專利名稱：酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異硫脲衍生物、其制備方法、含這些衍生物的醫(yī)藥制劑，以及它們在疾病治療方面的應(yīng)用，特別是它們作為一氧化氮合成酶抑制劑的應(yīng)用。
自20世紀(jì)80年代起，人們已知，乙酰膽堿所致的血管舒張同內(nèi)皮的存在有關(guān)，而這種活性被歸因于所謂內(nèi)皮衍化舒張因子(EDRF)的易變性體液因子。一氧化氮(NO)作為血管舒張藥的活性，為人們所知已逾百余年，而且NO還是亞硝酸戊酯、三亞硝酸甘油酯及其它硝基血管舒張藥的活性組分。近來鑒別出EDRF為NO，這正好同發(fā)現(xiàn)NO由酶即NO合成酶用氨基酸L-精氨酸合成的生物化學(xué)途經(jīng)不謀而合。
NO是可溶性鳥嘌吟核苷酸酯(鹽)環(huán)化酶的內(nèi)生刺激素，并參與除了內(nèi)皮依賴性舒張以外的許多生物作用，包括吞噬細胞的細胞毒性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞之間的交流(見Moncada等，Biochemical Pharmacology，38，1709-1715(1989)，及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))?，F(xiàn)在，人們認為，在許多疾病中，有可能產(chǎn)生過量NO，尤其是涉及系統(tǒng)性低血壓(systemic hypotension)如敗血(毒)性休克及用某些細胞素來治療的疾病。
由L-精氨酸合成NO，可為類似于L-N-單甲基精氨酸(L-NMMA)的L-精氨酸所抑制，因而已有人提議(WO 91/04024及GB-A-2240041)用L-NMMA來治療敗血性休克和其它類型的系統(tǒng)性低血壓。除L-NMMA之外，某些其它用于同一目的NO合成酶抑制劑在治療上的應(yīng)用，也已在WO 91/04024及EP-A-0446699中提出。
最近已搞清楚，NO合成酶至少有以下三類(ⅰ)位于內(nèi)皮中的一種基本的Ca++/調(diào)鈣蛋白依賴性酶，它在應(yīng)答受體或物理刺激時釋出NO。
(ⅱ)位于腦內(nèi)的一種基本的Ca++/調(diào)鈣蛋白依賴性酶，它在應(yīng)答受體或物理刺激時釋出NO。
(ⅲ)在血管平滑肌、巨噬細胞內(nèi)皮細胞及許多其它細胞被內(nèi)毒素及細胞素活化后所誘導(dǎo)的一種Ca++非依賴性酶。這種可誘導(dǎo)性NO合成酶，一旦被表達，即會長期合成NO。
由各種基本的酶所釋出的NO，起著服從轉(zhuǎn)導(dǎo)機理的一些生理應(yīng)答的作用。由可誘導(dǎo)酶產(chǎn)生的NO，則起著克制腫瘤細胞和入侵微生物的細胞毒素分子作用(Wright等，Card.Res.26，48-57(1992)及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))。也似乎表明，產(chǎn)生過多NO的不良作用，尤其是病理性血管舒張及組織損傷，有可能主要由可誘導(dǎo)NO的合成酶所合成的NO的作用所引起。
至今，人們所提議供治療應(yīng)用的NO合成酶抑制劑，尤其是L-NMMA，不具選擇性，它們既抑制基本的NO合成酶，又抑制可誘導(dǎo)的NO合成酶。使用這樣一種無選擇性的NO合成酶抑制劑，需要非常小心，以免因過度抑制基本的NO合成酶而產(chǎn)生的潛在嚴重后果，其中包括低血壓、血栓形成、CNS毒性及組織損傷。特別是，在將L-NMMA在治療上應(yīng)用來醫(yī)治敗血性休克時，已推薦在整個治療過程中，必須連續(xù)監(jiān)測病人的血壓。因此，無選擇性NO合成酶抑制劑，在適當(dāng)注意的前提下具有治療上的實用性，而在抑制可誘導(dǎo)NO合成酶要比抑制基本的NO合成酶具有大得多的選擇性的NO合成酶抑制劑，則在治療上具有更大的好處，并且大大方便了使用。
異硫脲的制備和生物學(xué)性質(zhì)，已在文獻中予以報導(dǎo)(Schroeder，Chem.Revs.，1955，55，181;Doherty等，J.Am.Chem.Soc.，1957，79，5667;以及Brand及Brand，Org.Synth.，1942，22，59;Smirk等，Brit.Med.J.1941，510-11;J.Physiol.，1942，100，474-483;Lancet，1942，301-303;J.Physiol.，1943，101，379-388;Fastier，Brit.J.Pharmacol.，1948，3.198)。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，異硫脲是NO合成酶的抑制劑，而且可用于治療系統(tǒng)性低血壓，而且特別可用于治療敗血性休克。除此之外，與基本的NO合成酶相比，這些化合物中的許多化合物都對可誘導(dǎo)NO合成酶具有選擇性。
因此，本發(fā)明提供了一種對需要抑制一氧化氮合成酶的疾病的治療方法，該方法包括投給哺乳動物有效量的、對NO合成酶具有抑制作用的異硫脲衍生物或其藥理學(xué)上可采用的鹽。另一方面，本發(fā)明提出了對NO合成酶具有抑制作用的異硫脲供制造一種有利于抑制NO合成酶的治療疾病的藥物的應(yīng)用。
更具體來說，本發(fā)明提出了一種治療系統(tǒng)性低血壓及/或敗血性休克的方法，該方法包括投給哺乳動物有效量的、對NO合成酶具有抑制作用的異硫脲衍生物或其藥理上可采用的鹽。另一方面，本發(fā)明提出了具有NO合成酶抑制作用的異硫脲衍生物供制造系統(tǒng)性低血壓及/或敗血性休克的藥物的應(yīng)用。
有利于抑制由L-精氨酸產(chǎn)生NO的另一些情況包括用TNF、IL-1及IL-2之類細胞素進行治療，或者用細胞素誘導(dǎo)劑如5，6-二甲基噸酮乙酸進行的治療，以及在移植治療中作短期免疫抑制輔劑。此外，抑制NO合成的化合物還可用來降低患有過量NO促進疾病理生理學(xué)的炎癥疾病如成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)及心肌炎的病人體內(nèi)的NO濃度。
還有證據(jù)表明，NO合成酶可能參與自體免疫及/或炎性疾病如關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腸道病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中發(fā)生的軟骨變性。人們還認為，NO合成酶可能參與胰島素依賴性糖尿病。因此，本發(fā)明的再一方面，提供了異硫脲衍生物或其鹽，以制造用來進行細胞素或細胞素誘導(dǎo)治療、在移植治療中作短期免疫抑制輔劑，供治療患有過量NO促進病癥病理生理學(xué)的炎性疾病病人、用于自體免疫及/或炎性適應(yīng)癥及胰島素依賴性糖尿病的藥物。
再有一個方面是，提供了治療與細胞素治療相關(guān)的不良作用，移植治療中短期免疫抑制的，治療患有過量NO促進病癥病理生理學(xué)的炎性疾病病人的，治療自體免疫及/或炎性癥狀疾病及治療胰島依賴性糖尿病的方法，該方法包括投給需要的哺乳動物有效量的、對NO合成酶具有抑制作用的異硫脲衍生物或其藥理學(xué)上可采用的鹽。
本文中所用的“治療”病人，意即包括預(yù)防;“哺乳動物”意即包括人或動物。
優(yōu)選的異硫脲包括式(Ⅰ)
所示的異硫脲或其鹽，式中R為(1)一個C1-14烴基;或(2)一個5-節(jié)和6節(jié)的雜環(huán);或(3)一個9節(jié)雙雜環(huán)系上述各R基團可為一或二個各自分別選自下列基團的基團所取代(a)鹵;
(b)-XR1，其中X為氧;C(O)m，式中m為1或2;S(O)n，式中n為0、1或2;或者NR2，式中R2為氫、C1-6烷基或C3-6環(huán)烷基，或者R2連到R1上，形成一個C2-6亞烷基;
R1為氫;或C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C3-6環(huán)烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)基團，上述各基團可任選地為一個或二個各自分別選自下列基團的基團所取代C1-3烷基、羥基、C1-3烷氧基團、氨基、C1-3烷基氨基、鹵、硝基、或者C(O)m′R2b基團，式中m′為1或2，R2b為氫或C1-4烷基;或者R1為一個NR3R4基團，式中R3和R4可以相同或不同，且各為氫或C1-4烷基，或者R3和R4相連，形成一個C2-6亞烷基;
基團，式中Y為氧;S(O)n，式中n如上所規(guī)定;或NR5，式中R5為氫或C1-4烷基;
W為0或1;
Q為C2-4烴基;
或者亞氨基氮連接到R基團或Q基團上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);或者(d)一個基團A，其中A是一個雜環(huán)系，它可任選地為如上定義的基團
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6鏈烯基或鏈炔基或者C3-6環(huán)烷基;或者R中，碳原子之一連到式(Ⅰ)所示化合物中的亞氨基氮原子上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);條件為R不是甲基。
適宜的R為(1)C1-8烷基;
(2)C2-8鏈烯基或鏈炔基;
(3)一個-(CH2)p
CH3基團，其中p為0至4，q為0至3;或者(4)一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，上述各基團可被一個或二個相同或不同的下列基團所取代(a)鹵素，(b)OR2b，其中R2b如上所定義;
(c)C(O)mR2b，其中m及R2b如上所定義;
(d)S(O)nR6，其中n如上所定義，R6為C1-4烷基，該烷基任選地被一個或二個各自分別選自氨基或如上定義的C(O)mR2b基團所取代;
(e)NR7R8，其中R7及R8及自分別選自氫、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C1-4烷氧烷基，或者R7及R8相連，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);
(f)一個苯環(huán)或一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，它可任選地被如上所定義的一個OR2b基團所取代，或者被一個
基團所取代，其中Q如上所定義;或者亞氨基氮與基團Q相連，形成一個噻唑或噻唑啉環(huán);或者(g)C1-4烷基，條件是R為一個雜環(huán);或者R中的一個碳原子連到式(Ⅰ)所示化合物中的亞氨基氮上，形成一個噻唑或噻唑啉環(huán)。
最適宜的R為(1)C1-4烷基;
(2)C2-4鏈烯基，(3)一個
CH3基團，其中p為1或2，q為0或1;或者(4)一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，其中含有一或二個氮原子;
