專利名稱：編碼胰島素受體底物1的突變dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼胰島素受體底物1的突變DNA，檢測胰島素受體底物1編碼基因中突變的方法，以及診斷組合物和用于該方法中的檢測試劑盒。
非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)是一種普遍的內(nèi)分泌疾病，有大量證據(jù)有力地表明發(fā)病機(jī)理中存在遺傳因素(1)。對顯性NIDDM患者和NIDDM高危個體的研究揭示胰島素分泌及胰島素作用的異常(2)。但是，胰島素和類胰島素生長因子1(IGF1)的細(xì)胞作用中一個或多個位點(diǎn)的遺傳缺陷很可能涉及調(diào)節(jié)胰島素分泌的組織及產(chǎn)生或提取葡萄糖的胰島素敏感性肝組織和肝外組織的生化途徑。
雖然在常與皮膚病微黑棘皮癥或卵巢雄激素過多癥相關(guān)的嚴(yán)重胰島素耐性綜合癥中已報導(dǎo)了二十種以上的突變(17)，但胰島素受體分子中的突變并不能解釋NIDDM普通形式的遺傳病因?qū)W。
晚期發(fā)作NIDDM的普通形式是一種異型疾病，其中至少有兩種主要缺陷貢獻(xiàn)于表型的病理生理學(xué)胰島素耐性和胰島素不足(2)。NIDDM很可能還是一種多基因病，這就意味著不同類病人將在各種基因、在該疾病遺傳成分的聚集中表現(xiàn)不同。NIDDM患者后代中糖尿病的高累積性危險(30-50％)和單卵性雙胎中的高共患率(70-100％)都突出了該疾病的遺傳病因?qū)W顯著性(1)。
胰島素通過與其四聚漿膜受體的α-亞單位結(jié)合來啟動其細(xì)胞效應(yīng)。這樣就激活了β-亞單位中的激酶，然后后者催化β亞單位特異酪氨酸殘基的分子間自磷酸化，進(jìn)而刺激受體對胰島素作用聯(lián)級中其它蛋白底物的酪氨酸激酶活性。
最近，對胰島素受體激酶的第一個內(nèi)源性底物(稱為胰島素受體底物1，縮寫為IRS-1)進(jìn)行了克隆和測序(4-6)。此互補(bǔ)DNA序列編碼相對分子量為165和185KD的胞漿親水蛋白(27，28)，它含有多個磷酸化位點(diǎn)。除作為胰島素受體激酶的底物外，IGF1受體激酶活化后IRS-1也被磷酸化(16)。
在表達(dá)少數(shù)胰島素受體的細(xì)胞中很難檢測到IRS-1，但在表達(dá)高水平受體的細(xì)胞中易于檢測，在表達(dá)生物信號化缺陷之突變受體的細(xì)胞中不易檢測到(27，28)。IRS-1是一種含20個酪氨酸磷酸化共有序列的獨(dú)特分子，其中6個出現(xiàn)在YMXM(Tyr-Met-X-Met)基元中。胰島素刺激IRS-1分子中YMXM基元酪氨酸磷酸化后，磷酸化的IRS-1結(jié)合磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)，這提示IRS-1作為一種多位“船塢”蛋白與信號蛋白結(jié)合，從而將受體激酶與胰島素敏感性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶結(jié)合(7-15)。PI3-激酶由至少兩個亞單位組成，包括一個110KDa的催化亞單位和一個85KDa的調(diào)節(jié)蛋白，后者含有通過與各種蛋白中磷酸酪氨酸殘基結(jié)合介導(dǎo)蛋白—蛋白間互相作用的2個src同源性功能區(qū)(src homology 2 do-mains)(7-15)。有趣的是，已證明胰島素引起IRS-1和PI-3激酶通過IRS-1的磷酸化YMXM基元和PI-3激酶85KDa調(diào)節(jié)亞單位的2個src同源性功能區(qū)發(fā)生相互作用。而且，IRS-1的過度表達(dá)加強(qiáng)胰島素刺激的細(xì)胞中PI3-激酶的活化，而且酪氨酰磷酸化IRS-1或含有磷酸化YMXM基元的合成肽在體外激活PI3-激酶。除作為胰島素受體激酶底物外，IRS-1還在IGF1受體激酶活化后被磷酸化(16)。因此，已表明IRS-1通過結(jié)合并調(diào)節(jié)含2個src同源性功能區(qū)的酶，可在選擇并區(qū)別胰島素和IGF1效應(yīng)與其它酪氨酸激酶的效應(yīng)中，在向多個細(xì)胞內(nèi)途徑的信號傳遞產(chǎn)生差異和擴(kuò)大中起關(guān)鍵作用(7-16)。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚異地發(fā)現(xiàn)許多NIDDM患者在IRS-1的編碼基因中帶有突變?，F(xiàn)認(rèn)為一種或多種此突變可涉及NIDDM的病因?qū)W或與之相關(guān)，這些突變的存在因而可用于診斷NIDDM并還可能用于診斷由胰島素耐性引起的其它疾病。
因此，本發(fā)明涉及包含編碼胰島素受體底物1(IRS-1)之DNA序列的DNA構(gòu)建物，該DNA序列含有至少一個核苷酸的突變，或該DNA構(gòu)建物包括該DNA序列含所述突變的片段。
現(xiàn)認(rèn)為IRS-1基因的突變可指示對發(fā)展NIDDM或其它疾病具有顯著性的異常。例如，突變可造成IRS-1中氨基酸的取代，從而引起IRS-1的三級結(jié)構(gòu)改變。這種改變可干擾胰島素或IGF-1受體激酶與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和生長的一種或多種細(xì)胞內(nèi)蛋白的正常相互作用。這些蛋白一般具有2個src同源性功能區(qū)，包括磷脂酰肌醇3-激酶、GRB-2和SHPTP-2(參見M.F.White等，Exp.Clin.En-docrinol、101，Suppl，2.1993，p.98-99，特別是

圖1)。該突變也可干擾基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或干擾IRS-1轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性?；蛘撸撏蛔兛膳c造成疾病的突變相關(guān)(即遺傳連鎖)。
另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明DNA構(gòu)建物并能夠表達(dá)其中至少一個氨基酸被取代的IRS-1的活系統(tǒng)。該活系統(tǒng)可包括含有適當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞或多細(xì)胞生物，該活系統(tǒng)可用于篩選對該系統(tǒng)中胰島素或IGF-1刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有效應(yīng)的物質(zhì)。
再一方面，本發(fā)明涉及檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的方法，該方法包括從受檢者獲取生物樣品，并分析樣品的至少一個核苷酸突變?；诂F(xiàn)今的認(rèn)識，本發(fā)明方法可用于診斷受檢者患NIDDM及由胰島素耐性產(chǎn)生的其它疾病(如男性樣肥胖、原發(fā)性高血壓、異常脂質(zhì)血或動脈粥樣硬化)的素質(zhì)。生物樣品例如可取自血液、血清、血漿或組織。本發(fā)明還涉及用于該方法的診斷組合物和檢測試劑盒。
具體講，本發(fā)明涉及包括一種DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列編碼IRS-1并含有引起IRS-1蛋白序列中至少一個氨基酸取代的突變。該突變例如可位于這樣的位點(diǎn)，此處的氨基酸取代干擾通過IRS-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)檫@種突變很可能與疾病病因?qū)W有關(guān)。這種DNA序列的一個實(shí)例是包含IRS-1基因第972密碼子第1位G到A突變的序列。
該突變導(dǎo)致第972位甘氨酸被精氨酸取代。IRS-1基因變異可導(dǎo)致發(fā)生NIDDM的分子機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。但與甘氨酸相比，精氨酸分子大得多并具有陽離子側(cè)鏈，pKa高至12.5。IRS-1中，972密碼子位于兩個YMXM基元之間。雖然甘氨酸被精氨酸取代可引起的IRS-1三級結(jié)構(gòu)變化還不清楚，但認(rèn)為IRS-1突變體的立體和靜電變化干擾胰島素和IGF-1介導(dǎo)的IRS-1相鄰YMXM基元的磷酸化與具有兩個src同源性功能區(qū)的信號傳遞蛋白間的正常相互作用?；蛘撸撏蛔兛蔀榕c該基因或另一基因中另一突變相關(guān)的標(biāo)記，所述另一突變是疾病病因?qū)W中實(shí)際涉及的突變。在805密碼子第三位(A到G)和第894密碼子第三位(G到C)的沉默突變也是如此。
臨床研究表明，與葡萄糖耐性對照相比，NIDDM患者總體上具有向周圍組織的胰島素耐性葡萄糖分布。但是NIDDM的甘氨酸972-突變攜帶者與突變陰性的糖尿病患者相比，其胰島素耐性水平?jīng)]有差別。另外在三個突變陽性非糖尿病人之中兩個身上測定了外周組織對胰島素的敏感性，結(jié)果證明胰島素敏感性值在正常范圍內(nèi)。相反，所有突變攜帶者與相應(yīng)的非攜帶者相比，胰島素和C-肽的空腹血漿濃度顯著低下。結(jié)合考慮可比的外周組織胰島素敏感性和低下的循環(huán)β-細(xì)胞分泌產(chǎn)物的基礎(chǔ)水平，可能指示胰腺β-細(xì)胞功能障礙。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建物包含序列表SEQID No1中所示DNA序列，或所述DNA序列的含有SEQ ID NO1的3494位核苷酸G到A之突變的片段。
根據(jù)應(yīng)用目的不同DNA構(gòu)建物的長度變化很大。用作雜交目的的寡核苷酸探針時，該DNA片段可短至17個核苷酸。為了如上所述在活系統(tǒng)中表達(dá)，該DNA構(gòu)建物一般包含編碼IRS-1的全長DNA序列。
