽。然后按順序或一步一步的方式彼此連接，并在去保護(hù)作用后，得到所需的肽。
按上述方法制備的本發(fā)明肽一般在真空或凍干法干燥后以固體形式貯存在黑暗寒冷的房間中。若以藥盒形式包裝，則將對(duì)HCV Ⅰ類(lèi)抗體特異性的抗原肽和對(duì)HCV Ⅱ類(lèi)抗體特異性的抗原肽各自放在藥盒的分開(kāi)的部分。這些分開(kāi)部分的例子是玻璃或樹(shù)脂制造的帶蓋小瓶和安瓶，微滴定盤(pán)，等。優(yōu)選的分開(kāi)部分形式是將每種肽吸附(或結(jié)合)到可以通過(guò)適宜的方法冷凍而穩(wěn)定的，用于ELISA的微滴定盤(pán)上的小孔上，以便使肽保持與HCV抗體的結(jié)合能力?？梢杂糜糜诰奂饔玫脑嚬?，小珠和支持物(如紅細(xì)胞)代替微滴定盤(pán)。在本發(fā)明的藥盒中，可以含有免疫分析必需的下列試劑緩沖液;酶-標(biāo)記的或放射性標(biāo)記的第二抗體;顯色劑;免疫反應(yīng)終止劑;等。表1到4表明下列多肽與臨床上已診斷為丙型肝炎的患者的血清的免疫反應(yīng)的EIA結(jié)果trpE.C14-1，trpE C14-1-2，trpE C14-2，trpE.C14-2-1(由SEQ ID NO∶3中的氨基酸殘基23到63組成)或trpE C14-2-2，結(jié)果說(shuō)明，trpE.C14-1和trpE C14-1-2可以特異性地鑒別HCV Ⅰ類(lèi)，而trpE.C14-2，trpE C14-2-1，trpE和C14-2-2可特異性地鑒別HCV Ⅱ類(lèi)。
表5，6和7表示能與HCV Ⅰ或Ⅱ類(lèi)特異性反應(yīng)的本發(fā)明肽片段與各種丙型肝炎患者血清發(fā)生免疫反應(yīng)的EIA結(jié)果。表5、6和7的結(jié)果說(shuō)明患者只感染上了HCV Ⅰ類(lèi)，或HCV Ⅱ類(lèi)，或HCV Ⅰ和Ⅱ類(lèi)均感染。市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到的丙型肝炎診斷試劑，Immucheck-HCV(ex International Reagents Corporation，Hyogo，Japan)作為比較試劑不能將HCV Ⅰ類(lèi)與HCV Ⅱ類(lèi)區(qū)分開(kāi)。因此，本發(fā)明提供一種區(qū)別丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法，它包括將具有SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列的抗原肽與假定含抗HCV抗體的樣品接觸以便進(jìn)行免疫反應(yīng);和檢測(cè)作為陽(yáng)性的屬Ⅰ類(lèi)的抗HCV抗體。若使用具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列的抗原肽，則抗HCV Ⅱ類(lèi)抗體可作為陽(yáng)性被檢測(cè)，因此，這種分類(lèi)方法也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明還涉及上述藥盒的使用。因此，本發(fā)明提供一種區(qū)分丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法，該方法包括將至少一種(選自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的第一肽，和與所述肽具有相同功能的肽變異體，以及至少一種(選自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的)第二肽，和與所述肽具有相同功能的肽變異體，逐一與假定含丙型肝炎病毒抗體的樣品接觸，通過(guò)免疫反應(yīng)定量或定性地確定抗體的第一和第二肽包含在上面所定義的藥盒中;和檢測(cè)丙型肝炎病毒Ⅰ或Ⅱ類(lèi)抗體。
可用的免疫檢測(cè)法是本領(lǐng)域常規(guī)使用的適當(dāng)技術(shù)，如Western印跡分析，酶免疫檢測(cè)，免疫沉淀，和放射性免疫檢測(cè)。根據(jù)所用檢測(cè)方法的類(lèi)型來(lái)適當(dāng)選擇測(cè)量條件(見(jiàn)下文所述的實(shí)施例)。樣品一般是血液，特別是血清。
實(shí)施例1構(gòu)建C14-1和C14-1-2表達(dá)質(zhì)粒用RT-PCR方法克隆HCV抗原-編碼的DNA為了從慢性丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因，使用RT(反轉(zhuǎn)錄酶)-PCR技術(shù)，其中僅用少量血漿就可以完成克隆。
首先將100μl丙型肝炎患者的血清加到200μl 6MGTC溶液(6M 硫氰酸胍，37.5mM檸檬酸鈉，0.75%Sarkosyl，0.2Mβ-巰基乙醇)和1μl酵母t-RNA(10mg/ml)中并攪拌。將20μl 3M乙酸鈉(pH 5.2)，30μlTE-飽和的苯酚(pH 7.5-8.0)和70μl氯仿/異戊醇(49∶1)迅速加到所得的混合物中，攪拌10秒鐘，并在冰上放15分鐘。在4℃以15，000離心20分鐘后，移出含水層，并將其與等體積異丙醇混合，在20℃放置至少1小時(shí)。在相同條件下進(jìn)一步離心后，回收沉淀，然后將其溶解在100μl 4MGTC(用無(wú)菌水稀釋6MGTC)中，與等體積異丙醇混合并在20℃放置至少1小時(shí)。在4℃以15，000離心20分鐘后，回收RNA沉淀用70%乙醇(1ml)洗滌，室溫下空氣干燥，并將其溶解在10μl無(wú)菌水中。以后將使用該RNA溶液。
按下列步驟完成HCV cDNA合成將10μl RNA溶液放在硅酮處理的試管(0.5ml)中，在70℃加熱3分鐘，并在冰上猝冷。然后，將1μl RNase抑制劑(50單位/μl);ex Takara Shuzo)，1μl dNTPs(各20mM)，100mM DTT，4ml 5XRT緩沖液(250mM Tris-HCl(pH85，375mM kCl，15mM MgCl2)，1μl隨機(jī)的寡門(mén)聚引物(100皮摩爾/μl)和反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)(200單位/μl)加到溶液中，并將滅菌水加到混合物中以達(dá)到20μl的總體積。在42℃用2小時(shí)完成HCV cDNA合成。然后在94℃，將混合物加熱5分鐘以使酶失活。
按下列步驟用得到的cDNA完成PCR所用的PCR是一個(gè)兩步法，其中首先用兩個(gè)引物完成第一步PCR，然后，用存在于第一個(gè)PCR產(chǎn)物DNA序列中的兩個(gè)引物完成第二步PCR。用這種方法，可以提高所檢測(cè)DNA的擴(kuò)增敏感性和特異性。
為了擴(kuò)增C14-1區(qū)域，參閱已知序列(Pro.Natl.Acad.Sci.USA 87，9524-9528，1990)合成下列引物第1步PCR中所用的引物5S15′-AGGTCGTCACTAGCACCTGGGTGC-3′(SEQ ID NO∶10);和5A15′-TGTATCCCGCTGATGAAGTTCCAC-3′(SEQ ID NO∶11);
第2步PCR中所用的引物5S25′-GAATTCACGACAGGCAGCGTGGTC-3′(SEQ ID NO∶12);和5A25′-CTATTACAGCAATCCGAGCGCCCT-3′(SEQ ID NO∶13)。
在一個(gè)0.5ml試管中，放入用于合成cDNA的20μl反應(yīng)溶液，8μl10×PC緩沖液(100mM.Tris-HCl(pH 8.3)，500mMKCl，15mM MgCl2，0.1%明膠)，兩種第1步引物(各75皮摩爾(pmole))和8μl 2mM dNTPs。然后將滅菌水加到該混合物中以達(dá)到100μl的總體積。在94℃加熱10分鐘后，將1μl AmpliTaq(5單位;ex Perkin-Elmer-cetus)邊攪拌邊加到混合物中，在粗離心前，將礦物油覆蓋在混合物溶液上。PCR的條件是變性94℃1分鐘;退火55℃ 1分鐘;延伸72℃，2分鐘;以及30個(gè)循環(huán)。在清潔的0 5ml試管中，放入10μl PCR反應(yīng)混合物9μl10×PCR緩沖液，兩種第2步PCR引物(各75皮摩爾)和9μl 1mM dNTPs，并將滅菌水加到該混合物中以達(dá)到100μl的總體積。在94℃加熱10分鐘后，將1μl Ampli Taq(5個(gè)單位)邊攪拌邊加到該混合物中，并在粗離心前將礦物油覆蓋在混合溶液上。在與第一步PCR相同的條件下，完成第二步PC。反應(yīng)后，用瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)混合物，用該方法也可以檢測(cè)特異性擴(kuò)增的DNA片段。
