專利名稱：修飾的血小板因子-4的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)人血小板因子-4的一種新的N-末端區(qū)域的加工形式，即下文的修飾的血小板因子-4(MPF-4)。本發(fā)明也包括一種經(jīng)蛋白質(zhì)水解裂解、非還原形式的血小板因子-4，即下文的裂解血小板因子-4(CPF-4)。從脂多糖刺激的外周血白細(xì)胞耗盡的培養(yǎng)基中可分離到MPF-4和CPF-4。
經(jīng)氨基酸測(cè)序揭示了MPF-4與以Ser-17開(kāi)始的血小板因子-4(PF-4)同源，因而推斷MPF-4是PF-4的一種自然發(fā)生的裂解產(chǎn)物。CPF-4具有與PF-4相同的氨酸酸順序，但因在16與17殘基間的肽鍵不存在而不同。然而，產(chǎn)生的兩個(gè)肽仍通過(guò)二硫橋鍵合。最有意義地是，本發(fā)明的化合物是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有效抑制因子，并且無(wú)論怎樣都比天然的PF-4活性高出10-100倍，這有賴于PF-4來(lái)源及報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室。
PF-4是正在擴(kuò)大的小的可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組成的家族的一個(gè)原型成員，當(dāng)用有絲分裂原或細(xì)胞因子刺激后可從各種各樣的細(xì)胞型中釋放出來(lái)。這個(gè)蛋白質(zhì)家族，被認(rèn)為是“intercrines”，發(fā)現(xiàn)它調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程，例如血管生成、細(xì)胞增殖、凝結(jié)、炎癥和組織修復(fù)。參見(jiàn)Oppenheim等，《新的前炎癥超基團(tuán)“intercrine”胞質(zhì)族的性質(zhì)》，Ann.Rev.Immunol.9617-648，1991;Taylar等，《精氨酸為血管生成的抑制劑》，Nature 297307-312，1982;以及Maione等，《由重組人血小板因子-4和相關(guān)肽抑制血管生成》，Science 24777-79，1990)。
intercrine家族的其它成員包含白細(xì)胞介素-8(IL-8)、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)刺激活性(hGro/MGSA)、β-血栓球蛋白(β-TG)、中性白細(xì)胞激活蛋白(NAP-2)、IP-10和巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-2)。參見(jiàn)Lindley等，《基團(tuán)編碼的單核細(xì)胞衍生的中性白細(xì)胞激活因子在大腸桿菌中的合成和表達(dá)天然的和重組的中性白細(xì)胞激活因子之間的生物等價(jià)性》，Proc.Natl.Acad.Sci.859199-9203，1988;Walz等，《在受刺激的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中形成的β-血栓珠蛋白的新的裂解產(chǎn)物激活人中性白細(xì)胞》，Biochem.Biophys.Res.Commun.159969-975，1989;Luster等，《γ-干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)含同源性的基因?qū)ρ“宓鞍踪|(zhì)的早期反應(yīng)》，Nature315672-676，1985;以及Wolpe等，《巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)2的識(shí)別和表征》，Proc.Natl.Acad.Sci.86612-616，1989)。
PF-4完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是熟知的(Poncz等，《由人紅白血病細(xì)胞系衍生的血小板因子-4 cDNA的克隆和表征》，Blood69219-223，1987)。PF-4的類似物和片段也是熟知的，并在美國(guó)專利4，545，828和4，737，580中稱作“制瘤素-A”，在此引用作為參考。研究顯示了intercrine蛋白家族在N-末端區(qū)域含有特征的半胱氨酰-X-半胱氨酸(CXC)基元。CXC基元通過(guò)與Cys-36和Cys-51殘基形成分子內(nèi)二硫鍵參與產(chǎn)生天然PF-4的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)(St.Charles等，《牛血小板因子-4的三維結(jié)構(gòu)在3.0-A的分辨》，J.Biol.chem.2642092-2098，1989)。
