專利名稱：通過T細(xì)胞α鏈的抗原特異性的免疫調(diào)節(jié)方法
本申請為1991年8月30日提交的申請編號07/752820的部分繼續(xù)。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及以抗原特異性方式調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的方法。
能夠與令人感興趣的抗原相結(jié)合的T細(xì)胞α鏈被用于為抑制或加強(qiáng)對特定抗原的免疫反應(yīng)設(shè)計(jì)的方案中。本文描述的治療方案可用于治療過敏反應(yīng)，自身免疫，移植排異和癌癥。2.相關(guān)技術(shù)的描述免疫學(xué)家和其它學(xué)者長期以來一直在研究免疫系統(tǒng)試圖找到一種調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機(jī)制。為此目的，以非特異性方式完全抑制或加強(qiáng)免疫反應(yīng)的多種藥物或方案被采用。然而，由于影響了整個(gè)免疫系統(tǒng)，這種類型的調(diào)節(jié)不能令人滿意。這種類型的調(diào)節(jié)未考慮到可只對特異性抗原的免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的免疫系統(tǒng)特殊組成。例如，在治療過敏反應(yīng)時(shí)，只選擇性地抑制對特定致敏原的免疫反應(yīng)而不抑制個(gè)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)是有利的。本文描述和權(quán)利要求的發(fā)明，部分基于發(fā)現(xiàn)了可溶性T細(xì)胞受體α鏈?zhǔn)敲庖叻磻?yīng)的抗原特異性介質(zhì)，涉及將那些T細(xì)胞受體α鏈用于抑制或加強(qiáng)對特異性抗原的免疫反應(yīng)的方法。2.1免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)外源抗原引入個(gè)體中引發(fā)包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩種主要組成的免疫反應(yīng)。這兩種免疫反應(yīng)分別由功能不同的T細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴細(xì)胞群介導(dǎo)。T細(xì)胞通過產(chǎn)生淋巴因子對抗原刺激起反應(yīng)，這些淋巴因子“輔助”或激活免疫系統(tǒng)中各種其它細(xì)胞類型。另外，某些T細(xì)胞可成為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞。另一方面，B細(xì)胞反應(yīng)主要包括它們的分泌產(chǎn)物，即抗體，抗體可直接與抗原結(jié)合。輔助T細(xì)胞(TH)可通過其細(xì)胞表面糖蛋白標(biāo)記CD4的表達(dá)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞區(qū)別開來。雖然CD4+輔助T細(xì)胞調(diào)節(jié)其它細(xì)胞類型的機(jī)制尚未完全闡明，但CD4+T細(xì)胞區(qū)劃內(nèi)的某些亞群的作用已有研究(Mosmann和Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7145-173)。I型輔助細(xì)胞(TH1)在激活后產(chǎn)生白介素-2(IL-2)和γ-干擾素，而II型輔助細(xì)胞(TH2)產(chǎn)生IL-4和IL-5。基于淋巴因子產(chǎn)生的分布型，TH1表現(xiàn)為涉及促進(jìn)其它T細(xì)胞的增殖，而TH2因子特異地調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖，抗體合成，和抗體類型的轉(zhuǎn)變。而且，這兩種TH群可互相調(diào)節(jié)，因?yàn)門H1產(chǎn)生的γ-干擾素抑制TH2的增殖和功能。
B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)兩者的一個(gè)顯著特點(diǎn)是它們對免疫抗原的精確特異性，但它們的抗原識別機(jī)制不同?？贵w在固體表面或溶液中直接與抗原結(jié)合，而T細(xì)胞只與呈遞在固相如抗原呈遞細(xì)胞表面上呈遞的抗原反應(yīng)。另外，抗原必須在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-編碼的I類或II類分子的組織中呈遞至T細(xì)胞。MHC指編碼具有多種免疫功能的蛋白質(zhì)的一個(gè)基因簇。I類基因產(chǎn)物可見于所有細(xì)胞并且它們是主要移植排異反應(yīng)的靶。II類基因產(chǎn)物主要在各種造血譜系的細(xì)胞上表達(dá)并且它們在免疫反應(yīng)中涉及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。一類和二類蛋白質(zhì)還顯示可作為抗原呈遞細(xì)胞表面上的抗原的受體。T細(xì)胞和抗原間相互作用的復(fù)雜性的另一水平在于，這種相互作用僅在抗原呈遞細(xì)胞和反應(yīng)性T細(xì)胞間的MHC單倍型(復(fù)合體中所有等位基因的組合)相同時(shí)發(fā)生。因此，對特定抗原特異性的T細(xì)胞只在抗原由表達(dá)匹配MHC的細(xì)胞所呈遞時(shí)產(chǎn)生反應(yīng)。這種現(xiàn)象即MHC-限制性。
1970年，Gershon和Kondo(Gershon和Kondo，1970，Immunology18723)提出T細(xì)胞也可負(fù)性地影響免疫反應(yīng)過程。雖然免疫調(diào)節(jié)概念最初受到懷疑，但最終它仍被大多數(shù)免疫學(xué)家接受，因?yàn)樗鼮榭乖驯凰o定免疫反應(yīng)消除，并且繼續(xù)反應(yīng)不再需要時(shí)，免疫系統(tǒng)中動(dòng)態(tài)平衡的維持提供了概念性框架。從那以后，抗原特異性抑制T細(xì)胞(Ts)在許多實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中被報(bào)告(Green等，1983，Ann，Rev.Immunol.1439-463；Dorf和Denacerraf，1984，Ann，Rev.Immunol.2127-158)。
描繪Ts作用機(jī)制的試嘗導(dǎo)致在T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了許多可溶性介體。因此，提出假定Ts通過釋放T抑制因子(TsF)起作用，TsF隨后作用于其它T和B細(xì)胞?；趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提出了多種復(fù)雜的模式以闡明不同Ts亞群和它們的TsF之間的復(fù)雜相互作用(Asherson等，1986，Ann.Rev.Immunol.437-68)。
由于不同T細(xì)胞功能亞群確立了特異性表面標(biāo)記，開始進(jìn)行了Ts和它們的FsF的獨(dú)特標(biāo)記的搜尋。一項(xiàng)Ts表面表型的研究首先顯示它們表達(dá)CD8(Lyt-2)，一種具細(xì)胞毒性潛力的T細(xì)胞共享的標(biāo)記。1976年，報(bào)道了一種看來與小鼠Ts特異性表達(dá)的結(jié)構(gòu)相作用的抗血清(Murphy等，1976，J.Exp.Med.144699；Tada等，1976，J.Exp.Med.144713)。對編碼抗原的基因圖譜研究將該基因定位于小鼠MHC中I-Eα和1-Eβ間的I區(qū)。(此位點(diǎn)稱為I-J。
20世紀(jì)80年代早期，細(xì)胞免疫領(lǐng)域開始從現(xiàn)象學(xué)轉(zhuǎn)向分子特征。該轉(zhuǎn)變導(dǎo)致若干發(fā)現(xiàn)如T細(xì)胞受體(TCR)的特征(見部分2.2，見下)。多種淋巴因子的鑒定，和MHC蛋白三維結(jié)構(gòu)的闡明。然而，將分子克隆技術(shù)應(yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的抑制的研究并未得到豐富的見識。例如，生化地純化TsF至均質(zhì)的嘗試基本上是失敗的。當(dāng)小鼠MHC I區(qū)的基因被分離并測序時(shí)，在I-Eα和I-Eβ間并未顯示有足夠的DNA來說明I-J基因。而且，當(dāng)一大組T細(xì)胞克隆和T細(xì)胞雜交瘤被檢測TCRβ基因重排時(shí)，只有輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞含有這樣的重排而所有測試的Ts均為陰性，表明Ts可能不表達(dá)功能性受體(Hedrick等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82531-535)。2.2 T細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)和功能T細(xì)胞和B細(xì)胞對抗原反應(yīng)的特異性是這些細(xì)胞表達(dá)的獨(dú)特受體的功能。當(dāng)發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞以抗體形式分泌其受體后，B細(xì)胞受體研究的進(jìn)展很快。漿細(xì)胞瘤是自然發(fā)生的，單克隆起源的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的腫瘤。這些腫瘤提供連續(xù)來源的均質(zhì)的蛋白質(zhì)，用于最初的抗體分子結(jié)構(gòu)的提純和特征鑒定(Potter，1972，Physiol.Res.52631-710)?，F(xiàn)已證實(shí)，除了細(xì)胞表面形式含有跨膜固定區(qū)外，抗體與它們的膜結(jié)合配對物是一致的(Tonegawa，1983，Nature 302575-581)。
另一方面，TCR方面的早期工作未能檢測出一種TCR的分泌形式，因而使用可溶性抗體的方法不能被有效地采用。另外，T細(xì)胞抗原識別中MHC限制性的發(fā)現(xiàn)為TCR的分析增加了另一重困難(Zinkernagel和Doherty，1974，Nature 248701-702)。當(dāng)時(shí)曾爭議是單個(gè)TCR與抗原加MHC兩者結(jié)合，還是涉及兩個(gè)單獨(dú)的受體。然而，看來清楚的是TCR不象是與B細(xì)胞受體相同。
在20世紀(jì)80年代，單克隆抗體，重組DNA技術(shù)和抗原特異性T細(xì)胞長期培養(yǎng)方法的發(fā)展的到來，大大易化了TCR的鑒定。針對克隆的T細(xì)胞群產(chǎn)生的單克隆抗體發(fā)現(xiàn)只與免疫的T細(xì)胞特異性地反應(yīng)(Allison等，1982，J.Immunol.1292293；Haskin等，1983，J.Exp.Med.1571149；Samelion等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806972)。使用這些克隆的特異性抗體免疫沉淀T細(xì)胞膜通過SDS-PAGE顯示了一個(gè)46000道爾頓分子量的帶。在非還原條件下，檢測出90000道爾頓的帶提示TCR具有二聚體結(jié)構(gòu)。隨后的實(shí)驗(yàn)確定了功能性的TCR是含有兩個(gè)稱為α和β的由二硫鍵連接的糖蛋白的異二聚體(Marrack和Kappler，1987，Science 2381073-1079)。大約在同時(shí)，從人和小鼠中分離出了編碼α和β鏈的互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆(Hedrick等，1984，Nature 308149-153；Hedrick等，1984，Nature 308153-158；Yanagi等，1984，Nature 308145-149)。cDNA的序列分析證明該編碼序列由類似于抗體的重排基因片段的重排基因片段構(gòu)成。結(jié)果顯示將α和β基因轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞對賦予受體細(xì)胞抗原特異性和MHC限制性是必需而且足夠的(Dembic等，1986，Nature 320232-238)。因此，看來異二聚TCR是負(fù)責(zé)對抗原和MHC結(jié)合的識別的。一些研究提示α和β的可變區(qū)分別偏向于抗原的識別和MHC的識別(Kappler等，1987，Cell 49263-271；Winoto等，1986，Nature324679-682；Tan等，1988，Cell 54247-261)，而其它研究提示識別是整個(gè)受體自然發(fā)生的特性(Kuo和Hood，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817614-7618；Danska等，1990，J.Exp.Med.17227-33)。
