專利名稱：適用于稻瘟病抗性基因橫的核酸標記物以及使用這些標記物分離到的稻瘟病抗性基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于稻瘟病抗性基因的核酸標記物，以及使用這些核酸標記物分離到的稻瘟病抗性基因。
稻瘟病抗性基因不僅對于開發(fā)優(yōu)良栽培稻種十分有用，而且還可以作為研究材料以及作為創(chuàng)制能被導入各種植物體的新抗性基因的遺傳源。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知存在著給植物提供抗病源體抗性的基因，并且在常規(guī)繁育中已經(jīng)將引入這些基因作為重要的指標。因此，至今通過導入這些抗性基因已制造了許多新類型的栽培種。鑒于這種生物方法通過利用植株的遺傳功能而阻礙瘟疫流傳將降低化學殺蟲劑的消耗，并且促進了人類健康以及保存了完好的環(huán)境，還能降低農(nóng)業(yè)成本，因此這些抗性基因的重要性將在世界范圍內(nèi)日益提高。
在抗病源體的植物抗性基因中，首先在日本發(fā)現(xiàn)了稻瘟病抗性基因，其后已知存在許多這樣基因。尤其是，來自于印度稻的抗性基因?qū)υ谌毡景l(fā)現(xiàn)的許多種稻瘟病真菌顯示有抗性，并且是十分有用的遺傳資源。在其他基因中，來源于印度稻的Pi-ta，Pi-ta2基因適合于分析基因的RFLP圖譜。但是仍然僅有十分有限的情況是將基因?qū)牒髮嶋H上提供了優(yōu)良栽培種。
原因可能是常規(guī)的育種方法需要通過許多代回交將抗性基因?qū)胍粋€栽培種，并且伴隨該過程，每年將病源體接種到許多單株上進行抗性試驗。由于嚴格控制外源病源體輸入，在日本國內(nèi)對外來病源體進行抗性檢測幾乎是不可能的。
另一方面，在植物生物技術(shù)方面的最新進展已能識別和分離各種基因，并且然后將它們導入到各種植株中。因此，對于植物抗性基因，如果使用遺傳工程技術(shù)將它們克隆后導入到任何有用的栽培種中并不困難，這樣將大大地降低在繁育抗性栽培種時需要的時間及勞動力。還可以闡明抗性基因怎樣在植株中活動的機理，并且可使修飾該基因然后提供新類型的抗性基因成為可能?，F(xiàn)在許多研究組正在努力嘗試以分離到抗性基因，但至今僅有幾個組獲得了成功。這歸因于下列事實只知道有限的關(guān)于抗性基因產(chǎn)物的生化特征的信息。
作為一種鑒別和分離基因的方法，一種已知的定位克隆技術(shù)正引起人們的注意。該技術(shù)使用基因圖譜中靠近靶基因的核酸標記物，并且從基因組文庫中分離出靶基因。實際上，使用該技術(shù)已經(jīng)分離到了某些引起人類遺傳病的基因。
雖然，在植物中已報道的這種位置克隆僅有幾種成功的情況，但根據(jù)下列原因據(jù)認為稻是該技術(shù)最合適的植物(1)在主要的作物中稻的基因組尺寸最小;(2)水稻中與一個單位遺傳距離(CM)相對應的物理距離(以kb計)非常小;(3)通過使用幾個鄰近的某基因系(NIL)很容易限制基因位點范圍，其中已通過將印度稻衍生的基因漸滲到日本稻本底而產(chǎn)生鄰近的某基因系(NIL);以及(4)容易將基因?qū)氲接糜诨パa測試的細胞中。
這種位點克隆過程成功的一個重要關(guān)鍵點是一能否得到一個相鄰接的有效的標記物。根據(jù)稻基因組大小和遺傳圖譜進行計算結(jié)果，估計對應于稻遺傳圖譜的1厘摩(CM)的物理距離(基于核酸來計算)大約為100-200kb。另一方面，插入的人工染色體(YAC)的平均大小大于200kb。因此，如果有一種距離小于100kb，即0.5-1.0CM的抗性基因的DNA標記物，該基因位點克隆的成功的可能性被認為是非常高的。
使用這樣的稻瘟病抗性基因的鄰近核酸標記物還可以大大地降低在常規(guī)育種中例如通過回交而檢測抗性所需的時間和勞動力。
本發(fā)明一個目的是提供稻瘟病抗性基因的新的鄰近核酸標記物，以及使用這些標記物分離并克隆的稻瘟病抗性基因。
本發(fā)明提供了稻瘟病抗性基因的核酸標記物，這些標記物與從稻基因組DNA中分離的RFLP探針進行雜交，并且定位于離稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta22.0 ceuti Morgan(CM)的距離內(nèi)。
本發(fā)明還提供了定位于在上面介紹的核酸標記物的二級核酸標記物，以及與利用這些核酸標記物分離到的抗性基因相關(guān)的基因組。
根據(jù)本發(fā)明，提供了適用于分離稻瘟病抗性基因Pi-ta2或Pi-ta的有效的標記物。通過這些核酸標記物的應用，便可以方便地從各種栽培稻種內(nèi)分離到稻瘟病抗性基因以及相關(guān)的基因組，從而有利于開發(fā)和繁育出優(yōu)良栽培種。還可以方便地完成水稻抗性檢測。開創(chuàng)了制備新的抗性基因的途徑。


