專利名稱：酮的立體選擇性還原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些含酮基的亞磺酰氨基化合物的立體選擇性微生物還原，用以形成相應(yīng)的含羥基化合物。
Larsen和Lish(Larsen，A.A和Lish，P.M.(1964)Nature，203，1283-1284)報(bào)導(dǎo)了一系列在苯環(huán)上帶烷基亞磺酰氨基的苯乙醇胺的生物活性。在該系列中，某些化合物具有腎上腺素能作用和抗腎上腺素能作用，包括α-腎上腺素能受體阻斷或受體激發(fā)作用，β-腎上腺素能受體阻斷或受體激發(fā)作用。D-(+)甲磺胺心定是一種β-阻斷劑(Uloth，R.H.，Kirk，J.R.，Gould，W.A.，和Larsen，A.A.(1966)Sulfonanilides，9，88-96)。與其它的β-阻斷劑不同，它具有第Ⅲ類防心律失常的性能(Lish，P.A.，Weikel，J.H.，和Dungan，K.W.(1965)，J.Pharma. and Exper.Therapeutics，149，161-173)。諸如心得安和甲磺胺心定之類的β-腎上腺素能阻斷藥物已被化學(xué)分離成右旋和左旋旋光異構(gòu)體，業(yè)已證實(shí)，D(+)異構(gòu)體的活性是相應(yīng)的L(-)異構(gòu)體的50倍(Somani，P.，和Bachand，T.(1969)，Eur.J.Pharma.，7，239-247)。因此，極其希望能有一種簡(jiǎn)便的立體選擇方法，以便得到上述亞磺酰氨基化合物的純的對(duì)映異構(gòu)物。
使用酶和微生物來(lái)制造某些旋光化合物在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的(例如見(jiàn)美國(guó)專利5，106，736;美國(guó)專利4，857，468;Akita，H等(1984)Chem.Pharm.Bull.，32(4)，1342-1348;Hummel，W.(1990)Biotechnology Letters，12(60)，403-408;和Schneider，M.P.等，在Bioflavour′87(P.Schreiner編著)中483-529頁(yè)，De Grugter，Berlin(1988)。但是，迄今為止還未報(bào)道過(guò)象下面提到的某些含酮基化合物的立體選擇性微生物/酶催化還原。
我們發(fā)現(xiàn)，某些酮(例如N-(4-(2-氯乙酰)苯基)-甲磺酰胺)通過(guò)立體選擇性微生物還原形成相應(yīng)的(+)-鏈烷醇。這些鏈烷醇本身是生物活性的，或者是合成某些心血管藥物(例如D-(+)甲磺胺心定)的關(guān)鍵的手性中間體。
本發(fā)明提供了一種將含酮基的化合物立體選擇性地酶催還原成相應(yīng)的含羥基化合物的方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種制備式(Ⅰ)的旋光性鏈烷醇化合物的方法
式中R1是低級(jí)烷基、芳基或取代的芳基;
R2是一個(gè)有1到4個(gè)碳原子的亞烷基，它通過(guò)1到2個(gè)碳原子把-X和
連接起來(lái);
Y是氫、鹵素、羥基、硝基、低級(jí)烷氧基、芐氧基、取代的芐氧基、低級(jí)烷基、或R3SO2NH-，其中R3獨(dú)立地具有和R1相同的意義;
X是氯、溴、碘、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基，或者是氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的氫氯化物;
該方法包括使通式(Ⅱ)的酮類化合物與能夠?qū)κ舰蚧衔锪Ⅲw選擇性地還原成式Ⅰ化合物起催化作用的酶或微生物接觸
式中R1、X和Y的定義同前，R2是1到4個(gè)碳原子的亞烷基，通過(guò)1到2個(gè)碳原子把-X和
連接起來(lái)。
式Ⅰ化合物可在防心絞痛、抗心律失常和抗高血壓等病癥治療中作為β-腎上腺素能阻斷劑使用，或者作為制備這些藥劑的中間體使用(例如見(jiàn)，美國(guó)專利3，351，584)。