CD3是多肽復(fù)合體，它非共價(jià)地與TCR連接，并涉及由占據(jù)TCR所引發(fā)的導(dǎo)致T細(xì)胞激活的跨膜信號事件(Clevers等，1988，Ann.Rev.Immunol.6629)。結(jié)果表明用抗體直接刺激CD3能模擬T細(xì)胞激活的正常途徑(Meuer等，1983，J.Exp.Med.158988)CD3要轉(zhuǎn)運(yùn)至T細(xì)胞表面需要它在細(xì)胞內(nèi)與完整的異二聚TCR復(fù)合體的聯(lián)結(jié)。也證實(shí)TCRα和β鏈的復(fù)合體和CD3多肽的復(fù)合體都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配(Minami等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842688-2692；Alarcon等，1988.J.Biol.Chem.2362953-2961)。正確形成的完整的受體，TCR/CD3，隨后作為功能單位被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。裝配不完整的受體復(fù)合體通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，并在那里被降解。因此，通常未連接的α和β鏈似乎不到達(dá)T細(xì)胞外部。甚至在細(xì)胞外連完整的分泌形式的TCRα和β受體也不能檢測到。因此，它們在抗原識別中的功能被認(rèn)為僅限于T細(xì)胞表面和以異二聚體形式。
現(xiàn)已清楚，大多數(shù)的功能性T細(xì)胞都表達(dá)αβTCR。雖然包含γδ異二聚體的第二種類型的TCR已被鑒定，但這些受體只有很小比例的外周T細(xì)胞表達(dá)并且它們在抗原特異性識別中的作用尚仍需證實(shí)。結(jié)構(gòu)上，T細(xì)胞的αβ和γδ受體在一級序列，基因結(jié)構(gòu)和DNA重排模式方面與抗體分子高度同源(Davis和Bjorkman，1988，Nature 334395-402)。然而，T細(xì)胞抗原受體在兩個(gè)主要方面不同于抗體TCR只在細(xì)胞表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)和它們只識別MHC-編碼分子結(jié)構(gòu)中的抗原。2.3可溶性T細(xì)胞受體最近的研究提示在某些情況下TCR可從細(xì)胞排出或釋放(Guy等，1989，Science 2441477-1480；Fairchild等，1990，J.Immunol.1452001-2009)。然而，尚未證實(shí)這些分泌的分子是完整的TCR，部分片斷，還是具有TCR交叉反應(yīng)表位的其它分子。在本文描述的實(shí)施例所證實(shí)的發(fā)現(xiàn)之前，功能上活性的TCRα鏈可從T細(xì)胞釋放而不管剩下的TCR組份的觀點(diǎn)是有爭議的和受到懷疑的。Klausner和同事(Bonifacino等，1990，Science 24779-82)已證明除非與CD3δ復(fù)合，TCRα就被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并被降解，而且(Minami等，1987，Proc.Natl.Acad.Bci.USA 842688-2692)不作為CD3-TCR復(fù)合體的一部分而排出到細(xì)胞表面的TCRα在溶酶體中被降解。這些觀察結(jié)果不支持TCRα可能從細(xì)胞釋放的途徑的存在。對類似地保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并降解的TCRβ的研究(Wileman等，1990，Cell Regulation 1907-917)提示TCR的裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)要更加復(fù)雜。例如，在表達(dá)TCRβ轉(zhuǎn)基因(Transgene)的SCID小鼠中，在缺乏TCRα或CD3成分時(shí)，TCRβ在未成熟胸腺細(xì)胞的表面上表達(dá)(Kishi等，1991，EMBOJ.1093-100)。進(jìn)一步，構(gòu)建了只包含VDJ和Cβ1結(jié)構(gòu)域的截短的TCRβ鏈基因，而且被分泌出來。雖然預(yù)期這種分子會(huì)被降解(Gascoigne，1990，J.Biol.Chem.2659296-9301)。因此在一些細(xì)胞中存在這樣的可能性，TCR可小量地被釋放，可能以與其它未鑒定分子形成的復(fù)合體形式和/或以翻譯后截短的形式。
一些實(shí)驗(yàn)報(bào)告存在一種未鑒定的可溶性調(diào)節(jié)因子或與針對TCRα的抗體反應(yīng)的因子。例如，在CD4+輔助T細(xì)胞雜交瘤A1.1的體外測定中檢測到無細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性，該A1.1對合成的多肽抗原，poly 18，加I-Ad特異，該因子的抗原精細(xì)特異性與T細(xì)胞雜交瘤的精細(xì)特異性相對應(yīng)(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358)。已發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于TCRVα和Vβ的反義寡核苷酸特異性地抑制細(xì)胞表面TCR-CD3表達(dá)，但只有Vα的反義而不是Vβ的(或?qū)φ展押塑账?抑制A1.1的可溶性調(diào)節(jié)活性的產(chǎn)生(Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863758-3762)。在最近的研究中A1.1的抗原特異性調(diào)節(jié)活性被對TCRα特異性的單克隆抗體柱結(jié)合并從該柱上洗脫，并從代謝地標(biāo)記的上清液分辨為46000道爾頓分子量的蛋白質(zhì)；該活性不被抗TCRβ，抗TCRVβ，或抗CD3ε抗體結(jié)合(Bissonnette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。雖然共有TCRα鏈決定簇，不是從表面TCR衍生的Ts活性，有報(bào)告但未有特征描述(Collins等，1990，J.Immunol.1452809-2812)。Takada(1990，J.Immunol.1452846-2853)也報(bào)告了共有TCRα鏈決定簇的Ts活性，但它是MHC限制性的。與這些結(jié)果相反，F(xiàn)airchild(1990，J.Immunol.1452001-2009)報(bào)告了與抗TCRCα反應(yīng)但不與抗Vβ和抗TCR-β抗體反應(yīng)的DNP特異性Ts因子。在本文所述的發(fā)明前，無人鑒定或闡明TCRα作為對觀察到的抗原特異性調(diào)節(jié)作用負(fù)責(zé)的可溶性免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用。
三種取代或取消TCR跨膜區(qū)的主要策略被試嘗用于生產(chǎn)可溶性TCR分子。在最直接的方法中，翻譯中止密碼子被引入TCRα或TCRα/β二聚體的上游。在cDNA轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞，COS-7細(xì)胞或Hela細(xì)胞，TCRα被報(bào)告可在進(jìn)入高爾基體前在一種非溶酶體的結(jié)構(gòu)中快速降解(Wileman等，J.Cell.Biol.，110973-986，1990；Lippincott-Schwartz等，Cell，54209-220，1988；Baniyash等，J.Biol.Chem.，2639874-9878，1988；Bonifacino等，Science，24779-82，1990；Bonifacino等，Cell，63505-513，1990；Manolios等，Science，249274-277，1990；Shin等，Science，2591901-1904，1993)。在第二種策略中，TCRα和β鏈的細(xì)胞外V和C結(jié)構(gòu)閾被推至胞盤堿性磷酸酶或Thy-1分子的糖基磷脂酰肌醇膜固定裝置上(Lin，等，Science，249677-679，1990；Slanetz等，Eur.J.Immunol.，21179-183，1991)。通過用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C處理細(xì)胞，對應(yīng)的脂連接的TCR多肽以可溶形式從膜上釋放，并且可溶解的TCRαβ異二聚體顯示與抗Clonotypic單克隆抗體特異性反應(yīng)。但是，釋放的TCR多肽產(chǎn)率過低，使該分子不能應(yīng)用于臨床使用。第3種方法是構(gòu)建TCR的雜種蛋白質(zhì)。用免疫球蛋白恒定區(qū)(Gregoire等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 888077-8081，1991；Weber等，Nature，356793-796，1992)和CD3Z(zeta)鏈(Engel，等，Science，2561318-1321，1992)。這些融合蛋白質(zhì)由轉(zhuǎn)染的骨髓瘤或白血病細(xì)胞分泌入培養(yǎng)液，并且這些可溶性TCRs顯示保留了相應(yīng)細(xì)胞表面結(jié)合TCR的所有血清學(xué)上可測定表位。然而，這些融合蛋白質(zhì)顯示抗原的低親合性識別并可能是免疫原性的。此外，單獨(dú)TCRα鏈的功能表達(dá)從未成功過。
以前已報(bào)告使用Vα和Vβ多肽的融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)TCR(見Hoo，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.894759-4763，1992)。然而，只有1％的蛋白質(zhì)能以再折疊蛋白質(zhì)形式回收。在本發(fā)明中，再折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)量與典型的可溶性蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子同樣多，這使之有可能為臨床應(yīng)用提供均質(zhì)的TCRα分子。
為在大腸桿菌中表達(dá)動(dòng)物蛋白質(zhì)，很多研究者發(fā)展了各種系統(tǒng)。然而，在此微生物中表達(dá)異源基因時(shí)常遇到一些困難。例如大腸桿菌和動(dòng)物基因在它們的密碼子使用類型和翻譯起始信號兩方面的顯著不同，可妨礙在細(xì)菌的核糖體上對動(dòng)物mRNA的有效翻譯(Orormo，等，Nucl.AcidsRes.102971-2996，1982)。換言之，在大腸桿菌中合成的異源蛋白質(zhì)由于宿主細(xì)胞的蛋白水解酶活性可能不能積累到顯著水平(Gottesman.，Annu.Rev.Genet.，23163-198，1989)。另外，治療學(xué)上有用的蛋白質(zhì)的物理特性可引起問題，因?yàn)橐恍┓置诘姆肿踊蚰は嚓P(guān)分子如TCR為了穩(wěn)定性和可溶性需要糖基化和二硫鍵連接。因?yàn)樵诩?xì)菌細(xì)胞質(zhì)中不能得到這樣的穩(wěn)定化過程，在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)常形成被稱為“包涵體”的不可溶聚合體(Schein，等，Bio/Technology.71141-1149，1989)。本發(fā)明提供在大腸桿菌包涵體中表達(dá)截短形式的TCRα多肽和再折疊并提純有生物活性TCRα的方法。
3.本發(fā)明的概要本發(fā)明涉及應(yīng)用TCRα鏈從抗原特異性方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法。表現(xiàn)下列兩種可在體外被評價(jià)的重要特性的TCRα鏈被用于生產(chǎn)和使用本發(fā)明的實(shí)踐中本發(fā)明的方法中使用的TCRα鏈必須能夠結(jié)合所研究的抗原，和在本文描述的輔助成分存在下調(diào)節(jié)針對此抗原產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)，即，通過抑制或增強(qiáng)該抗原特異性免疫反應(yīng)。