在IRS-1編碼DNA序列中含有突變的本發(fā)明DNA構(gòu)建物可適當(dāng)?shù)貋碜曰蚪MDNA或cDNA，例如通過制備基因組DNA或cD-NA文庫、按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用合成寡核苷酸探針雜交篩選編碼IRS-1之全部或部分的DNA序列而獲得(參見Sambrook等，MolecularcloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)。所用探針應(yīng)是對突變特異性的。或者，野生型IRS-1的編碼DNA序列可通過定點(diǎn)誘變進(jìn)行修飾，其中使用含該突變的合成寡核苷酸按熟知的步驟進(jìn)行同源重組。該DNA序列還可通過使用特異引物的聚合酶鏈反應(yīng)而制得，例如US 4,683,202或Saiki等Science 239，1988，pp.487-491中所述。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建物還可按已有的標(biāo)準(zhǔn)方法用合成方法制備，例如Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869中描述的磷二酰胺法，或Matthes等在EMBO Journal 3(1984)，801-805中描述的方法。按照磷二酰胺法，如在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸、純化、退火并連接。該方法優(yōu)選用于制備IRS-1編碼DNA序列的片段。
插入DNA構(gòu)建物的重組表達(dá)載體可以是能方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體。載體的選擇常取決于其所要引入的宿主細(xì)胞。例如，該載體可為自主復(fù)制型載體，即以染色體外單位存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如為質(zhì)粒。或者，也可以是這樣的載體當(dāng)將其引入宿主細(xì)胞時與宿主細(xì)胞基因組整合并隨著其所整合的染色體一起復(fù)制(例如病毒載體)。
在此載體中，編碼IRS-1的突變DNA序列應(yīng)與適當(dāng)?shù)膯幼有蛄杏行У剡B結(jié)。啟動子可為在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可來自與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白的編碼基因。引導(dǎo)IRS-1突變編碼DNA在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子，例如為SV40啟動子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，851-864)、MT-1(金屬硫蛋白基)啟動子(Palmiter等，Science 272(1983)，809-814)或腺病毒2主要晚期啟動子。
編碼IRS-1的突變DNA序列還可與適當(dāng)終止子有效地連結(jié)，如人生長激素終止子(Palmiter等，同上)。載體還可包含諸如聚腺苷化信號序列(如來自SV40或腺病毒5Elb區(qū))、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列(如SV40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子序列(如編碼腺病毒VA RNA的序列)之類的元件。
重組表達(dá)載體可進(jìn)一步包含能使載體在有關(guān)宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列的一個實(shí)例是SV40的復(fù)制起始區(qū)。該載體還可含有可選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞中某一缺陷的基因，如二氫葉酸還原酶(DHFR)的編碼基因，或提供對某一藥物抗性的基因，如抗新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。
用于分別連接IRS-1的編碼DNA序列、啟動子和終止子的方法，和將它們插入含復(fù)制所需息信的適當(dāng)載體中的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，如Sambrook等，同上)。
另一方面，本發(fā)明涉及含至少一個氨基酸取代的IRS-1變體，尤其是在特定位點(diǎn)含至少一個氨基酸取代的變體，其中所述取代干擾通過IRS-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或其包含所述取代的片段。這種變體的實(shí)例是其中甘氨酸972被精氨酸取代的變體，或其含有所述取代的片段，如具有序列表SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的變體，或其含有Arg972的片段。
向其中引入本發(fā)明DNA構(gòu)建物的活系統(tǒng)為能夠產(chǎn)生IRS-1并具有適當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞。該細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，如脊椎動物細(xì)胞，如爪蟾卵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，尤其是哺乳動物細(xì)胞。適當(dāng)哺乳動物細(xì)胞系的實(shí)例為COS(ATCC CRL 1650)、BHK(ATCC CRL1632，ATCC CCL 10)、CHL(ATCC CCL39)或CHO(ATCC CCL61)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞和表達(dá)引入細(xì)胞中的DNA序列的方法描述在下列文獻(xiàn)中，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol，159(1982)，601-621；Southern和Berg.J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad，Sci，USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell 14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Graham和Van der Eb，Virology52(1973)，456，和Neumann等，EMBO J，1(1982)，841-845。
然后編碼IRS-1的突變DNA序列通過在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中在有利于IRS-1編碼DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可為適于哺乳動物細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如含適當(dāng)補(bǔ)充物質(zhì)的含血清或不含血清的培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可從供應(yīng)商得到或可按照公開出版的資料制備(如AmericanType Culture Collection的目錄)。
本發(fā)明的活系統(tǒng)還可包括轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物是在其基因組中引入了異源DNA序列的動物。具體講，轉(zhuǎn)基因動物是轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物，一般具有適當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的哺乳動物。該哺乳動物一般為嚙齒類，如大鼠或小鼠。編碼IRS-1的突變DNA序列可按以前描述的用于該目的的方法之一引入轉(zhuǎn)基因動物中。簡言之，可將要引入的DNA序列注射到受精卵或胚胎細(xì)胞中，然后再按標(biāo)準(zhǔn)方法將受精卵或胚胎細(xì)胞植入雌性哺乳動物體內(nèi)，結(jié)果形成其胚細(xì)胞和/或體細(xì)胞中含有突變DNA序列的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。關(guān)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法的更詳細(xì)描述見B.Hogan等Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork。該突變DNA序列還可通過用含此DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染受精卵而引入動物，參見R.Jaenisch，Proc.Natl.Acad.Sci.USA73，1976，pp.1260-1264。制備轉(zhuǎn)基因動物的另一方法描述在Gor-don和Ruddle的Mothods Enzmol 101，1983，pp.411-432中。