本文中的“烷基”一詞當(dāng)單獨(dú)使用或作為另一基團(tuán)的一部分使用時(shí)，代表任意取代的、但是最好是未取代的直鏈和支鏈飽和烴基，優(yōu)選在直鏈中有1到10個(gè)碳原子。這類未取代的基團(tuán)實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基、戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基等。烷基可以被適當(dāng)?shù)娜〈〈?，即，能形成適用于本發(fā)明的化合物的取代基。烷基的取代基實(shí)例包括一個(gè)或多個(gè)、最好是三個(gè)或更少的氯基、溴基或碘基。
本文所用的“低級(jí)烷基”一詞代表任意取代的、但是最好是未取代的基團(tuán)，例如上述的在直鏈中有1到4個(gè)碳原子的烷基。
“低級(jí)烷氧基”一詞代表通過(guò)一個(gè)氧鍵(-O-)鍵合的上述的低級(jí)烷基。術(shù)語(yǔ)“單烷基氨基”或“二烷基氨基”分別代表被一或二個(gè)上述烷基取代的氨基。
本文所用的芳基一詞代表碳環(huán)芳基、最好是含有1或2個(gè)環(huán)和6到12個(gè)環(huán)碳原子。芳基的實(shí)例包括苯基、聯(lián)苯基和萘基。術(shù)語(yǔ)“取代的芳基”和“取代的芐氧基”代表其中的一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)被取代的基團(tuán)。取代基實(shí)例包括一個(gè)或多個(gè)、最好是三個(gè)或更少的硝基、上述的烷基或上述的烷基的取代基。
本發(fā)明的方法具有產(chǎn)生特定對(duì)映性結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。此方法主要是形成D(+)對(duì)映體而不是優(yōu)選的和不優(yōu)選的對(duì)映體的外消旋混合物。具體實(shí)施方案的其它優(yōu)點(diǎn)包括，與多步的化學(xué)合成相比，只需一步特定對(duì)映性還原。另外，尤其是在環(huán)境溫度和壓力下催化還原時(shí)，可以達(dá)到酮化合物向相應(yīng)醇化合物的優(yōu)選對(duì)映體轉(zhuǎn)化的高轉(zhuǎn)化度，以及醇化合物的高的對(duì)映體純度。
本發(fā)明中使用的酶或微生物可以是能夠催化本文所說(shuō)的立體選擇性酶催還原的任何酶或微生物。這些酶或微生物可以以游離狀態(tài)或固定在載體上的形式使用，例如以物理吸附或夾帶的形式固定。
合適的酶，不管其來(lái)源或純度如何，包括稱作氧化還原酶或脫氫酶的那些酶。所用的酶可以是例如從微生物中分離出的酶，例如先將細(xì)胞懸浮液均化，接著通過(guò)分解、離心、二乙氨乙基纖維素色譜、硫酸銨分級(jí)、使用凝膠過(guò)濾介質(zhì)的色譜例如Sephacryl(烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基二丙烯酰胺的交聯(lián)的共聚物)色譜以及離子交換色譜例如Mono-Q(通過(guò)季胺基結(jié)合帶負(fù)電的生物分子的陰離子交換劑)色譜進(jìn)行分離。這些酶的實(shí)例包括L-2-羥基異己酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、酵母酶濃縮物(Sigma)和β-羥基丁酸脫氫酶，或是由下文提到的微生物衍生得到的那些酶。
關(guān)于微生物的使用，本發(fā)明的方法可以用能夠催化本文所述立體選擇性酶催還原的任何合適的微生物進(jìn)行。例如。細(xì)胞可以以完整的濕細(xì)胞或干細(xì)胞的形式使用，例如冷凍干燥的、噴霧干燥的或加熱干燥的細(xì)胞，或者是以處理過(guò)的細(xì)胞物質(zhì)的形式使用，例如破裂的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。合適的微生物包括細(xì)菌、酵母和霉菌的下列屬無(wú)色桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、放線菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、黃桿菌屬、甲基單胞菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、曲霉屬、假絲酵母屬、鐮孢霉屬、地絲菌屬、漢遜酵母屬、克勒克酵母屬、青霉屬、畢赤酵母屬、根霉屬、紅酵母屬、酵母屬、木霉屬、被孢霉屬、小克銀漢霉屬、球擬酵母屬和紅假單胞菌屬。