上述各基團可任選地被一個或二個相同或不同的下列基團所取代(a)鹵，優(yōu)先為溴;
(b)一個OR2b′基團，其中R2b′為氫或甲基;
(c)一個C(O)mR2b′基團，其中m及R2b′如上所定義;
(d)一個SR9基團，其中R9為甲基或乙基;
(e)一個NR7bR8b基團，其中R7b和R8b各自分別選自氫或C1-4烷基，優(yōu)先為氫、甲基或乙基;
(f)一個可任選地為一個如上所定義的OR2b′或一個
基團取代的苯環(huán);
(g)含有一個或二個各自分別選自氮或氧的雜原子的5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);或者(h)C1-4烷基，優(yōu)先為甲基;
或者R中的一個碳原子連到式(Ⅰ)所示化合物的亞氨基氮上，形成一個噻唑或噻唑啉環(huán)。
式(Ⅰ)包括式(ⅠA)、(ⅠB)、及(ⅠC)所示的異硫脲衍生物。
，式中R′為一個C1-8亞烷基，或者一個C2-8亞烯基或亞炔基，它們含或不含一個苯環(huán)、一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，或者一個如前所定義的X基團，其中虛線代表一個雙鍵或一個單鍵。
式Ⅰ還包括式(Ⅱ)
所示的化合物或其鹽，式中Ra為一個C1-8烴基，或者5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，或者一個9節(jié)雙環(huán)雜環(huán)系，它們各自任選地被鹵素或者一個或二個-XaR1a基團所取代，其中R1a為氫、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基，或者一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)基團，該雜環(huán)基團任選地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、鹵素或硝基所取代，或者R1a為一個NR3aR4a基團，其中R3a和R4a或同或不同，且各為氫或C1-3烷基，或者R3a和R4a相連，形成一個C2-6亞烷基，且Xa為氧;C(O)ma，其中ma為1或2;S(O)na，其中na為0、1或2;或者NR2a，其中R2a為氫、C1-6烷基或C3-6環(huán)烷基，或者R2a連到R1a上，形成一個C2-6亞烷基，或者為一個
基團所取代，其中t為0至4，Wa為0或1，Ya為氧、硫及NR7a，其中R7a為氫或C1-4烷基;或者Ra將硫原子連到式(Ⅰ)所示化合物中的一個氮原子上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，條件是Ra不是甲基。
優(yōu)選的一組化合物，是其中的R不是甲基、乙基、丙基或異丙基的那些化合物。
優(yōu)選的式(Ⅰ)所示化合物包括S-(2-氨乙基)異硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)異硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)異硫脲S，S′-亞乙基二(異硫脲)S，S′-1，5-亞戊基二(異硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)異硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亞己基二(異硫脲)S，S′-1，7-亞庚基二(異硫脲)S-芐基異硫脲S-(2-嗎啉代乙基)異硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)異硫脲S，S′-(1，4亞苯基二(亞甲基)二異硫脲S-叔丁基異硫脲S-(4-乙基芐基)異硫脲S-((甲硫基)甲基)異硫脲S-(3-溴丙基)異硫脲S-(2-溴乙基)異硫脲
S-(3-甲基-2-丁烯基)異硫脲S-烯丙基異硫脲S-(3-氨基丙基)異硫脲S，S′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二異硫脲S，S′-(2-亞甲基-1，3-亞丙基)二異硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亞基)二異硫脲S，S′-(1，3-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)異硫脲S-(3-羥基丙基)異硫脲S-(2-苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-1，3-亞苯基二(亞甲基)二(S-甲基異硫脲)N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基異硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲
S-(2-(4-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)異硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)異硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲，及它們的鹽。
特別優(yōu)選的化合物，包括S，S′-(1，3-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲、S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲、S-(2-(5-脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲、S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲及S-(2′-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲。
其它優(yōu)選用來治療敗血性休克的化合物，為S-乙基異硫脲、S-丙基異硫脲及S-異丙基異硫脲，尤其為S-乙基異硫脲及S-異丙基異硫脲，特別是S-乙基異硫脲。
術(shù)語“烴基”基團，意即只含碳原子和氫原子，但可含雙鍵及/或叁鍵，并且實質(zhì)上可為環(huán)狀或芳香族的基團。
術(shù)語“雜環(huán)”意即含有1至3個選自氧、硫及氮，優(yōu)選為氮或硫的雜原子的環(huán)狀化合物。
術(shù)語“鹵素”意指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選為溴。
式(Ⅰ)所示化合物，包括許多在分子中視各種基團的確切含義而定的不對稱中心，而且式(Ⅰ)旨在包括各種可能的異構(gòu)體。
本發(fā)明的另一方面，提供了除芐基異硫脲、S，S(1，4-亞苯基二(亞甲基))二異硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)異硫脲之外的、具有抑制NO合成酶作用、用于醫(yī)藥的式(Ⅰ)所示異硫脲或其藥物學(xué)可接受的鹽。
另一方面，本發(fā)明提供了如上所定義的式(ⅠA)、(ⅠB)及(ⅠC)所示新化合物。這些化合物包括S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)異硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-甲基異硫脲)N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基異硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)異硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)異硫脲及它們的鹽。
本發(fā)明包括鹽形式，尤其酸加成鹽形式的異硫脲。適宜的鹽包括那些既用有機酸又用無機酸生成的鹽。這樣的酸加成鹽一般都為藥理學(xué)所接受，雖然藥理學(xué)上不接受的鹽在制備和提純所涉及化合物時可加以利用。因此，優(yōu)選的鹽包括由鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲基苯磺酸、苯磺酸及羥乙磺酸生成的鹽。異硫脲的鹽，可使游離堿形式的適宜化合物與相宜的酸作用來制取。
本發(fā)明的異硫脲雖然可以原化學(xué)物質(zhì)來投藥，但以藥物制劑形式給藥為佳。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，其中含有本發(fā)明的一種異硫脲或一種異硫脲的藥理學(xué)可用鹽或溶劑化物，以及一種或多種藥理學(xué)可用的載體和任選的一種或多種其它治療用組分。例如一種抗生素，及/或一種體液補充液。所說載體必須在與其它制劑成分配伍的意義上“可用”，而不得對其受體有害。
制劑包括那些適于經(jīng)口、胃腸外(包括皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi))、直腸及局部(包括皮、口、舌下及眼內(nèi))給藥劑型，雖然最適宜的用藥方案或許取決于例如受藥者的病癥和障礙。制劑可方便地以單位劑量形式來提供，并可用藥物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的任何方法來制備。所有方法都包括將式(Ⅰ)化合物或其藥理學(xué)可用的鹽或溶合物(“有效成份”)與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相互組合的步驟。一般，制劑是通過將有效成分同液態(tài)載體或細分散固態(tài)載體或固、液二種載體均勻充分混合，然后在必要時將產(chǎn)品成型為所需劑型。
適于經(jīng)口給藥的本發(fā)明制劑，可以按分立單位的形式提供，例如膠囊、扁囊劑或片劑，其中各含有預(yù)定量的活性成分;例如粉劑或粒劑;例如含水液體或非水液體中的溶液劑或懸液劑;或例如水包油乳液劑或油包水乳液劑。有效成分也可以按大藥丸、糖劑或膏劑的形式提供。
片劑可任選地用一種或多種輔助成分通過壓制或模塑來制造。壓制的片劑，可以在適當(dāng)?shù)臋C器中將任選地混有粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，潤滑、表面活性或分散劑的自由流動狀態(tài)如粉末或顆粒的有效成分加壓來制造。模塑的片劑，可在適當(dāng)?shù)臋C器中模塑經(jīng)惰性液態(tài)稀釋劑潤濕的粉狀化合物來制造。片劑可任選地被包覆或刻痕，并可制成可緩慢或有控制地釋效其中有效成分的劑型，供胃腸外給藥的制劑包括含水及非水的滅菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑及能使制劑與受藥者血液等滲的溶質(zhì);以及水質(zhì)或非水質(zhì)滅菌懸液劑，其中可包括懸浮劑和增稠劑。這些劑型可以裝在單次劑量或多次劑量的容器如封焊的安瓿及小藥瓶中供使用，并可在凍干(真空冷凍干燥)條件下保存，用前只需添加滅菌液態(tài)載體，例如鹽水、注射用水。作為選擇，這些劑型可供連續(xù)輸注之用。