用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離徑PCR擴(kuò)增的C14-1 DNA片段(約200bp)。在68℃，將含該DNA片段的凝膠在200μl的滅菌水中溶解15分鐘。用TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-飽和的苯酚將溶液提取兩次以便分離含DNA片段的含水層。使含水層經(jīng)乙醇沉淀以得到DNA片段沉淀，然后將2μl10×激酶緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM DTT，1mM亞精胺，1mM EDTA pH 8.0)，1μl 10mMATP.和1μl T4激酶(10個(gè)單位/μl;ex Takara Shuzl)加入其中，隨后加入無(wú)菌水以得到20μl的總體積。使混合物在37℃反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行5′末端磷酸化。在68℃加熱10分鐘使激酶失活后，將反應(yīng)混合的與pUC119(Vieira，J.and Messing，J.，Methods in Enzymolgy，153，3-11(1987))連接。將pUC119(1μg)于37℃，在20μl限制反應(yīng)溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10個(gè)單位的SmaI酶(ex Takara Shuzo))中預(yù)先消化1小時(shí)，然后，加80μl滅菌水后，將反應(yīng)混合物在68℃加熱10分鐘，以便得到SmaI克隆載體溶液。在2μl10×緩沖液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM Mgcl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4激酶(350個(gè)單位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl滅菌水中，于16℃過(guò)夜完成10μl磷酸化DNA片段與2μl SmaI載體的連接反應(yīng)。
將10μl的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。預(yù)先用氯化鈣方法(Madel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159-162(1970))制備感受態(tài)大腸桿菌菌株。
然后將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在37℃，在加入了50μ12%X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)和10μl 100mM IPTG(異丙基-β-D_硫代吡喃半乳糖苷)的LB-Amp盤(pán)(1%胰胨，0 5%酵母提取物，0.5%NaCl，1 5%瓊脂，氨芐青霉素(20μg/ml)上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取-鉑環(huán)在盤(pán)上產(chǎn)生的白色菌落，并將其在含25μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl)中在37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將1 5ml培養(yǎng)物離心，收集細(xì)胞菌細(xì)胞，使它隨后按堿溶解法(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，1982)小量制備以得到質(zhì)粒DNA。將1μg得到的質(zhì)粒DNA在37℃用30μl限制反應(yīng)溶液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，7mM MgCl.2，各10個(gè)單位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo)消化1小時(shí)，使消化物用瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)大小分析以確定約250bp的插入DNA片段。將含該插入DNA片段的克隆命名為pUC.C14-1。用Sanger′s雙脫氧鏈末端方法(Sanger，F(xiàn).，Sciencl，214，1205-1210(1981))測(cè)定C14-1 DNA片段的核苷酸序列，用這種方法也可確定推測(cè)的氨基酸序列。在SEQ ID NO∶1和5中分別列出了確定的氨基酸與核苷酸序列。
為了從NS3的后半部到NS5的前半部中分離基因組HCV RNA區(qū)域(稱(chēng)為C6.2)，除使用下列引物外，按與上述相同的方法完成RT-PCR在第一步PCR中所用的引物KK15′-GGCTATACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶14);
和A65′-GTCTCAGCTCCCTTCCGATC-3′(SEQ ID NO∶15);
在第二步PCR中所用的引物KK5-GATCTACTGCTAACACATGTGTCA-3′(SEQ ID NO∶16);和A6(見(jiàn)上文)反應(yīng)后，回收擴(kuò)增的片段，然后，按上述方法插入到PBM載體(見(jiàn)下文)中以生產(chǎn)C6-2。
在50μl的總體積中，將1ng作為模板的C6-2與各50皮摩爾的引物(5′-GCGAATTCACAACAGGCAGTGTGGTCATT-3′(SEQ ID NO∶17)和5′-GCTCATTAGAAGGTCTCAAGGGCT-CGCCA-3′(SEQ ID NO′18))，67mMTris-HCl(pH 8.8)，16.6mM(NH4)2SO4，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，0.2mg/ml明膠，0.05%Triton X.100混合，再將2.5單位的Taq DNA聚合酶加到混合物中。覆蓋了石蠟油后，進(jìn)行C6-2片段的PCR(94℃ 30秒，55℃ 60秒，72℃ 120秒，30個(gè)循環(huán))。反應(yīng)混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離約260bp的片段，隨后用Glass粉方法(Gene Clean Ⅱ;ex BIO101)將其回收到50μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl，(pH 7.5)，1mM EDTA)中。將3μl 10×T4緩沖液(0.5M Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，100mM DTT)，3μl 2mM dNTPs，3μl ATP，加到所回收的DNA溶液(25μl)中。然后再將5單位的DNA聚合酶I(ex New England Biolab)和10個(gè)單位的T4多核苷酸激酶(ex Takar a Shuzo)加到混合物中以便在37℃反應(yīng)1小時(shí)。用Glass粉方法，將所需的DNA片段回收到25μl TE溶液中。
另一方面，在20μl的限制系統(tǒng)(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，7mM MgCl
2，20mM KCl，10個(gè)單位的smaI)中，經(jīng)限制反應(yīng)，將1μg的PTTT3 19U(exPharmacia)在37℃裂解1小時(shí)。將10μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)，70μl滅菌水，2個(gè)單位的細(xì)菌堿性磷酸酶(ex Takara Shuzo)加到反應(yīng)混合物中以便在68℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，用苯酚/氯仿提取溶液中的DNA，然后用乙醇沉淀。將回收的DNA(10μl)溶解在10ml TE緩沖液后，將1μl該溶液與10μl上述的PCR DNA片段混合，然后加入50μl的Ligation液A和10μl Liagtion液B(DNA Ligation kit;ex Takara Shuzo)，混合均勻以便在16℃反應(yīng)1小時(shí)。將10μl得到的DNA溶液按Hanahan′s方法(DNA cloningA practical approach(D.M.Glover編著)，vol.1，9，109，IRC印刷(1985)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-blue(ex Stratagene)中。所得的克隆是質(zhì)粒DNA的，該質(zhì)粒DNA來(lái)自可用EcoRI和SalI裂解以產(chǎn)生一個(gè)約290bp片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)，分離的DNA片段具有SEQ ID NO∶6所示的核苷酸序列，并編碼具有SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列的肽(即，C14-1-2)。
構(gòu)建表達(dá)載體