再者，基于公布的牛PF-4三維結(jié)構(gòu)，確定了N-末端Gln-9到Val-19殘基形成一個(gè)巨大的開(kāi)環(huán)，Thr-16與Cys-51以氫鍵締合。這些N-末端結(jié)構(gòu)已表明對(duì)PF-4的免疫調(diào)節(jié)活性是重要的。(Katz等，《血小板因子-4的蛋白酶誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)活性》，Proc.Natl.Acad.Sci.833491-3495，1986)。
雖然PF-4主要在血小板的α-粒中發(fā)現(xiàn)，但是基因組克隆揭示了這樣一個(gè)事實(shí)，即產(chǎn)生不同形式的PF-4(即PF-4 varI和PF-4alt)的人PF-4基團(tuán)的復(fù)制(Doi等，《大白鼠血小板因子-4基因結(jié)構(gòu)巨核型分辨標(biāo)記》，Mol.Cell Biol.7898-912，1987)。變異體的推斷氨基酸序列顯示在N-末端先導(dǎo)序列和C-末端富賴氨酸結(jié)構(gòu)域存在重要差別(Green等，《人血小板因子-4的基因變異體，PF4var 1的識(shí)別和表征》，Mol.Cell.Biol.91445-1451，1989;Eisman等，《人血小板因子4和PF4alt的基因結(jié)構(gòu)和功能比較》，Blood 76336-344，1990)。先導(dǎo)序列的變化提示其分泌方式和表達(dá)的組織類型所在有區(qū)別。因此，PF-4的替代品形式也可能是由細(xì)胞產(chǎn)生的而非血小板。
人們也公認(rèn)PF-4富含賴氨酸的C-末端區(qū)域與肝素和有關(guān)的氨基葡聚糖牢固結(jié)合(Rucinski等《人血小板因子4及其C-末端肽肝素結(jié)合和從循環(huán)中清除》，Thrombos.Haemostas.63493-498，1990)。
PF-4的突變形式已被公開(kāi)作為利用突變體來(lái)治療血管形成的疾病。見(jiàn)美國(guó)專利5，086，164和5，112，946，在此引用作為參考。這些專利揭示PF-4 C-末端區(qū)域的修飾而產(chǎn)生的類似物再也沒(méi)有結(jié)合肝素的能力。本發(fā)明公開(kāi)PF-4的加工后形式MPF-4及CPF-4。
本發(fā)明包含MPF-4成份和CPF-4成份，MPF-4實(shí)質(zhì)上由具有序列SEQ.ID.No1氨基酸順序的一種蛋白質(zhì)組成，CPF-4實(shí)質(zhì)上由具有序列SEQ ID No1的氨基酸順序的蛋白質(zhì)與具有序列SEQ.ID.No2的氨基酸順序的蛋白質(zhì)以二硫鍵鍵合的蛋白質(zhì)組成。CPF-4的兩條蛋白質(zhì)鏈?zhǔn)怯蒘EQ.ID.No1的Cys-20與SEQ.ID.No2的Cys-10以及SEQ.ID.No1的Cys-36與SEQ.ID.No2的Cys-12以二硫鍵連接。本發(fā)明還包含純化MPF-4及CPF-4的方法，包括反相色譜法→肝素親合層析色譜法→反相色譜法。此外，服用抑制劑量的MPF-4及CPF-4以阻止血管形成的方法也是權(quán)利要求的。編碼MPF-4和CPF-4的最終重組DNA化合物也包含在本發(fā)明中，它們是包含這些重組DNA化合物的載體和宿主細(xì)胞。


圖1是一個(gè)濃度效應(yīng)曲線，表示MPF-4、CPF-4及PF-4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。
MPF-4是一個(gè)由54個(gè)氨基酸殘基組成的自然存在的蛋白質(zhì)，由SDS-PAGE測(cè)得其分子量約為七千道爾頓。MPF-4與PF-4C-端的54個(gè)殘基100%同源，因而被認(rèn)為是PF-4的一種加工形式。在SEQ.ID.No1中陳述了MPF-4的氨基酸順序。
CPF-4是一個(gè)天然存在的蛋白質(zhì)，由一條含16個(gè)氨基酸鏈(SEQ.ID.No2)和一條MPF-4的54個(gè)氨基酸鏈(SEQ.ID.No1)組成。CPF-4由SDS-PAGE測(cè)得分子量約為7.8-8.0千道爾頓。CPF-4的兩條蛋白鏈在SEQ.ID.No1的Cys-20和SEQ.ID No2的Cys-10間二硫鍵合，另一個(gè)二硫鍵橋在SEQ.ID.No1的Cys-36和SEQ.ID.No2的Cys-12之間。
普通的熟練技術(shù)人員會(huì)明白對(duì)這些序列作一些保守氨基酸的替換而不會(huì)對(duì)本發(fā)明造成有害的影響。保守氨基酸替換包括Gly和Ala間、Asp和Glu間、Asu和Glu間、Phe和Tyr間和Lys和Arg間的替換。
與親本蛋白相似，MPF-4與CPF-4都與肝素結(jié)合并抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，這使它們成為用于治療血管形成的及細(xì)胞增殖的疾病的有吸引力的候選者。肝素結(jié)合區(qū)域認(rèn)為是SEQ.ID.No1的Lys-45到Lys-50。
給予在此公布的序列資料和固相蛋白質(zhì)合成的技術(shù)陳述，可通過(guò)化學(xué)合成獲得基本純的MPF-4和CPF-4。多肽的固相化學(xué)合成原理在技術(shù)上是已知的，并且可在此領(lǐng)域的一般教科書(shū)中找到，如Dugas，H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry(1981)Springer-Verlag，New York，54-92頁(yè)。