臨時注射液及懸液，可用上述類型的滅菌粉劑、粒劑及片劑來制備。
供直腸用的劑型，可以含有常用載體如可可脂或聚乙二醇的栓劑形式提供。
供口腔內(nèi)局部，例如頰、舌下給藥的劑型包括錠劑，其中在加有調(diào)味劑的基料，如加有蔗糖的阿拉伯樹膠或黃蓍膠中含有有效成分，以及軟錠劑，其中在諸如明膠加甘油或蔗糖加阿拉伯樹膠的基料中含有有效成分。
優(yōu)選的單次劑量劑型是那些含有如下指定有效劑量或其適當(dāng)分劑量的有效成分的劑型。
應(yīng)當(dāng)理解的是，除了上面特別提及的各成分之外，本發(fā)明的各劑型中還可包含本領(lǐng)域中常用的、與所討論劑型種類有關(guān)的其它藥劑，例如適于經(jīng)口給藥的劑型可含有調(diào)味劑。
對上面提及的各種疾病而言，本發(fā)明化合物可以0.1-250mg/kg/d的劑量經(jīng)口或經(jīng)注射給藥。對成人的劑量范圍，一般為5mg-17.5g/d，優(yōu)選為5mg-2g/d，最優(yōu)選為10mg-1g/d。片劑或其它以分散單位提供的給藥形式，可方便地含有適當(dāng)量的本發(fā)明化合物，它以例如含5mg-500mg，通常約10mg-200mg的一次劑量或多次劑量為有效。
式(Ⅰ)所示化合物優(yōu)選以經(jīng)口或注射(靜脈內(nèi)或皮下)方式給藥。對病人給與化合物的精確用量，是主治醫(yī)師的責(zé)任。然而，所有的劑量則視諸多因素而定，其中包括病人的年令及性別，待治療的確切病癥及其嚴重程度。同樣，給藥方案也可視病癥及其嚴重程度而異。
本發(fā)明還提供了相似于本領(lǐng)域中已知制備異硫脲衍生物方法的如上所定義新化合物制備方法。
因此，式(Ⅰ)所示化合物或其帶保護基團的衍生物，可通過使硫脲與化合物RL(L′)r(式中R如上所定義，L及L′均為離去基團，例如鹵原子如溴，r為0或1)反應(yīng)，需要時隨后脫除保護基團來制備。
更具體地說，(ⅰ)如上所定義的式(ⅠA)
所示化合物，可使硫脲與一種其中L、L′及R如上所定義的化合物L(fēng)RL′反應(yīng)來制備。適宜的是，該反應(yīng)在極性溶劑如乙醇中，在20℃至溶劑回流溫度下進行。
式LRL′所示化合物可市購而得，或者可用相應(yīng)的二醇HO-R′-OH，相宜地通過在極性溶劑如二氯甲烷中，在鹵化劑如四溴化碳及三苯基膦存在下進行反應(yīng)來制取。
式HO-R′-OH所示的化合物可市購而得，或者可用本領(lǐng)域中已知的方法來制備。
(ⅱ)如上所定義的式(ⅠB)所示化合物
可將式(ⅠB1)
所示化合物脫除保護基團來制備，式(ⅠB1)中，R′及虛線的定義如上所述，P及P′或同或不同，二者均為保護基團，例如芐基、芐氧羰基或叔丁氧羰基。該反應(yīng)可在三氟乙酸中，于-20℃至100℃的非極度的溫度例如0℃下，在有清除劑分子，例如苯硫基甲烷及1，2-乙二硫醇存在下進行。
當(dāng)虛線代表單鍵且取代基在4-位時，式(ⅠB1)所示化合物可用式(ⅠB2)
所示的化合物來制備。式(ⅠB2)中，R′、P及P′如上所定義。疊氮化物還原成胺，并環(huán)化成噻唑啉，可在四氫呋喃中，在三苯基膦存在下進行。
式(ⅠB2)所示的化合物，可用式(ⅠB3)
所示的化合物可通過用疊氮化物陰離子在諸如二甲基甲酰胺之類的極性溶劑中，于-20℃-200℃，例如溶劑回流的溫度下置換甲苯磺酸鹽來制備，式(ⅠB3)中，R、P及P′如上所定義。
式(ⅠB3)所示的化合物的制備，可用式(ⅠB4)
所示(其中R′、P′及P如上所定義)的化合物，通過添加硫氰酸根陰離子以產(chǎn)生一種開環(huán)醇鹽，該醇鹽可以甲苯磺酰衍生物(ⅠB3)的形式被添加的對甲基苯磺酰氯所捕集。式(ⅠB4)所示化合物可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知的方法來制備。
當(dāng)虛線為單鍵且取代基在5位上時，式(ⅠB1)所示的化合物可用式(ⅠB5)
所示的化合物來制備，其方法是用硫氰酸根陰離子取代甲苯磺酸鹽(Tetrahedron Asymmetry 1992，749-752)，該置換反應(yīng)可在極性溶劑如乙醇中，于-20℃至200℃，例如溶劑回流溫度的非極端溫度下進行，隨后用相似于用式(ⅠB2)化合物制備式(ⅠB)化合物的方法進行環(huán)化。式(ⅠB5)的化合物可用相應(yīng)的環(huán)氧化物，以疊氮化物陰離子將其開環(huán)，再在極性溶劑如二甲基甲酰胺中，于-20℃至200℃，例如100℃的非極端溫度下，用對甲基苯磺酰氯捕集醇鹽來制備(Tetrahedron Lett、1990，31(2)，221)。
當(dāng)虛線代表雙鍵并且噻唑環(huán)上的取代基在5位上時，式(ⅠB1)的化合物可通過式(ⅠB6)所示氯乙縮醛
用硫脲環(huán)化來制備，在式(ⅠB6)中，R′、P及P′如上所定義，R10為C1-4烷基。該反應(yīng)可在極性溶劑如丙酮或乙醇中，于-20℃至200℃的非極端溫度下進行(Chem.Abs.5414230d)。
式(ⅠB6)所示化合物，可用硫酰氯和式(ⅠB7)
所示的醛來制備，式(ⅠB7)中，R′、P及P′如上所定義(Proc.Indian.Acad.Sci.1941，14A，630-5;Chem Abs.36∶410z)。式(ⅠB7)所示化合物可市購得到，或者可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法來制備。
當(dāng)虛線代表雙鍵并且噻唑環(huán)上的取代基在4位上時，式(ⅠB1)所示的化合物，可用本領(lǐng)域已知的方法來制備，例如α-N-芐氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸芐酯(Synthetic Communications 1990，20(30)，3097-3102)。
(ⅲ)式(ⅠC)所示化合物
可按如下方法制備(a)當(dāng)虛線為單鍵并且取代基在4位上時，用相似于以式(ⅠB4)所示的那些化合物制備式(ⅠB)所示化合物的方法來制備。
(b)當(dāng)虛線代表單鍵并且取代基在噻唑啉環(huán)的5位上時，用相似于以式(ⅠB5)所示化合物制備式(ⅠB)所示化合物的方法來制備。
(c)當(dāng)虛線代表雙鍵并且取代基在噻唑啉環(huán)的4位上時，通過式(ⅠC1)所示化合物
與硫脲反應(yīng)來制備。相宜的是，該環(huán)化反應(yīng)可在極性溶劑如丙酮中，于-20℃至200℃，例如20℃的非極端溫度下進行。
式(ⅠC1)所示化合物，可以本領(lǐng)域已知的方法，用通式HO2C-R′-CO2H(其中R′如上所定義)所示化合物來制備(J.Chem.Soc.1940，1304-7;Chem.Abs.35∶1133)。
(d)當(dāng)虛線為雙鍵并且取代基在噻唑啉環(huán)的5位上時，用相似于以式(ⅠB6)所示的化合物制備式(ⅠB)所示化合物的方法來制備。
式(Ⅰ)所示化合物作為離體NO合成酶抑制劑的活性，已對照人體胎盤、腦及細胞素誘導(dǎo)的癌細胞中分離出來的NO合成酶，進行了驗證。
下面將僅以舉例方式來說明本發(fā)明實施例1制備S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基))二異硫脲二氫溴酸化物將1，4-亞苯基二乙酸(10.0g，51.5mmol)在四氫呋喃(200ml)，中的溶液于0℃和攪拌下滴加到氫化鋁鋰(3.91g，103mmol)混于四氫呋喃(30ml)而形成的懸浮液中。將該混合物加熱回流3小時，然后冷至0℃。緩緩加入水(4.0ml)、15%氫氧化鈉(4.0ml)及水(12ml)，使剩余的氫化鋁鋰驟冷。將懸浮液同硫酸鎂一起攪拌5分鐘、過濾并濃縮。用硅膠色譜法(乙酸乙酯/己烷梯度50-100%)提純粗制的油狀物，得到透明、無色油狀的中間體二醇(7.38g，86%)。將此油狀物溶于二氯甲烷(200ml)，所得溶液在0℃下用四溴化碳(32.4g，97.7mmol)及三苯基膦(25.6g，97.7mmol)處理。在20℃下將該混合物攪拌4小時，然后添加戊烷(500ml)。放置15小時后，將溶液從棕色固體物中潷析出來，加以濃縮并以硅膠色譜法(乙酸乙酯/己烷梯度0-20%)提純，得到油狀1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二溴化物(8.2g，64%)。將該二溴化物(4.0g，13.7mmol)及硫脲(2.09g，27.4mmol)溶于無水乙醇(100ml)所形成的溶液回流加熱2小時，冷卻并濃縮至干。使初始油狀物在乙醇中再結(jié)晶，得到白色晶態(tài)固體物1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲二氫溴酸鹽(2.89g，47%)，溶點＝234-236℃。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.26(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.01(t，J＝7.0Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析計算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;14.43。實測值C，32.45;H，4.59;Br，35.89;N，12.51;S，14.35。
實施例2制備S-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-4-氯甲基噻唑(Spraque，J.M.等J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)(1.0g，5.4mmol)及L-半胱氨酸鹽酸鹽(804mg，5.1mmol)溶于二甲基甲酰胺(10mL)所成的溶液中，添加碳酸鉀(2.5g)。在22℃下，將該懸浮液攪拌18小時。將所得混合物濃縮至干，重溶于水，并加到離子交換柱(Dowex 50×8，強酸性)上。產(chǎn)物用具有濃度梯度的氫氧化銨(0.1N-0.5N)洗脫。將匯集起來的產(chǎn)物餾分予以部分濃縮并冷干，得棕褐色帶靜電的固態(tài)物S-(2′-氨基-4′-噻唑基甲基)-L-半胱氨酸(1.04g，87%)。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ6.5(s，1H)，3.8(m，1H)，3.6(s，2H)，3.05-2.85(m，2H)。
質(zhì)譜(CI)234(M+1，71%)。