優(yōu)選的微生物包括簡(jiǎn)單節(jié)桿菌、局限諾卡氏菌、鮭色諾卡氏菌、纏繞紅球菌、玫瑰色紅球菌、牝牛分枝桿菌、地中海諾卡氏菌、自養(yǎng)諾卡氏菌、馬型紅球菌、白假絲酵母、白地霉、高山被孢霉、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、刺孢小克銀漢霉、多孢球擬酵母、光滑球擬酵母和乙酸鈣不動(dòng)桿菌，特別是小球諾卡氏菌(例如ATCC 21505)、季也蒙假絲酵母(例如ATCC 20318)、紅平紅球菌(例如ATCC 4277)、釀酒酵母(例如ATCC 24702)、惡臭假單胞菌(例如ATCC 11172)、拉曼被孢霉(例如ATCC 38191)、費(fèi)比恩漢遜酵母(例如ATCC 58045)、多形漢遜酵母(例如ATCC 26012)、多孢木霉(例如ATCC 28014)、紅球菌種(例如ATCC 21243)、ATCC 12975和ATCC 29675)、纏繞紅球菌(例如ATCC 21950)、局限諾卡氏菌(例如ATCC 14887)、產(chǎn)糖芽霉菌(例如ATCC 16623)、布里馬毛霉菌(例如ATCC 89778)和高山被孢霉(例如ATCC 36965)。
使用遺傳工程化的生物體也在考慮之內(nèi)。寄主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，例如大腸埃希氏桿菌，改性成含有一個(gè)或多個(gè)基因，用以表達(dá)能起本文所述催化作用的一種或多種酶。
特別優(yōu)選使用漢遜酵母屬的微生物，尤其是多形漢遜酵母種，特別是多形漢遜酵母ATCC 26012小種;費(fèi)比恩漢遜酵母種，特別是費(fèi)比恩漢遜酵母ATCC 58045小種;紅球菌屬，特別是紅球菌種ATCC 21243和纏繞紅球菌ATCC 21950種，以及諾卡氏菌屬?！癆TCC”一詞是指所述微生物的保藏地美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)的登記號(hào)。還特別優(yōu)選使用從這些生物體得到的細(xì)胞提取物或分離出的酶。當(dāng)然，兩種或更多的酶和/或微生物的組合也認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的立體選擇性酶催還原法可以在所用微生物的發(fā)酵之后進(jìn)行(兩步發(fā)酵和還原)，或者與其同時(shí)進(jìn)行，后一種情形也就是原位發(fā)酵和還原(一步發(fā)酵和還原)。在一步法中，微生物可以在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，直到微生物得到充分生長(zhǎng)。然后可以向微生物培養(yǎng)基中加入式Ⅱ化合物，立體選擇性酶催還原與發(fā)酵一起繼續(xù)進(jìn)行，最好是一直進(jìn)行到完全轉(zhuǎn)化。
在兩步法中，可以使微生物在第一步里于合適的發(fā)酵介質(zhì)中生長(zhǎng)，直到顯示出所要求的酶(例如氧化還原酶)活性。接著，可以通過(guò)離心收取細(xì)胞，將收取的細(xì)胞懸浮在合適的緩沖溶液中制備微生物細(xì)胞懸浮液?？梢允褂弥T如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鈉等緩沖物。也可以用水來(lái)制備微生物細(xì)胞的懸浮液。在第二步中，可以將式Ⅱ化合物與微生物細(xì)胞懸浮液混合，微生物細(xì)胞懸浮液對(duì)化合物的立體選擇性酶催還原起著催化作用。上述的還原反應(yīng)最好進(jìn)行到全部或者接近全部的式Ⅱ化合物都被立體選擇性還原為止。