在檢測IRS-1基因中是否存在某突變的本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方案中，從受檢者采取生物樣品，從樣品中分離DNA(尤其是基因組DNA，用在突變位點(diǎn)酶切DNA的限制性內(nèi)切酶消化，檢測IRS-1編碼基因中該位點(diǎn)的DNA剪切。消化后，形成的DNA片段可在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將膠上的DNA印在硝基纖維素濾膜上并與放射標(biāo)記的探針雜交。該探針可方便地含有跨越該突變的IRS-1基因的DNA片段(基本按照E.M.Southern的方法，J.Mol.Biol.98，1975，pp.503，如B.J.Conner等在Proc.Natl Acad.Sci USA，80，1983，pp.278-282中所述)。
在該實(shí)施方案的一變異方案中，從樣品中分離的DNA在用限制性內(nèi)切酶消化之前可進(jìn)行擴(kuò)增?？赏ㄟ^使用基于跨突變位點(diǎn)的IRS-1適當(dāng)序列的寡核苷酸引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，這樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增，基本按Saiki等Science 230，1985，pp1350-1354所述方法。擴(kuò)增后，擴(kuò)增的DNA用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。對所得限制性酶切圖進(jìn)行分析，例如用溴化乙錠染色，在紫外線下可見凝膠色帶。作為對照，可對編碼IRS-1的野生型DNA(即不含突變)進(jìn)行相同步驟，對比限制性酶切圖。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選分析樣品中位于特定位點(diǎn)的突變，該位點(diǎn)的氨基酸取代干擾通過IRS-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種突變的一個具體實(shí)例是IRS-1編碼基因中第972密碼子第一位G到A的突變。該突變在編碼IRS-1的突變DNA序列中造成一個新的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)
5’-CCA/TGG-3’3’-GGT/ACC-3’適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的一個實(shí)例是BstNI。
本發(fā)明方法的另一具體實(shí)施方案是采用U.Landegren等在Sci-ence 241，1988，pp.1077-1080中描述的方法，該方法涉及互補(bǔ)靶DNA分子上相鄰寡核苷酸的連接。如果核苷酸堿基正確配對，兩個寡核苷酸交叉處將發(fā)生連接。
在本發(fā)明方法的又一具體實(shí)施方案中，從樣品中分離的DNA可用相當(dāng)于IRS-1編碼基因之鏈節(jié)的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。然后可通過與一標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交分析擴(kuò)增的DNA，該探針包括相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因的DNA序列，并含有至少一個核苷酸的突變，該突變相當(dāng)于要檢測IRS-1編碼基因中是否存在的那種突變。作為對照，擴(kuò)增的DNA還可與這樣的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交，該探針含相當(dāng)于至少部分IRS-1野生型編碼基因的DNA序列。該方法已由例如Dilella等在Lancet，1，1988，pp.497-499中描述過?？捎糜诒景l(fā)明的另一基于PCR的方法是由R.Saiki等Nature 324，1986，163-166，或D.Y.Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，pp.2757-2760描述的等位基因特異性PCR方法，該方法使用對IRS-1基因中突變特異的引物。
檢測DNA中突變的其它方法見U.landegren，GATA 9，1992，pp.3-8中的綜述?，F(xiàn)今優(yōu)選的檢測突變方法是基本如Orita等Proc.Natl Acad.Sci.USA 86，1989，pp.2766-2770，或Orita等，Genomics5，1989，pp.874-879描述的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。
標(biāo)記探針的標(biāo)記物優(yōu)先選自酶，有色物或熒光物質(zhì)，或放射性同位素。
可用作標(biāo)記物的酶例如有過氧化物酶(如辣根過氧化物酶)、磷酸酶(如酸性或堿性磷酸酶)、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、β-葡糖苷酶、蛋白酶、丙酮酸脫羧酶、酯酶、蟲熒光素酶等。
酶本身并不能被檢測，必須與底物結(jié)合以催化反應(yīng)，終產(chǎn)物可以被檢測。可用于本發(fā)明方法的底物例如包括過氧化氫/四甲基聯(lián)苯胺或氯萘酚或鄰二苯胺或3-(對羥苯基)丙酸或魯米諾，磷酸羥基吲哚酯、磷酸對硝基苯酯、半乳糖硝基苯基甙、4-甲基umbelliferyl-D-半乳糖吡喃糖甙、或熒光素。
或者，標(biāo)記物可包含有色或熒光物質(zhì)，包括金顆粒、有色或熒光乳膠顆粒、染料顆粒、熒光黃、藻紅素或藻青素。在一尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，用放射性同位素標(biāo)記探針?？捎糜诒景l(fā)明目的放射性同位素可選自I-125、I-131、In-111、H-3、P-32、C-14或S-25。這些同位素發(fā)射的放射活性可在β-或γ-計(jì)數(shù)器中或用液閃照像機(jī)按本身已知的方法測定。
本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法的、檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的檢測試劑盒，該試劑盒包括(a)在突變位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶，(b)相當(dāng)于至少部分IRS-1野生型編碼基因的第一DNA序列，和/或(c)相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因并含有至少一個核苷酸突變的第二DNA序列，所述突變相當(dāng)于要檢測IRS-1編碼基因中是否存在的突變。
第一DNA序列例如可從來自健康受檢者的編碼IRS-1的基因組DNA或CDNA獲得。
第二DNA序列可方便地為本發(fā)明的DNA構(gòu)建物。
本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法的、檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的檢測試劑盒，該試劑盒包括(a)擴(kuò)增DNA的工具，和(b)包含相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因的DNA序列并含有至少一個核苷酸突變的標(biāo)記寡核苷酸探針，該突變相當(dāng)于要檢測IRS-1編碼基因中是否存在的突變。
擴(kuò)增DNA(一般為從生物樣品中分離的基因組DNA)的適宜工具包括，如寡核苷酸引物、適宜緩沖液和熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
在下列實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明，但無意于限制權(quán)利要求中的本發(fā)明范圍。附圖的簡要說明圖1表示用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)對人胰島素受體底物1(IRS-1基因)的核苷酸3338-3600的突變篩選。如“方法”中所述用特異寡核苷酸引物從基因組DNA PCR-擴(kuò)增該片段，用32P標(biāo)記并進(jìn)行非變性凝膠電泳。放射自顯影圖顯示單鏈DNA(ssDNA)以及雙鏈DNA(ds DNA)的遷移圖。第3泳道顯示甘氨酸972突變雜合(He)個體的遷移圖。泳道1和2顯示相應(yīng)野生型(wt)的遷移圖。
圖2表示IRS-1 3338-3600bp片段一部分的直接核苷酸測序。在非編碼鏈上進(jìn)行測序(見表3)。上圖表示野生型序列，而下圖表示雜合個體的核苷酸序列，其編碼鏈中3494位核苷酸如箭頭所示存在單一堿基取代(G→A)(見表3)。在密碼子972中的這一堿基取代造成甘氨酸被精氨酸取代。