實施例3制備γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸(3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸)γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸，按實施例6的方法，用α-N-叔丁氧基羰基-γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸芐酯來制備(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，3097-3102)，收率為9.6%。
1H NMR(D2O)δ6.5(s，1H)，3.9(t，J＝6.4Hz)，2.75(m，2H)，2.2(m，2H)。
C7H11N3O2S·C2HF3O2·0.3H2O的分析計算值C，29.31;H，2.89;N，8.54;S，6.52。
實測值C，29.37;H，3.02;N，8.53;S，6.63。
實施例4制備S，S′-(1，3-亞苯基二(1，2-亞乙基))二異硫脲二氫溴酸鹽按實施例1的方法，用1，3-亞苯基二乙酸(Aldrich)制備S，S′-(1，3-亞苯基二(1，2-亞乙基))二異硫脲二氫溴酸鹽。在乙醇中再結(jié)晶后，得到白色晶態(tài)固體物(熔點 194-190℃)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.4-7.2(m，4H)，3.39(t，J＝6.9Hz，4H)，3.02(t，J＝6.9Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析計算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
實測值C，32.52;H，4.49;Br，36.04;N，12.61;S，14.35。
實施例5制備S，S′-(1，2-亞苯基二(1，2-亞乙基))二異硫脲二氫溴酸鹽按實施例1的方法，用1，2-亞苯基二乙酸(Aldrich)來制備S，S′-(1，2-亞苯基二(1，2-亞乙基))二異硫脲二氫溴酸鹽，產(chǎn)率為30%，產(chǎn)物為黃色泡沫狀物。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ7.29(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.09(t，J＝7.0Hz)。在乙醇中再結(jié)晶，得分析用樣品，熔點＝205-207℃。
C12H20Br2N4S2的分析計算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
實測值C，32.47;H，4.58;Br，35.92;N，12.58;S，14.43。
實施例6制備β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸(3-(2-氨基-4-噻唑基)-L-丙氨酸)在氮氣氛和-88℃下，攪拌由α-N-叔丁氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸芐酯(1.47g)(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，2097-3102)溶于二氯甲烷(15ml)所成的溶液，往其中加入三乙基硅烷(3ml)，再加入三氟乙酸(3ml)。將所得溶液在1小時內(nèi)加熱到室溫，然后加以濃縮。殘留物用乙酸(30ml)、20% Pd/C(2.0g)及1，4-環(huán)己二烯(20ml)處理。在2小時內(nèi)，將上述混合物加以聲處理使其從室溫升至33℃，并濾過硅藻土，用水洗滌。將濾液濃縮，再溶入30ml乙酸中，并用2.0g新鮮20% Pd/C和2ml 1，4-環(huán)己二烯處理。在經(jīng)聲處理2小時后，用硅藻土過濾懸浮液。重復(fù)添加新鮮催化劑三次，然后用重復(fù)半制備性逆相色譜法(C-18，以10%甲醇/含0.1%三氟乙酸的水進行洗脫)提純粗產(chǎn)物。凍干產(chǎn)物餾分，得337mg(18%)粘稠玻璃態(tài)固體物β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸。
1H NMR(D2O)δ 6.6(s，1H)，4.0(t，J＝7.6Hz，1H)，3.15(m，2H)。質(zhì)譜(CI)188(M+1)。
C12H12N3F9O8S的分析計算值C，27.23;H，2.29;N，7.94;S，6.06。
實測值C，27.22;H，2.42;N，7.8;S，5.67。
實施例7S，S′-(2，6-亞吡啶基二(亞甲基))二異硫脲在0℃，向由2，6-吡啶二甲醇(5.0g，35.9mmol)溶于二氯甲烷(200ml)所成的溶液中添加四溴化碳(23.83g，71.9mmol)及三苯基膦(18.85g，71.9mmol)。攪拌溶液，并在6小時內(nèi)加熱至20℃。加入戊烷(300ml)。令溶液在20℃下靜置16小時，然后過濾，以除去固體雜質(zhì)。濃縮濾液至油狀物，并以硅膠色譜法(己烷，然后10%乙酸乙酯/己烷)提純，得灰白色粉未狀固體物2，6-吡啶二溴化物(4.47g，47%)。在由2，6-吡啶二溴化物(3.94g，14.87mmol)溶于乙醇(100ml)所成的溶液中，加入硫脲(2.26g，29.74mmol)，在回流條件下，將所成懸浮液攪拌2小時，將所得溶液濃縮至干，得白色粉未狀S，S′-(2，6-亞吡啶基二(亞甲基)二異硫脲(5.3g，83.9%)。
1H NMR(200 MHz，DMSO)δ7.95(t，J＝7.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，2H)，4.65(s，4H)。
C9H15N5S2Br2·0.6H2O分析計算值C，25.26;H，3.81;N，16.36;S，14.98;Br，37.34。
實測值C，25.3;H，3.78;N，16.25;S，14.94;Br，37.38。
實施例8制備S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-5-碘甲基噻唑啉(4.44g，12mmol)(Creeke & Mellor，Tet.Lett.1989，30(33)，4435-4438)及L-鹽酸半胱氨酸(1.76g，10.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(75ml)所成的溶液中，添加碳酸鉀(5.0g，36mmol)。在22℃下，將懸浮液攪拌72小時，并回流30分鐘。加入乙腈并過濾混合物。用溫?zé)岬募状挤磸?fù)洗滌所得的固體物。用乙醇稀釋甲醇溶液，產(chǎn)生白色沉淀，并以過濾法除去之。將濃縮后的濾液(油狀物)溶入甲醇/乙醇中，并用乙醇鹽酸處理，直至再也觀察不到沉淀為止，然后過濾混合物。把濃縮濾液所得的油狀物用離子交換色譜法(Dowex 50×8，強酸性)處理，用0.1N氫氧化銨洗脫，從而將其提純。匯集茚三酮正餾分并凍干，得0.453g混雜有二甲基甲酰胺的淺棕褐色固體物。該固體物以制備性HPLC(高壓液相色譜法)(C18逆相，甲醇∶水∶三氟乙酸/5∶95∶0.1)提純，得0.36g三氟乙酸鹽形式的S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸。TLC(氫氧化銨∶甲醇/1∶50)Rf＝0.5。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ 4.37-4.24(m，1H)，4.11-3.87(m，3H)，3.27-3.13(m，2H)，3.05-2.97(m，2H)。質(zhì)譜(FAB)236.0(M+1，48%)。
C7H13N3O2S2·3(C2HF3O2)的分析計算值C，27.04;H，2.79;N，7.28;S，11.11。
實測值C，27.32;H，2.91;N，7.41;S，11.17。
實施例9制備4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸以Patt等(Synth，Commun.1990，20(20)，3097-3102)的方法，用N-t-Boc-L-2-氨基己二酸1-叔丁酯(Ramsamy等，Synthesis，1982，42-43)制備4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯，總產(chǎn)率為45%(1.3g)。
t-Boc及叔丁酯保護基團除去的方法如下在1.68g 4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯溶于35ml二噁烷所成的溶液中，加入1.1ml三乙基硅烷及8ml 4N鹽酸二噁烷溶液。過濾混合物，將固體物先在22℃下攪拌16小時，再用二噁烷沖洗。對粗樣品的核磁共振，表明反應(yīng)不完全。將粗制固體物重溶于20ml二噁烷中，用4N鹽酸(5ml)處理4小時。以過濾法分離出固體物，將其溶于水中，并凍干，得1.23g白色收濕性固體物4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸(二鹽酸鹽，水合1.4%(mol)水，并溶合0.3%(mol)二噁烷)。分析性HPLC;Phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，k′＝0.34。
1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ9.25(brs，2H)，8.5(br s 2H)，6.55(s，1H)，3.93(m，1H)，2.6(m，2H)，1.8(m，4H)。
C8H13N3O2S·2HCl·1.4H2O·0.3二噁烷的分析計算值C，32.51;H，5.99;N，12.36;S，9.43;Cl，20.86。
實測值C，32.28;H，5.72;N，12.71;S，9.60;Cl，20.86。
實施例10制備N，N′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-甲基異硫脲)在0℃下攪拌由3.30g(25mmol)間苯二甲基二胺(Aldrich Chemical產(chǎn))溶于100ml二氯甲烷所成的溶液，向其中添加7.0ml(52mmol)苯甲酰異硫氰酸酯。在20℃下，將混合物攪拌18小時，并減壓除去溶劑。將粗制固體物(淡黃色)懸浮于100ml 10%氫氧化鈉溶液中，并回流5分鐘。趁熱用濃鹽酸將混合物酸化，冷卻后添加氫氧化銨，使之呈堿性。收集沉淀出來的白色固體物，并于60℃下減壓干燥至恒重，得4.82g灰白色固態(tài)二硫脲中間產(chǎn)物。
C10H14N4S2的分析計算值C，47.22;H，5.55;N，22.03;S，25.10。實測值C，47.49;H，5.50;N，21.81;S，25.01。