表現(xiàn)這種特性的TCRα鏈可有利地用于在人類或動(dòng)物體內(nèi)或在體外抗原特異性免疫反應(yīng)的下調(diào)或上調(diào)的方法中。例如，在超免疫的反應(yīng)的病人，如過敏，自身免疫疾病，或移植物排異中，在輔助成分的存在下，可體內(nèi)施用抑制抗原特異性免疫反應(yīng)的針對該反應(yīng)原的有效劑量的TCRα鏈。相反地，免疫抑制的病人的體液可測到表現(xiàn)免疫抑制作用的可溶性TCRα鏈存在?？赏ㄟ^使用對TCRα鏈特異性的抗體，或抑制TCRα鏈表達(dá)的反義寡核苷酸去除或中和可溶性TCRα鏈獲得病人對抗原免疫反應(yīng)的增強(qiáng)。
在本文中描述了可用于評價(jià)本發(fā)明中使用的TCRα鏈的體外測定法。例如，一些免疫親合技術(shù)可用于評價(jià)抗原結(jié)合，和下文中詳述的斑形成細(xì)胞(PFC)法(以后稱為“PFC”法)可用于評價(jià)所檢測的TCRα鏈的調(diào)節(jié)功能。簡言之，在PFC測定中在輔助成分存在下，將被檢測的TCRα鏈加至含有所感興趣的抗原的脾細(xì)胞培養(yǎng)體系中，該抗原與免疫原性的，可溶解(lysable)載體如外源性紅血細(xì)胞結(jié)合。通過測定經(jīng)數(shù)天后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)來評價(jià)TCRα鏈的免疫調(diào)節(jié)作用，如培養(yǎng)中空斑形成細(xì)胞的產(chǎn)生所表明的那樣。即這種免疫反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞生產(chǎn)針對載體(如紅細(xì)胞)的補(bǔ)體固定的抗體，并且這些細(xì)胞可通過一種細(xì)胞與補(bǔ)體和載體(如紅細(xì)胞)混合并形成單層的測定法檢測。載體的溶解導(dǎo)致形成一個(gè)清楚的空斑，對應(yīng)于一個(gè)空斑形成細(xì)胞(PFC)的存在。抑制培養(yǎng)中PFC的產(chǎn)生表明即抑制了由對偶聯(lián)的抗原特異性的TCRα鏈所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。如在下文中更詳細(xì)地解釋的，用于測定的輔助成分是從去除了可溶性成分如TCRα鏈的受刺激的T細(xì)胞上清液制備，這些可溶性因子直接與用于刺激T細(xì)胞的抗原結(jié)合。除非TCRα鏈存在，該輔助成分本身對免疫反應(yīng)無作用。
本發(fā)明部分基于組成性的由T細(xì)胞雜交瘤分泌的可溶性TCRα鏈的發(fā)現(xiàn)。如在工作實(shí)施例中所證實(shí)，這種分泌的TCRα鏈能直接結(jié)合于其抗原，并在輔助成分存在下，抑制通常針對該抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。然而，本發(fā)明不限于使用自然分泌的TCRα鏈，因?yàn)槿魏蜹CRα鏈基因可被克隆，表達(dá)并且使用本文描述的技術(shù)和方法測定這些基因產(chǎn)物在本發(fā)明的實(shí)踐中的適合性。另外，本文描述的測定法可用于評價(jià)其它分子，如抗體，其它TCR成分，它們以抗原特異性方式顯示免疫調(diào)節(jié)功能。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了基于使用大鼠鈣調(diào)蛋白作為融合伴侶(fusion partner)的一種新的融合基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)可優(yōu)選用于具有生物活性的TCRα蛋白的高表達(dá)和提純。大鼠鈣調(diào)蛋白在大腸桿菌中通過使用含有大腸桿菌trp啟動(dòng)子和trpA終止子的表達(dá)載體表達(dá)成功(Matsuki等，Biotech，Appl.Biochem.，12284-291，1990)。在此系統(tǒng)中，大鼠鈣調(diào)蛋白cDNA被修飾以去除5’-非翻譯序列并為大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)摻入了合適的序列。為配合圍繞翻譯起始密碼子的大腸桿菌一致核苷酸序列，而選擇了數(shù)種N-末端氨基酸的密碼子。通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，可溶級鈣調(diào)蛋白占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的30％以上。通過使用苯基瓊脂糖凝膠柱層析，約100mg90％純度的重組鈣調(diào)蛋白可從1升培養(yǎng)液中得到。在本發(fā)明中為在大鼠鈣調(diào)蛋白基因3’末端融合TCRα基因，由凝血酶識別的(Chang，Eur.J.Biochem.，151217-224，1985)編碼蛋白水解酶裂解位點(diǎn)的附加序列，Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)，被插入鈣調(diào)蛋白的C-末端。本方法有許多原因使分離TCRα蛋白成為可能1)表達(dá)水平高，2)融合蛋白以可溶形式表達(dá)，3)蛋白質(zhì)的提純驚人地容易，4)每個(gè)TCRα蛋白的單個(gè)再折疊過程是不必要的。
4.圖的簡述

圖1A和B.T細(xì)胞雜交瘤3-1-V，產(chǎn)生輔助成分，在存在得自A1.1細(xì)胞的抗原特異性TCRα鏈時(shí)介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)活性。圖2.從A1.1細(xì)胞分離的TCRα基因的完整核苷酸序列。在該基因的恒定區(qū)下劃線。(SEQ ID NO14)。圖3.TCRα從A1.1細(xì)胞向175.2細(xì)胞的基因傳遞(175.2-A1.1α)傳遞了產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)活性的能力。(A)A1.1 TCRα傳遞前后CD3在175.2細(xì)胞上的表達(dá)。在存在(B)相關(guān)抗原，(C)僅有載體(SRBC)，和(D)不相關(guān)對照抗原(SEQ ID NO15)時(shí)A1.1和175.2-A1.1α上清液中的抗原特異性調(diào)節(jié)活性。圖4.來自雜交瘤A1.1的TCRα鏈調(diào)節(jié)活性測試中使用的肽(SEQ IDNOS16，17，18，19，20，21，22，23和24)。圖5.A1.1細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)活性被針對TCRα鏈的抗體中和。圖6(A)和(B).在A1.1 TCRα傳遞后在圖6(A)AF5和圖6(B)AF6細(xì)胞(175.2的兩個(gè)亞克隆)上CD3的表達(dá)和用抗CD3抗體選擇。圖7A和B.TCRα從BB19細(xì)胞向175.2細(xì)胞的基因傳遞不傳遞產(chǎn)生抗SRBC PFC測定顯示的抗原特異性免疫調(diào)節(jié)活性的能力。圖8.TCRα從A1.1細(xì)胞向B9細(xì)胞(B9-A1.1α)的基因傳遞傳遞產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)活性的能力。圖9.從B9-A1.1α釋放的調(diào)節(jié)活性被抗TCRα結(jié)合并顯示與A1.1細(xì)胞的活性相同的抗原特異性。圖10A和B.A1.1 TCRα在缺乏TCRβ的細(xì)胞中的表達(dá)足以產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)活性。圖11A.在A1.1和其它表達(dá)A1.1 TCRα的細(xì)胞系的上清液中的抗原特異性結(jié)合活性。圖11B.肽對在A1.1和其它表達(dá)A1.1 TCRα的細(xì)胞系的上清液中抗原特異性結(jié)合活性的競爭。圖12.體外翻譯的A1.1 TCRα和β多肽的SDS-PAGE。圖13A和B.體外翻譯的A1.1 TCRα基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)活性被抗TCRα而不被抗TCRβ結(jié)合。圖14.顯示A1.1 TCRαcDNA的完整核苷酸序列和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NOS25和26)。圖15.顯示3B3衍生的TCRαcDNA的完整核苷酸和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NOS27和28)。圖16.顯示攜帶trp啟動(dòng)子和trpA終止子的表達(dá)質(zhì)粒PST811。圖17.顯示表達(dá)質(zhì)粒PST811-A1.1 TCRαS5。圖18.顯示攜帶大鼠鈣調(diào)蛋白cDNA和trp啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒PTCAL7。圖19.顯示攜帶大鼠鈣調(diào)蛋白和trp啟動(dòng)子并含有來自PTCAL7的附加克隆位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒PCF1。圖20.顯示表達(dá)質(zhì)粒PCF1-3B3 TCRα。圖21.顯示來自兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌產(chǎn)生的鈣調(diào)蛋白-TCRα的SDS-PAGE。圖22.大腸桿菌表達(dá)的A1.1 TCRαS5蛋白的SDS-PAGE。圖23.大腸桿菌表達(dá)的3B3 TCRα(鈣調(diào)蛋白-TCRα融合蛋白)的SDS-PAGE。圖24a.重組體A1.1 TCRαS5的免疫抑制活性是劑量信賴的。圖24b.重組體A1.1 TCRαS3的免疫抑制活性是劑量信賴的。圖25.在使用poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA(SEQ ID NO2)時(shí)可觀察到TCRα鏈的免疫抑制活性。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在抗原特異性免疫反應(yīng)中使用T細(xì)胞抗原受體的抗原結(jié)合鏈。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，評價(jià)TCRα鏈結(jié)合抗原和調(diào)節(jié)針對該抗原的特異免疫反應(yīng)的能力。本文描述了可用于此目的的體外測定法。表現(xiàn)適當(dāng)活性的TCRα鏈可用如重組DNA和/或化學(xué)合成方法大量生產(chǎn)并可用于對特異抗原免疫反應(yīng)的下調(diào)或上調(diào)。例如，超敏反應(yīng)，自身免疫反應(yīng)和移植物排異反應(yīng)可通過使用對相應(yīng)抗原特異并誘導(dǎo)抗原特異性抑制的TCRα鏈而被抑制。另外，可通過去除這種α鏈，或通過抑制在受試者中產(chǎn)生這種α鏈增強(qiáng)對抗原的免疫性，以特異性地增強(qiáng)針對特定抗原的免疫反應(yīng)。相反地，增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的TCRα鏈可被鑒定和使用。
本發(fā)明部分基于分泌形式的TCRα鏈的發(fā)現(xiàn)，該鏈直接與抗原結(jié)合并抑制針對該抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。特別地，對合成多肽抗原，poly 18，加I-Ad特異性的CD4+輔助T細(xì)胞雜交瘤A1.1被描述，它組成性的釋放其與抗原結(jié)合的TCRα鏈的分泌形式，并在合適的輔助成分存在下，抑制對該抗原的免疫反應(yīng)。本文描述的A1.1 TCRα鏈基因的分離與其傳遞入poly 18非活性T細(xì)胞系(見下文第6部分)，以及A1.1 TCRα鏈基因體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物介導(dǎo)這種調(diào)節(jié)活性的證實(shí)(見下文第7部分)，證明了是TCRα鏈基因而不是TCRβ鏈基因負(fù)責(zé)編碼調(diào)節(jié)因子，該調(diào)節(jié)因子直接結(jié)合抗原并介導(dǎo)調(diào)節(jié)功能。