微生物的生長(zhǎng)可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用合適的培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于生長(zhǎng)微生物的合適的培養(yǎng)基包括能為微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必需營(yíng)養(yǎng)物的那些培養(yǎng)基。典型的用于微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基包含有必要的碳源、氮源和微量元素。也可以加入誘導(dǎo)物。這里所用的“誘導(dǎo)物”一詞包括能促進(jìn)在微生物細(xì)胞內(nèi)形成所希望的酶(例如氧化還原酶)活性的任何化合物，例如含酮基的化合物。可以在微生物生長(zhǎng)期間加入式Ⅰ化合物作為誘導(dǎo)物。
碳原可以包括糖，例如麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、丙三醇、山梨糖醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇等;有機(jī)酸，例如乙酸鈉、檸檬酸鈉等;氨基酸，例如谷氨酸鈉等;以及醇，例如乙醇、丙醇等。
氮源可以包括N-Z胺A、玉米漿、大豆粉、牛肉提取物、酵母提取物、糖蜜、發(fā)面酵母、胰化胨、脫脂大豆粉、胨、酵母蛋白水解產(chǎn)物、硝酸鈉、硫酸銨等。
微量元素可以包括磷酸鹽和美、錳、鈣、鈷、鎳、鐵、鈉及鉀鹽。
使用的培養(yǎng)基可以包括一種以上的碳源或氮源或其它營(yíng)養(yǎng)物。
優(yōu)選的培養(yǎng)基包括含有以下物質(zhì)的水基介質(zhì)(按重量%)培養(yǎng)基1麥芽提取物 1%酵母提取物 1%胨 1%葡萄糖 2%pH7.0培養(yǎng)基2胨 0.3%甘油 4%麥芽提取物 1%酵母提取物 1%pH7.0培養(yǎng)基3琥珀酸鈉 2%麥芽提取物 1%酵母提取物 1%胨 0.3%pH7.0培養(yǎng)基的pH以調(diào)節(jié)到6至8左右為宜，最好是6.5，滅菌，例如在121℃下滅菌30分鐘，然后調(diào)節(jié)到pH約為6.5至7.5，最好是7.0。
本發(fā)明的方法在適合形成所要求的式Ⅰ化合物的條件下進(jìn)行。在微生物生長(zhǎng)和進(jìn)行立體選擇性還原期間，不管是用酶還是用微生物進(jìn)行，培養(yǎng)基的pH以保持在4.0至9.0之間為宜，最好是在6.0和8.0之間。
溫度是可供立體選擇性還原過(guò)程使用的熱能的量度，應(yīng)當(dāng)維持在確保有足夠的能量供此過(guò)程利用的某個(gè)溫度。適合本發(fā)明方法的溫度范圍是從約15℃至約60℃。優(yōu)選的溫度范圍是從約25℃至約40℃。
對(duì)于實(shí)施本發(fā)明而言，壓力無(wú)嚴(yán)格要求，為方便起見(jiàn)，通常采用大氣壓左右的壓力。
本發(fā)明的方法最好是在有氧條件下進(jìn)行。反應(yīng)混合物的攪拌和充氣影響立體選擇性還原期間的可用氧量，這可以在一步法或兩步法中的微生物生長(zhǎng)期間于搖瓶培養(yǎng)器或發(fā)酵罐中進(jìn)行。攪拌速度以從50至1000轉(zhuǎn)/分為宜，最好是50至500轉(zhuǎn)/分。充氣速度以每體積培養(yǎng)基每分鐘0.1至10體積空氣(即0.1至10V/Vt)為宜，最好是每體積培養(yǎng)基每分鐘約5體積空氣(即，5V/Vt)。
式Ⅱ化合物的完全轉(zhuǎn)化，從如上所述用微生物或酶開(kāi)始處理式Ⅱ化合物算起，可能需要例如4到48小時(shí)左右，最好是12到24小時(shí)。
本發(fā)明的立體選擇性酶催還原方法可以使用一種輔助因子，例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，尤其是當(dāng)使用分離出的酶時(shí)。NADH隨后可以再生和重新使用。可以使用另一種酶使NADH原位再生，例如甲酸脫氫酶。合適的氫供體包括分子氫、甲酸鹽(例如堿金屬或銨的甲酸鹽)、次磷酸鹽或者在紫精(例如甲基紫精)存在下的電化學(xué)還原。也可以不用另外的酶，而用例如乙醇或甲酸鹽使NADH再生。
最好是使用水基液體作為反應(yīng)介質(zhì)，但是也可以使用有機(jī)液體，或者混溶或不混溶(兩相)的有機(jī)/水基液體混合物。