例如，肽或蛋白質(zhì)如MPF-4可通過(guò)固相方法利用Applied Biosystems 430A肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln center Drive，F(xiàn)oster City，CA94404)以及Applied Biosystems提供的合成循環(huán)合成。Boc氨基酸及其它試劑可從Applied Biosystems以及其它的化學(xué)供應(yīng)商店買到。將利用雙連結(jié)法的有順序的Boc化學(xué)過(guò)程應(yīng)用于開(kāi)始的對(duì)-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂以產(chǎn)生C-末端甲酰胺(carboxamides)。用相應(yīng)的PAM樹(shù)脂生成C-末端酸。用預(yù)先形成的羥基苯并三唑酯將天冬酰胺、谷氨酰胺及精氨酸連接起來(lái)。可使用下列側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)Arg，甲苯磺?；鵄sp，環(huán)己基
Glu，環(huán)己基Ser，芐基Thr，芐基Tyr，4-溴芐酯基Boc脫保護(hù)可在二氯甲烷中用三氟醋酸完成。合成完成后，肽可在含10%間甲苯酚的無(wú)水氟化氫(HF)中脫保護(hù)并從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。側(cè)鍵保護(hù)基的裂解以及肽從樹(shù)脂上的裂解可在攝氏零度甚至更低的條件下進(jìn)行，優(yōu)選在-20℃進(jìn)行30分鐘再在0℃進(jìn)行20分鐘。除去HF后，肽/樹(shù)脂用乙醚洗滌，肽用冰乙酸提取出來(lái)并冷凍干燥。
同樣，分子生物學(xué)上的技術(shù)陳述給普通的熟練技術(shù)人員提供了另一種可獲得基本純的MPF-4和CPF-4的方法。雖然這兩種分子都可用固相肽合成法、從耗盡的培養(yǎng)基中分離或者重組的方法來(lái)生產(chǎn)，但是如果想要一個(gè)高產(chǎn)量，重組方法是優(yōu)選的。重組生產(chǎn)MPF-4或CPF-4的基本步驟包括a)編碼MPF-4的天然DNA序列的分離或者構(gòu)建合成或半合成DNA編碼序列，b)將編碼序列放入一個(gè)表達(dá)載體中，使其能以適當(dāng)?shù)姆绞絾为?dú)表達(dá)此蛋白質(zhì)或表達(dá)一個(gè)融合蛋白質(zhì)，c)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種合適的真核或原核宿主細(xì)胞，d)在允許表達(dá)MPF-4或CPF-4的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
e)回收并純化重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，(如果必要)使蛋白質(zhì)再折迭到其天然構(gòu)象。
正如前面敘述的那樣，兩蛋白質(zhì)的編碼序列可全合成或可對(duì)更大的、天然PF-4編碼為DNA修飾后得到。編碼天然PF-4的DNA序列在美國(guó)專利No.5，086，164上有描述，并且它可作為重組產(chǎn)生MPF-4的起始原料，或者通過(guò)改變天然序列得到前體蛋白質(zhì)以獲得預(yù)期結(jié)果。
合成的基因，在體內(nèi)或體外經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后將產(chǎn)生MPF-4或CPF-4，這些基因可由已知的技術(shù)構(gòu)建。由于基因密碼天然的簡(jiǎn)并性，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)出一個(gè)相當(dāng)大的編碼MPF-4或CPF-4的確定數(shù)目的DNA序列。
合成基因的構(gòu)建方法學(xué)在技術(shù)上是已知的。參見(jiàn)Brown等，(1979)Methods in Enzymology，Academic Press，N.Y.，68卷，109-151頁(yè)。編碼MPF-4或CPF-4的DNA序列可根據(jù)在此公布的氨基酸順序和公布的PF-4順序來(lái)設(shè)計(jì)。一旦設(shè)計(jì)好后，序列本身可利用常規(guī)DNA合成儀器如Applied Biosystems Model 380A或380B DNA合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA94404)來(lái)產(chǎn)生。