實(shí)施例1對象實(shí)驗(yàn)中包括共86名NIDDM病人和76名對照對象。所有研究參加者為不相關(guān)的丹麥高加索人，他們的臨床特征示于表1和2中。對照對象具有正常空腹血漿葡萄糖水平，沒有已知糖尿病的家族史。從就診于Steno糖尿病中心院外病人中連續(xù)不加選擇地征募國家糖尿病資料組(National Diabetces Data Group)(18)所定義的NIDDM病人。所有NIDDM病人用飲食、口服低血糖藥或兩者結(jié)合治療。研究參加者經(jīng)臨床或標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室檢查評價沒有人患肝或腎病，沒有人服用任何已知影響胰腺β-細(xì)胞功能或能量代謝的其它任何藥物。參與前已對所有志愿者仔細(xì)解釋了研究目的和風(fēng)險，并得到了他們的明確同意。本實(shí)驗(yàn)得到地方哥本哈根道德委員會的許可，符合赫爾辛基宣言。正常血糖—高胰島素血夾實(shí)驗(yàn)(Clamp)用正常血糖—高 胰島素夾實(shí)驗(yàn)檢查NIDDM病人和19各葡萄糖耐受性健康對照對象。實(shí)驗(yàn)在過夜禁食10小時后于0800至1500間空腹進(jìn)行。每個夾實(shí)驗(yàn)包括2小時基礎(chǔ)階段，然后是4小時高胰島素血葡萄糖夾實(shí)驗(yàn)。以前已詳細(xì)描述過夾實(shí)驗(yàn)的技術(shù)(19)。為了估計(jì)外周葡萄糖總吸收，在研究期間一直灌注(3-3H)葡萄糖。以啟動(25-μci)和連續(xù)(0.25-μCi/min)方式在對照對象中注入(3-3H)葡萄糖，而在NIDDM對象中，啟動量隨著空腹血漿葡萄糖濃度增加而成比例增加；標(biāo)記葡萄糖的連續(xù)注入與對照組相同(0.25μCi/min)。通過連續(xù)注入2mU胰島素/kg/分(Actrapid，Novo Nordisk，丹表)進(jìn)行夾實(shí)驗(yàn)，以可變速度注入20％葡萄糖來維持血糖正常，通過以5-10分鐘間隔檢測血漿葡萄糖水平確定輸入速度。用Steele’s非穩(wěn)態(tài)等式(20)從(3-3H)葡萄糖的血漿濃度和血漿葡萄糖計(jì)算總的葡萄糖處理速度。在這些計(jì)算中，假定葡萄糖分布體積為200ml/kg體重，池分?jǐn)?shù)為0.65。在最高穩(wěn)態(tài)血漿胰島素水平，此時假定肝的葡萄糖生產(chǎn)為零，葡萄糖輸入速度用于計(jì)算葡萄糖處理速度。用尿中葡萄糖損失校正總的外周葡萄糖吸收?；蚪MDNA的制備和擴(kuò)增通過蛋白激酶K消化然后用酚提取在Applied Biosystems 341核酸純化系統(tǒng)上從來自全血的人白細(xì)胞核分離基因組DNA。用0.3μg基因組DNA進(jìn)行第一次50μlPCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)條件是10mMTris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100、0.2mMdNTP’s、0.2μM每種寡核苷酸引物和1.25 U Taq DNA聚合酶(Promega，Medison Wisconsin)。人IRS-1基因的特異寡核苷酸引物(4)(20-25bp，在3’端有2個G或2個C)在Applied Biosystems 394DNA/RNA合成儀(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)上合成，在NAB-10柱(Pharmacia P-L Biochemicals Inc，Milwaukee，Wiscon-sin)上洗脫，不用進(jìn)一步純化直接使用。
用于聚合酶鏈反應(yīng)的DNA引物的核苷酸序列如下
1. 553 5′GCTCAGCGTTGGTGGTGGCGGTGG3′ 5772. 783 3′CGACGAAGTTGTAGTTGTTCGCCCG5′8073. 727 5′GAAGTGGCGGCACAAGTCGAGCGC3′ 7564. 999 3′CGAGGCCGGAACCACTCCGACC5′ 10205. 924 5′ACCGTGCTAAGGGCCACCACGACG3′ 9476. 1180 3′CCTCCGTCGCCGGCACCACGA5′ 12007. 1128 5′TCTACCGCCTTTGCCTGACCAGC3′ 11508. 1392 3′CGGTCAGGAGCAGGTTGACG5′14119. 1337 5′ACCATCCTGGAGGCCATGCGG3′ 135710.1598 3′GGTCGGAGCCACCTGCCGTCGGGA5′162111.1545 5′CAGGCTCCTTCCGTGTCCGCG3′ 156512.1807 3′GGGTGCCGCTAGATCACGAAG5′ 182713.1757 5′CTGTCGTCCAGTAGCACCAGTGG3′ 177914.2007 3′GGGACTGGCGGGGGTTGCCAG5′ 203715.1953 5′GCGGTGAGGAGGAGCTAAGC3′193216.2200 3′GGGCAGGGTCAGGAGTCACCG5′ 223017.2151 5′AGAGAACTCACTCGGCAGGC3′217018.2401 3′GGTGTGCCTACTACCGATGTACGG5′242419.2352 5′ACCCCTTGGAGCGTCGGGGG3′237120.2600 3′GGACTGAATCCTCCACCGGGGTCG5′262321.2546 5′CAGAGAGTGGACCCCAATGG3′256622.2800 3′CCTGAGGTTGTGGTCGTCGG5′281923.2712 5′TCTTGCCTCACCCCAAACCC3′315024.2964 3′CGAGACCAGCGGAAGAGATA5′2983
25.2918 5′GAGCCGGAGGAGGGTGCCCG3′ 293826.3180 3′GGTTCCGGTCGTGGAATGGA5′ 319927.3131 5′CAGACCAATAGCCGCCTGGC3′ 315028.3392 3′CCGTGACTCCTCATGTACTT5′ 341129.3339 5′CTTCTGTCAGGTGTCCATCC3′ 335830.3582 3′CGATGCACCTGTGGAGCGGT5′ 360131.3532 5′GGGCAGTGCCCAGCAGCCGG3′ 354132.3743 3′CGACGGGTGAGCAGGGACGACC5′ 376433.3687 5′CCTCAGCAGCCTCTGCTTCC3′ 371234.3950 3′CGTCGTCATCCCCCGCCACC5′ 396935.3900 5′CCACACCCAGTGCCACCCGG3′ 391936.4141 3′CCTGAAGTTTGTCACGGGAG5′ 416037.4067 5′GAGCCAGCCAAACTGTGTGG3′ 408638.4320 3′CCTGTAGTGTCGTCCAGCAA5′ 4339在混合物上涂以40μl礦油，在95℃起始變性3分鐘后，將樣品進(jìn)行35個擴(kuò)增循環(huán)60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘及94℃變性1分鐘。在這些初級PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增了800-900bp的片段。以1μl1∶10稀釋的初級PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二級PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件如上所述，只是要加入(α-32P)dCTP(Amersham International，Buck-inghamshire，UK)。在二級PCR中擴(kuò)增的每個片段具有280-285bp的大小。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析在初級突變篩選中，對來自19名胰島素耐性NIDDM病人和5名對照對象的基因組DNA進(jìn)行整個IRS-1編碼區(qū)的SSCP分析(按Orita等，Genomics 5，1989，pp.874-879描述的方法)(表1)。在每例中，將2μl二級PCR產(chǎn)物與8μl測序終止溶液合并。加樣一μl不加熱以鑒定雙鏈產(chǎn)物，94℃加熱5分鐘后向分別含1％或5％甘油的90mM Tris一硼酸、2.5mM EDTA中的38×31×0.03cm 5％聚丙烯酰胺凝膠(49∶1，丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)的相同孔中加樣2μl。每個病人的SSCP分析在2種不同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行將凝膠、緩沖液和電泳儀在4℃放置過夜后，在1％甘油存在下以35W恒壓于4℃進(jìn)行電泳4-5小時；在5％甘油存在下以65W恒壓于25℃進(jìn)行2-3小時(21)。將凝膠轉(zhuǎn)移到3MM濾紙上，用塑料覆蓋物覆蓋，用增感屏于-80℃放射自顯影2-10小時。該凝膠含有兩個具有已知質(zhì)粒突變和相應(yīng)野生型片段的泳道作為對照。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，檢測已知質(zhì)粒突變(單一堿基取代、小插入、或小缺失)的能力為80-90％(22)。
單鏈DNA的合成和直接核苷酸測序用生物素標(biāo)記的寡核苷酸引物和鏈霉親和素包衣的磁珠(可從Dynal AS，Oslo，Norway購得)產(chǎn)生可測序的單鏈DNA。用醋酸銨和異丙醇沉淀產(chǎn)物并重懸于適當(dāng)體積的水中。用AutoRead測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)和熒光-dATP的測序在自動激光熒光DNA測序儀(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行分析。PCR產(chǎn)物的直接限制酶消化在15μl反應(yīng)液中進(jìn)行限制酶消化，反應(yīng)液中含有10μl沉淀的二級PCR產(chǎn)物、1.5μl 10×NE緩沖液2、100μg/ml牛血清白蛋白和10U限制酶Bst N1(New England Biolabs Inc.，Beverley，MA)。在4.5％高分辨瓊脂凝膠上分析這些片段，用溴化乙錠染色后便可見。cDNA的合成局部麻醉下從股外肌取出經(jīng)皮肌肉活組織樣品(約500mg)。從肌肉樣品中去除血液及結(jié)締和脂肪組織，30秒內(nèi)冷凍在液氮中，于-80℃儲存至用于實(shí)驗(yàn)。從肌樣中按以前描述的方法(23)分離總RNA。在含下列物質(zhì)的25μl體積中合成cDNA1μg總RNA，0.2mM三磷酸脫氧核苷，40u RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)，0.625μgOligo(dT)18，400U Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Life TechnologiesInc.，Grand Island，NY)，50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2和10mM DTT。反應(yīng)于37℃進(jìn)行1小時，然后于95℃孵育10分鐘將酶失活。按基因組DNA的方法對cDNA進(jìn)行SSCP。其它分析10小時禁食過夜后，于早晨從所有研究參與者采取血漿以分析化學(xué)量。用己糖激酶方法測定雙份血漿葡萄糖。按已有方法(24)測定血漿中的含氚葡萄糖。用HPLC方法測定HbA1C(正常范圍4.1-6.4％)。用放射免疫分析(25，26)分析血漿胰島素和C-肽水平。