1μl pUC.C14-1 DNa在20μl限制溶液(100mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，7mM MgCl2，各10個(gè)單位的EcoRI和BamHI(ex Takara Shuzo))中，于37℃消化1小時(shí)，并使其經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳以制備約200bp純化的DNA片段。另一方面，在相同條件下處理1μg的表達(dá)載體pAt.trp.trpE DNA(JP-A-1-215，289)以得到載體DNA片段。在含350單位T4連接酶(ex Takara Shuzo)的5μl 10X連接酶緩沖液(660mM Tris-HCl(pH 7.5)，66mM MgCl2，100mM二硫蘇糖醇(DTT)，10mM ATP)加水到50μl的總體積中，將所得的EcoRI-BamHI處理的載體DNA(1μg)與上述制備的C14-1 DNA片段在16℃過(guò)夜連接。
將所得的10μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株C600中。用氯化鈣(Mandel，M.and Higa，A.J.Mol.Biol.(53，159-162(1970))制備用于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌菌株。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞放大含25μg/ml氨芐青霉素的LB-盤(pán)(1胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%瓊脂)上，并在37℃貯存過(guò)夜。挑取1鉑環(huán)平盤(pán)上產(chǎn)生的菌落，并在含25μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將所得的培養(yǎng)物(1.5ml)離心以便收集細(xì)胞細(xì)胞用堿溶解方法(Maniatis et al.，上文)小量制備質(zhì)粒DNA。
用EcoR I和BamHI雙重消化所得的DNA(1μg)，在消化產(chǎn)物中篩選表達(dá)質(zhì)粒pAT.trp.trp.trpE C14-1，從中得到約200bp的EcoRI-BamHI片段。
用相似的方法，從中可得到約290bp EcoRI-SalI片段的表達(dá)質(zhì)粒pAT.trp.trpE C14-1-2，可以從pUC.C14-1-2 DNA構(gòu)建。
實(shí)施例2構(gòu)建C14-2表達(dá)載體克隆編碼HCV抗原的DNA按下列步驟，用PCR引物5′-GAATTCGCGACCGGCTGCATTTCC-3′(SEQ ID NO∶19)CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT-3′(SEQ ID NO∶20)完成被認(rèn)為是HCV Ⅱ類(lèi)的克隆C10-14(FERM P-3426;Japanese Patent Application No.3-189，268)的PCR。將C10-14克隆DNA(1ng)加到10μl 10×PCR緩沖液(0.1M Tris-HCl(pH 8.3)，0.5M KCl)，兩處引物(各75皮摩爾)和10μl 2mM dNTPs中，并再將滅菌水加到混合物中以達(dá)到100μl的總體積。在94℃加熱10分鐘后，將1μl AmpliTaq(5個(gè)單位/μl;ex Perkin-Elmer-Cetus)加到混合物中，接著將兩滴礦物油覆蓋在混合物上。PCR條件是變性94℃1分鐘;退火55℃ 1分鐘;延伸72℃ 2分鐘;30個(gè)循環(huán)。
用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增的C14-2片段(約200bp)，將含DNA片段的凝膠在200μl滅菌水中在68℃溶解15分鐘。用TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-飽和的苯酚將溶液提取兩次以分離含DNA片段的含水層。使含水層經(jīng)乙醇沉淀以得到DNA片段沉淀，然后加入2μl的10×激酶緩沖液(0.5M Tris-HCl pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM Dtt，1mM亞精胺，1mM EDTA pH 8.0)，1μl 10mM ATP和1μl T4激酶(10個(gè)單位/μl;ex Takara Shuzo)，隨后，再向其中加入滅菌水以達(dá)到20μl的總體積。將混合物在37℃反應(yīng)1小時(shí)進(jìn)行5′末端磷酸化。在68℃加熱10分鐘使激酶失活后，將反應(yīng)混合物與pUC119(Vieira，J.and Messing，J.，Methods in Enzymology，153，3-11(1987))連接。將pUC119(1μg)，20μl限制反應(yīng)溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10個(gè)單位的Sma I酶(ex Takara Shuzo))中于37℃預(yù)先消化1小時(shí)，加入80μl滅菌水后，將反應(yīng)混合物在68℃加熱10分鐘，以便得到SmaI克隆載體溶液。在2μl10×緩沖液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM MgCl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4連接酶(350單位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl滅菌水中，于16℃使10μl磷酸化DNA片段與2μl SmaI載體的連接反應(yīng)進(jìn)行過(guò)夜。
將10μl的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。用氯化鈣方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159-0162(1970))預(yù)先制備感受態(tài)大腸桿菌菌株。
然后將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在加上50μl 2% X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)和10μl 100mM IPTG(異丙異-β-D_硫代吡喃半乳糖苷的LB-Amp盤(pán)(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%瓊脂，氨芐青霉素(25μg/ml))上在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取1鉑環(huán)盤(pán)上產(chǎn)生的白色菌落，并含25μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl)上于37℃振蕩培養(yǎng)。將1.5ml培養(yǎng)物離心，以收集細(xì)胞細(xì)胞，然后使其按堿溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制備，從而得到質(zhì)粒DNA。將得到的1μg質(zhì)粒DNA在30μl限制反應(yīng)溶液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM Nacl，7mM MgCl2，各10單位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo))中于37℃消化1小時(shí)，并將消化物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分析以確定約250bp的插入DNA片段。含插入DNA片段的克隆被稱(chēng)為pUC.C14-2。用Sanger′s雙脫氧鏈末端法(Sanger，F(xiàn).，上文)測(cè)定C14-2 DNA片段的核苷酸序列，用該方法，也可確定其推測(cè)的氨基酸序列。SEQ ID NO∶3和7分別表示了確定的氨基酸和核苷酸序列。
除用5′-GAATTCCCTGATAAGGAAATTTTA-3′(SEQ ID NO∶21)和5′-CTATTATAAGAGGCCTTGATATTTT-3′(SEQ ID NO∶22)作引物外，按上文描述的克隆方法制備含約140 bp C14-2-1 DNA片段的克隆，該克隆命名為pUC.C14-2-1。該C14-2-1 DNA片段編碼具有SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中23到63位序列的肽。
構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒用與實(shí)施例1中相似的方法，用pUC.C14-2 DNA作為起始材料構(gòu)建從中可制備約200bp EcoRI-BamHI DNA片段的表達(dá)質(zhì)粒pAT.trp.trpE.C14-2。圖2中列出了構(gòu)建過(guò)程。用相似的方法，從pUC.C14-2-1 DNA也可構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAT.trp.trpEC14-2-1。