為了實(shí)現(xiàn)MPF-4或CPF-4的表達(dá)，人們通過(guò)利用合適的核酸限制性內(nèi)切酶，將設(shè)計(jì)合成的DNA序列插入到許多合適的重組DNA表達(dá)載體的任何一種中。通常參見(jiàn)Maniatis等(1989)Molecular Cloning;A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，N.Y.，1-3卷。核酸限制性內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)被設(shè)計(jì)在MPF-4編碼DNA的任何一端以利于整合到已知的擴(kuò)增和表達(dá)載體中以及從中分離出來(lái)。使用的特殊核酸內(nèi)切酶是由使用的親本表達(dá)載體的核酸限制性內(nèi)切酶裂解圖譜來(lái)確定的。限制性位點(diǎn)的選擇是為了以控制調(diào)節(jié)使編碼序列正確定向以獲得正確的框架閱讀以及目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。編碼序列必須與啟動(dòng)子和表達(dá)載體的核糖體結(jié)合部位放在正確的閱讀框架中，在表達(dá)此蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中后兩者都是起作用的。
為了獲得合成基因的高效轉(zhuǎn)錄，所述基因必須與一個(gè)啟動(dòng)子-操縱子區(qū)域相聯(lián)接。因此，合成基因的啟動(dòng)子-操縱子區(qū)域要位于相對(duì)于合成基因的ATG起始密碼子順序相同的方向。
用于轉(zhuǎn)化原核和真核細(xì)胞的各種表達(dá)載體在技術(shù)中是已知的。參見(jiàn)The Promega Biological Research Products Catalogue(1992)(Promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison WI，53711-5399);和The Stratagene cloning Systems Catalogue(1992)(Stratagene Corp.，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037。而且，美國(guó)專利No.4，710，473描述了環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體，用于大腸桿菌中高水平表達(dá)外源基因。這些質(zhì)粒用作重組DNA過(guò)程中的轉(zhuǎn)化載體和a)授與質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力;
b)涉及維持宿主細(xì)胞培養(yǎng)的溫度，調(diào)節(jié)質(zhì)粒自主復(fù)制;
c)在宿主細(xì)胞群中穩(wěn)定質(zhì)粒的生長(zhǎng);
d)在宿主細(xì)胞群中指示質(zhì)粒生長(zhǎng)的一種蛋白質(zhì)的直接合成;
e)提供只對(duì)質(zhì)粒的幾組核酸限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn);
f)終止mRNA轉(zhuǎn)錄這些環(huán)狀DNA質(zhì)粒在重組DNA過(guò)程可作為有用的載體以獲得外源基因的高水平表達(dá)。
構(gòu)建好表達(dá)載體后，下一步是將載體放入一種合適的細(xì)胞中，從而構(gòu)建了一個(gè)在目的基因表達(dá)中有用的重組宿主細(xì)胞。用重組DNA載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)在技術(shù)中是已知的，并可在如Maniatis等(見(jiàn)上)類似的一般參考文獻(xiàn)中找到。宿主細(xì)胞可由真核或原核細(xì)胞構(gòu)建。真核宿主細(xì)胞能進(jìn)行表達(dá)蛋白質(zhì)的翻譯后糖基化，有一些還能將目的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。
原核宿主細(xì)胞通常以高速度生產(chǎn)蛋白質(zhì)，它們?nèi)菀着囵B(yǎng)但不能對(duì)最終蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化。在高水平細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白特征地聚集為顆?；虬w，其中含有高水平的過(guò)度表達(dá)蛋白。一般用已知的技術(shù)將這種蛋白質(zhì)聚集體溶解、變性和再折迭，參見(jiàn)Kreuger等，(1990)Protein folding，Gierasch和King出版，136-142頁(yè)，American Association for the Advancement of Science Publication No.89-18S，Washington，D.C.;以及美國(guó)專利No.4932967。