TCRα鏈的產(chǎn)生和其作為抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用在下面部分中詳細(xì)描述和舉例說明。5.1 TCRα鏈的生產(chǎn)本發(fā)明涉及具有抗原結(jié)合和免疫調(diào)節(jié)活性兩者的TCRα鏈(不是完整T細(xì)胞表面抗原受體α和β)。具有抗原特異性調(diào)節(jié)活性的抗原結(jié)合TCRα蛋白可用多種方法生產(chǎn)。例如，TCRα鏈蛋白的表達(dá)可通過重組DNA技術(shù)和/或基于已知氨基酸序列的化學(xué)合成技術(shù)獲得。另外，TCRα鏈可從釋放此活性的連續(xù)T細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液直接提純。5.1.1 TCRα鏈的評價(jià)不管使用什么方法生產(chǎn)這樣的TCRα鏈，都應(yīng)該評價(jià)該分子的抗原結(jié)合力和免疫調(diào)節(jié)活性。例如，TCRα鏈直接與所研究抗原結(jié)合的能力可通過改進(jìn)的免疫測定技術(shù)評價(jià)，這些技術(shù)包括但不限于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)，免疫沉淀，Western印跡，或放射免疫測定法，其中在這些方法中通常使的抗體被TCRα鏈取代。
抗原結(jié)合TCRα鏈的免疫調(diào)節(jié)能力可使用允許以抗原特異方式檢測免疫反應(yīng)的任何測定系統(tǒng)予以評價(jià)。例如本文描述和例舉的PFC測定法可用于鑒定抑制直接針對特定抗原的免疫反應(yīng)的TCRα鏈。當(dāng)脾細(xì)胞在高度免疫原性載體如綿羊紅細(xì)胞(SRBC)存在下培養(yǎng)時(shí)，一種導(dǎo)致空斑形成細(xì)胞產(chǎn)生的免疫反應(yīng)發(fā)生了。通過將培養(yǎng)的脾細(xì)胞與SRBC(或適合的可溶解載體)和補(bǔ)體混合，并將混合物培養(yǎng)為單層，確定每一培養(yǎng)產(chǎn)生的PFC數(shù)。被一個(gè)清楚的空斑(即溶解的紅細(xì)胞)圍繞的細(xì)胞計(jì)數(shù)為PFCs。脾細(xì)胞培養(yǎng)中PFC產(chǎn)生的抑制，即PFC/培養(yǎng)物數(shù)的減少，表示免疫反應(yīng)的抑制。為測試TCRα鏈的抑制活性，并保證此抑制為抗原特異性的，PFC測定可按下述進(jìn)行將被研究抗原與SRBC連接(Ag-SRBC)并加入未免疫小鼠的脾細(xì)胞中。通過在存在下述輔助成分時(shí)(即，輔助成分應(yīng)在被測試的TCRα鏈前或同時(shí)加至培養(yǎng)物中)向培養(yǎng)物中加入被測TCRα鏈評價(jià)針對抗原特異的TCRα鏈的免疫調(diào)節(jié)作用。對照培養(yǎng)物在缺乏輔助成分時(shí)加入TCRα鏈或反過來加入TCRα但又缺乏輔助成分，或者可涉及非相關(guān)抗原的應(yīng)用。培養(yǎng)后，確定每種情況的PFC/培養(yǎng)數(shù)。與在對照組中所觀察到的相比，被測試培養(yǎng)物中PFC產(chǎn)生的抑制表明被測TCRα鏈以抗原特異性方式抑制通常在該培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
在測定系統(tǒng)中使用的輔助成分包括去除了任何可溶性因子的被刺激T細(xì)胞上清液。這些可溶性因子，包括TCRα鏈，它可直接與用于刺激該T細(xì)胞的抗原結(jié)合。因此這些輔助成分本身不抑制免疫反應(yīng)。這些輔助成分得自在體內(nèi)用抗原-特異性PFC測定的載體/指示劑刺激的T細(xì)胞例如，下述步驟可用于制備供上述PFC測定系統(tǒng)使用的輔助成分，以其中的靶是Ag-SRBC。得自SRBC-免疫的小鼠的脾細(xì)胞被去除B細(xì)胞后，將濃縮的T細(xì)胞培養(yǎng)或用于產(chǎn)生一個(gè)可再生的連續(xù)供給培養(yǎng)上清液的T細(xì)胞雜交瘤。使用PFC測定法測試T細(xì)胞培養(yǎng)物上清液抑制抗-SRBC免疫反應(yīng)的能力，其中SRBC是在存在或缺乏T細(xì)胞上清液情況下被加至培養(yǎng)的脾細(xì)胞中。被發(fā)現(xiàn)可抑制抗SRBC反應(yīng)的T細(xì)胞培養(yǎng)上清液隨后用SRBC吸收以去除任何可溶性因子如可與SRBC直接結(jié)合的可溶性TCRα鏈。隨后使用PFC測定法測試被吸附的上清液抑制抗SRBC免疫反應(yīng)的能力。不抑制抗SRBC反應(yīng)的那些被吸附的上清液被用作PFC測定法中的輔助成分，該P(yáng)FC測定法被設(shè)計(jì)用于鑒定表現(xiàn)抗原特異性免疫抑制活性的TCRα鏈(即，使用Ag-SRBC靶的PFC測定法)。另外，可得到不需要吸附步驟產(chǎn)生輔助成分的T細(xì)胞雜交瘤；例如，下文中第8部分中描述的雜交瘤3-1-V(見圖1)組成性的在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生輔助成分。因此，輔助成分本身無抑制性，它含有一或多種因子，可使抗原特異性因子即TCRα鏈以抗原-特異性方式抑制免疫反應(yīng)。這種測定系統(tǒng)的實(shí)例在下文6.1.5部分中給出。
相反地，增強(qiáng)免疫反應(yīng)的TCRα鏈也可用類似方法鑒定。在這種情況下，一種證實(shí)在吸收前增加PFC產(chǎn)生而吸收后無活性的，從T細(xì)胞雜交瘤或從T細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備的輔助成分可被用于PFC測定法中，該P(yáng)FC測定法被設(shè)計(jì)用于鑒定以抗原特異性方式增強(qiáng)針對Ag-SRBC的免疫反應(yīng)的TCRα鏈。
由于上述測定系統(tǒng)使用未接觸抗原的脾細(xì)胞培養(yǎng)物測定免疫反應(yīng)，和接觸載體的脾細(xì)胞培養(yǎng)物制備輔助成分，所用的培養(yǎng)的脾細(xì)胞可限于是動(dòng)物材料來源的(如，小鼠、大鼠、兔、和非人類靈長類)。然而，這不妨礙它們用于測定人類TCRα鏈的免疫調(diào)節(jié)活性。實(shí)際上許多人類免疫功能可在基于動(dòng)物的測定系統(tǒng)中檢測；例如，人類抗體效應(yīng)物功能如補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解作用和抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性可分別使用動(dòng)物血清和動(dòng)物效應(yīng)物細(xì)胞證實(shí)。然而，使用人類細(xì)胞培養(yǎng)物取代動(dòng)物脾細(xì)胞培養(yǎng)物改良PFC測定法可能是優(yōu)選的。例如，可使用Thomas等人，1980，J.Immunol.1252402中描述的反相溶血PFC測定法(亦參見Thomas，1982，J.Immunol.1281386)評價(jià)TCRα鏈對針對特定抗原的免疫反應(yīng)的作用。美國商陸有絲分裂原刺激的T細(xì)胞上清液可用作本測定系統(tǒng)中輔助成分的一種來源。5.1.2.細(xì)胞的選擇用作TCRα鏈來源和/或用于產(chǎn)生在本發(fā)明方法中使用的用以產(chǎn)生TCRα鏈的遺傳學(xué)材料來源的抗原特異性T細(xì)胞可用本領(lǐng)域中熟知的一些體外技術(shù)產(chǎn)生和選擇。T細(xì)胞的來源可為外周血，淋巴結(jié)，脾，和其它淋巴樣器官以及T細(xì)胞已侵潤的組織位點(diǎn)如腫瘤結(jié)節(jié)。T細(xì)胞類群可通過密度梯度離心或使用針對T細(xì)胞表面標(biāo)記如CD2，CD3，CD4，CD8等的抗體的細(xì)胞分選方法與其它細(xì)胞類型分離。這些方法包括但不限于淘洗法，親合層析法，流式細(xì)胞計(jì)，磁珠分離。也可采用負(fù)選擇方法以濃縮T細(xì)胞包括通過使用針對不被T細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記的抗體或利用非T細(xì)胞的膜特性如對各種基質(zhì)的粘附去除非T細(xì)胞群。所研究的T細(xì)胞亞群的進(jìn)一步選擇可應(yīng)用上述技術(shù)，這些技術(shù)使用針對更特異標(biāo)記物的抗體如分別選擇輔助和細(xì)胞毒/抑制T細(xì)胞的抗CD4和抗CD8，或針對在T細(xì)胞亞群如記憶細(xì)胞上表達(dá)的標(biāo)記物的抗體。
抗原特異性T細(xì)胞系可在適當(dāng)?shù)慕?jīng)射線照射的抗原呈遞細(xì)胞和細(xì)胞因子存在下用最適濃度的特異性抗原反復(fù)刺激在體外產(chǎn)生?？乖蔬f細(xì)胞應(yīng)得自自身的或MHC相匹配的來源，他們可為巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，郎格爾漢斯細(xì)胞，EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或未分離的外周血單核細(xì)胞。細(xì)胞因子可包括各種血介素如自然的或重組形式的自介素1，2，4，和6。這種技術(shù)，參見，如Takata等，1990，J.Immunol.1452846-2853。
抗原特異性T細(xì)胞的克隆群可通過在經(jīng)射線照射的滋養(yǎng)細(xì)胞，抗原和細(xì)胞因子存在下使用有限稀釋克隆法的T細(xì)胞克隆術(shù)取得。替代地，T細(xì)胞雜交瘤可通過將抗原特異性T細(xì)胞與融合伴侶(fusion partner)腫瘤系如BW5 147或BW1100融繼以HAT選擇和再克隆而產(chǎn)生?？乖禺愋訲細(xì)胞也可通過使用對CD3的單克隆抗體克隆和繁殖。T細(xì)胞克隆和T細(xì)胞雜交瘤可使用直接由體內(nèi)來源的細(xì)胞產(chǎn)生并隨后對抗原特異性進(jìn)行測試和選擇，或抗原特異性T細(xì)胞系在克隆和融合事件前得到。通過每7～14天用抗原或抗-CD3反復(fù)刺激隨后用細(xì)胞因子擴(kuò)大(expansion)，T細(xì)胞克隆可在培養(yǎng)中長期維持，而T細(xì)胞雜交瘤不需周期性抗原刺激就可在合適培養(yǎng)基中生長。
單克隆T細(xì)胞群的抗原特異性可在測定增殖和/或這些細(xì)胞對抗原反應(yīng)的淋巴因子產(chǎn)量的體外測定中被評價(jià)。T細(xì)胞的表型可通過用針對各種T細(xì)胞標(biāo)記物的抗體染色來證實(shí)。
這種抗原特異性T細(xì)胞可組成性的分泌TCRα鏈或它們可能需要激活信號以供釋放它們的α鏈。優(yōu)選地，抗原特異性T細(xì)胞可被用作通過重組DNA和/或化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)TCRα鏈所需要的遺傳學(xué)物質(zhì)來源。使用這種方法，某些不能分泌自然產(chǎn)生的TCRα鏈的抗原特異性T細(xì)胞可用作本發(fā)明使用的TCRα鏈的遺傳學(xué)物質(zhì)來源。5.1.3 TCRα鏈編碼序列的分離用于制備cDNA的信使RNA(mRNA)可來自產(chǎn)生所要的α鏈的細(xì)胞，而TCRα基因組序列可得自任何細(xì)胞來源。按照上文5.1.2部分中所述產(chǎn)生的任何T細(xì)胞既可用作TCRα鏈編碼序列來源，又和./或可用于制備cDNA或基因組文庫。另外部分淋巴器官(如脾、淋巴結(jié)、胸腺、和外周血淋巴細(xì)胞)可被研碎并用作提取DNA或RNA的來源。替代地，T細(xì)胞系可用作方便的DNA或RNA來源。遺傳操縱的含有TCRα編碼序列的微生物或細(xì)胞系可用作此目的的方便的DNA來源。