統(tǒng)計(jì)分析在正文和表中的數(shù)據(jù)以平均值±SE的形式給出。為了進(jìn)行比較，對不成對數(shù)據(jù)應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)。
IRS-1基因中突變的初級篩選利用來自19名NIDDM病人和5名對照的基因組DNA，在19個重疊片段(每個含250-285bp)中分析了IRS-1基因的整個編碼區(qū)。與相應(yīng)的對照對象相比，NIDDM病人組血胰島素過多(P＜0.02)并具有胰島素刺激向周圍組織的葡萄糖分布減小的特征(P＜0.0001)(表1)。SSCP掃描顯示3種不同的異常遷移圖。接下來的核苷酸測序揭示第805密碼子處的一種多態(tài)性(GCA→GCG丙氨酸))。這種單一堿基取代不會產(chǎn)生任何氨基酸序列的變化，19名NIDDM中4人是這一取代的雜合體。在第894密碼子處檢測到另一沉默突變(CCG→CCC(脯氨酸))。19名NIDDM病人中僅一人是這種核苷酸堿基變異的雜合體。但在972密碼子處，SSCP分析表明19名NIDDM病人中三人是突變雜合體，該突變中甘氨酸(GGG)被精氨酸(AGG)取代(圖1和2)。通過兩條DNA鏈的測序和用限制酶Bst NI對PCR產(chǎn)物的直接酶消化證實(shí)了這一突變，通過這一核苷酸取代造成了BstNI的限制性酶切位點(diǎn)(未顯示數(shù)據(jù))。經(jīng)初級SSCP掃描，5名對照對象未顯示多態(tài)性跡象。972甘氨酸突變位于IRS-I基因中兩個Tyr-Met-X-Met基元之間(表3)。隨后，在從血細(xì)胞分離的基因組DNA上初步鑒定的972密碼子突變由cDNA的研究得以證實(shí)，cDNA由從骨骼肌活組織樣品分離的總RNA合成。甘氨酸972突變的二級篩選用SSCP分子掃描和初級PCR產(chǎn)物的特異酶消化進(jìn)一步檢查了67名NIDDM病人(表2)和76名鍵康對照對象的甘氨酸972突變的發(fā)生率。67名NIDDM病人中7人是該突變的雜合體。另外，76名鍵康志愿者中3人也是密碼子972突變的雜合攜帶者。所有三名突變陽性對照對象都對口服葡萄糖刺激具有正常的葡萄糖反應(yīng)(未給出數(shù)據(jù))。
帶有甘氨酸972突變之個體的臨床特征化表1顯示對三名甘氨酸972突變陽性的葡萄糖耐性對照進(jìn)行臨床研究所得結(jié)果。對三名突變攜帶者中的兩名進(jìn)行胰島素—葡萄糖夾實(shí)驗(yàn)，這些個體的葡萄糖處理速度在19名突變陰性對照對象的范圍內(nèi)。但有趣的是葡萄糖耐性突變攜帶者還有一特征是與從突變陰性鍵康對照所得平均值相比，其空腹血漿胰島素(降低33-46％)和C-肽(降低25-40％)值較低。
表2綜合了與IRS-1基因中甘氨酸972突變陰性的76名NID-DM病人相比，作為該突變雜合攜帶者的10名NIDDM病人的表型特征。在年齡、已知糖尿病持續(xù)時間、體質(zhì)指數(shù)(body mass index)、空腹血漿葡萄糖水平、HbA1C、基礎(chǔ)葡萄糖處理速度或胰島素刺激的葡萄糖處理速度方面都沒有明顯區(qū)別。但與突變陰性糖尿病對象相比，甘氨酸972突變陽性糖尿病患者的胰島素和C-肽空腹血漿水平分別減低44％(P＜0.05)和37％(P＜0.02)。
實(shí)施例2研究了383名不相關(guān)的健康高加索年青人(15-32歲)的隨機(jī)樣品，以確定甘氨酸972突變是否造成胰島素耐性。用Bergman’s最小模型結(jié)合甲苯磺丁脲靜脈注射葡萄糖)估測所有個體的胰島素敏感性，用SSCP掃描法(如實(shí)施例1中所述)和基因組DNA的限制酶分析(如實(shí)施例1中所述)測定甘氨酸972突變的發(fā)生率。發(fā)現(xiàn)35個對象帶有該突變。
體質(zhì)指數(shù)(BMI)大于25kg/m2(n＝10，BMI＝28.4±0.9kg/m2)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的甘氨酸972突變攜帶者比相同BMI的非攜帶者(n＝99，BMI＝28.1±0.3kg/m2)的胰島素敏感性低2倍，C-肽的空腹血清水平顯著地高。而在BMI低于25kg/m2的對象中，該突變的攜帶者和非攜帶者之間所測定的變量都沒有區(qū)別。在調(diào)節(jié)VO2max、BMI、性別和年齡差異的多變量分析中，在肥胖對象組中甘氨酸972突變的存在與胰島素敏感性負(fù)相關(guān)(P＜0.04)，與空腹血清C-肽(p＜0.09)、空腹血清甘油三酯(P＜0.02)和血清總膽固醇(P＜0.03)正相關(guān)。
研究結(jié)果表明青年肥胖者中甘氨酸972突變與整體胰島素耐性和血脂異常有關(guān)。
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表1、通過IRS-1基因的初級SSCP掃描檢查的19名NIDDM病人的表型特征化與未檢測到IRS-1突變的19名匹配對照和3名由精氨酸取代甘氨酸972的葡萄糖耐性對照相比較血漿 血漿 血漿NHbA1CM-值 M-值體質(zhì)指數(shù)(女 年齡 (％)葡萄糖胰島素 C-肽 (基礎(chǔ)) (胰島素)(kg/m2)男) (歲) (mM) (pM)(nM)NIDDM均值 6/13 54 29 7.9 10.4 95 0.92 88 330±SE 2 10.5 0.9 13 0.09 330對照(非突變攜帶者)均值 7/12 50 28 5.4*5.5*60+ 0.67§77+ 484*±SE 2 10.1 0.1 60.04 230對照(突變攜帶者)No.1 F50 27 4.7 5.1 32 0.40 71 461No.2 M64 23 5.6 6.0 40 0.51 78 389No.3 M66 23 6.0 5.9 34 0.42 ND ND葡萄糖、胰島素和C-肽的血漿水平在早晨空腹?fàn)顟B(tài)測定。M-值是早晨空腹?fàn)顟B(tài)(基礎(chǔ))時和正常血糖及高胰島素血夾實(shí)驗(yàn)后4小時(胰島素)的葡萄糖處理速度(mg/m2/min)，其中夾實(shí)驗(yàn)最后30分鐘內(nèi)穩(wěn)態(tài)血漿胰島素濃度對NIDDM病人為1165±71pM，對非甘氨酸972突變攜帶者對照為1034±56pM。在3各葡萄糖耐性突變攜帶者中，穩(wěn)態(tài)血漿胰島素水平分別為786pM(對象no 1)和1008pM(對象no.2)。ND＝未測定。*P＜10-4vs.NIDDM；+p＜0.02vs.NID-DM；§p＜0.03vs.NIDDM。
表2、10名IRS-1基因中攜帶甘氨酸972→精氨酸突變的NIDDM病人的特征與不攜帶該突變的NIDDM病人比較+突變-突變N(女/男)3/7 30/46年齡(歲) 52±2 54±1體質(zhì)指數(shù)(kg/m2) 29±2 30±1已知糖尿病持續(xù)時間(年) 5±14±1HbA1C(％) 8.6±0.68.0±0.2血漿葡萄糖(mM) 12.4±1.1 11.7±0.5血漿胰島素(pM) 53±10 94±8*血漿C-肽(nM) 0.49±0.06 0.78±0.05+M-值(基礎(chǔ)) 86±5 91±3M-值(胰島素) 286±29 265±16表中數(shù)值為均值±SE。葡萄糖、胰島素和C-肽的血漿濃度在早晨空腹?fàn)顟B(tài)測定。M值為早晨空腹?fàn)顟B(tài)(基礎(chǔ))和正常血糖及高胰島素血夾實(shí)驗(yàn)后4小時(胰島素)的葡萄糖處理速度(mg/m2/min)，其中夾實(shí)驗(yàn)的最后30分鐘內(nèi)的穩(wěn)態(tài)血漿胰島素濃度對攜帶甘氨酸972突變的NIDDM病人為980±57pM，對非攜帶者的NIDDM病人為1153±34pM。*P＜0.05；+P＜0.02。
表3已公開的人胰島素受體底物1(IRS-1)的部分核苷酸(3392-3562)和氨基酸(938-994)序列。甘氨酸到精氨酸的突變位于第972密碼子(用黑體表示)。兩個YMXM基元下劃線，該基元是帶有2個src同源性功能區(qū)的胰島素信號轉(zhuǎn)移蛋白的推定識別位點(diǎn)。bp3392編碼5′-GGCACTGAGGAGTACATGAAGATGGACCTGGGGCCGGGCCGGAGGGCAGCCTGGCAG非編碼 3′-CCGTGACTCCTCATGTACTTCTACCTGGACCCCGGCCCGGCCTCCCGTCGGACCGTCaa938 GlyThrGluGluTyrMetLysMetAspLeuGlyPrcGlyArgArgAlaAlaTrpGlnAGAGAGCACTGGGGTCGAGATGGGCAGACTGGGCCCTGCACCTCCCGGGGCTGCTAGCCTCTCGTGACCCCAGCTCTACCCGTCTGACCCGGGACGTGGAGGGCCCCGACGATCGArgGluSerThrGlyValGluMetGlyArgLeuGlyProAlaProProGlyAlaAlaSer972ATTTGCAGGCCTACCCGGGCAGTGCCCAGCAGCCGGGGTGACTACATCACCATGCAG-3′3562TAAACGTCCGGATGGGCCCGTCACGGGTCGTCGGCCCCACTGATGTACTGGTACGTC-5′IleCysArgProThrArgAlaValProSerSerArgGlyAspTyrMetThrMetGln994