MPF-4和CPF-4還能從有絲分裂原刺激的PBL制品或產(chǎn)生它們的任何細(xì)胞株的耗盡培養(yǎng)基中分離得到。在人PBLs情形中，用技術(shù)上已知的任何一種方法將PBLs從全血的血沉棕黃層中分離得到。已發(fā)表的許多制備人PBLs方法中的一個(gè)例子是Singh等，《人單核細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子的純化和生化性質(zhì)》，Proc.Natl.Acad.Sci.856374-6378，1985。一旦分離后，PBL制品在平衡的鹽溶液中充分漂洗以除去任何非細(xì)胞物質(zhì)。
然后將PBL制品接種到含有有絲分裂原的規(guī)定的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。普通的技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到各種發(fā)表并可買到的適用于培養(yǎng)PBL制品的生長(zhǎng)介質(zhì)。類似地，許多能刺激PBL活性的有絲分裂原在技術(shù)中上也是已知的。下面是與主題發(fā)明一致的有絲分裂原的實(shí)例，它們只用來(lái)解釋而不是限定脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、伴刀豆蛋白A(ConA)、酵母多糖和一些有絲分裂原決定簇的直接抗體。
PBL制品然后在合適的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間以生成MPF-4和CPF-4，通常培養(yǎng)一至數(shù)天，這取決于接種的初始濃度。耗盡的培養(yǎng)基再收集起來(lái)并通過(guò)過(guò)濾、離心或其它方法與細(xì)胞分開(kāi)。
不管用什么方法生產(chǎn)MPF-4或CPF-4，都需要純化。許多種蛋白質(zhì)純化技術(shù)在技術(shù)上均是已知的，其中很多對(duì)一般熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，按照這里公布的新教導(dǎo)明顯是合適和容易的。一本敘述蛋白質(zhì)純化技術(shù)的基本教材是Janson和Ryden的Protein purification，VCH Publishers Inc.，New York，1989。
我們發(fā)現(xiàn)了一種非常有用的純化方法，它包括先將耗盡的培養(yǎng)基加到一種反相純化柱上。這種柱在技術(shù)中是已知的，并可從許多賣方買到，包括Pharmacia、Biorad和Amicon。在目的蛋白質(zhì)與柱相互作用時(shí)，用逐漸線性增加的一種有機(jī)溶劑在三氟乙酸(TFA)中的溶液進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選的有機(jī)溶劑是乙腈，含有MPF-4和CPF-4的組份在30-50%的乙腈梯度部分發(fā)現(xiàn)。更優(yōu)選的梯度部分是33-39%的區(qū)域。
洗脫下的蛋白質(zhì)然后與肝素親合樹(shù)脂接觸。一般熟練的技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到這一步最好在柱上以色譜方式進(jìn)行。肝素親合柱可從上面提到的一些賣方中買到。在這一步，目的分子MPF-4或CPF-4與肝素柱結(jié)合并用逐漸線性增加的鹽梯度溶液洗脫。NaCl是優(yōu)選的鹽，優(yōu)選收集的梯度部分是0.1～2.0M部分。收集的更優(yōu)選的梯度部分是0.7～2.0M部分。
最后一步是將0.7～2.0M部分洗脫液上到第二根反相柱并用溶于TFA的乙腈線性梯度洗脫。優(yōu)選梯度是25-75%乙腈，而27-67%更好。柱中流出物用220nm處的吸收度監(jiān)測(cè)。峰蛋白質(zhì)部分進(jìn)行細(xì)胞抗增殖活性(生物活性)檢驗(yàn)。較早顯示生活性的洗脫峰是CPF-4，后面的活性洗脫峰是MPF-4。
下面的實(shí)施例對(duì)指導(dǎo)純化過(guò)程及理解本發(fā)明是有用的。這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明的目的，絕不想以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1從州際血庫(kù)購(gòu)買健康供血者的血液制備得血沉棕黃層。PBL細(xì)胞制品是通過(guò)histopaqueTM(Sigma chemical Co.，St.Louis，Mo 63178)在4℃進(jìn)行梯度離心，從匯集的血沉棕黃層中分離得到的。PBL制品用Hank′s平衡鹽溶液(GIBCO;Grand Island，N.Y.)洗滌，以密度為3×106細(xì)胞/毫升(總體積為4升)接種到無(wú)血清最小基本培養(yǎng)基(GIBCO;Grand Island，N.Y.)中，并補(bǔ)充2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、0.8mM D-葡萄糖、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和20μg/ml的脂多糖(Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178)。PBL制品在37℃含5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)30小時(shí)。收集耗盡培養(yǎng)基，PBLs用0.2μm濾器過(guò)濾除去。