cDNA或基因組文庫可從用本領(lǐng)域熟知技術(shù)產(chǎn)生的DNA片段制備。編碼TCRα的片段可通過用與TCRα序列的一部分同源的核苷酸探針篩選這種文庫來鑒定。在這點(diǎn)上，應(yīng)指出人和小鼠中有一個(gè)TCRα的單一恒定區(qū)基因(Cα)。由于編碼此二物種Cα的核苷酸序列是已知的，可用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)方法合成與恒定區(qū)同源的DNA探針并用于從上文5.1.2部分中描述的T細(xì)胞分離TCRα基因或mRNA轉(zhuǎn)錄本，TCRα基因或mRNA轉(zhuǎn)錄本可用于合成TCRα，cDNA或在從這種T細(xì)胞或基因組克隆制備的cDNA文庫中鑒定合適的TCRα序列。替代地，也可構(gòu)建針對所需的TCRα鏈的可變區(qū)特異的寡核苷酸，但這些必須在一例一例的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)，信賴于可變區(qū)的序列。在此方面，基于恒定區(qū)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針具有優(yōu)越性，因?yàn)樗鼈兛捎糜凇疤匠觥比魏蜹CRα鏈基因或編碼序列。雖然編碼序列的部分可用于克隆和表達(dá)，全長克隆即那些含TCRα整個(gè)編碼區(qū)者，對于表達(dá)可能是優(yōu)選的。為此，用于分離DNA，產(chǎn)生合適限制性片段，構(gòu)建克隆和文庫，和篩取重組體的，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法可用于此。見，如，在Maniatis等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring HarborLaboratory，紐約，中描述的各種技術(shù)。在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，在下文6部分中以示例方式從T細(xì)胞雜交瘤A1.1分離了TCRα鏈基因的完整核苷酸編碼序列，描繪于圖2中。
替代地，得自特異TCRα序列的寡核苷酸探針可用作PCR(多聚酶鏈反應(yīng))方法中的引物，以產(chǎn)生可被直接克隆的TCRα序列的cDNA或基因組拷貝。這種PCR技術(shù)的綜述，見，如，Gelfand，D.H.1989，“PCRTechnology.Principles and Applicutions for DNA Amplification”Ed.，H.A.Erlish，Stockton Press，紐約，和“Current-protocols inmolecutar Biology”卷2，Ch.15，Eds.Ausubel等，John Wiley &Sons，1988。
不管選擇任何方法去鑒定和克隆TCRα編碼序列，可用表達(dá)克隆方法基本減去篩選的努力。最近報(bào)告了一種用于克隆和表達(dá)抗體的一步法(McCaffererty等，1990，Nature 348552-554；Winter和Milstein 1991，Nature 3492-299)。基于此技術(shù)，TCRα鏈基因可在鄰近噬菌體如λ或fd的包被蛋白基因的位點(diǎn)被直接克隆入載體。攜帶TCRα基因的噬菌體在其表面表達(dá)融合蛋白，這樣可用含抗原或TCRα特異性抗體的柱通過親合活性分離噬菌體顆粒。暫時(shí)的基因表達(dá)系統(tǒng)可用于鑒定正確的TCRα基因。例如，可使用COS細(xì)胞系統(tǒng)(如Cerard & Gluzman，1986，Mol.Cell.Biol.6(12)4570-4577)；然而，TCRα鏈的表達(dá)應(yīng)在已被CD3δ鏈基因轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞提取液中被檢測(Bonifacin等，1990，Cell 63503-513)。
由于核苷酸編碼序列的簡并性，編碼任何已知抗原特異性TCRα鏈基因的類似氨基酸序列的其它DNA序列可用于本發(fā)明TCRα克隆和表達(dá)的實(shí)踐中。這種改變包括缺失，添加或不同核苷酸殘基的替換導(dǎo)致編碼相同或功能相當(dāng)?shù)幕虍a(chǎn)物。這種基因產(chǎn)物可包含序列中氨基酸殘基的缺失，添加或替換，導(dǎo)致靜止變化從而產(chǎn)生生物活性產(chǎn)物。這種氨基酸替換可在所涉及的殘基在極性電荷，可溶性，疏水性，親水性和/或兩親性方面類似性的基礎(chǔ)上制造。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；帶有具有類似親水值的不帶電極性頭基團(tuán)的氨基酸包括下列亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
TCRα鏈序列可被修飾以取得供體內(nèi)使用的改良特性的基因產(chǎn)物，如改良穩(wěn)定性和半衰期。例如，雜種基因可通過將TCRα鏈基因，或其可變區(qū)，連接于人類免疫球蛋白基因如IgG的恒定區(qū)構(gòu)建。為可應(yīng)用的技術(shù)，可參見Capon等，1989，Nature 337525-531。5.1.4.α鏈編碼序列的表達(dá)為表達(dá)具有生物活性的TCRα鏈，將上文5.1.3部分中描述的編碼TCRα的核苷酸序列或功能相當(dāng)物插入合適的表達(dá)載體，即，含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的編碼序列所必須的元件的載體?？蓸?gòu)建TCRα編碼序列的改良型以增加表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，產(chǎn)量，提純和產(chǎn)出。例如，可構(gòu)建表達(dá)融合蛋白或包含TCRα和異源蛋白的可剪切融合蛋白。這種融合蛋白可用親和層析法很容易地分離；例如，通過固定在對異源蛋白特異性的柱上。由于將剪切位點(diǎn)構(gòu)建在TCRα部分和異源蛋白之間，TCRα鏈可通過用破壞剪切位點(diǎn)的合適的酶或試劑處理而從層析柱上釋放(如，見Booth等，1988，Immunol.Lett.1965-70；和Gardella等，1990，J.Biol.Chem.26515854-15859)。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含TCRα編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳學(xué)重組。見，如，Maniatis等，1989，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.中描述的技術(shù)。
許多宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)TCRα編碼序列。這些包括但不限于微生物如用含有TCRα編碼序列的重組體噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或柯斯質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用含TCRα編碼序列的重組體酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用重組體病毒表達(dá)載體(如，花椰菜鑲嵌病毒，CaMV；煙草鑲嵌病毒，TMV)感染的或用含TCRα編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞體系；用含TCRα編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含TCRα編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，牛痘病毒)感染的動(dòng)物細(xì)胞，或?yàn)榉€(wěn)定表達(dá)而構(gòu)建的轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。如下文第7部分中工作實(shí)施例所證實(shí)，TCRα免疫調(diào)節(jié)活性似乎不需要表達(dá)產(chǎn)物的糖基化。因此，細(xì)菌表達(dá)體系將有利于大量生產(chǎn)TCRα產(chǎn)物。然而，糖基化對體內(nèi)應(yīng)用可能是重要的，盡管它對免疫調(diào)節(jié)活性是不必要的；例如，糖基化產(chǎn)物顯示在體內(nèi)半衰期增長。在這種情況下，可采用提供翻譯和翻譯后修飾的表達(dá)系統(tǒng)；如，哺乳類，昆蟲，酵母菌或植物表達(dá)系統(tǒng)。
按照所采用的宿主/載體系統(tǒng)，一些合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯元件中任何一個(gè)，包括組成性和可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等，可在表達(dá)載體中使用(見，如，Bitter等，1987，Methods inEnzymology 153516-544)。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可應(yīng)用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如噬菌體λ的PL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可應(yīng)用來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組(如金屬硫因(metallothionein)啟動(dòng)子)或來源于哺乳動(dòng)物病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列；腺病毒遲啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。也可用重組DNA或合成技術(shù)生產(chǎn)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄插入的TCRα編碼序列。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)對表達(dá)TCRα的用途有利與不選用一些表達(dá)載體。例如，當(dāng)希望大量生產(chǎn)TCRα?xí)r，所需要的是能指導(dǎo)高水平表達(dá)易于提純的融合蛋白產(chǎn)物的載體。優(yōu)選的是那些構(gòu)建有一個(gè)助于TCRα回收的剪切位點(diǎn)的載體。這種載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO.J.2l791)，其中TCRα編碼序列可在帶有1acZ編碼區(qū)的框架區(qū)連接于載體，從而產(chǎn)生雜種TCRα-lacZ蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nucleic acid Res.133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)；等。在酵母中，許多含組成性的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的載體可被應(yīng)用。綜述，見Current Protocols in Molecular-Biology Vol 2，1988，Ed.Ausubel等，Greene Publish ASSOC. & Wiley Interscience，Ch，.13，Grant等，1987，Expression and Secretion Vectors foryeast，在Methods in Enzymology中，Eds，Wu & Grossman，31987，Acad Press，紐約，Vol 153，pp516-544；Glover，1986，DNACloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3，和Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.Press，紐約，Vol.152，pp 673-684；和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds.Strathem等，Cold Spring Harbor Press，Vols I和II?？墒褂媒M成性的酵母菌啟動(dòng)子如ADH或LEU 2或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如GAL(Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein于DNA Cloning Vol.11，A Practical Approach，Ed.DM Glover，1986，IRL.Press，Wash.，D.C.)。替代地，可使用促使外源DNA序列摻入酵母菌染色體的載體。