最好是使用占化合物和反應(yīng)介質(zhì)總重量0.1%至25%的式Ⅱ化合物起始物。選擇所用的酶或微生物相對(duì)于起始物的數(shù)量，以便能催化本發(fā)明的立體選擇性酶催還原反應(yīng)。
最好是使用的條件能達(dá)到反應(yīng)產(chǎn)率大于約80%、最好是大于約90%，D(+)對(duì)映體的光學(xué)純度約為60%或更大、大于約80%為佳、大于約90%更好、最好是大于約99%。
式Ⅱ化合物上的基團(tuán)，例如羥基，可以任選地加以保護(hù)以便用于本發(fā)明的選擇性酶催還原方法中;這些基團(tuán)隨后可以任選地去保護(hù)。
分離本發(fā)明的立體選擇性還原法的產(chǎn)物可以用已知方法分離和純化，例如萃取、蒸餾、結(jié)晶、柱狀色譜等。
從反應(yīng)介質(zhì)的剩余化合物中分離出所要求的式Ⅰ化合物的一種優(yōu)選的方法是萃取。一種示例性的萃取技術(shù)，例如當(dāng)產(chǎn)物是由全細(xì)胞懸浮液制得時(shí)，是用乙酸乙酯萃取含有上述懸浮液的反應(yīng)介質(zhì)，用鹽水洗有機(jī)層，然后減壓除掉溶劑，得到油狀液體，將它在高效制備液相色譜中用C18(25微米)柱(2×10英寸)層析，得到所要的產(chǎn)物(式Ⅰ化合物)。
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作出說(shuō)明，但不應(yīng)理解成是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1立體選擇性酶催還原使用各種品系的全細(xì)胞以下酶催還原過(guò)程的底物是N-(4-(1-氧-2-氯乙烷)-甲烷)磺酰胺(化合物A)，其結(jié)構(gòu)如下
所希望的產(chǎn)物(化合物B)是化學(xué)式如下的化合物
其化學(xué)名稱為(+)N-(4-(1-羥基-2-氯乙烷)甲烷)-磺酰胺。用于此還原過(guò)程中的微生物列在后面的表1中。
所用的微生物保存在液氮中的小瓶里。為進(jìn)行接種物的常規(guī)培育，將一個(gè)小瓶接種到在500毫升燒瓶中的100毫升培養(yǎng)基1(其成分見(jiàn)上)中，在28℃和280轉(zhuǎn)/分下于搖蕩器上培育48小時(shí)。在微生物生長(zhǎng)之后，將10毫升培養(yǎng)物接種到含100毫升培養(yǎng)基1的500毫升燒瓶中，在28℃和250轉(zhuǎn)/分下在搖蕩器上培育。
收取細(xì)胞，懸浮在pH6.0的100mM磷酸鉀緩沖液中。制備10毫升20%w/v的細(xì)胞懸浮液。在細(xì)胞懸浮液中補(bǔ)加25毫克底物(化合物A)和750毫克葡萄糖，在28℃、150轉(zhuǎn)/分下進(jìn)行還原(“生物轉(zhuǎn)化”)22-40小時(shí)。取1體積的樣品用2體積的乙酸乙酯提取，分離出的有機(jī)相經(jīng)過(guò)一個(gè)0.2微米LID/X過(guò)濾器過(guò)濾并收集。
用帶有火焰電離檢測(cè)器(FID)的Hewlett Packard氣相色譜儀分析樣品中的底物和產(chǎn)物濃度。使用Hewlett Packard (Dalo Alto，California)公司的熔融石英毛細(xì)管柱(交聯(lián)的甲基硅氧烷、15米長(zhǎng)，膜厚0.33微米、內(nèi)徑0.32毫米)，檢測(cè)器溫度250℃，注入溫度190℃。起始爐溫為195℃，最終爐溫為205℃。溫度以每分鐘0.5℃的速度升高。使用50毫升/分的氦氣作為載氣。底物(化合物A)的保留時(shí)間為1.02分，相應(yīng)的還原產(chǎn)物(化合物B)為9.6分。用手性高效液體色譜測(cè)定產(chǎn)物(化合物B)的光學(xué)純度。在室溫下使用Baker-bond Chiralcel OB柱。注入體積為20微升，流動(dòng)相為含35%正丁醇的65%己烷，流量為0.5毫升/分，檢測(cè)器波長(zhǎng)230毫微米。R-(+)對(duì)映體的保留時(shí)間為16.32分，S-(-)對(duì)映體為13.63分。
使用各種微生物在培養(yǎng)基1上生長(zhǎng)并遵照以上步驟所得的結(jié)果列在表1中。