實(shí)施例3構(gòu)建C14-2-2表達(dá)質(zhì)?？寺【幋aHCV抗原的DNA使用RT-PCR技術(shù)從慢性丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因。
首先將100μl丙型肝炎患者的血清加到200μl 6M GTC溶液(6M 硫氰酸胍，37.5mM檸檬酸鈉，0.75% Sarkosyl，0.2Mβ-巰基乙醇)和1μl酵母t-RNA(10mg/ml)中并攪拌。將20μl 3M 乙酸鈉(pH5.2)，30μl TE-飽和的苯酚(pH 7.5-8.0)和70μl氯仿/異戊醇(49∶1)迅速加到所得的混合物中，攪拌10秒鐘，并在冰上放置15分鐘。4℃以15，000rpm離心20分鐘后，移出含水層，與等體積的丙異醇混合，并在-20℃放置至少1小時(shí)，在相同的條件下再次離心后，回收沉淀，然后將其溶解在100μl 4M GTC(用滅菌水稀釋6M GTC)中，與等體異丙醇混合，并在-20℃放置至少1小時(shí)。4℃以15，000rpm離心20分鐘后，回收RNA沉淀，用70%乙醇(1ml)洗滌，室溫下空氣干燥，并溶解在10μl滅菌水中。該RNA溶液待用。
按下列步驟完成HCV cDNA合成將10μl RNA溶液放在硅酮處理的試管(0.5ml)中，在70℃加熱3分鐘，并在冰上猝冷。然后對(duì)該溶液加入1μl RNase抑制劑(50單位/μl;ex Takara Shuzo)，1μl dNTPs(各20mM)，100mM DTT，4μl 5×RT緩沖液(250mM Tris-HCl(pH 8.5)，375mM KCl，15mM MgCl2)，1μl隨機(jī)的寡六聚引物(100皮摩爾/μl)和反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)(200單位/μl)，并將滅菌水加到混合物中以達(dá)到20μl的總體積。在42℃經(jīng)2小時(shí)完成HCV cDNA合成。然后將反應(yīng)混合物在94℃加熱5分鐘以便使酶失活。
用如實(shí)施例1中所述的兩步法進(jìn)行PCR。
為了擴(kuò)增含C14-2-2區(qū)域的HCV NS4區(qū)域，參考已知序列(J.Gen.Virol.72∶2697 2704(1991))合成下列引物在第一步PCR中所用的引物5′-GGATCACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶23);和5′-CCCCAAAATGTTGAGAAGGATA-3′(SEQ ID NO∶24);
在第二步PCR中所用的引物5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′(SEQ ID NO∶);和5′-GTGCTAGTTGACAACGGACTGGT-3′(SEQID NO∶26)。
在一個(gè)0.5ml試管中，放入用于cDNA合成的20μl反應(yīng)溶液。8μl 10×PCR緩沖液(100mM Tris-HCl(pH 8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2，0 1%明膠)，兩種第一步引物(各75皮摩爾)和8μl 2mM dNTPs，然后將滅菌水加到混合物中以達(dá)到100μl的總體積。在94℃加熱10分鐘后，將1μl Ampli Taq(5單位;ex Perkin-Elmer-Cetus)邊攪拌邊加到混合物中，在粗離心，前將礦物油覆蓋在混合溶液上。PCR的條件是變性94℃1分鐘;退火55℃1分鐘;延伸72℃，2分鐘;30個(gè)循環(huán)。在一個(gè)清潔的0.5ml試管中，放入10μl PCR反應(yīng)混合物，9μl 10×PCR緩沖液，兩種第2步PCR引物(各75皮摩爾)和9μl 1mM dNTPs，并將滅菌水加到混合物中以達(dá)到100μl的總體積。在94℃加熱10分鐘后將1μl AmpliTaq(5單位)隨攪拌加到混合物中，在粗離心前，將礦物油覆蓋在混合溶液上。在與第一步PCR相同的條件下完成第二步PC。反應(yīng)后，用瓊脂糖凝膠電泳分析10μl反應(yīng)混合物，用該方法也可檢測(cè)特異性擴(kuò)增的DNA片段。
用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)PCR擴(kuò)增的C14-8 DNA片段(約700bp)，在68℃，將含DNA片段的凝膠在200μl滅菌水中溶解15分鐘。用TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-飽和的苯酚將該溶液提取兩次以分離含DNA片段的含水層。經(jīng)乙醇沉淀含水層以得到DNA片段沉淀，然后在沉淀中加入2μl 10×激酶緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM DTT，1mM亞精胺，1mM DETA pH 8.0)，1μl 10mM ATP和1μl T4激酶(10單位/μl;ex Takara Shuzo)，隨后向其中加入滅菌水以達(dá)到20μl的總體積。將混合物在37℃反應(yīng)1小時(shí)進(jìn)行5′末端磷酸化。在68℃加熱10分鐘使激酶失活后，反應(yīng)混合物與pBM(參見(jiàn)下文;Japanses Patent Application No.4.207，391申請(qǐng)日1992，7，10)連接。將pBM(1μg)在20μl限制反應(yīng)溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10個(gè)單位的SmaI酶(ex Takara Shuzo))中于37℃預(yù)先消化1小時(shí)，在加入80μl滅菌水后，將反應(yīng)混合物在68℃加熱10分鐘以得到SmaI克隆載體溶液。在2μl 10×緩沖液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM MgCl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4連接酶(350單位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl滅菌水中，于16℃過(guò)夜完成10μl磷酸化DNA片段與2μl SmaI載體的連接反應(yīng)。
可以按下列步驟構(gòu)建pBM載體用EcoRV和BalI從pB322(Sutchliffe，J.G.，Cold Spring Harbor Symposium，43，77-90(1979))中刪除EcoRV-BalI｜列(1259bp)。將pUC119多克隆位點(diǎn)(Vieria，J.and Messing，J.，Methods in Enzymology，153，3.11(1987))的EcoRI-Hind Ⅲ摻入pBR322片段的EcoRI-Hind Ⅲ中以產(chǎn)生質(zhì)?！鱬BR Mcs，其中，具有Pst Ⅰ缺失的pUC 119的VspI-ScaI序列取代了pBR322的VspI-ScaI序列，以便產(chǎn)生所需的pBM載體(3122bp)，所述的PstI存在于pBR322的VspI-ScaI中。在pBM中，存在限制位點(diǎn)PstI36，Hind Ⅲ49，Vsp I2298，ScaI2605和EcoRI3120，帶有一個(gè)氨芐青霉素抗性序列(Amp)和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(Ori)。
然后，將所得的10μl連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。用氯化銨法(Hanahan，DNA CloningA Practical approch，IRC Press(1985))預(yù)先制備感受整大腸桿菌菌株。
然后在LB-Amp平盤(pán)(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%瓊脂，氨芐青霉素(50μg/ml)上將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取一鉑環(huán)盤(pán)上產(chǎn)生的白色菌落，并在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl)上于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將1.5ml的培養(yǎng)物離心以便收集細(xì)菌細(xì)胞，按堿溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制備，得到質(zhì)粒DNA。將1μg得到的質(zhì)粒DNA在30μl反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，7mM MgCl2，各10個(gè)單位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo))中于37℃消化1小時(shí)，將消化物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分析以確定約700bp的插入DNA片段。將含插入DNA片段的克隆命名為p C14-8。用Sanger′s雙脫氧鏈末端方測(cè)定C14-8 DNA片段的核苷酸序列，用該方法也可以確定其推測(cè)的氨基酸序列。在SEQ ID NO∶9中列出了確定的氨基酸和核苷酸序列。