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹表(F)郵政編碼(ILP)2880(G)電話+454444 8888(H)傳真+45 4449 3256(I)電傳37304(ii)發(fā)明題目編碼胰島素受體底物1的突變DNA(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒價類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度6152個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬無(vi)起始來源(A)生物Homo sapiens(ix)特性(A)名稱/關(guān)鏈詞CDS(B)位置581..4309(xi)序列描述SEQ ID NO1TGGTATTTGG GCGGCTGGTG GCGGCGGGGA CTGTTGGAGG GTGGGAGGAG GCGAAGGAGG60AGGGAGAACC CCGTGCAACG TTGGGACTTG GCAACCCGCC TCCCCCTGCC CAAGGATATT120TAATTTGCCT CGGGAATCGC TGCTTCCAGA GGGGAACTCA GGAGGGAAGG GGGCGCGCGC180TCCTGGAGGG GCACCGCAGG GACCCCCGAC TGTCGCCTCC CTGTGCCGGA CTCCAGCCGG 240GGCGACGAGA GATGCATCTT CGCTCCTTCC TGGTGGCGGC GGCGGCTGAG AGGAGACTTG 300GCTCTCGGAG GATCGGGGCT GCCCTCACCC CGGACGCACT GCCTCCCCGC CGGGCGTGAA 360GCGCCCGAAA ACTCCGGTCG GGCTCTCTCC TGGGCTCAGC AGCTGCGTCC TCCTTCAGCT 420GCCCCTCCCC GCGCGGGGGG CGGCGTGGAT TTCAGAGTCG GGGTTTCTGC TGCCTCCAGC 480CCTGTTTGCA TGTGCCGGGC CGCGGCGAGG AGCCTCCGCC CCCCACCCGG TTGTTTTTGG 540GAGCCTCCCT CTGCTCAGCG TTGGTGGTGG CGGTGGCAGC ATG GCG AGC CCT CCG 595Met Ala Ser Pro Pro1 5GAG AGC GAT GGC TTC TCG GAC GTG CGC AAG GTG GGC TAC CTG CGC AAA 643Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val Gly Tyr Leu Arg Lys10 15 20CCC AAG AGC ATG CAC AAA CGC 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GAG CGT CGG GGG 2371Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro Leu Glu Arg Arg Gly585 590 595GGG CAC CAC CGC CCA GAC AGC TCC ACC CTC CAC ACG GAT GAT GGC TAC 2419Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Asp Asp Gly Tyr600 605 610ATG CCC ATG TCC CCA GGG GTG GCC CCA GTG CCC AGT GGC CGA AAG GGC2467Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro Ser Gly Arg Lys Gly615 620 625AGT GGA GAC TAT ATG CCC ATG AGC CCC AAG AGC GTA TCT GCC CCA CAG2515Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser Val Ser Ala Pro Gln630 635 640 645CAG ATC ATC AAT CCC ATC AGA CGC CAT CCC CAG AGA GTG GAC CCC AAT2563Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln Arg Val Asp Pro Asn650 655 660GGC TAC ATG ATG ATG TCC CCC AGC GGT GGC TGC TCT CCT GAC ATT GGA2611Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys Ser Pro Asp Ile Gly665 670 675GGT GGC CCC AGC AGC AGC AGC AGC AGC AGC AAC GCC GTC CCT TCC GGG2659Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Val Pro Ser Gly680 685 690ACC AGC TAT GGA AAG CTG TGG ACA AAC GGG GTA GGG GGC CAC 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AATAAATGAT 6139GTTTGCTCTG AAG 6152(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度1243個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ser Pro Pro Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val1 5 10 15Gly Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu20 25 30Arg Ala Ala Ser Glu Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu35 40 45Asn Glu Lys Lys Trp Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile50 55 60Pro Leu Glu Ser Cys Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn65 70 75 80Lys His Leu Val Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala85 90 95Ala Asp Ser Glu Ala Glu Gln Asp Ser Trp Tyr Gln Ala Leu Leu Gln100 105 110Leu His Asn Arg Ala Lys Gly His His Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly115 120 125Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly130 135 140Glu Ala Gly Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Ala145 150 155 160Phe Lys Glu Val Trp Gln Val Ile Leu Lys Pro Lys Gly Leu Gly Gln165 170 175Thr Lys Asn Leu Ile Gly Ile Tyr Arg Leu Cys Leu Thr Ser Lys Thr180 185 190Ile Ser Phe Val Lys Leu Asn Ser Glu Ala Ala Ala Val Val Leu Gln195 200 205Leu Met Asn Ile Arg Arg Cys Gly His Ser Glu Asn Phe Phe Phe Ile210 215 220Glu Val Gly Arg Ser Ala Val Thr Gly Pro Gly Glu Phe Trp Met Gln225 230 235 240Val Asp Asp Ser Val Val Ala Gln Asn Met His Glu Thr Ile Leu Glu245 250 255Ala Met Arg Ala Met Ser Asp Glu Phe Arg Pro Arg Ser Lys Ser Gln260 265 270Ser Ser Ser Asn Cys Ser Asn Pro Ile Ser Val Pro Leu Arg Arg His275 280 285His Leu Asn Asn Pro Pro Pro Ser Gln Val Gly Leu Thr Arg Arg Ser290 295 300Arg Thr Glu Ser Ile Thr Ala Thr Ser Pro Ala Ser Met Val Gly Gly305 310 315 320Lys Pro Gly Ser Phe Arg Val Arg Ala Ser Ser Asp Gly Glu Gly Thr325 330 335Met Ser Arg Pro Ala Ser Val Asp Gly Ser Pro Val Ser Pro Ser Thr340 345 350Asn Arg Thr His Ala His Arg His