表1化合物A微生物還原成化合物B反應(yīng)時(shí)間 化合物B 化合物B的微生物 (小時(shí)) 產(chǎn)率(%) 光學(xué)純度(%)產(chǎn)糖芽霉菌 ATCC 16623 48 73 75多形漢遜酵母 ATCC 26012 20 95 99布里馬毛霉菌 ATCC 89778 48 34 70高山被孢霉 ATCC 36965 20 35 80多孢木霉 ATCC 28014 20 86 77紅平紅球菌 ATCC 4277 20 63 68紅球菌屬 ATCC 12975 22 44 60紅球菌屬 ATCC 29675 22 53 95紅球菌屬 ATCC 21243 22 64 97纏繞紅球菌 ATCC 21950 22 45 99小球諾卡菌 ATCC 21505 22 63 78局限諾卡菌 ATCC 14887 22 75 85
實(shí)施例2使用全細(xì)胞反應(yīng)時(shí)間變化如實(shí)施例1中所述，本方法的底物是化合物A，所希望的產(chǎn)物為化合物B。
多形漢遜酵母ATCC 26012的細(xì)胞在合并于500毫升燒瓶中的100毫升培養(yǎng)基1內(nèi)生長(zhǎng)。生長(zhǎng)過(guò)程在25℃和280轉(zhuǎn)/分下進(jìn)行48小時(shí)。將100毫升培養(yǎng)物接種到裝在發(fā)酵罐中的15升培養(yǎng)基2里(其成分見(jiàn)前)。在發(fā)酵罐中于25℃、每分鐘充氣15升和500轉(zhuǎn)/分的攪速下生長(zhǎng)60小時(shí)。自發(fā)酵罐中收取細(xì)胞用來(lái)將化合物A還原(“生物轉(zhuǎn)化”)成化合物B。
將200克細(xì)胞懸浮在3升100mM的磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中，制得均勻的細(xì)胞懸浮液。向此細(xì)胞懸浮液中加入12克化合物A和120克葡萄糖，在22℃、160轉(zhuǎn)/分下進(jìn)行化合物A向化合物B的生物轉(zhuǎn)化24小時(shí)，24小時(shí)后，再加入35克葡萄糖，在22℃和160轉(zhuǎn)/分下再繼續(xù)生物轉(zhuǎn)化72小時(shí)。制得樣品，按實(shí)施例1中所述確定產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度。所得結(jié)果總結(jié)在后面的表中。
表2反應(yīng)時(shí)間 化合物B產(chǎn)率% 化合物B的光學(xué)純度%6 28 -12 52 -18 78 -22 96 99
實(shí)施例3使用細(xì)胞提取物和輔助因子此方法的底物(化合物A)和所希望的產(chǎn)物(化合物B)與實(shí)施例1中所述的相同。
按照實(shí)施例2中所述使多形漢遜酵母ATCC 26012的細(xì)胞在培養(yǎng)基1和2上生長(zhǎng)。
將150克細(xì)胞懸浮在pH6.0的1.5升0.2M磷酸鉀緩沖液中。用微流化器在13000磅/平方英寸壓力下將均化的細(xì)胞懸浮液在4℃下分裂。分裂的細(xì)胞懸浮液在12000轉(zhuǎn)/分下離心30分鐘。透明的上層清液(“細(xì)胞提取液”)用于化合物A向化合物B的生物轉(zhuǎn)化。
在1升細(xì)胞提取液中補(bǔ)加2.5克底物(化合物A)、甲酸脫氫酶(500單位)、0.7mM NAD(煙酰胺嘌呤二核苷酸)和25克甲酸鈉。反應(yīng)在pH6.0、攪速150轉(zhuǎn)/分和22℃下進(jìn)行。定期取樣，按實(shí)施例1中所述分析反應(yīng)產(chǎn)率和化合物B的光學(xué)純度。所得結(jié)果總結(jié)在下面的表3中。
表3反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 化合物B(克/升) 產(chǎn)率(%) 光學(xué)純度(%)24 2.3 90 99在以上步驟中，用于化合物A向化合物B生物轉(zhuǎn)化的NADH輔助因子，用甲酸脫氫酶NAD+和甲酸鹽在生物轉(zhuǎn)化的同時(shí)形成和再生，其情形如下圖所示。
在化合物A完全轉(zhuǎn)化成化合物B之后，將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)到pH為7.0，用等體積的乙酸乙酯萃取3次。分離出有機(jī)相，用0.7M的碳酸氫鈉洗2次。將分出的有機(jī)層在無(wú)水硫酸鈉上干燥，減壓除掉乙酸乙酯。所得的油狀殘余物在室溫下真空干燥，回收到灰白色的固體，產(chǎn)率85%(分離的)，光學(xué)純度99%。