為了從C14-8 DNA制備C14-2-2DNA片段，除使用下列引物外，按與上述相同的方法完成PCR5′-GCGAATTCGCGACCGGGTGTGTTTCCAT-3′(SEQ ID NO∶27);和5′-TCATTAGAACTGCTCCACCTTGGGCCA-3′(SEQ ID NO∶28)。
在50μl的總體積中，將1ng作為模板的Cl4-8 DNA與各50皮摩爾的上述引物、67mM Tris-HCl(pH 8.8)、16.6mM(NH4)2SO4、0.2mM dNTPs;2mM MgCl2;0.2mg/ml明膠;及0.05%Triton x-100混合，然后再將25單位的Taq DNA聚合酶加到混合物中。覆蓋了石蠟油后，進(jìn)行PCR(94℃30秒，55℃60秒，72℃120秒，30個(gè)循環(huán))。將反應(yīng)混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離一個(gè)約260bp片段，隨后用Glass粉法(Gene Clean Ⅱ;ex BIO101將該片段回收到TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA)中。將3μl 10×T4緩沖液(0.5M Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，100mM DTT)，3μl 2mM dNTPs，和3μl ATP加到回收的DNA溶液(25μl)中，然后，再將5個(gè)單位的DNA聚合酶Ⅰ(ex New England Biolab)和10個(gè)單位的T4多核苷酸激酶(ex Takara Shuzo)加到混合物中以便在37℃反應(yīng)1小時(shí)。用Glass粉法將所需的DNA片段回收到25μl TE溶液中。
另一方面，將1μg pUC118(Vieira，J.，上文)在20μl限制系統(tǒng)(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，7mM MgCl2，20mM KCl，10個(gè)單位的SmaI)中，于37℃通過(guò)限制反應(yīng)進(jìn)行裂解1小時(shí)。將10μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)，70μl滅菌水和2個(gè)單位細(xì)胞堿性磷酸酶(ex Takara Shuzo)加到反應(yīng)混合物中以便在68℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，用酚/氯仿提取溶液中的DNA，然后用乙醇沉淀。將回收的DNA(10μl)溶解在10ml TE緩沖液后，將1μl溶液與10μl上述的PCR DNA片段混合，然后向其中加入50μl Ligation液A和10μl Ligation液B(DNA Ligation Kit;ex Takara Shuzo)，混合均勻以便在16℃反應(yīng)1小時(shí)。按Hanahan′s方法(Hanahan，同上文)，將10μl所得的DNA溶液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-blue(ex Stratagene)中。
從所得的克隆中回收重組質(zhì)粒DNA。然后，按循環(huán)定序法(參見(jiàn)Technical manual made by Applied Biosystems)，使1.5μg質(zhì)粒DNA在M13RP1引物(ex Applied Biosystems)或-21M13引物(ex Ammlied Biosystems)存在的情況下反應(yīng)。在DNA Sequencer Meddl 370A(versionl.30;ex Applied Biosystems)上分析反應(yīng)產(chǎn)物以確定其SEQ ID NO∶8所示的核苷酸序列。該DNA片段(C14-2-2)編碼具有SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列的肽。
構(gòu)建表達(dá)載體
在20μl限制溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCL，7mM MgCl2，各10個(gè)單位的EcoRI和SalI(ex Takara SHuzo))中，將1μg pUC.C14-2-2 DNA在37℃消化1小時(shí)，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和Glass粉法以純化所需的DNA。另一方面，在相同的條件下處理1μg的表達(dá)載體pAT.trp.trpE DNA(JP-A-1-215，289)以得到載體DNA片段。將所得的EcoRI-SalI處理的載體DNA(1μg)與上述制備的C14-2-2 DNA片段用DNA連接藥盒(ex Takara Shuzo)按制造商說(shuō)明的方法，在16℃連接1小時(shí)。
將所得的10μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株C600中。用Hanahan′s方法(Hanahan，同上文)制備用于轉(zhuǎn)化的感受大腸桿菌菌株。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞放在含50μg/ml氨芐青霉素的LB盤(pán)(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%瓊脂)上，在37℃過(guò)夜貯存。挑取-鉑環(huán)盤(pán)上產(chǎn)生的菌落并在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將所得的培養(yǎng)物(1.5ml)離心以收集細(xì)菌細(xì)胞，并用堿溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制備質(zhì)粒DNA。
用EcoRI和SalI雙重消化所得的DNA(1μg)。并在消化物中篩選可產(chǎn)生一個(gè)約260bp EclRI-SalI片段的表達(dá)質(zhì)粒pAT.trp.trpE C14-2-2。
實(shí)施例4表達(dá)并純化由C14-1，C14-1-2，C14-2，C14-2-1，和C14-2-2DNA片段編碼的肽將攜帶各5個(gè)在實(shí)施例1到3中構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌C600細(xì)胞接種到含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，并在其中，于37℃進(jìn)行次培養(yǎng)過(guò)夜。將該培養(yǎng)物再接種到4升的M9-CA培養(yǎng)基(0.6% Na2HPO4，0.5%KH2PO4，0.5%NaCl，0.1%NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mM MgSO4，0.5%酪蛋白氨基酸，0.2%葡萄糖)上并于37℃培養(yǎng)。當(dāng)OD600達(dá)到0.3時(shí)，將吲哚丙烯酸加到培養(yǎng)中以達(dá)到40ml/l的最終濃度，并再繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，離心該培養(yǎng)的收集12克菌細(xì)胞。將60ml的溶解緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，30mM NaCl，5mM EDTA)加到細(xì)胞中，然后將12mg的溶菌酶(ex Seikagaku Kogyo KK)加到混合物中以便在37℃反應(yīng)1小時(shí)。聲處理150秒破碎了大腸桿菌細(xì)胞后，在4℃，以15，000rpm經(jīng)15分鐘完成離心以分離含融合肽的不可溶部分，所述融合肽由所需DNA和trepE編碼的肽組成。將55ml溶解緩沖液(4M脲，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1%NP-40)加到該部分，以便提取融合肽。
將脲和DTT加到提取物中，使其分別達(dá)到6M和50mM的最終濃度。在4℃放置至少1小時(shí)后，將混合物用于，用含6M脲和5mM DTT的50mM Tris-HCl(pH 8.5)平衡的Mono柱(ex Pharmacia)。然后用OM到0.2M的梯度NaCl從柱上洗脫所需的肽。收集洗脫的部分，并將其用于用含6M脲，0.15M NaCl和5mM DTT的50mM Tris-HCl(pH 85)平衡的HiLoad Superdex75pg柱(ex Pharmacia)以純化融合肽。
用上述方法，可得到下列物質(zhì)trp.C14-1(Mr.約8KDa);trpE.C14-1-2(Mr.約11KDa);trpE.C14-2(Mr.約10KDa);trpE.C14-2-1(Mr.約6KDa);和trpE.C14-2-2(Mr.約11KDa)實(shí)施例5制備C14-1，C14-1-2，C14-2和