向2.54g(10mmol)二硫脲中間產(chǎn)物溶于25ml二甲基甲酰胺所成的溶液中，添加5.0ml(80mmol)碘代甲烷。在20℃下，將該溶液攪拌65小時，減壓除去溶劑，并在熱乙醇中使殘留物重結(jié)晶。在60℃下，減壓干燥淡黃色結(jié)晶，得4.28g(81%)N，N′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-甲基異硫脲)。熔點＝164-167℃。TLC(用1%氫氧化銨甲醇溶液在硅膠上產(chǎn)生一個色斑，Rf＝0.48)。
1H NMR(300 MHz，DMSO/D2O)δ7.5-7.4(m，1H)，7.35-7.2(m，3H)，4.59(s，4H)，2.65(s，6H)。
C12H18N4S2·1.9HI的分析計算值C，27.43;H，3.82;N，10.66;S，12.20;1，45.89。
實測值C，27.30;H，3.91;N，10.57;S，12.19;1，45.92。
實施例11制備N，N′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基異硫脲)在由1.0g(3.93mmol)于實施例10中制得的二硫脲溶于20ml乙醇所得的溶液中，加入6.29g(78.62mmol)碘代乙烷。將該混合物加熱至回流溫度，歷時8小時，并減壓濃縮成泡沫狀物。粗產(chǎn)物以硅膠色譜法用甲醇二氯甲烷溶液(10%至20%)提純，得1.66g(74%)N，N′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基硫脲)。TLC(Rf＝0.3-0.48，20%甲醇二氯甲烷溶液)。質(zhì)譜(FAB)311.2(M+1)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 7.5-7.4(m，1H)，7.31-7.22(m，3H)，4.58(s，4H)，3.20(q，J＝7.4Hz，4H)，1.28(t，J＝7.4Hz，6H)。
C14H24N4S2·2HI的分析計算值C，29.69;H，4.27;N，9.89;S，11.32;1，44.82。
實測值C，29.44;H，4.25;N，9.64;S，11.50;1，44.65。
實施例12制備S-(3(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲以實施例1中的方法，用3-(4-羧基苯基)丙基(Lancaster Synthesis)制備(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲白色固體物(2.95g，熔點＝190-195℃)。質(zhì)譜(FAB)283(M+1)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.26(d，J＝8.1，Hz，2H)，4.36(s，2H)，3.06(t，J＝7.2Hz，2H)，2.74(t，J＝7.4Hz，2H)，2.1-1.9(m，2H)。
C12H18N4S2·2HBr的分析計算值C，32.44;H，4.54;N，12.61;S，14.43;Br，35.97。
實測值C，32.53;H，4.58;N，12.56;S，14.34;Br，35.85。
實施例13制備S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲在0℃下，向由21.48g(0.19mol)，α，α-二氯甲基·甲基醚(Fluka公司產(chǎn))溶于300ml二氯甲烷所成的溶液中，添加44.76g(0.172mol)四氯化錫(Aldrich公司產(chǎn))。15分鐘后，在數(shù)分鐘時間內(nèi)滴加由24.01g(0.14mol)2-噻吩乙酸乙酯(Aldrich)溶于50ml二氯甲烷所成的溶液。1小時后將混合物傾入冰水中，并攪拌30分鐘。二氯甲烷層用水洗滌、用硫酸鈉脫水，并加以濃縮。粗產(chǎn)物用10%乙酸乙酯的己烷溶液進行硅膠色譜提純，得22.85g(82%)5-甲?；?2-噻吩乙酸乙酯中間產(chǎn)物。
在0℃下攪拌0.77g(20.29mmol)氫化鋁鋰在200ml四氫呋喃中所成的懸浮液，向其中加入由2.0g(10.09mmol)上述所制備的中間產(chǎn)物溶于50ml四氫呋喃所成的溶液。在20℃下，將該懸浮液攪拌16小時，冷至0℃，并小心地加入0.8ml水、0.8ml 1N氫氧化鈉溶液及2.4ml水，以使剩余的氫化物停止反應(yīng)。將懸浮液同硫酸鎂一起攪拌，過濾，濃縮，并用50%乙酸乙酯的己烷溶液至100%乙酸乙酯進行硅膠色譜提純。分離得到1.07g(67%)二醇中間產(chǎn)物，再將其按如下所述直接轉(zhuǎn)化成二溴化物。
將上述二醇中間產(chǎn)物(1.07g，6.76mmol)溶于50ml二氯甲烷，在0℃下用3.90g(14.87mmol)三苯基膦及4.93g(14.87mmol)四溴化碳處理。將溶液攪拌1小時，然后往其中添加200ml戊烷，潷析出上清液，使之與油狀殘留物分離，濃縮所潷出的上清液，并用己烷進行硅膠色譜提純，得1.10g(57%)二溴化物中間產(chǎn)物。將二溴化物產(chǎn)物(1.10g，3.87mmol)溶于50ml乙醇中，并用0.59g(7.75mmol)硫脲處理。在回流條件下，將溶液攪拌2小時。溶液經(jīng)濃縮后，用制備性HPLC(Waters C18 Bondapak PrepPak cartridge)，以甲醇/水/三氟乙酸濃度梯度法(5/95/0.1至90/10/0.1)進行提純。將匯集后產(chǎn)物餾分濃縮，用水稀釋，并凍干，得306g二(三氟乙酸)鹽形式并水合0.1mol水的S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲(溶點＝186-190℃)1H NMR(200 MHz，D2O)δ 6.98(d，J＝3.5Hz，1H)，4.57(s，2H)，3.38(t，J＝6.5Hz，2H)，3.2(t，J＝6.5Hz，2H)。
C9H14N4S3·2.0C2HF3O2·0.1H2O的分析計算值C，30.96;H，3.24;N，11.11;S，19.08。
實測值C，31.02;H，3.19;N，11.00;S，18.97。
實施例14制備S-(3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲按實施例13所述，制備5-甲酰基-2-噻吩乙酸乙酯。在由2.0g(10.09mmol)所說的酯溶于100ml四氫呋喃所成的溶液中，添加3.87g(11.10mmol)乙酯基亞甲基三苯基正磷(Carbethoxymethylenetriphenylphosphorane)。將該溶液回流過夜并濃縮之。將粗產(chǎn)物與2.0g第二種用10.54g(30.27mmol)乙酯基亞甲基三苯基正磷在100ml四氫呋喃中回流3小時所得的反應(yīng)物混合。混合后的粗產(chǎn)物用硅膠色譜法(10%乙酸乙酯/己烷)提純，得2.39g(44%)烯二酯(enediester)中間產(chǎn)物。向由1.0g(3.73mmol)所說烯二酯溶于50ml乙醇所成的溶液中，添加1.0g 10%披鈀碳。在20℃及50psi氫氣氛下，將混合物搖振14小時。用硅藻土濾除催化劑，并濃縮溶液，得1.0g粗二酯中間產(chǎn)物。對該中間產(chǎn)物進行的最終三種反應(yīng)，其中包括氫化鋁鋰還原(82%)、對所成二醇進行溴化(78%)及用硫脲(88%)使二溴化物烷基化，相似于實施例13中所述的那些反應(yīng)。烷基化反應(yīng)的粗產(chǎn)物，用制備性HPLC(Waters，C18 BondaPak PrePak cartridge)法，以甲醇/水濃度梯度法10%至90%甲醇在40min內(nèi)提純(溶液以0.1%三氟乙酸緩沖)。凍干產(chǎn)物餾分，得1.53g S-((3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲，其形式為混合鹽(1.0HBr，1.1TFA)并溶合0.5mol甲醇。熔點＝146-151℃。
質(zhì)譜(FAB)303。(M+1)。1H NMR(200 MHz，D2O)δ6.77(d，J＝3.3，Hz，1H)，6.73(d，J＝3.3Hz，1H)，3.37(t，J＝6.6Hz，2H)，3.21-3.03(m，2H)，2.91(t，J＝7.2Hz，2H)，2.1-1.95(m，2H)。C11H18N4S3·1.0HBr·1.1C2HF3O2·0.5H2O的分析計算值C，31.35;H，4.24;Br，15.22;N，10.68;S，18.05。
實測值C，31.59;H，4.01;Br，14.94;N，10.45;S，18.05。
實施例15-17重復(fù)實施例2的方法。粗產(chǎn)物用制備性HPLC(Waters，C18 BondaPak Prepak cartridge)提純。用甲醇/水/三氟乙酸(5/95/0.1至90/10/1.0)濃度梯度法洗脫，再凍干，得所需的氨基酸，其形式為三氟乙酸加成鹽。
實施例15S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸用D-半胱氨酸和2-氨基-4-氯代甲基噻唑(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)來制備。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/七氟丁酸(80/20/1.7)，一個峰，k′＝1.9。UV(pH7.0緩沖劑)λmax 254nm(logε3.73)。1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ8.1(br，2H)，8.1-7.5(br，2H)，6.5(s，1H)，4.25(m，1H)，3.65(d，J＝6Hz，2H)，3.0(m，2H)。
C7H11N3O2S·2.3C2HF3O2·0.1H2O的分析計算值C，27.92;H，2.72;N，8.43;S，12.85。
實測值C，28.00;H，2.89;N，8.74;S，12.62。
實施例16S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸用(D，L)-高半胱氨酸及2-氨基-4-氯代甲基噻唑來制備(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一個峰，k′＝2.3。UV(pH7.0緩沖劑)λmax 254nm(logε3.73)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 8.5-8.0(br，2H)，7.2-7.0(br，2H)，6.35(s，1H)，4.0(t，J＝4Hz，1H)，3.55(s，2H)，2.6(m，2H)，2.0(m，2H)。
C8H13N3O2S·1.1C2HF3O2·1.0H2O的分析計算值C，31.35;H，4.15;N，10.75;S，16.41。
實測值C，31.30;H，4.07;N，10.73;S，16.31。