實(shí)施例24升無(wú)細(xì)胞耗盡培養(yǎng)基加入0.1%(V/V)三氟乙酸(TFA)酸化，然后以約為15ml/min的流速直接上到反相C4-RP-304TM(250×21.5mm)半制備柱(BioRad，Richmond，CA 94804)上。柱子用在0.1%TFA中的0-50%乙腈線性梯度洗脫約40分鐘，然后用含有50%乙腈的0.1%TFA洗脫10分鐘。流速為15ml/min。大約50分鐘可收集15ml組分。洗脫過(guò)程在220nm處監(jiān)測(cè)，收集并匯集用33-39%乙腈洗脫的組份(C4-池)。
實(shí)施例3C4-池進(jìn)一步在Econo-pacTM5ml肝素-瓊脂糖cartridge(BioRad，Richmond，CA 94804)上通過(guò)肝素親合色譜進(jìn)行分級(jí)。結(jié)合的蛋白質(zhì)以流速為2.0ml/min通過(guò)含有0-2.0M NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS)線性梯度洗脫。從柱上洗脫的蛋白質(zhì)匯集為3個(gè)部分(1)不與肝素結(jié)合部分(流過(guò))(2)與肝素低親合性結(jié)合部分(0-0.7M NaCl)和(3)與肝素高親合性結(jié)合(0.7M-2.0M NaCl)部分。
實(shí)施例4將與肝素高親合性結(jié)合部分(3)(0.7M-2.0M NaCl)上到預(yù)先用含27%乙腈的0.1%TFA平衡的VydacTM0.46×10cm C-4高壓液相柱(The Marshall Co.;Worthington，OH 43085)。該柱用0.1%TFA中線性梯度為27%-67%的乙腈洗脫約40分鐘。監(jiān)測(cè)220nm處吸收度并人工收集峰蛋白質(zhì)組分，然后再依實(shí)施例5的方法進(jìn)行生物活性檢測(cè)。兩個(gè)峰說(shuō)明了抑制細(xì)胞增殖的能力。根據(jù)常規(guī)氨基酸順列分析，發(fā)現(xiàn)較早洗脫下的生物活性峰為CPF-4，后面洗脫下的生物活性峰是MPF-4。
實(shí)施例5實(shí)際按Buzney等，《視網(wǎng)膜脈管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞體外的不同生長(zhǎng)特點(diǎn)》，Invest.Ophthalmol.Visual Sci.24470-483(1983)敘述的方法制備原代視網(wǎng)膜毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，并按Voyta等，《基于其增加攝取低乙?；芏戎鞍椎膬?nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別和分離》，J.Cell.Biol.992034-2040(1981)敘述的方法分離污染的細(xì)胞。
也可以制備牛心臟內(nèi)皮細(xì)胞(American Type CultureCollection;Rockville MD 20852)用作檢測(cè)。無(wú)論哪種來(lái)源，內(nèi)皮細(xì)胞都接種到24孔組織培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為10000細(xì)胞/孔，用Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基(GIBCO;Grand Island，N.Y.)，補(bǔ)充了5%牛血清白蛋白、1%青霉素-鏈霉素、1%L-谷氨酰胺和20ng/ml成纖維生長(zhǎng)因子。接種細(xì)胞后，立即將各種量的PF-4(Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178)、MPF-4或CPF-4(按上述實(shí)施例中的方法分離得到)加到各個(gè)培養(yǎng)孔中。MPF-4和CPF-4試驗(yàn)終濃度從0.001至1μg/ml。天然PF-4作為對(duì)照，試驗(yàn)濃度為0.001至3μg/ml，并且從只補(bǔ)充培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物可在含5%CO2的37℃潮濕組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。然后培養(yǎng)物分別用胰酶消化收集，并用Zm-Coulter計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics.Inc.;Opa Locka FL 33054)計(jì)數(shù)。