C14-2-2肽片段按Fast Moc系統(tǒng)的附加說(shuō)明，用Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A(ex Applied Biosystems)合成肽片段。合成結(jié)束時(shí)，用常規(guī)方法完成去保護(hù)作用和去樹(shù)脂，接著用HPLC純化肽片段。
收集所需的峰值部分，并用氨基酸分析儀JLC-300(ex JEOL LTD)分析其氨基酸內(nèi)含物或用蛋白質(zhì)測(cè)序儀Model 477A(ex Applied Biosystems)分析氨基酸序列以便確認(rèn)是所需的肽。
實(shí)施例6檢測(cè)丙型肝炎患者血清中的HCV抗體(ⅰ)用Western印跡分析檢測(cè)HCV抗體使表達(dá)的肽trpE.C14-2(1μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Laemmli，Nature 227，680(1970))，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾器(ex Bio-Rad)上。將濾器在阻斷溶液(4% Block-Ace(ex Snow Brand Nilk Products Co.)，2%BSA，0.1M磷酸鈉(PH7.4))中室溫下浸1小時(shí)。此后，將濾器上的肽與健康人和丙型肝炎患者的血清(以1/100稀釋的)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，0.05% Tween-20)洗滌濾器后，使濾器與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-人IgG(以1/1000稀釋的)在室溫反應(yīng)30分鐘。再次洗滌后，將濾器浸在二氨基聯(lián)苯胺(作為底物)溶液中。一旦發(fā)生了顏色顯色，將濾器浸在純水中停止反應(yīng)。
如圖3所示，表達(dá)的肽與患者的血清強(qiáng)烈反應(yīng)，但與健康人的血清不反應(yīng)，因此，在Western印跡濾器上可將肽檢測(cè)為特異性的帶。
(ⅱ)用酶-免疫檢測(cè)(ELISA)(A)鑒別HCV類(lèi)型通過(guò)使用融合肽trpE.C14-1，trpE.C14-1-2，trpE.C14-2，trpE.C14-2-1和trpE.C14-2-2進(jìn)行ELISA來(lái)檢測(cè)日本慢性丙型肝炎患者各種血清的HCV類(lèi)型。以常規(guī)方法按如下步驟完成ELISA用含8M脲的0.1M磷酸緩沖液(pH 7.5)稀釋純化的抗原使成為5μg/ml的最終濃度。然后在4℃或室溫，將其固定在微量培養(yǎng)板上。用洗滌溶液洗滌數(shù)次后，將檢測(cè)的血清放在盤(pán)上的孔中，并在30℃或室溫培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌后，將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗一人IgG(小鼠單克隆抗體)加到每個(gè)孔中以便在30℃或室溫下反應(yīng)。將盤(pán)洗滌數(shù)次，接著加入50μl的正苯二胺溶液使其在37℃發(fā)生變色反應(yīng)。隨后加入2M H2SO4停止顏色的加深并用比色器確定其在492nm的吸收值。同時(shí)，用相同方法測(cè)定作為對(duì)照的健康人血清，并用市場(chǎng)上可購(gòu)到的Chiron藥盒C10-3(ex Ortho)作對(duì)比。在表1，2，3和4中列出了結(jié)果。
表1，2，3和4表明，融合肽trpE.C14-1和trpE.C14-1-2都可以特異性地認(rèn)別HCV Ⅰ類(lèi)的抗體，而融合肽trpE.C14-2，trpE.C14-2-1和trpE.C14-2-2可特異性認(rèn)別HCV Ⅱ類(lèi)抗體。另外，結(jié)果說(shuō)明，若C14-1和/或C14-1-2肽與C14-2和/或C142-1和/或C14-2-2肽結(jié)合在一起使用時(shí)，在確定丙型肝炎患者是否僅僅感染上HCV Ⅰ類(lèi)或HCV Ⅱ類(lèi)還是HCV Ⅰ和Ⅱ類(lèi)均被感染時(shí)，所用的肽是很有用的。
表1樣品NO. trpE. C14-2 Chiron Kit(C100-3)(Ⅱ類(lèi)) (Ⅰ類(lèi))1 + -2 + -3 + -4 + -5 - +6 + -7 - +8 + -9 - +10 + -11 + -12 - +13 - +14 - +15 - +陰性對(duì)照 - -
表2樣品NO. trpE. C14-2-1 trpE. C14-2(Ⅱ類(lèi)) (Ⅱ類(lèi))16 + +17 - -18 + +19 - -20 - -21 + +22 - -23 - -24 - -25 - -26 + +27 - -陰性對(duì)照 - -
表3樣品NO. trpE. C14-1 trpE. C14-2(Ⅰ類(lèi)) (Ⅱ類(lèi))28 - +29 + -30 + -31 + -32 + -33 + -34 + -35 + -36 + -37 - +38 + -39 + -40 - +41 + -42 - +43 + -44 + -45 + -46 + +47 - -陰性對(duì)照 - -
(ⅲ)用ELISA(B)鑒別HCV類(lèi)型通過(guò)使用trpE.C14-1，trpE.C14-2-2，和(實(shí)施例5中制備的)C14-1，C14-1-2，C14-2和C14-2-2肽片段(1-Y，1-Z，1-B，2-B和2-Z)進(jìn)行ELISA，檢測(cè)日本慢性丙型肝炎患者各種血清的HCV類(lèi)型。
用與上文相同的方法，將trpE.C14-1-2或trpE.C14-2-2預(yù)先固定在微量培養(yǎng)板的小孔中。將20μl樣品與20μl實(shí)施例5中合成的各種肽(0 1mg/ml)混合，在室溫放1小時(shí)。將200μl稀釋的樣品加到肽溶液中，然后放置在盤(pán)的小孔中。于30℃反應(yīng)1小時(shí)，接著洗滌后，將盤(pán)與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗一人IgG(小鼠單克隆抗體)在30℃反應(yīng)1小時(shí)。洗滌后，將正-苯二胺溶液加到反應(yīng)混合物中，在30℃反應(yīng)1小時(shí)。加入1M硫酸停止反應(yīng)，用比色器，在492nm確定顏色顯現(xiàn)的吸收值。在免疫反應(yīng)中，使用市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)的HCV診斷劑“Immucheck-HCV”(ex International Reageuts Corporation)作為對(duì)比。
在表5、6和7中列出了結(jié)果。
從與trpE.C14-1-2的反應(yīng)結(jié)果，可以看出表5中所述的全部樣品屬于HCV Ⅰ類(lèi)這一事實(shí)，表5也說(shuō)明，加入在實(shí)施例5中制備的具有HCV Ⅰ類(lèi)序列的肽可以抑制樣品與trpE.C14-1-2的反應(yīng)。從與trpE.C14-2-2的反應(yīng)結(jié)果，可以看出表7中所述的全部樣品屬于HCV Ⅱ類(lèi)這一事實(shí)，表7也說(shuō)明加入在實(shí)施例5中制備的具有HCV Ⅱ類(lèi)序列的肽可以抑制樣品與trpE.C14-2-2的反應(yīng)，此外，從與trpE.C14-1-2或trpE C14-2-2的反應(yīng)結(jié)果可以看出表6中所述的全部樣品屬于HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)這一事實(shí)，且表6也說(shuō)明，加入在實(shí)施例5中制備的具有HCV Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)序列的肽可抑制樣品與trpE.C14-1-2或C14-2-2的反應(yīng)。
因此，發(fā)現(xiàn)trpE.C14-1-2或trpE.C14-2-2可特異性地與抗-HCV抗體反應(yīng)，還發(fā)現(xiàn)用實(shí)施例5中制備的肽片段，通過(guò)檢測(cè)trpE C14-1-2或trpE.C14-2-2與抗-HCV抗體免疫反應(yīng)的抑制，人們可以確定患者是否只感染上HCV Ⅰ類(lèi)或HCV Ⅱ類(lèi)還是已HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)均已感染。因此，該肽片段也可用于鑒別HCV類(lèi)型。相反，象在表5、6和7中所見(jiàn)到的，用Immucheck-HCV鑒別這些類(lèi)型很困難。
1)COI中斷指示(Cur off ind ex) 2)1-Y＝Z1-Y和1-Z抑制抗-HCV抗體與trpE.C14-1-2的反應(yīng)到相同的程度。
3)1-Z＞B＞Y1-Z，1-B和1-Y按1-Z1-B＞1-Y的順序抑制反應(yīng)。
4)1-Z＝B∶1-Z和1-B抑制所述反應(yīng)到相同的程度。
表6COI1)在492nm的吸收值樣品No. ImmuchektrpE. trpE.