Arg Gly Arg Ala Arg Leu His Pro355 360 365Pro Leu Asn His Ser Arg Ser Ile Pro Met Pro Ala Ser Arg Cys Ser370 375 380Arg Ser Ala Thr Ser Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly385 390 395 400His Gly Ser Thr Ser Asp Cys Leu Phe Pro Arg Arg Ser Ser Ala Ser405 410 415Val Ser Gly Ser Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ile Ser Ser Asp Glu Tyr420 425 430Gly Ser Ser Pro Cys Asp Phe Arg Ser Ser Phe Arg Ser Val Thr Pro435 440 445Asp Ser Leu Gly His Thr Pro Pro Ala Arg Gly Glu Glu Ile Leu Ser450 455 460Asn Tyr Ile Cys Met Gly Gly Lys Gly Pro Ser Thr Leu Thr Ala Pro465 470 475 480Asn Gly His Tyr Ile Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gly His Arg Cys Thr485 490 495Pro Gly Thr Gly Leu Gly Thr Ser Pro Ala Leu Ala Gly Asp Glu Ala500 505 510Ala Ser Ala Ala Asp Leu Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser515 520 525Ala Gly Thr Ser Pro Thr Ile Thr His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser530 535 540Ser Val Ala Ser Ile Glu Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Tyr Pro545 550 555 560Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Leu Pro Gly His Arg His Ser Ala565 570 575Phe Val Pro Thr Arg Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro580 585 590Leu Glu Arg Arg Gly Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His595 600 605Thr Asp Asp Gly Tyr Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro610 615 620Ser Gly Arg Lys Gly Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser625 630 635 640Val Ser Ala Pro Gln Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln645 650 655Arg Val Asp Pro Asn Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys660 665 670Ser Pro Asp Ile Gly Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn675 680 685Ala Val Pro Ser Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Trp Thr Asn Gly Val690 695 700Gly Gly His His Ser His Val Leu Pro His Pro Lys Pro Pro Val Glu705 710 715 720Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu Pro Cys Thr Gly Asp Tyr Met Asn Met725 730 735Ser Pro Val Gly Asp Ser Asn Thr Ser Ser Pro Ser Asp Cys Tyr Tyr740 745 750Gly Pro Glu Asp Pro Gln His Lys Pro Val Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu755 760 765Pro Arg Ser Phe Lys His Thr Gln Arg Pro Gly Glu Pro Glu Glu Gly770 775 780Ala Arg His Gln His Leu Arg Leu Ser Thr Ser Ser Gly Gly Leu Leu785 790 795 800Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser805 810 815Leu Gly Gly Gly Tyr Cys Gly Ala Arg Leu Glu Pro Ser Leu Pro His820 825 830Pro His His Gln Val Leu Gln Pro His Leu Pro Arg Lys Val Asp Thr835 840 845Ala Ala Gln Thr Asn Ser Arg Leu Ala Arg Pro Thr Arg Leu Ser Leu850 855 860Gly Asp Pro Lys Ala Ser Thr Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gln Gln Gln865 870 875 880Gln Gln Gln Pro Leu Leu His Pro Pro Glu Pro Lys Ser Pro Gly Glu885 890 895Tyr Val Asn Ile Glu Phe Gly Ser Asp Gln Ser Gly Tyr Leu Ser Gly900 905 910Pro Val Ala Phe His Ser Ser Pro Ser Val Arg Cys Pro Ser Gln Leu915 920 925Gln Pro Ala Pro Arg Glu Glu Glu Thr Gly Thr Glu Glu Tyr Met Lys930 935 940Met Asp Leu Gly Pro Gly Arg Arg Ala Ala Trp Gln Glu Ser Thr Gly945 950 955 960Val Glu Met Gly Arg Leu Gly Pro Ala Pro Pro Arg Ala Ala Ser Ile965 970 975Cys Arg Pro Thr Arg Ala Val Pro Ser Ser Arg Gly Asp Tyr Met Thr980 985 990Met Gln Met Ser Cys Pro Arg Gln Ser Tyr Val Asp Thr Ser Pro Ala995 10001005Ala Pro Val Ser Tyr Ala Asp Met Arg Thr Gly Ile Ala Ala Glu Glu101010151020Val Ser Leu Pro Arg Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala1025103010351040Ala Ser Ala Ser Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ala Ala Glu Leu Ala Ala104510501055His Ser Ser Leu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Met Ser Ala106010651070Phe Thr Arg Val Asn Leu Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ser Ala Lys Val107510801085Ile Arg Ala Asp Pro Gln Gly Cys Arg Arg Arg His Ser Ser Glu Thr109010951100Phe Ser Ser Thr Pro Ser Ala Thr Arg Val Gly Asn Thr Val Pro Phe1105111011151120Gly Ala Gly Ala Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser112511301135Glu Asp Val Lys Arg His Ser Ser Ala Ser Phe Glu Asn Val Trp Leu114011451150Arg Pro Gly Glu Leu Gly Gly Ala Pro Lys Glu Pro Ala Lys Leu Cys115511601165Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp117011751180Leu Val Lys Asp Phe Lys Gln Cys Pro Gln Glu Cys Thr Pro Glu Pro1185119011951200Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Gln Pro Leu Gly Ser Gly Glu120512101215Ser Ser Ser Thr Arg Arg Ser Ser Glu Asp Leu Ser Ala Tyr Ala Ser122012251230Ile Ser Phe Gln Lys Gln Pro Glu Asp Arg Gln12351240