在使用植物表達(dá)載體的情況下，TCRα編碼序列的表達(dá)可被許多啟動(dòng)子中任何一個(gè)啟動(dòng)。例如，病毒啟動(dòng)子如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson等，1984，Nature 310511-514)，或TMV的包被蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu等，1987，EMBO J.6307-311)可被使用；替代地，可使用植物啟動(dòng)子如RUBISCO的小亞單位(Coruzzi等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie等，1984，Science 224838-843)；或熱休克啟動(dòng)子如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。這些結(jié)構(gòu)可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等方法引入植物細(xì)胞。為綜述這些技術(shù)見，如Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，紐約，Section VIII，pp 421-463；和Grierson & Corey，1988，PlantMolecular Biology，2d Ed.，Blackie，倫敦，Ch.7-9。
可用于表達(dá)TCRα的另一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是一種昆蟲系統(tǒng)。在一種這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(AcNPV)被用作表達(dá)外源基因的載體。該病毒在草地貪夜蛾細(xì)胞中生長。該TCRα編碼序列可被克隆入病毒的次要區(qū)(如polyhedrin基因)并置于AcNPV啟動(dòng)子(如polyhedrin啟動(dòng)子)的控制下。TCRα編碼序列的成功插入將導(dǎo)致polyhedrin基因的滅活和產(chǎn)生非封閉型的重組體病毒(即，缺乏由polyhedrin基因編碼的蛋白的包被)。這些重組體病毒隨后用于感染草地貪夜蛾細(xì)胞，在這些細(xì)胞中表達(dá)所插入的基因。(如，見Smith等，1983，J.Viol.46584；Smith U.S.Patent No.4215051)。
真核系統(tǒng)，并優(yōu)選哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，允許被表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白的適當(dāng)翻譯后修飾發(fā)生。具有供適當(dāng)加工初級轉(zhuǎn)錄本，糖基化，磷酸化和進(jìn)一步分泌基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)器的真核細(xì)胞應(yīng)用作表達(dá)TCRα的宿主細(xì)胞。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。這樣的宿主細(xì)胞系可包括但不限于CHO，VERO，BHK，Hela，COS，MDCK，-293，和WI38。
可能TCRα在T細(xì)胞宿主中的產(chǎn)生增加其活性，例如，因?yàn)閮?yōu)先加工和/或與其它T細(xì)胞分子相聯(lián)系。當(dāng)希望這種表達(dá)時(shí)，T細(xì)胞宿主包括但不限于T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，T細(xì)胞雜交瘤，產(chǎn)生輔助成分的T細(xì)胞，或可應(yīng)用產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子的T細(xì)胞。
可構(gòu)建利用重組體病毒或病毒元件進(jìn)行直接表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，當(dāng)使用腺病毒表達(dá)載體時(shí)，TCRα編碼序列可與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體連接，例如，遲啟動(dòng)子和分成三部分的先導(dǎo)序列。該嵌合基因可隨后通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。病毒基因組的非必要區(qū)(如E1區(qū)或3區(qū))中的插入將導(dǎo)致產(chǎn)生存活的并能在被感染的宿主中表達(dá)TCRα鏈的重組體病毒(例如，見Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)?；蛘?，可使用牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子(例如，見Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794927-4931)。特別有興趣的是基于具有作為染色體外元件復(fù)制能力的牛乳頭狀瘤病毒的載體(Sarver等，1981，Mol.Cell.Biol.1486)。這種DNA進(jìn)入小鼠細(xì)胞不久，質(zhì)粒復(fù)制約每細(xì)胞100至200拷貝。插入的cDNA的轉(zhuǎn)錄不需要質(zhì)粒摻入宿主染色體中，因而產(chǎn)生高水平的表達(dá)。通過在質(zhì)粒中包括進(jìn)一個(gè)可選擇的標(biāo)記如neo基因，這些載體可用于穩(wěn)定表達(dá)。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可被修飾以供用作載體，此載體能在宿主細(xì)胞中引入和指導(dǎo)TCRα鏈基因的表達(dá)(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816349-6353)。高水平表達(dá)還可得自應(yīng)用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。包括，但不限于，金屬硫因(metallo thionine)IIA啟動(dòng)子和熱休克啟動(dòng)子。
為了長期，高產(chǎn)量的生產(chǎn)重組體蛋白，應(yīng)優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。宿主可被由適當(dāng)表達(dá)控制元件(如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，多腺苷酸化位點(diǎn)等)，和可選擇標(biāo)記的TCRα cDNA轉(zhuǎn)化，而不是使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體。重組體質(zhì)粒的可選擇性標(biāo)記授予對選擇的抗藥性并允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地?fù)饺肴旧w中并生長形成中心，此中心隨后可被克隆并擴(kuò)展形成細(xì)胞系。例如，在外源DNA引入后，構(gòu)建的細(xì)胞可在富營養(yǎng)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，隨后轉(zhuǎn)換至選擇性培養(yǎng)基。許多選擇系統(tǒng)可被使用，包括但不限于單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等，1977，Cell.11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Szybalska& Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)，和腺苷轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Lowy等，1980 Cell 22817)基因可分別用于tk-，hgprt-、或aprt-細(xì)胞。另外，抗代謝物抗藥性可被用作下列選擇的基礎(chǔ)授予對氨甲喋呤抗藥性的dhfr(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；授予對霉酚酸抗藥性的gpt(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)授予對氨基糖苷G418抗藥性的neo(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)和授予對勻霉素抗藥性的hygro(Santerre等，1984，Gene 30147)。最近，其它可選擇的基因已被描述，即，trpB，它可允許細(xì)胞使用吲哚替換色氨酸；hisD，它允許細(xì)胞使用histinol替換組氨酸(Hartman & Mulligan，1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047)；和DOC(鳥氨酸脫羧酶)它授予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO的抗藥性(McConlogue L.1987，在Current Communications in MolecularBiology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.中)。5.1.5 TCRα鏈表達(dá)產(chǎn)物的提純用遺傳操縱的細(xì)胞表達(dá)的TCRα蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)方法測定，如Western印跡，免疫測定如放射免疫沉淀，酶聯(lián)免疫測定等。然而該表達(dá)系統(tǒng)成功的最終測定涉及生物活性TCRα基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。當(dāng)宿主細(xì)胞分泌基因產(chǎn)物時(shí)，可測定來自培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的無細(xì)胞培養(yǎng)基的TCRα或其免疫調(diào)節(jié)活性。當(dāng)基因產(chǎn)物不被分泌時(shí)，可測定細(xì)胞溶解物的這種活性。在這兩種情況下，可使用許多測定法以確定TCRα活性，包括但不限于測定被表達(dá)的TCRα結(jié)合抗原的能力的測定法，評價(jià)其免疫學(xué)功能的測定法，如在上文5.1.1部分中描述并在下文6.1.5部分中例舉的PFC測定法。
一旦一種產(chǎn)高水平生物活性TCRα的克隆被鑒定，該克隆即可被擴(kuò)大并用于生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)，并用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)提純，這些技術(shù)包括但不限于免疫親和提純，色譜方法包括高效液相色譜法等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)由培養(yǎng)的細(xì)胞分泌時(shí)，TCRα可很容易地從培養(yǎng)液中回收。
從T細(xì)胞粗培養(yǎng)液提純TCRα的方法可適用于克隆表達(dá)的產(chǎn)物的提純。如，在下文實(shí)施例中使用的得自A1.1細(xì)胞的TCRα可從T細(xì)胞粗培養(yǎng)液中通過硫酸銨沉淀繼以親合層析法提純(Zheng等，1988，J.Immunol 1401351-1358；Bissonnette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。對所有鼠TCRα鏈上共亨的決定簇或含有其特異性抗原性表位的抗原或片段特異的純化的單克隆抗體可偶聯(lián)在溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)上并用于親合層析。結(jié)果表明以此方法從粗培養(yǎng)液提純的蛋白質(zhì)的生物活性已濃縮了3000倍。替代地，如果知道哪一個(gè)特異性Vα基因片段編碼所研究的α鏈蛋白，可使用針對不同Vα基因族產(chǎn)物的抗體。此外，可產(chǎn)生針對特異性TCRα鏈可變區(qū)的抗體并用于從其它非相關(guān)TCRα鏈中提純該α鏈。在這種情況下，只要足夠量的蛋白存在，特異性α鏈甚至可從大量培養(yǎng)的T細(xì)胞粗培養(yǎng)液中分離。