HCV 抑制肽 抑制肽C14-1-2 C14-2-2CH11 7.72< 3.000< (1-Z) 3.000< (2-B>Y)3)CH36 7.72< 3.000< (1-Y) 3.000< (2-Y)LC66 7.72< 2.995 (1-Z) 2.559 (2-Y)HCC88 7.72< 1.088 (1-Z) 0.833 (2-Y>Z>X)4)LC13 7.72< 2.800 (1-Z=Y)2)2.081 (2-Y)CH82 7.72< 2.961 (1-Y) 0.761 (2-Y=B)HCC71 7.72< 2.559 (1-Z) 0.748 (2-B)HCC93 7.72< 3.000< (1-Y) 0.495 (2-B)LC71 7.72< 1.967 (1-Y) 2.363 (2-Y=B)
1)COI中斷指示2)2-Z＝B2-Z和2-B抑制抗-HCV抗體與trpE C14-1-2的反應(yīng)到相同的程度。
3)Z-B＞YZ-B和Z-Y按2-B＞2-Y的順序抑制抗-HCV抗體與trpE.C14-2-2的反應(yīng)。
4)2-Y＞Z＞X2-Y，2-Z和2-X按2-Y＞2-Z＞2-X的順序抑制所述反應(yīng)。
5)2-Y＝B2-Y和2-B抑制所述反應(yīng)到相同的程度。
表7COI1)在492nm的吸收值樣品No. Immuchek trpE.
trpE. C14-2-2 抑制肽HCV C14-2-2CH20 7.72< 0.128 3.000< (2-Z=B)2)IC69 7.72< 0.098 3.000< (2-B)HCC51 7.72< 0.027 2.978 (2-Y)1)COI中斷指示2)2-Z＝B2-Z和2-B抑制抗-HCV抗體與trpE.C14-2-2的反應(yīng)到相同的程度。
(ⅳ)用ELISA(C)鑒別HCV類(lèi)型將實(shí)施例5中制備的肽片段(1-Z，1-Y)固定在微量培養(yǎng)板的小孔中。將丙型肝炎患者的血清加到每個(gè)孔中。用與(ⅱ)中相同的方法反應(yīng)后，測(cè)定在492nm的吸收值。在表8中列出了結(jié)果。如在表中見(jiàn)到的，用肽片段如1-Z和1-Y可以完成HCV的分類(lèi)。然而，只與“Z”或“Y”反應(yīng)的樣品說(shuō)明，肽片段最好是一種至少兩種肽已被組合或與另一種結(jié)合的肽。
表8血清No 抑制肽 反應(yīng)肽 C14-1-220 1-Z 1-Y +25 1-Y 1-Y +26 1-Z 1-Y,1-Z +28 1-Z 1-Z +30 1-Y 1-Y +實(shí)施例7制備藥盒用含8M脲的磷酸緩沖液逐一稀釋純化的抗原(如Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi))以達(dá)到5μg/ml的最終濃度。將各個(gè)稀釋溶液以每孔100μl的量放在不同的板，并在4℃放置過(guò)夜。將溶液從板中輕輕倒出，并將阻斷溶液(300μl/孔)放在板上的孔中，接著在室溫放2小時(shí)。將溶液輕輕倒出后，洗滌小孔，然后冷凍干燥。將每個(gè)冷凍干燥的平板(如Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi))放在不同袋或盒中，密封，包裝在盒中形成藥盒，在4℃貯藏。在藥盒中，在不同容器(如瓶或小瓶)放下列試劑預(yù)先確定的能與HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)分別發(fā)生特異性反應(yīng)的陽(yáng)性血清;稀釋檢測(cè)樣品血清的稀釋液;洗滌液;酶標(biāo)記的抗人IgG小鼠單克隆抗體;和顯色液。
實(shí)施例8干擾素(IFN)-治療效果與用RT-PCR鑒別HCV類(lèi)型的關(guān)系用一組可特異性分別檢測(cè)HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)的引物，分析IFN-治療效果與用RT-PCR鑒別HCV類(lèi)型的關(guān)系，如下將100μl丙型肝炎患者的血清與300μl6M GTC溶液(6M，硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，0.5%Sarkosgl，0.2Mβ-巰基乙醇)混合。再將40μl 2M乙酸鈉(pH 5.2)，400μl苯酚和80μl氯仿/異戊醇(49∶1)邊攪拌邊加到混合物中。移出含水層，然后向其中加入異丙醇，并離心以產(chǎn)生用于cDNA合成的RNA沉淀。在含RNA沉淀的反應(yīng)混合物(10mM Tris-HCl，0.01%明膠，1mM DTT，100皮摩爾引物)中，RNase抑制劑和反轉(zhuǎn)錄酶存在的條件下，在37℃經(jīng)2小時(shí)完成cDNA合成。得到的cDNA用于兩步PCR。
按下列步驟進(jìn)行PCR將10mM Tris-HCl，0.01%明膠，各2mM dNTPs，1.5mM MgCl2和引物(各50皮摩爾;見(jiàn)下文)加到上述制備的100μl反應(yīng)混合物(含cDNA)中。所用的PCR條件是變性94℃，1.5分鐘;退火50℃，2分鐘;延伸70℃，2分鐘;35個(gè)循環(huán)。至于檢測(cè)用引物，下列四種引物能檢測(cè)HCV Ⅱ類(lèi)特異性的20bp DNA片段第1步PCR中所用的引物KK215′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶29);和KK225′-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3′(SEQ ID NO∶30);
第2步PCR中所用的引物KK265′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′(SEQ ID NO∶31);和KK27∶5′-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3′(SEQ ID NO∶32)。
另一方面，可以用下列四種引物檢測(cè)HCV Ⅰ類(lèi)特異性的153bp DNA片段
第1步中所用的引物KK15′-GGCTATACCGGCGACTTCGA-3′(SEQ ID NO∶33);和KK25′-GACATGCATGTCATGATGTA-3′(SEQ ID NO∶34);
第2步中所用的引物KK55′-GATCGACTGTAACACATGTG-3′(SEQ ID NO∶35);和KK85′-CACATTTGATCCCACGATGG-3′(SEQ ID NO∶36)。
在表9中列出了結(jié)果。該表說(shuō)明，占78%的9個(gè)患者的血清屬于Ⅱ類(lèi)，這些患者有驚人的IFN效果，而另外22%屬于Ⅰ類(lèi)，因此，有IFN治療效果的大部分患者已感染上HCV Ⅱ類(lèi)。
如在上述實(shí)施例中所見(jiàn)到的，可用抗原肽或含本發(fā)明抗原肽的藥盒確定丙型肝炎患者是否僅感染HCV Ⅰ燈或HCV Ⅱ類(lèi)還是HCV Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)均已感染了(即混合感染)。如果發(fā)現(xiàn)患者感染HCV Ⅱ類(lèi)，則以IFN治療對(duì)抗HCV Ⅱ類(lèi)特別有效這一事實(shí)為基礎(chǔ)，患者可以有效地接受早期的IFN治療。本發(fā)明的肽和藥盒也可用于診斷HCV感染。
表9丙型肝炎 IRN治療 分類(lèi)結(jié)果患者No 效果1 ME) I2 ME II3 ME I4 ME II5 ME II6 ME II7 暫時(shí)的 I8 暫時(shí)的 I9 暫時(shí)的 II10 暫時(shí)的 I11 暫時(shí)的 I12 無(wú)效 I13 無(wú)效 I14 無(wú)效 I15 無(wú)效 I16 無(wú)效 I17 暫時(shí)的 I18 無(wú)效 I19 無(wú)效 I20 ME II21 無(wú)效 I22 無(wú)效 I23 ME II24 ME II25 暫時(shí)的 I1)ME驚人的效果序列目錄
SEQ ID NO∶1序列長(zhǎng)度63序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型肽
SEQ ID NO∶2序列長(zhǎng)度87序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型肽
SEQ ID NO∶3序列長(zhǎng)度63序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)果線性分子類(lèi)型肽
SEQ ID NO∶4序列長(zhǎng)度87序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型肽
SEQ ID NO∶5序列長(zhǎng)度189序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型cDNA到基因組RNA
SEQ ID NO∶6序列長(zhǎng)度267序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型cDNA到基因組RNA
SEQ ID NO∶7序列長(zhǎng)度189序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型cDNA到基因組RNA
SEQ ID NO∶8序列長(zhǎng)度261序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型cDNA到基因組RNA
SEQ ID NO∶9序列長(zhǎng)度667序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型cDNA到基因組RNA