圖1.表示將水稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-ta2導入日本栽培稻種的譜系圖。底下劃線表示帶有抗性基因的栽培種。
圖2.圖解觀察水稻第十二種染色體的帶有Pi-ta2或Pi-ta的鄰近等基因系。黑色或灰色部分表示來源于印度供體的區(qū)域。
圖3是將稻第十二染色體上的稻瘟病抗性基因Pi-ta2和Pi-ta擴大后的解剖圖。a將PiNo.4(帶有Pi-ta2)和Norin22(無Pi-ta2)之間雜交后進行F2分析結(jié)果。bKasalatb(印度稻)和Koshihikari(日本稻)雜交后F2分析結(jié)果;這親本都不帶有抗性基因。c來源于圖2的結(jié)果的可能存在的Pi-ta2區(qū)域。較小的括號表示Pi-ta和Pi-ta2精確的等位的情況。較大的括號表示Pi-ta和Pi-ta2不精確的非等位基因的情況。
下文進一步詳細描述本發(fā)明的核酸標記物通過比較幾個帶有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-ta2的不同栽培稻種的基因組DNAS以及不帶有瘟病抗性基因的栽培稻種的基因組DNAs，并且在稻瘟病抗性基因附近(2.0CM或200-400kb內(nèi))識別出在帶有稻瘟病抗性基因的栽培種中存在的特異性DNA譜帶。
基因組DNAs的比較可以在具有稻瘟病抗性基因的印度稻栽培種(供體親本)和不具有這種基因的日本栽培稻種(回交親本)之間進行并且通過將供體親本和回交親本的回復雜交而開發(fā)了兩稻栽培種之間的鄰近等基因系。
此外，通過與任何RFLP探針雜交可以檢測到本發(fā)明的核酸標記物。因此在本發(fā)明中，通過用限制性酶切割待測試的稻栽培稻種的基因組DNA(例如上面介紹的供體親本，回交親本和鄰近等基因系)，然后在凝膠電泳后與一種RFLP探針雜交而鑒別DNA標記物。
通過RFLP分析而將由此制備到的本發(fā)明的核酸標記物分級分離如在所試驗的稻栽培種單株的基因組DNA中是印度稻來源或日本稻來源，并且被定位于稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta2的2CM的附近范圍內(nèi)，并且可作為稻瘟病抗性基因或相關(guān)基因的有效的標記物。
本發(fā)明將用實施例和試驗的方法在以下作進一步的詳細說明。
實施例鑒別稻瘟病抗性基因Pi-ta2的核酸標記物。
(1)材料的制備(a)DNA提取分別采用已知方法制備下列提取物(1)含有水稻DNA文庫的大腸桿菌DNA估粒;
(2)含有稻瘟病抗性基因Pi-ta1的栽培稻(供體親本)的DNA;
(3)不含有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的日本栽培(回交親本)的DNA;
(4)通過將回交親本與供體親本重復雜交而制備的稻栽培種DNA(鄰近等基因系)。
(b)RFLP探針使用由Saito等(Jpn.J.Bneed.，41，665670，1991)限定的稻第十二染色體的RFLP探針。
(2)DNA片段與RFLP探針雜交對于在上述(a)中列出的DNA提取物(1)至(4)中每一種，使用限性酶(見表1)將2-3μg的基因組DNA分裂成片段，并加到用1×TAE緩沖液和0.7-1%瓊脂糖配制的凝膠的3-5×1-mm狹槽中并以5V/cm的電壓梯度電泳4小時。然后采用已知技術(shù)將DNA從電泳后的凝膠上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。另一方面，采用已知技術(shù)(例如隨機引物方法)用32P或過氧化物酶將上述(b)中列出的RFLP探針進行標記，并且采用Southern雜交方法，基于它們的互補性而特異性地與固定在膜上的DNA雜交。隨后，通過置于X射線膠片上而檢測雜交DNA譜帶。
(3)核酸標記物的鑒別對于上述(1)-a的(2)，(3)，(4)列出的DNA提取物的DNA片段，比較與RFLP探針的雜交的DNA譜帶，并且存在具有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的DNA2)和4)而不存在于不具有Pi-ta2基因的DNA3)中的譜帶被標記。從由F2分析得到的這些DNA譜帶中選擇出定位于離Pi-ta2基因2.0cm的距離內(nèi)的DNA譜帶，并且鑒別出這些DNA譜帶為Pi-ta2基因的核酸標記物。
表1顯示與Pi-ta2附近的核酸標記物雜交的RFLP探針，探針的大小以及用于切割基因組DNA的限制性酶。
還證明了如果這些標記物來源于具有Pi-ta2基因的栽培稻種則這些標記物也可用作為上述水稻基因組文庫(1)的Pi-ta2的滿意的標記物。
接下來完成一些試驗以調(diào)查將要顯示的這些核酸標記物的特征。