當(dāng)TCRα編碼序列被構(gòu)建成編碼一種可剪切的融合蛋白時(shí)，TCRα的提純應(yīng)用親合層析技術(shù)而很易于完成。例如，蛋白酶因子Xa剪切識別序列可構(gòu)建在TCRα羧基末端和麥芽糖結(jié)合蛋白之間。所產(chǎn)生的融合蛋白在使用直鏈淀粉結(jié)合的柱子時(shí)很容易提純，麥芽糖結(jié)合蛋白與直鏈淀粉結(jié)合。隨后用含麥芽糖的緩沖液將TCRα融合蛋白從柱上洗脫，然后用因子Xa處理。被剪切的TCRα鏈通過第2個(gè)直鏈淀粉柱而去除麥芽糖結(jié)合蛋白而進(jìn)一步提純(New England Biolabs，Beverly，MA)。通過使用本發(fā)明的這一方面，任何剪切位點(diǎn)或酶剪切底物可構(gòu)建在TCRα序列和具有可用于提純的結(jié)合伴侶(binding partner)的第二肽或蛋白之間，例如，可為之制備免疫親和柱的任何抗原。5.1.6 產(chǎn)生TCRα鏈的其它技術(shù)一旦一種特異性TCRα鏈基因克隆并且其DNA序列測定后，其蛋白產(chǎn)物除可通過上文描述的那些方法以外還可通過許多方法生產(chǎn)。例如，可用固相化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)全部或部分基于從DNA序列推斷的氨基酸序列的TCRα鏈(見Creighton，1983，Proteins Structures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NP.pp.50-60)。這種方法在產(chǎn)生對應(yīng)于分子活性位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的小部分方面特別有用。在可結(jié)合抗原的TCRα情況下，很可能由V和J基因片段編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端可變區(qū)對抗原結(jié)合是重要的。因此，可以生產(chǎn)對應(yīng)于α鏈可變區(qū)的合成肽。另外，例如，如果已知一個(gè)區(qū)域?qū)ζ渑c輔助因子相互作用產(chǎn)生完全的免疫調(diào)節(jié)作用是重要的，則也可合成含該α鏈恒定區(qū)的特異性部分的大片段肽。
基于其克隆的DNA序列的產(chǎn)生TCRα鏈的另一方法是通過在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄和翻譯其基因。在下文部分7中作為示例的一項(xiàng)特殊實(shí)施方案中，A1.1 TCRα鏈基因在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯并且其產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE顯示為約32000道爾頓分子量的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)對應(yīng)于赤糖基化的TCRα多肽鏈。雖然這種無細(xì)胞體外系統(tǒng)不是為大量蛋白質(zhì)生產(chǎn)設(shè)計(jì)的，本方法的優(yōu)勢是提供了一種方法用于明確地證實(shí)在缺乏其它蛋白的情況下在特異性免疫反應(yīng)中特異性TCRα鏈的作用。
抗體結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)構(gòu)型的分子擬態(tài)提供了另一種用于生產(chǎn)具有與特異性TCRα鏈相類似的結(jié)合特異性的蛋白質(zhì)的方法。例如象特異性TCRα鏈一樣針對相同抗原決定簇的抗獨(dú)特型抗體或單克隆抗體可以具有與TCRα鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)上相同的結(jié)合位點(diǎn)。這種證實(shí)有TCRα鏈免疫調(diào)節(jié)功能的抗體可代替TCRα鏈。這種證實(shí)是用本文描述的PFC測定法。這種抗體在某些情況下優(yōu)選使用，如，在證明該抗體比自然的α鏈具有更長的體內(nèi)半衰期時(shí)，在下文描述的代替的治療應(yīng)用中，結(jié)合于并中和TCRα鏈的單克隆抗體可能是需要的。這些抗體也可用于體外診斷測定，如，放射免疫測定，ELISAs，以檢測人類中循環(huán)的TCRα鏈。這種單克隆抗體易于使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)大量生產(chǎn)。
為生產(chǎn)模擬TCRα的抗體，可用所希望的抗原或抗TCRα鏈抗體免疫接種多種宿主動(dòng)物，包括但不限于小鼠、兔、倉鼠、大鼠、和非人類靈長類，以產(chǎn)生模擬TCRα鏈的抗體，如通過測定它們競爭性地抑制TCRα鏈對其抗原的抗原特異性結(jié)合的能力，以及如在本文中描述的PFC測定法中所評價(jià)的它們調(diào)節(jié)對抗原特異的免疫反應(yīng)的能力。為產(chǎn)生結(jié)合并中和TCRα鏈的抗體，宿主動(dòng)物將用TCRα鏈本身免疫接種?？捎酶鞣N佐劑增加免疫反應(yīng)，取決于宿主種類，包括但不限于弗氏佐劑(完全的和和不完全的)，礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，普盧尼克多元醇類，聚陰離子，肽類，油乳劑，鑰孔墄血藍(lán)蛋白，二硝基苯酚，和潛在有用的人類佐劑如BCG(卡介苗)和棒狀桿菌parvum。
可使用供用培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)單克隆抗體的任何技術(shù)制備單克隆抗體。這些包括但不限于最早由Kohler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(Nature，1975 256.495-497)，人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，Immunology Today，472 Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，MonoclonalAntibodies；and Cancer Therapy.Alan R.Liss，Inc.，pp 77-96)?？蓱?yīng)用為通過剪接來自有合適抗原特異性的小鼠抗體的基因與得自人類抗體分子基因生產(chǎn)“嵌合抗體”而發(fā)展的技術(shù)(如，Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)。另外，為單鏈抗體的生產(chǎn)所介紹的技術(shù)(U.S.專利4946778)可適用于生產(chǎn)單鏈抗體。
可用已知的技術(shù)生產(chǎn)含有所需要的特異性的結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段和通過還原F(ab’)2片段的二硫橋鍵產(chǎn)生的Fab片段。另外，可使用為進(jìn)行快速和簡易的單克隆Fab片段鑒定而構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，Science，246.1275-1281)所介紹的技術(shù)。5.2 TCRα鏈作為免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用TCRα鏈抗原特異性免疫調(diào)節(jié)活性使它在人類或動(dòng)物受試者體內(nèi)以及體外的有廣泛的用途。任何能結(jié)合抗原并在體外測定中表現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)活性的TCRα鏈，或其片段和衍生物都可用于本發(fā)明方法的實(shí)踐中，如果受試者血清中存在輔助成分的各因子，TCRα鏈可作為單一活性劑施用。然而，TCRα鏈可與在輔助成分，生長因子，或抑制劑中發(fā)現(xiàn)的生物活性因子聯(lián)合應(yīng)用。能夠結(jié)合抗原并抑制通常針對該抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的TCRα鏈在諸如超敏反應(yīng)，移植排異，和自身免疫疾病的抗原特異性免疫反應(yīng)的下調(diào)中特別有用。另外，去除或中和這樣的TCRα鏈，或與這樣的TCRα鏈相關(guān)聯(lián)的因子，可用作一種增強(qiáng)對癌癥和免疫缺陷等疾病的免疫反應(yīng)的方法。在本發(fā)明的一項(xiàng)可選擇的實(shí)施方案中，增強(qiáng)免疫反應(yīng)的對抗原特異性的TCRα鏈可用于在體內(nèi)增強(qiáng)這種抗原特異性反應(yīng)。5.2.1抗原特異性免疫抑制證實(shí)抗原特異性免疫抑制作用的抗原結(jié)合TCRα鏈可在免疫反應(yīng)有害的情況下用于治療而且希望以抗原特異的方式抑制這種反應(yīng)?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的這些疾病包括但不限于超敏反應(yīng)(I-III)，自身免疫疾病以及器官和組織移植后的移植物排異反應(yīng)。
超敏反應(yīng)通常分為四組。I型反應(yīng)是一種抗原特異性IgE觸發(fā)的肥大細(xì)胞脫顆粒導(dǎo)致的速發(fā)型超敏反應(yīng)。I型疾病的實(shí)例包括由下列物質(zhì)引起的常見過敏反應(yīng)，這些物質(zhì)如植物花粉、霉菌孢子、昆蟲身體部件、動(dòng)物毛發(fā)皮屑、蜂毒和蛇毒。工業(yè)粉塵、室內(nèi)塵埃、食物產(chǎn)品、化學(xué)物質(zhì)和藥劑。II型反應(yīng)由特異性抗體通常為IgG和IgM對靶細(xì)胞的作用引起，導(dǎo)致細(xì)胞破壞。II型疾病的實(shí)例包括輸血反應(yīng)，胎兒成紅細(xì)胞增多癥，自身免疫性溶血性貧血，重癥肌無力和突眼性甲狀腺腫。III型反應(yīng)由抗原抗體復(fù)合物形成和隨后的抗體效應(yīng)機(jī)制激活引起。III型疾病的實(shí)例包括免疫復(fù)合物型腎小球腎炎，腎小球性腎炎咯血綜合征和某些型的關(guān)節(jié)炎。IV型反應(yīng)為細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)包括T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。它們也被稱為遲發(fā)型超敏反應(yīng)。過敏性接觸性皮炎是本組的典型實(shí)例。
自身免疫疾病指一組由免疫系統(tǒng)對自身抗體反應(yīng)導(dǎo)致組織破壞而引起的疾病。這些反應(yīng)可由抗體，自身反應(yīng)T細(xì)胞或兩者激活。這些疾病中很多與上面超敏反應(yīng)中描述的疾病重疊。一些重要的自身免疫疾病包括糖尿病，自身免疫性甲狀腺炎，多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，和重癥肌無力。
MHC的基本認(rèn)識導(dǎo)致了組織分型的技術(shù)進(jìn)步，而這些進(jìn)步又大大提高了器官和組織移植的成功率。一些目前通常施行的移植外科手術(shù)包括器官和組織如腎臟、心臟，肝臟，皮膚，胰島和骨髓。然而，在供者和受者遺傳學(xué)上不一致時(shí)，移植物排異仍可發(fā)生。
對于所有上面確定的疾患，包括但不限于所提及的特定疾病，對有害免疫反應(yīng)的下調(diào)對宿主是有利的。在此方面，抗原特異性TCRα可用于特異性地抑制由T細(xì)胞，抗體或兩者介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而保持所有其它正常的免疫功能。例如，實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)是人類多發(fā)性硬化的一種動(dòng)物模型，可通過施用經(jīng)提純的髓磷脂堿性蛋白在小鼠中被誘導(dǎo)。已顯示TH在此疾病的發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用(Wraith等，1989，Cell 57709-715)。在所給定小鼠株系中自身反應(yīng)T細(xì)胞識別的抗原決定簇?cái)?shù)目是有限的。而且，用于構(gòu)建自身免疫性TCR的Vα和Vβ基因片段也同樣受限制，從而使對少數(shù)致腦炎性表位反應(yīng)的多數(shù)T細(xì)胞具有相同的TCR。針對TCR決定子的抗體已被成功地用于去除體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞，從而避免疾病(Owhashi和Heber-Katz，1988，J.Exp.Med.1682153-2164)。為實(shí)踐本發(fā)明，TCRα鏈基因可從這樣的自身反應(yīng)細(xì)胞中分離，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并測定其抑制體內(nèi)和體外抗原特異性免疫反應(yīng)的能力。為此目的應(yīng)用TCRα鏈特別重要，因?yàn)楦鶕?jù)最近的發(fā)現(xiàn)，在某些人類疾病如多發(fā)性硬化和重癥肌無力中，已檢測到自身免疫性T細(xì)胞并且它們似乎類似地具有某些Vα和Vβ等位基因的有限的用途(Oksenberg等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86988-992)。