實施例17S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸用L-半胱氨酸及2-氨基-4-(2-溴代乙基)噻唑(用1，5-二溴-2-丁酮作原料，以Spraque等人的方法制得，J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)作原料來制備。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一個峰，k′＝2.6。UV(pH7.0緩沖劑)λmax 256nm(logε3.71)。1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ9.2-8.8(br，2H)，8.6-8.2(br，2H)，6.6(s，1H)，4.2(m，1H)，3.0(m，2H)，2.8(m，2H)。
C8H13N3O2S2·2.0C2HF3O2·2.4H2O的分析計算值C，27.79;H，3.85;N，8.10;S，12.37。
實測值C，27.65;H，3.69;N，8.02;S，12.38。
實施例18制備S-(2-(4-溴代苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽在0℃下，向由4-溴代苯乙醇(720mg，0.5ml，3.58mmol)及三苯基膦(1.13g，4.30mmol)溶于二氯甲烷(7.0ml)所成的溶液中，添加四溴化碳(1.42g，4.30mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌30min，同時加熱至室溫。將溶液傾入己烷(100ml)，并濾過硅藻土。真空蒸除溶劑，添加己烷，并使溶液濾過硅藻土。在真空除去溶劑后，對粗料進行球管蒸餾(120℃/70μm Hg)，得透明油狀物。
將該透明油狀物溶于95%乙醇(7.0ml)，并加入硫脲(300mg，3.94mmol)。加熱反應(yīng)混合物至回流溫度，并回流16h，冷至室溫，并真空除去溶劑，得白色固體物。將該固體物懸浮于熱丙酮中并過濾之，得832mg(68% 收率)的標(biāo)題化合物。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.02(s，4H)，7.52(d，J＝8.3Hz，2H)，7.26(d，J＝8.3Hz，2H)，3.43(t，J＝7.6Hz，2H)，291(t，J＝7.4Hz，2H)。C9H12N2SBr2的M.S.(CI)，m/z(相對強度)259(M+-Br，100)，183(68)，77(92)。
C9H12N2SBr2的元素分析計算值C，31.79;H，3.56;N，8.24;S，9.43;Br，46.99。
實測值C，31.84;H，3.59;N，8.19;S，9.34;Br，46.92。
實施例19制備S-(2-(4-氟代苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽按實施例18的方法，用4-氟苯乙醇來制備。使標(biāo)題化合物在無水乙醇中重結(jié)晶而將其提純。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.10(br，s，2H)，8.96(br.s，2H)，7.32(m，2H)，7.14(m，2H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.91(t，J＝6.8Hz，2H)。
C9H12N2SFBr的M.S.(CI)，m/z(相對強度)199(M+-Br，42)，77(100)。
(C9H12N2SF)(CH4N2S)0.63(HBr)1.06的元素分析計算值C，34.84;H，4.43;N，13.75;S，15.74;Br，25.51。
實測值C，35.31;H，4.41;N，13.62;S，15.51;Br，25.92。
實施例20制備S-(2-(4-(乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽按實施例18的方法，用4-乙氧基-3-甲氧基苯乙醇來制備。使標(biāo)題化合物在無水乙醇中重結(jié)晶而將其提純。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO);δ 8.95(br，s，4H)，6.87(s，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz，1H)，6.73(d，J＝8.2Hz，1H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C12H19N2O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相對強度)255(M+-Br，56)，179(100)。
C12H19N2O2SBr的元素分析計算值C，42.99;H，5.71;N，8.36;S，9.56;Br，23.83。
實測值C，43.09;H，5.73;N，8.42;S，9.61;Br，23.89。
實施例21制備S-(2-(4-(乙氧基苯基)乙基)異硫脲鹽酸鹽按實施例18的方法，用4-乙氧基苯乙醇來制備。將粗產(chǎn)物溶于水，并添加2摩爾當(dāng)量的含水苦味酸鈉。以過濾法分離出淺黃色沉淀物，并在AG1-X2陰離子交換樹脂(200-400目，氯化物狀態(tài)，10∶1的水∶甲醇洗脫液)上進行色譜分離，得鹽酸鹽。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.19(br.s，4H)，7.19(d，J＝8.1Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相對強度)225(M+-Cl，37)，149(100)。
(C11H16N2OS)(HCl)1.08(CH4N2S)0.08(H2O)0.16的元素分析計算值C，48.81;H，6.55;N，11.10;S，12.70;Cl，14.04。
實測值C，48.91;H，6.41;N，11.12;S，12.55;Cl，14.20。
實施例22制備S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)異硫脲鹽酸鹽按實施例21的方法，用2，6-二甲氧基苯乙醇來制備。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.14(br，s，4H)，7.18(t，J＝8.2Hz，1H)，6.07(d，J＝8.2Hz，2H)，3.73(s，6H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)。
C11H17N2O2SCl的元素分析計算值C，47.74;H，6.19;N，10.12;S，11.48;Cl，12.81。
實測值C，47.77;H，6.19;N，10.07;S，11.48;Cl，12.87。
實施例23制備S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)異硫脲鹽酸鹽按實施例21的方法，用4-甲氧基苯乙醇來制備。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.19(br，s，4H)，7.19(d，J＝8.0Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.2Hz，2H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相對強度)211(M+-Cl，22)，135(100)。
(C10H15N2OSCl)的元素分析計算值C，48.68;H，6.13;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
實測值C，48.70;H，6.10;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
實施例24制備2-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲鹽酸鹽按實施例21的方法，用3-甲氧基苯乙醇來制備。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(br，s，4H)，7.21(t，J＝7.9Hz，1H)，6.80(m，3H)，3.72(s，3H)，3.43(t，J＝7.0Hz，2H)，2.88(t，J＝7.4Hz，2H)。
C10H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相對強度)211(M+-Cl，100)，135(10)，77(70)。
(C10H15N2OS)(HCl)1.05(CH4N2S)0.20(H2O)0.05的元素分析計算值C，45.39;H，6.13;N，12.62;S，14.45;Cl，13.61。
實測值C，45.28;H，6.18;N，12.54;S，14.43;Cl，13.65。
實施例25制備S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽按實施例18的方法，用2，4，6-三甲氧基苯乙基醇來制備。使標(biāo)題化合物在無水乙醇中重結(jié)晶而將其提純。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(s，4H)，6.80(s，2H)，3.24(t，J＝6.8Hz，2H)，2.84(t，J＝6.7Hz，2H)，2.49(s，3H)，2.28(s，6H)。
C12H19N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相對強度)223(M+-Br，50)，147(100)。
C12H19N2SBr的元素分析計算值C，47.53;H，6.32;N，9.24;S，10.57;Br，26.53。
實測值C，47.26;H，6.30;N，9.34;S，10.49;Br，26.48。
實施例26制備S-(2-(3-甲基苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽按實施例18的方法，用3-甲基苯乙醇來制備。使標(biāo)題化合物在無水乙醇中重結(jié)晶而將其提純。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.08(br，s，2H)，9.03(br，s，2H)，7.20(t，J＝7.5Hz，1H)，7.08(m，3H)3.43(t，J＝7.8Hz，2H)，2.88(t，J＝7.6Hz，2H)，2.28(s，3H)。
C10H15N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相對強度)195(M+-Br，100)，119(56)，77(42)。