結(jié)果繪制在圖1中，圖中每一點(diǎn)代表四個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值，也就是每個(gè)培養(yǎng)孔是一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。結(jié)果表明PF-4抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，半數(shù)有效抑制濃度(IC50)約為800-1000ng/ml(大約130nM)。這些結(jié)果與最近發(fā)表的關(guān)于重組PF-4抗增殖活性的研究(Science，24777-79(1990)有很好的相關(guān)性。數(shù)據(jù)還表明在相同的條件下，MPF-4和CPF-4都是內(nèi)皮細(xì)胞增殖更有效的抑制劑。證明MPF-4的半數(shù)抑制濃度為30-50ng/ml(約7nm)，CPF-4的半數(shù)抑制濃度約為150ng/ml(20nm)。MPF-4的抑制濃度與人血漿中PF-4的生理范圍接近(同上)。
序列目錄SEQ ID No1數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No1
SEQ ID No2數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No權(quán)利要求
1.氨基酸順序?yàn)镹H2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH的修飾的血小板因子-4(MPF-4)。
2.氨基酸順序?yàn)镹H2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH.的裂解的血小板因子-4(CPF-4)，它以二硫鍵與氨基酸順序?yàn)镹H2-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH的第二個(gè)蛋白連接，即MPF-4的Cys-20與第二個(gè)蛋白的Cys-10和MPF-4的Cys-36與第二個(gè)蛋白的Cys-12以二硫鍵合。
3.含有如權(quán)利要求1和2中任何一項(xiàng)所述的一個(gè)活性組份MPF-4或CPF-4的藥物制劑，該制劑還含有一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)適用的載體、賦形劑或稀釋劑。
4.如權(quán)利要求1和2中任何一項(xiàng)所述的用于血管形成抑制劑的MPF-4或CPF-4。
5.如權(quán)利要求1和2中任何一項(xiàng)所述的MPF-4或CPF-4的制備方法，包括a)提供含有MPF-4或CPF-4的液體混合物;b)將混合物上到反相純化柱上并收集用30-50%乙腈洗脫下的第一部分洗脫液;c)將從b)中收集的洗脫液與肝素親合樹(shù)脂接觸，使MPF-4或CPF-4與肝素親合樹(shù)脂結(jié)合并從收集的洗脫液中除去與MPF-4或CPF-4結(jié)合的樹(shù)脂;d)用0.7M到2.0M NaCl從肝素親合樹(shù)脂中將第二部分洗脫液洗脫下來(lái);e)將由d)中得到的第二部分洗脫液上樣到第二根反相分析高壓液相色譜柱，同時(shí)在200nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè);f)根據(jù)生物活性和220nm波長(zhǎng)處的吸收，收集含有MPF-4或CPF-4的級(jí)分。
6.權(quán)利要求5的方法，其中含有MPF-4或CPF-4的液體混合物是利用權(quán)利要求1和2中任何一項(xiàng)的編碼MPF-4或CPF-4的重組DNA化合物產(chǎn)生的。
7.權(quán)利要求6的重組DNA化合物。
8.含有權(quán)利要求7的一個(gè)DNA化合物的重組DNA載體，當(dāng)轉(zhuǎn)化入一種合適的宿主細(xì)胞后，該載體能夠驅(qū)使表達(dá)權(quán)利要求7的DNA化合物。
9.用權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明基于人血小板因子-4兩種修飾形式的發(fā)現(xiàn)，在此叫做MPF-4或CPF-4，它們是從脂多糖刺激的外周血白細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基中分離得到的。氨基酸順序測(cè)定顯示MPF-4與血小板因子-4自N-末端第17個(gè)殘基起同源。CPF-4由MPF-4與血小板因子-4的N-末端16個(gè)殘基以二硫鍵合構(gòu)成。MPF-4和CPF-4都是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有效抑制劑，比天然的或重組血小板因子-4效力高約10—100倍，這使它們?cè)谥委熝馨l(fā)生的疾病上有用。
文檔編號(hào)C07K14/52GK1088216SQ9311729
公開(kāi)日1994年6月22日 申請(qǐng)日期1993年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月25日
發(fā)明者S·K·古塔, J·P·星 申請(qǐng)人:伊萊利利公司