SEQ ID NO∶10序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型AGGTCGTCACTAGCACCTGGGTGC 24SEQ ID NO∶11序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型TGTATCCCGCTGATGAAGTTCCAC 24SEQ ID NO∶12序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GAATTCACGACAGGCAGCGTGGTC 24SEQ ID NO∶13序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型CTATTACAGCAATCCGAGCGCCCT 24SEQ ID NO∶14序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GGCTATACCGGTGACTTTGA 20SEQ ID NO∶15序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線笥分子類(lèi)型GTCTCAGCTCCCTTCCGATC 20SEQ ID NO∶16序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈撲結(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GATCTACTGCTAACACATGTGTCA 24SEQ ID NO∶17序列長(zhǎng)度29序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GCGAATTCACAACAGGCAGTGTGGTCATT 29SEQ ID NO∶18序列長(zhǎng)度29序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GCTCATTAGAAGGTCTCAAGGGCTCGCCA 29SEQ ID NO∶19序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GAATTCGCGACCGGCTGCATTTCC 24SEQ ID NO∶20序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT 24SEQ ID NO∶21
序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GAATTCCCTGATAAGGAAATTTTA 24SEQ ID NO∶22序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT 24SEQ ID NO∶23序列長(zhǎng)度19序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GGATCACCGGTGACTTTGA 19
SEQ ID NO∶24序列長(zhǎng)度22序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型CCCCAAAATGTTGAGAAGGATA 22SEQ ID NO∶25序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GATGCCCACTTCCTCTCCCA 20SEQ ID NO∶26序列長(zhǎng)度23序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GTGCTAGTTGACAACGGACTGGT 23
SEQ ID NO∶27序列長(zhǎng)度28序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GCGAATTCGCGACCGGGTGTGTTTCCAT 28SEQ ID NO∶28序列長(zhǎng)度28序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型TCATTAGAACTGCTCCACCTTGGGCCA 28SEQ ID NO∶29序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型
GGATACACCGGTGACTTTGA 20SEQ ID NO∶30序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型TGCATGCACGTGGCGATGAT 20SEQ ID NO∶31序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GATGCCCACTTCCTCTCCCA 20SEQ ID NO∶32序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GTCAGGGTAACCTCGTTGGT 20
SEQ ID NO∶33序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GGCTATACCGGCGACTTCGA 20SEQ ID NO∶34序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GACATGCATGTCATGATGTA 20SEQ ID NO∶35序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型GATCGACTGTAACACATGTG 20
SEQ ID NO∶36序列長(zhǎng)度20序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型CACATTTGATCCCACGATGG 20
權(quán)利要求
1.一種具有SEQIDNO∶1或SEQIDNO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原肽，其中，部分序列選自SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其組合，或SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74粒氨基酸和其組合。
3.一種具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的抗原肽，其中，部分序列選自SEQ ID NO3所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸及其組合，或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸及其組合。
5.一種鑒別丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法，包括將權(quán)利要求1的抗原肽與假設(shè)含丙型肝炎病毒抗體的樣品接觸，以完成免疫反應(yīng);和檢測(cè)為陽(yáng)性的抗屬于Ⅰ類(lèi)的丙型肝炎病毒抗體。
6.一種鑒別丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法，包括將權(quán)利要求3的抗原肽與假設(shè)含丙型肝炎病毒抗體的樣品接觸，以完成免疫反應(yīng);和檢測(cè)作為陽(yáng)性的抗屬于Ⅱ類(lèi)的丙型肝炎病毒抗體。
7.一種鑒別丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)的藥盒，它含有在分開(kāi)的部分內(nèi)的至少一種第一抗原肽，和與所述肽有相同功能的肽變異體，所述肽選自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的肽;以及至少一種第二抗原肽和與所述肽有相同功能的肽變異體，所述肽選自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)發(fā)生特異性反應(yīng)的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥盒，其中，部分序列選自SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其組合;SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸和其組合;SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其組合;SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸和其組合。
9.一種鑒別丙型肝炎病毒類(lèi)型的方法，包括將至少一種第一肽和與所述第一肽有相同功能的肽變異體以及至少一種第二肽和與所述第二肽有相同功能的肽變異體與假設(shè)含丙型肝炎病毒抗體的樣品接觸，以便用免疫反應(yīng)，在權(quán)利要求7中所定義的藥盒中包括的第一和第二肽定量或定性地確定抗體;所述的第一肽選自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的肽，所述第二肽選自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能與抗丙型肝炎病毒Ⅱ類(lèi)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的肽;和檢測(cè)丙型肝炎病毒Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種NS4-相關(guān)的，與抗丙型肝炎病毒HCVI類(lèi)的抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽；涉及一種NS4-相關(guān)的，與抗HCVII類(lèi)的抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原肽；涉及一種在分開(kāi)的部分含所述肽的，用于鑒別HCVI類(lèi)或II類(lèi)的藥盒；涉及鑒別HCV類(lèi)型的方法。本發(fā)明的肽可用于特異性檢測(cè)HCVI類(lèi)或II類(lèi)以及檢測(cè)混合感染的患者。用這種方法，可以使HCVII類(lèi)——感染的患者得到早期有效的干擾素治療。所述肽也可用于診斷HCV感染。
文檔編號(hào)C07K14/18GK1087915SQ9311689
公開(kāi)日1994年6月15日 申請(qǐng)日期1993年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月16日
發(fā)明者長(zhǎng)谷川明, 槙升, 八木慎太郎, 柏熊富子, 山口健次郎, 池口尚子, 小林倫子, 妹尾千晶 申請(qǐng)人:東燃株式會(huì)社