(C10H15N2SBr)(CH4N2S)0.14的元素分析計算值C，42.60;H，5.49;N，11.17;S，12.79;Br，27.95。
實測值C，42.66;H，5.50;N，11.20;S，12.57;Br，27.79。
實施例27制備S-(2-(2-氟苯基)乙基)異硫脲鹽酸鹽按實施例21的方法，用2-氟代苯乙醇來制備。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.21(br，s，4H)，7.39(m，1H)，7.28(m，1H)，7.17(m，2H)，3.43(t，J＝7.7Hz，2H)，2.92(t，J＝7.8Hz，2H)。
C9H12N2SFCl的M.S.(CI)，m/z(相對強度)199(M+-Cl，100)，123(39)。
C9H12N2SFCl的元素分析計算值C，46.05;H，5.15;N，11.93;S，13.66;Cl，15.10。
實測值C，45.93;H，5.11;N，11.83;S，13.59;Cl，15.14。
實施例28制備S-(2-(3-硝基苯基)乙基)異硫脲氫溴酸鹽在0℃下，向由3-硝基苯乙醇(500mg，2.99mmol)及吡啶(35.6mg，36μl，0.45mmol)溶于THF(10ml)所成的溶液中，添加三溴化磷(298mg，0.10ml，1.10mmol)。即刻形成白色沉淀物。將反應(yīng)混合物加熱至室溫，并攪拌1h。加入水和乙醚，并將二相分離。有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，并用無水硫酸鎂脫水。過濾混合物，并真空除去溶劑，得棕色油狀物。
將粗制溴化物溶于95%乙醇(10ml)，并向其中加入硫脲(251mg，3.30mmol)。將反應(yīng)混合物加熱回流16h，冷至室溫，真空除去溶劑。將粗制黃色固體物懸浮于丙酮中，并將該混合物加熱回流10min。過濾熱溶液，得白色固體物。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.12(br，s，2H)，8.96(br，s，2H)，8.22(s，1H)，8.14(d，J＝7.9Hz，1H)，7.78(d，J＝7.6Hz，1H)，7.64(t，J＝8.0Hz，1H)，3.50(t，J＝7.0Hz，2H)，3.10(t，J＝7.2Hz，2H)。
C9H12N3O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相對強度)226(M+-Br，26)，136(36)，76(81)。
C9H12N2O2SBr的元素分析計算值C，35.31;H，3.95;N，13.72;S，10.47;Br，26.10。
實測值C，35.22;H，3.88;N，13.62;S，10.36;Br，26.18。
實施例29制備S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)異硫脲在室溫下，向由新蒸餾過的N-(2-溴代乙基)吡咯(1.00g，5.74mmol)溶于95%乙醇(12ml)所成的溶液中，添加硫脲(415mg，5.74mmol)。在回流下，攪拌溶液22h，冷至室溫，并真空濃縮該混合物，得稠密的淺米黃色漬狀物。令該油狀物在室溫下結(jié)晶16h以上，過濾晶體并以氯仿(10ml)沖洗，得1.078g標(biāo)題所述化合物，其形態(tài)為淺米黃色針狀結(jié)晶(收率75%)。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.06(br，s，4H)，6.80(t，J＝2.10Hz，2H)，5.99(t，J＝2.10Hz，2H)，4.12(t，J＝6.50Hz，2H)，3.52(t，J＝6.50Hz，2H)。
C7H12N3SBr的元素分析計算值C，33.61;H，4.84;N，16.80;S，12.82;Br，31.94。
實測值C，33.68;H，4.84;N，16.74;S，12.74;Br，31.99。
熔點94.6-95.0℃。
實施例30用下列方法測定了對NO合成酶的抑制作用由人胎盤提純NOS
從新鮮胎盤中除去羊膜及絨毛膜，然后用0.9% NaCl沖洗胎盤。在一臺Waring攪切機中，以3體積HEDS緩沖液(20mM HEPES pH7.8，0.1mM EDTA，5mM DTT，0.2M蔗糖)加0.1mM PMSF使組織勻漿化。使勻漿濾過干酐包布，再以1000g離心20min。將上清液以27，500g在離心30min。在上清液中加入固體硫酸銨，使飽和度達到32%。把沉淀出來的蛋白質(zhì)以25，000g制成團粒，再將其重溶于最小體積的HEDS緩沖液加0.1mM PMSF、10μg/ml抑酶醛肽及大豆胰蛋白酶抑劑制、以及1μg/ml抑胃肽的混合液中。重溶后的丸粒以15，000g離心10min。向上清液中加入1/20體積的2.5′ADP瓊脂糖樹脂(Sigma)，并將漿料緩慢混合過夜。第二天一早，將漿料裝入柱中。依次用HEDS、0.5M NaCl(溶于HEDS)、HEDS洗滌樹脂，再用10mM NADPH(溶于HEDS)洗脫NOS。該酶可用超濾及速凍法來濃縮，并在-70℃下貯存至少3個月而不失活。
人胎盤NOS的測定按Schmidt等人的方法(PNAS，88，365-369，1991)來觀察瓜氨酸的形成，以測定NOS，該方法的改變?nèi)缦?0mM Hepes，PH7.4，10μg/ml調(diào)鈣蛋白，2.5mM CaCl2，2.5mM DTT，125μm HADPH，10μm四氫生物喋呤，0.5mg/ml BSA，以及1μML-[14C]精氨酸(New England Nuclear產(chǎn))。在使用單時間點測定速度來對動力學(xué)進行研究之前，先確定NOS催化速度的線性。
從細胞誘導(dǎo)的人體結(jié)腸直腸腺癌DLD-1細胞中提純NOS在37℃下，使DLD-1(ATCC編號CCL221)在補充以L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、以及10%熱滅活胎牛血清的，5% CO2溶于RPMI 1640所成的培養(yǎng)基中生長。使細胞生長至融合，然后加入下列細胞素合劑100單位/ml干擾素-γ，200單位/ml白細胞介素-6(interleukin-6)，10ng/ml腫瘤壞死因子，以及0.5ng/ml白細胞素-1β(interleukin-1β)。在18-24h誘導(dǎo)后，刮收細胞，并以磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌。將成困粒的細胞貯存在-70℃下。在4℃下，對已誘導(dǎo)過的NOS進行提純。將置于TDGB(20mM tris pH7.5，10%甘油，1mM DTT，2μM四氫生物喋吟)的細胞冷凍/解凍三次，以此來制備粗浸出液。將浸出液直接加到2′，5′ADP瓊脂糖(Pharmacia)柱上。順次用TDGB、0.5M NaCl的TDGB溶液、TDGB來洗滌樹脂。用2mM NADPH(溶于TDGB)來洗脫NOS。接著，加入BSA，將1mg/ml的最終濃度。NOS可予以速凍，并可在-70℃下貯存至少2月而不失活。
可誘導(dǎo)人體NOS的測定按上所述來測定瓜氨酸的形成，但使用10μM FAD，并從測定混合物中除去調(diào)鈣蛋白和CaCl2。
從人腦中提純NOS人腦NOS用Schmidt等人(PNAS88，365-369，1991)、Mayer等人(Fed.Eur.Biochem.Soc.288 187-191，1991)及Bredt與Snyder(PNAS 87 682-685，1990)提出的各種方法來制備。簡而言之，將新鮮的整腦(3個，分離掉有髓組織，1050g)在冷緩沖液A(50mM HEPES，pH7.5(室溫pH值)及0.5mM EDTA，10mM DTT，總體積3.6L)中，用多聚酯來勻漿?；旌衔镆?3，000g離心1h，并取出上清液(約2050ml)。在上清液中添加固態(tài)硫酸銨(365g，約30%飽和)，并緩慢攪拌總計30min。
沉淀物以13，000g造粒30min，并將這些團粒重新懸浮于約400ml含4μM四氫生物喋呤、1μM FAD(Sigma)及1μM FMN(Sigma)的緩沖液A中。將懸浮液以41，000g離心60min。取出上清液，傾入液氮中予以冷凍，并在-70℃下保存過夜。將混合物解凍，并使之以4ml/min流過2′，5′ADP-瓊脂糖柱(0.4g，膨脹于緩沖液A中)。以100ML緩沖液A、200ml含500mM NaCl的緩沖液A、100ml緩沖液A，以及30ml含5mM NADPH的緩沖液A洗滌該柱。向酶溶液中添加四氫生物喋呤至10μM，F(xiàn)AD及FMN至1μM，以及加吐溫(Tween)至0.1%。用Centriprep-30將該溶液濃縮至體積約為500μl。按Schmidt等于1991年所述的方法測定酶活性，但在測定時使用了10μM四氫生物喋呤。
抑制的結(jié)果示如表1。
數(shù)值為抑制常數(shù)(Ki)，該常數(shù)是通過在三種或三種以上抑制劑濃度下測量百分抑制率，并估計相對于精氨酸的競爭抑制率后而獲得的。
權(quán)利要求
1.具有NO合成酶抑制作用的異硫脲衍生物供制造有利于抑制NO合成酶的疾病治療藥物的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中異硫脲衍生物是通式(Ⅰ)
所示的化合物或其鹽，式中R為(1)一個C1-14烴基;或(2)一個5-節(jié)和6節(jié)的雜環(huán);或(3)一個9節(jié)雙雜環(huán)系上述各R基團可為一或二個各自分別選自下列基團的基團所取代(a)鹵;(b)-XR1，其中X為氧，C(O)m，式中m為1或2;S(O)n，式中n為0、1或2;或者NR2，式中R2為氫、C1-6烷基或C3-6環(huán)烷基，或者R2連到R1上，形成一個C2-6亞烷基;R1為氫;或C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C3-6環(huán)烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)基團，上述各基團可任選地為一個或二個各自分別選自下列基團的基團所取代C1-3烷基、羥基、C1-3烷氧基團、氨基、C1-3烷基氨基、鹵、硝基、或者C(O)m′R2b基團，式中m′為1或2，R2b為氫或C1-4烷基;或者R1為一個NR3R4基團，式中R3和R4可相同或不同，且各為氫或C1-4烷基，或者R3和R4相連，形成一個C2-6亞烷基;(c)一個
基團，式中Y為氧;S(O)n，式中n如上所規(guī)定;或NH5，式中R5為氫或C1-4烷基;W為0或1;Q為C2-4烴基;或者亞氨基氮連接到R基團或Q基團上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);或者(d)一個基團A，其中A是一個雜環(huán)系，它可優(yōu)選地為如上定義的基團