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建物，其包括編碼胰島素受體底物1(IRS-1)的DNA序列，該DNA序列含有至少一個核苷酸的突變，或所述構(gòu)建物包括該DNA序列含有所述突變的片段。
2.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中的突變造成IRS-1序列中至少一個氨基酸的取代。
3.權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物，其中突變位于使氨基酸取代干擾通過IRS-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中突變是第972密碼子第一位G到A的突變，第805密碼子第三位A到G的突變，第894密碼子第三位G到C的突變。
5.權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建物，其包括序列表SEQ ID NO1中所示DNA序列，或包括該DNA序列包含SEQ ID NO1之3494核苷酸G到A突變的片段。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)之DNA構(gòu)建物的重組表達(dá)載體。
7.一種活系統(tǒng)，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)之DNA構(gòu)建物或權(quán)利要求6之重組表達(dá)載體，并能夠表達(dá)其中至少一個氨基酸被取代的IRS-1。
8.權(quán)利要求7的活系統(tǒng)，其包括哺乳動物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物，尤其是轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物。
9.一種檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的方法，該方法包括從受檢者獲取生物樣品并分析樣品IRS-1序列中至少一個核苷酸的突變。
10.權(quán)利要求9的方法，其中分析樣品IRS-1編碼序列中造成至少一個氨基酸取代的突變。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中分析樣品位于使氨基酸取代干擾通過IRS-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之位點(diǎn)的突變。
12.權(quán)利要求11的方法，其中分析樣品IRS-1編碼基因中第972密碼子第一位G到A的突變，第805密碼子第三位A到G的突變，第894密碼子第三位G到C的突變。
13.權(quán)利要求9的方法，其中從受檢者獲取生物樣品，從樣品中分離DNA并用在突變位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶消化，測定IRS-1編碼基因中在該位點(diǎn)的DNA切割。
14.權(quán)利要求13的方法，其中用限制性內(nèi)切酶消化后的DNA限制酶切圖，與用陰性對照獲得的限制酶切圖相比較，該陰性對照含有至少部分野生型IRS-1編碼DNA。
15.權(quán)利要求13的方法，其中用限制性內(nèi)切酶消化后的DNA限制酶切圖，與用陽性對照獲得的限制酶切圖比較，該陽性對照含有至少部分IRS-1編碼DNA并含有所述突變。
16.權(quán)利要求15的方法，其中陽性對照含有按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。
17.權(quán)利要求13的方法，其中限制性內(nèi)切酶是在以下序列處切割DNA的內(nèi)切酶5’-CCA/TGG-3’3’-GGT/ACC-3’
18.權(quán)利要求17的方法，其中限制性內(nèi)切酶是BstN1。
19.權(quán)利要求13的方法，它還包括在用限制性內(nèi)切酶消化前，擴(kuò)增從樣品獲得的DNA。
20.權(quán)利要求9-19的方法，其用于測定受檢者對非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的素質(zhì)。
21.權(quán)利要求9的方法，其中從受檢者獲得生物樣品，從樣品中分離DNA，擴(kuò)增DNA并與標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，然后測定探針與DNA的雜交，所述探針包含相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因的DNN序列并含有至少一個核苷酸的突變，該突變相當(dāng)于要檢測其在IRS-1編碼基因中是否存在的突變。
22.權(quán)利要求21的方法，其中擴(kuò)增的DNA進(jìn)一步與包含相當(dāng)于至少部分IRS-1野生型編碼基因之DNA序列的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交，并測定該探針與DNA的雜交。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中標(biāo)記含突變之寡核苷酸探針的標(biāo)記物不同與標(biāo)記相當(dāng)于野生型DNA之寡核苷酸探針的標(biāo)記物。
24.權(quán)利要求21或22的方法，其中標(biāo)記物選自酶、有色物質(zhì)或熒光物質(zhì)、和放射性同位素。
25.權(quán)利要求21-24之中任一項(xiàng)的方法，其為測定受檢者對NIDDM的素質(zhì)的方法。
26.用于檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的診斷組合物，該組合物含有根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。
27.用于檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的檢測試劑盒，該試劑盒包含(a)在突變位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶，(b)相當(dāng)于至少部分IRS-1野生型編碼基因的第一DNA序列，和/或(c)相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因并含有至少一個核苷酸突變的第二DNA序列，所述突變相當(dāng)于要檢測其在IRS-1編碼基因中是否存在的突變。
28.權(quán)利要求27的檢測試劑盒，其中第二DNA序列為根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。
29.權(quán)利要求27的檢測試劑盒，其中限制性內(nèi)切酶為在下列序列處切割DNA的內(nèi)切酶5’-CCA/TGG-3’S’-GGT/ACC-3’
30.權(quán)利要求29的檢測試劑盒，其中限制性內(nèi)切酶為BstN1。
31.權(quán)利要求27的檢測試劑盒，其還含有擴(kuò)增DNA的工具。
32.權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的檢測試劑盒，其為測定受檢者對NIDDM的素質(zhì)的試劑盒。
33.用于檢測IRS-1編碼基因中是否存在某突變的檢測試劑盒，該試劑盒包括(a)擴(kuò)增DNA的工具，和(b)一種標(biāo)記的寡核苷酸探針，其包含相當(dāng)于至少部分IRS-1編碼基因的DNA序列并含有至少一個核苷酸的突變，該突變相當(dāng)于要檢測其在IRS-1基因中是否存在的突變。
34.權(quán)利要求33的檢測試劑盒，其中標(biāo)記的寡核苷酸探針包含根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。
35.權(quán)利要求33的檢測試劑盒，其還包括含有相當(dāng)于至少部分IRS-1野生型編碼基因之DNA序列的標(biāo)記寡核苷酸探針。
36.權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)的檢測試劑盒，其中標(biāo)記物選自酶、有色物質(zhì)或熒光物質(zhì)、和放射性同位素。
37.含有至少一個氨基酸取代的IRS-1變體。
38.權(quán)利要求37的變體，其含有特定位點(diǎn)的至少一個氨基酸取代，在該位點(diǎn)的取代干擾通過IRS-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者該變體含有所述取代的片段。
39.權(quán)利要求38的變體，其中甘氨酸972被精氨酸取代，或者其含有所述取代的片段。
40.權(quán)利要求39的變體，其具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或者該變體含有Arg972的片段。
全文摘要
含有編碼胰島素受體底物1(IRS-1)的DNA序列的DNA構(gòu)建物，該DNA序列含有至少一個核苷酸的突變，或含有該DNA序列含所述突變的片段的DNA構(gòu)建物。
文檔編號C07K14/47GK1129001SQ9419296
公開日1996年8月14日 申請日期1994年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月10日
發(fā)明者O·佩德森, C·比約伯克, K·A·弗雷德里克森 申請人:諾沃挪第克公司