權(quán)利要求
1.一種制備式(Ⅰ)的旋光性鏈烷醇化合物的方法
式中R1是低級(jí)烷基、芳基或取代芳基；R2是1到4個(gè)碳原子的亞烷基，通過(guò)1到2個(gè)碳原子將-X和
連接起來(lái)；Y是氫、鹵素、羥基、硝基、低級(jí)烷氧基、芐氧基、取代的芐氧基、低級(jí)烷基、或R3SO2NH-，其中R3獨(dú)立地具有與R1相同的含義；X是氯、溴、碘、氨基、單烷基氨基或二烷基氨基，或者是氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的氫氯化物；所述的方法包括使化學(xué)式(Ⅱ)的酮化合物與能夠?qū)κ舰蚧衔锪Ⅲw選擇性還原成式Ⅰ化合物起催化作用的酶或微生物接觸
式中R1、X和Y的定義同上，R2是一個(gè)有1到4個(gè)碳原子的亞烷基，通過(guò)1到2個(gè)碳原子把-X和
連接起來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用酶催化，其中的酶選自L-2-羥基異己酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、酵母酶濃縮物和β-羥基丁酸脫氫酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用微生物催化，其中的微生物是選自下列屬的微生物無(wú)色桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、放線菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、黃桿菌屬、甲基單胞菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、曲霉屬、假絲酵母屬、鐮孢霉屬、地絲菌屬、漢遜酵母屬、克勒克酵母屬、青霉屬、畢赤酵母屬、根霉屬、紅酵母屬、酵母屬、木霉屬、被孢霉屬、小克銀漢霉屬、球擬酵母屬和紅假單胞菌屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用微生物催化，其中的微生物選自簡(jiǎn)單節(jié)桿菌、局限諾卡氏菌、鮭色諾卡氏菌、纏繞紅球菌、玫瑰色紅球菌、牝牛分枝桿菌、地中海諾卜氏菌、自養(yǎng)諾卡氏菌、馬型紅球菌、白假絲酵母、白地霉、高山被孢霉、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、刺孢小克銀漢霉、多孢球擬酵母、光滑球擬酵母、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、小球諾卡氏菌、季也蒙假絲酵母、紅平紅球菌、釀酒酵母、惡臭假單胞菌、拉曼被孢霉、費(fèi)比恩漢遜酵母、多形漢遜酵母、多孢木霉、纏繞紅球菌和局限諾卡氏菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用微生物催化，其中的微生物選自小球諾卡氏菌ATCC 21505、季也蒙假絲酵母ATCC 20318、紅平紅球菌ATCC 4277、釀酒酵母ATCC 24702、惡臭假單胞菌ATCC 11172、拉曼被孢霉ATCC 38191、費(fèi)比恩漢遜酵母ATCC 58045、多形漢遜酵母ATCC 26012、多孢木霉ATCC 28014、紅球菌種ATCC 21243、纏繞紅球菌ATCC 21950、局限諾卡氏菌ATCC 14887、產(chǎn)糖芽霉菌ATCC 16623、布里馬毛霉菌ATCC 89778、高山被孢霉ATCC 36965、紅球菌種ATCC 12975和紅球菌種ATCC 29675。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用微生物催化，其中的微生物選自漢遜酵母屬、紅球菌屬和諾卡氏菌屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用微生物催化，其中的微生物選自多形漢遜酵母ATCC 20012、費(fèi)比恩漢遜酵母ATCC 58045、紅球菌種ATCC 21243和纏繞紅球菌ATCC 21950。