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6鏈烯基或鏈炔基或者C3-6環(huán)烷基;或者R中各碳原子之一連到式(Ⅰ)所示化合物中的亞氨基氮原子上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán);條件為R不是甲基。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中R為(1)C1-4烷基;(2)C2-4鏈烯基，(3)一個
基團，其中p為1至2，q為0至1;或者(4)一個5節(jié)或六節(jié)雜環(huán)，其中含有一或二個氮原子;上述各基團可任選地為一個或二個相同或不同的下列基團所取代(a)鹵素，優(yōu)先為溴;(b)一個OR2b′，其中R2b′為氫或甲基;(c)一個C(O)mR2b′，其中m及R2b′如上所定義;(d)一個SR9基團，其中R9為甲基或乙基;(e)一個NR7bRab基團，其中R7b和R8b各自分別選自氫或C1-4烷基，優(yōu)先為氫、甲基或乙基;(f)一個可任選地為如上所定義的一個OR2b′，或
基團所取代的苯環(huán);(g)含有一個或二個各自分別選自氮或氧的雜原子的5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，或者(h)C1-4烷基，優(yōu)先為甲基;或者R中的一個碳原子連到式(Ⅰ)所示化合物的亞氨基氮上，形成一個噻唑或噻唑啉環(huán)。
4.權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，條件為R不是乙基、丙基或異丙基。
5.權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中異硫脲衍生物是式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)所示的化合物。
式中R′為一個C1-8亞烷基，C2-8亞烯基或亞炔基，它們含或不含一個苯環(huán)、一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，或者一個如前所定義的X基團，其中虛線代表一個雙鍵或一個單鍵。
6.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中異硫脲衍生物為式(Ⅱ)
所示的化合物或其鹽，式中Ra為一個C1-8炔基，或者5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，或者一個9節(jié)雙環(huán)雜環(huán)系，它們各自任選地被鹵素或者一個或二個-XaR1a所取代，其中R1a為氫、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C7-9芳烷基、C5-10芳基，或者一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)基團，該雜環(huán)基團任選地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、鹵素或硝基所取代，或者R1a為一個NR3aR4a基團，其中R3a和R4a或同或不同，且各為氫或C1-3烷基，或者R3a和R4a相連，形成一個C2-6亞烷基，且Xa為氧;C(O)ma，其中ma為1或2;S(O)na，其中na為0、1或2;或者NR2a，其中R2a為氫、C1-6烷基或C3-6環(huán)烷基，或者R2a連到R1a上，形成一個C2-6亞烷基，或者為一個
基團所取代，其中t為0至4，Wa為0或1，Ya為氧、硫及NR7a，其中R7a為氫或C1-4烷基;或者Ra將硫原子連到式(Ⅰ)所示化合物中的一個氮原子上，形成一個5節(jié)或6節(jié)雜環(huán)，條件是Ra不是甲基。
7.權(quán)利要求1至6所述的應(yīng)用，其中所述異硫脲衍生物選自S-(2-氨乙基)異硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)異硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)異硫脲S，S′-亞乙基二(異硫脲)S，S′-1，5-亞戊基二(異硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)異硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亞己基二(異硫脲)S，S′-1，7-亞庚基二(異硫脲)S-芐基異硫脲S-(2-嗎啉代乙基)異硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)異硫脲S，S′-(1，4亞苯基二(亞甲基)二異硫脲S-叔丁基異硫脲S-(4-乙基芐基)異硫脲S-((甲硫基)甲基)異硫脲S-(3-溴丙基)異硫脲S-(2-溴乙基)異硫脲S-(3-甲基-2-丁烯基)異硫脲S-烯丙基異硫脲S-(3-氨基丙基)異硫脲S，S′-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二異硫脲S，S′-(2-亞甲基-1，3-亞丙基)二異硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亞基)二異硫脲S，S′-(1，3亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)異硫脲S-(3-羥基丙基)異硫脲S-(2-苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-甲基異硫脲)N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基異硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲S-(2-(4-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)異硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)異硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲或它們的鹽。
8.權(quán)利要求1至3或6中任何一項所述的應(yīng)用，其中所述異硫脲衍生物選自S-乙基異硫脲、S-丙基異硫脲、S-異丙基異硫脲。
9.權(quán)利要求1所述異硫脲作治療系統(tǒng)性低血壓的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述異硫脲作治療敗血性休克的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求9所述異硫脲的應(yīng)用，其中系統(tǒng)性低血壓因細胞素或細胞素誘導(dǎo)療法所致。
12.權(quán)利要求1所述異硫脲作短期免疫抑制治療的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1所述異硫脲作自體免疫疾病治療的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1所述異硫脲作炎性疾病治療的應(yīng)用。
15.除了S-乙基異硫脲、S-丙基異硫脲、S-異丙基異硫脲、芐基異硫脲、S，S-(1，4-亞苯基二(亞甲基)二異硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)異硫脲之外，供藥用的式(Ⅰ)所示異硫脲衍生物。
16.前列權(quán)利要求中所定義式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)的新異硫脲衍生物。
17.權(quán)利要求16所述的異硫脲衍生物，該衍生物選自S，S′-(1，4-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)二異硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亞苯基二(1，2-亞乙基)二異硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-甲基異硫脲)N，N-(1，3-亞苯基二(亞甲基))二(S-乙基異硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)異硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)異硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)異硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)異硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)異硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)異硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)異硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)異硫脲及其鹽。
18.權(quán)利要求16所述異硫脲衍生物的制備方法，該方法包括a)硫脲與化合物RL(L′)r的反應(yīng)，式中R如前所定義，L及L′均為離去基團，r為0或1，需要時，在反應(yīng)后除去保護基團;或者b)除去式(IB1)所示化合物的保護基團，
式中R′及虛線的定義如前所述，P及P′或同或不同，均為保護基團。
19.一種醫(yī)藥制劑，該制劑包括除S-乙基異硫脲、S-丙基異硫脲、S-異丙基異硫脲、S-芐基異硫脲、S，S-(1，4-亞苯基二亞甲基二異硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)異硫脲之外，如前所定義的一種異硫脲衍生物，或其任一種藥理學(xué)可接受的鹽或其溶劑化物，以及一種或多種藥理學(xué)可配伍的載體，以及可含或不含一種或多種其它治療性成分。
20.一種有利于NO合成酶抑制的疾病治療方法，該方法包括投給治療有效的量的、具有對NO合成酶抑制作用的異硫脲衍生物。
全文摘要
公開了異硫脲衍生物及其在醫(yī)學(xué)，尤其在有利于抑制一氧化氮合成酶的疾病治療方面的應(yīng)用，還公開了含該類衍生物的藥物制劑及其制造方法。
文檔編號C07D207/36GK1095710SQ9312164
公開日1994年11月30日 申請日期1993年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月27日
發(fā)明者E·P·加維, G·J·塔努力, J·A·奧普林格, E·S·富法恩 申請人:惠爾康基金會集團公司