試驗1對于實施例中獲得的核酸標記物，測試其在鄰近等基因系(NILS)中的行為，該鄰近等基因系已通過與印度栽培稻重復回交而導入了稻瘟病抗性基因。
已知來源于印度稻的Pi-ta2和Pi-ta基因占據(jù)相同位點并且通過如圖1所示的重復回交而分別將它們導入到5和4個系中。在這些供體親本，回交親本和鄰近等基因系中調(diào)查靠近Pi-ta2的RFLPS，并且弄清每個栽培種中來源于印度稻的染色體區(qū)。
從顯示于圖1中的每個栽培種中提取DNAs并利用表1顯示的RFLP探針進行Southern印跡分析，以調(diào)查每個鄰近基因系中來源于印度稻的染色體區(qū)(圖2)。結(jié)果，估計Pi-ta2在染色體圖譜上的位置是在圖2劃分的范圍內(nèi)。
試驗2進行F2分析以在RFLP圖譜中確定稻瘟病抗性基因Pi-ta2的位置。
將一種具有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的栽培種PiNo.4與一種不含有Pi-ta2的栽培種Norin22進行雜交，并且獲得了許多F2單株。利用這些F2，測定稻瘟病抗性基因Pi-ta2和核酸標記物之間的重組比例，以及測定它們之間的遺傳距離。
栽培的400粒F2單株，在約5片葉期時，將1×105/ml的稻瘟病HoRu-1菌株菌絲體懸液噴霧接種到葉上。將經(jīng)過接種后的葉置于25℃，100%相對濕度24小時，然后移到溫室中。接種7天后，根據(jù)葉上出現(xiàn)的壞死損傷而確診單株是抗性或易感染。
從確定為易感染性的84個單株的每株提取DNA，并以相同于實施例描述的方法用RFLP探針進行Souhem雜交，以檢測各個核苷酸標記物帶是印度型或日本型。結(jié)果，用XNpb289探測的核酸標記物未發(fā)現(xiàn)重組，估計該標記物和抗性基因之間的遺傳距離低于0.0CM。該距離相當于基因組DNA中約小于60-120kb的距離?？紤]到在酵母人工染色體(YAC)中200-300kb基因組片段容易獲得因而該遺傳距離非常短，對于該距離有足夠能力進行位點克隆。由于與其他探針雜交的其他核酸標記物定位于該圖譜上2CM的距離內(nèi)，暗示這些核酸標記物可作為Pi-ta2基因的滿意的有效標記物(圖3)。
在F2分析中僅使用易感染性單株以避免由于不充分的噴霧接種而出現(xiàn)明顯未顯示出損傷但被診斷為抗性的易感染單株。相反，一個抗性單株顯示許多壞死損傷的可能性是非常低的。因此導致表現(xiàn)型診斷的較高的精確性。由于抗性基因是顯性，在pi-ta2基因位點易感染單株是日本型隱性純合。并預期附近的標記物的譜帶型是日本型。因此，能容易檢測到兩個日本型同源染色體之間僅有的一個雜交。由于可以在兩倍數(shù)量的單株染色體中檢測到重組，測定重組比例的效率也高出二倍。這兩個優(yōu)點對于測定是非常低重組比例的兩個基因之間的距離是十分重要的。
根據(jù)上面描述的測試1和2的結(jié)果，證實在實施例中獲得的核酸標記物是用于Pi-ta和pi-ta2基因的滿意的標記物，定位于來自稻瘟病抗性基因pi-ta和pi-ta2的遺傳圖譜上0-2CM的距離內(nèi)。
權(quán)利要求
1.稻瘟病抗性基因的核酸標記物，它能與從稻基因組DNA中分離的任何RFLP探針雜交，并且定位于離稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta22.0厘摩(CM)的距離內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸標記物，其中所述的RFLP探針是XNpb289，XNpb196，XNpb319，XNpb239-1，XNpb154，XNpb88，XNpb261，RUBSS和XNpb316。
3.稻瘟病抗性基因pi-ta和pi-ta2的二級核酸標記物，它定位于權(quán)利要求1所述核酸標記物附近。
4.稻瘟病抗性基因pi-ta或pi-ta2或其相關(guān)的遺傳組，它們是使用權(quán)利要求1，2或3所述核酸標記物分離到的。
5.從RFLP探針，第12染色體上XNpb289和XNpb316之間區(qū)域分離到的稻抗性基因Pi-ta2。
6.從RFLP探針，第12染色體上的XNpb289和XNpb088之間區(qū)域分離到的稻抗性基因pi-ta。
全文摘要
本發(fā)明提供了適用于稻瘟病抗性基因pi-ta和pi-ta
文檔編號C07K14/415GK1104252SQ94116149
公開日1995年6月28日 申請日期1994年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月29日
發(fā)明者川崎信二, 桂直樹, 佐藤征彌, 安東郁男, 齊藤彰 申請人:農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 新技術(shù)事業(yè)團