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R1是低級(jí)烷基或苯基，R2是亞乙基或亞甲基，Y是氫或低級(jí)烷基，X是氯或異丙氨基鹽酸化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R1是甲基，R2是亞甲基，Y是氫，X是氯。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用微生物催化并且以一步發(fā)酵的形式進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用微生物催化并且以二步發(fā)酵的形式進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用微生物催化并且在誘導(dǎo)劑存在下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用酶催化并且在輔助因子存在下進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用微生物催化并且在培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基中含有一種或多種碳源，選自麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、丙三醇、山梨糖醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、乙醇、丙醇;一種或多種氮源，選自N-Z胺A、玉米漿、大豆粉、牛肉提取物、酵母提取物、糖蜜、發(fā)面酵母、胰化胨、脫脂大豆粉、胨、酵母蛋白水解產(chǎn)物、硝酸鈉、硫酸銨;以及一種或多種微量元素，選自磷酸鹽，錳、鈣、鈷、鎳、鐵、鈉鹽及鉀鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法在從約4到約9的pH下和從約15℃到約60℃的溫度下進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法在從約6到約8的pH下和從約25℃到約40℃的溫度下進(jìn)行48小時(shí)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法采用微生物催化并且在攪拌下進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在該方法之后有一個(gè)分離出所要產(chǎn)物的附加步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的分離步驟用萃取、蒸餾、結(jié)晶或柱狀色譜等形式進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所要產(chǎn)物的產(chǎn)率大于約80%，所要產(chǎn)物的光學(xué)純度大于約80%。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所要產(chǎn)物的產(chǎn)率大于約90%，所要產(chǎn)物的光學(xué)純度大于約90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，用以將例如N-(4-(2-氯乙酰)苯基)甲磺酰氨之類的含酮基的化合物立體選擇性酶催還原，形成相應(yīng)的含羥基化合物。此方法對(duì)于D(+)對(duì)映體有選擇性，由諸如氧化還原酶或脫氫酶之類的酶或諸如漢遜酵母、紅球菌或諾芐氏菌等微生物催化進(jìn)行。
文檔編號(hào)C07C311/21GK1091472SQ93119819
公開(kāi)日1994年8月31日 申請(qǐng)日期1993年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月5日
發(fā)明者R·N·帕特爾, A·班納吉, C·G·麥克納米, L·J·施扎卡 申請(qǐng)人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司