根據(jù)本發(fā)明，前述疾病可通過向病人施用有效劑量的對相關(guān)抗原特異的TCRα鏈進(jìn)行治療，此TCRα鏈抑制針對該抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。被選用的TCR鏈可用體外免疫調(diào)節(jié)測定法如本文描述的PFC測定法評價(jià)。此TCRα鏈可通過許多方式施用，包括但不限于注射，輸注，非腸道途徑，和口服。TCRα和及相關(guān)的衍生物，類似物如從可變區(qū)衍生的肽類，可用作單一活性劑，或與其它化合物一起使用。這種組合物可與生理學(xué)上可接受的載體包括磷酸鹽緩沖鹽溶液，鹽水和滅菌水一起施用。另外，脂質(zhì)體可用于運(yùn)送TCRα。在此方面，脂質(zhì)體可與識別并結(jié)合細(xì)胞特異性抗原的抗體配合，從而提供使TCRα組合物“對準(zhǔn)目標(biāo)”(“targeting”)的一種方法。
有效劑量為抑制在體內(nèi)針對相關(guān)抗原本來會(huì)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)所需的量。所使用的TCRα量將隨用藥方式，其它活性化合物的使用等而不同?？偟膩碚f，可使用使循環(huán)血清水平為0.1～100μg/ml的劑量。抑制抗原特異性反應(yīng)的最有效劑量可通過在下文6.1.5部分中描述的如PFC測定法的體外測定法中加入不同濃度的TCRα并監(jiān)測所取得的抑制水平而在體外確定。5.2.2抗原特異性免疫刺激作用某些疾病是免疫反應(yīng)缺乏或缺陷的結(jié)果。免疫反應(yīng)受損可能是由于免疫系統(tǒng)某些部分功能缺乏或異常，或存在特異地下調(diào)這些反應(yīng)的因子。在后一種情況，例如，可能涉及病人過量產(chǎn)生抑制針對特定抗原的免疫反應(yīng)的抗原特異性TCRα。在這種情況下，系統(tǒng)地去除或中和TCRα可能能使應(yīng)答細(xì)胞免受這種抑制從而增加它們針對它們所識別的抗原的效能。本文描述的PFC測定法可用于測定病人體液如血清中發(fā)揮抗原特異性免疫抑制效應(yīng)的循環(huán)或可溶性TCRα鏈的存在。這種病人可隨即使用針對TCRα鏈的抗體治療以去除或中和循環(huán)的抑制性分子。
T細(xì)胞介導(dǎo)的抑制作用可解釋為什么腫瘤即使在證實(shí)腫瘤特異性免疫反應(yīng)時(shí)仍能不斷地生長。在許多實(shí)驗(yàn)性腫瘤系統(tǒng)中，已有報(bào)道消除抗原特異性Ts和TsF可暴露潛在的抗腫瘤反應(yīng)(North，1982，J.Exp.Med.55106-107；Hellstorm等，J.Exp.Med.49799-804；Nepom等，1977，Biochim Biophy，Acta；121-148)。抗原特異性抑制因子可直接由腫瘤細(xì)胞或Ts釋放，Ts在識別腫瘤抗原的某些抑制產(chǎn)生性表位后被激活(Sercarz和Krzych，1991，Immunol，Today 12111-118)。最初針對TsF產(chǎn)生的單克隆抗體也可與T細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的腫瘤特異性T抑制因子反應(yīng)(Steele等，1985，J.Immunol，1342767-2778)。數(shù)種與此抗體結(jié)合的TsF與抗TCRα抗體結(jié)合。因此，具有對腫瘤抗原適當(dāng)特異性的TCRα鏈可參與腫瘤免疫的阻抑，在這種情況下，去除或中和這種TCRα對恢復(fù)和增強(qiáng)腫瘤特異性反應(yīng)將可能是有利的。
這種病人體內(nèi)自然的TCRα鏈的活性可通過體內(nèi)施用中和其活性，即其結(jié)合抗體的能力和/或其導(dǎo)致的抗原特異性免疫抑制效應(yīng)的對α鏈特異的抗體而被抑制(見上文5.1.4部分)。盡管針對TCRα恒定區(qū)和可變區(qū)的抗體都可使用，但與可變區(qū)結(jié)合者可能是優(yōu)選的，因?yàn)橹挥袑δ欠N特定抗原特異的TCRα鏈將被中和從而使免疫反應(yīng)以抗原特異性方式被增強(qiáng)。替代地，含有可測定水平的可溶性腫瘤抗原特異性TCRα鏈的癌癥病人血清可經(jīng)體外通過含有針對α鏈或抗原或其肽的抗體的柱而被吸附；即，血漿去除法。
為體內(nèi)使用，抗體可以許多方法施用，包括但不限于注射，輸注，非腸道途徑和口服。該抗體可在任何生理學(xué)上可接受的載體中施用，這些載體包括磷酸鹽緩沖鹽溶液，鹽水和滅菌水。本抗體的使用量將隨用藥方法，其它活性化合物的使用等而不同，通常為飽和劑量，此劑量將導(dǎo)致結(jié)合游離的系統(tǒng)的TCRα鏈全部或大部分。為體外吸附，與柱偶聯(lián)的抗體或抗原量應(yīng)足以去除病人血清中大部分甚至全部游離TCRα。
反義寡核苷酸可用于干擾特異性免疫抑制TCRα鏈的表達(dá)和系統(tǒng)釋放，從而選擇性地增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)。在這方面，可使用表現(xiàn)催化活性的互補(bǔ)寡核苷酸，即核酶(ribozyme)方法。參見，一般如，PCT國際出版物WO90/11364；Sarver等，1990，Science 2471222-1225。使用針對每個(gè)TCRα鏈的Vα反義或核酶(ribozyme)寡核苷酸時(shí)要優(yōu)選使用完整的TCRα，因?yàn)檫@將只抑制所研究的特異性TCRα。為此目的，可合成與任何已知TCRα鏈序列的mRNA互補(bǔ)的核酸酶抗性反義Vα寡脫氧核苷酸。在被攝取入抗原特異性T細(xì)胞后，這些試劑可通過堿基配對與它們的互補(bǔ)mRNA序列雜交，阻斷翻譯和破壞被編碼蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生(這類技術(shù)的文獻(xiàn)，見Green等，1986，Ann.Rev.Biochem.55569-597)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，對所研究抗原特異并增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)的TCRα鏈可按上文5.1.1部分中所述予以鑒定?？蓪⒅委煂W(xué)有效劑量的這種TCRα鏈?zhǔn)┯糜诓∪艘栽鰪?qiáng)病人針對該特定抗原的免疫反應(yīng)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種其本純的融合多肽R1-[X1]-R2，其中R1是載體肽，R2是由結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽，X1是蛋白水解酶識別序列。“載體肽”位于融合肽序列的氨基末端。在原核生物，本發(fā)明融合蛋白的載體肽可用于運(yùn)輸融合肽至包涵體，周質(zhì)，外膜或，優(yōu)選地，外部環(huán)境中在真核生物，據(jù)信載體肽功能是運(yùn)輸融合多肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。該分泌蛋白隨后經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)入分泌小囊和進(jìn)入細(xì)胞外空間或，優(yōu)選地，進(jìn)入外部環(huán)境。本發(fā)明的載體肽包括但不限于鈣調(diào)蛋白多肽。按照本發(fā)明可使用的載體肽種類包括前肽原和外膜肽。它可包含蛋白水解酶識別位點(diǎn)?？山邮艿妮d體肽也包括激素的氨基末端原區(qū)。本文描述的具有類似特性的其它載體肽對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，或可不必過分的實(shí)驗(yàn)就易于確定。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，載體肽被包括在表達(dá)載體中，它特異地位于鄰近載體蛋白N-末端處。本發(fā)明實(shí)施例中使用的載體是鈣調(diào)蛋白核苷酸序列，但提供轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(對于真核生物)和進(jìn)入外部環(huán)境或進(jìn)入包涵體(對于原核生物)的方法的其它序列在本發(fā)明中也會(huì)同樣有效。如上描述的這種序列對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
本發(fā)明載體肽的羧基末端含有蛋白水解酶識別位點(diǎn)以便結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽易于從融合多肽分離。剪切識別位點(diǎn)的不同是可能的，因?yàn)閷τ诘鞍姿馓禺愋源嬖诓煌拿?。?yōu)選地，剪切位點(diǎn)為序列Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)，它被凝血酶識別。這個(gè)識別位點(diǎn)允許產(chǎn)生意想不到地高水平的由結(jié)構(gòu)基因編碼的活性蛋白。其它剪切位點(diǎn)，如由因子Xa蛋白酶識別者，對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)是已知的。
本發(fā)明的融合多肽包含一條由結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽，優(yōu)選位于融合多肽的羧基末端。任何結(jié)構(gòu)基因均與載體肽和剪切位點(diǎn)一起表達(dá)。結(jié)構(gòu)基因可操作地與表達(dá)載體中的載體和剪切位點(diǎn)連接，以便融合多肽作為一個(gè)單獨(dú)的單位表達(dá)?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的融合多肽的結(jié)構(gòu)基因的一個(gè)實(shí)例編碼截短的TCRα，它僅包括TCRα的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明提供一種基本純的多肽。本文使用的術(shù)語“基本純”指基本不含其它蛋白，脂質(zhì)，碳水化合物或其它可能自然地相聯(lián)系的物質(zhì)的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用蛋白質(zhì)提純的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提純該多肽，如應(yīng)用與多肽的一種表位結(jié)合的單克隆抗體的親和層析法。此基本純的多肽在聚丙烯酰胺凝膠上將產(chǎn)生單一的主帶。該多肽的純度也可用氨基末端氨基酸序列分析確定。只要此多肽的活性存在，該多肽即包含本多肽的功能片段。在本發(fā)明中包括具有多肽的生物活性的較小的肽。
本發(fā)明還提供編碼該融合多肽的多聚核苷酸。這些多聚核苷酸包括DNA，cDNA，和RNA序列。在理解為編碼完整或部分融合多肽的所有多聚核苷酸也包括在本文中，只要它們編碼一種其剪切產(chǎn)物具生物活性的多肽。這些多聚核苷酸包括自然產(chǎn)生的，合成的，和有意構(gòu)建的多聚核苷酸。例如，多聚核苷酸可受到位點(diǎn)定向的突變。該多聚核苷酸序列還包括反義序列和作為遺傳密碼的結(jié)果簡并的序列。有20種天然氨基酸，大多數(shù)由一種以上的密碼子決定。因此，所有變性的核苷酸序列都包括在本發(fā)明中，只要由該核苷酸序列編碼的融合多肽的氨基酸序列在功能上未改變。
本發(fā)明的DNA序列可通過上述幾種方法取得，例如，DNA可使用本領(lǐng)域中熟知的雜交程序分離。這些包括但不限于1)探針對基因組或cDNA文庫的雜交以檢測共享的核苷酸序列；2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢測共享的結(jié)構(gòu)特征；和3)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成。
當(dāng)所希望的多肽產(chǎn)物氨基酸殘基的整個(gè)序列已知時(shí)，DNA序列的合成是常選用的方法。當(dāng)所希望的多肽的氨基酸殘基的整個(gè)序列未知時(shí)，不可能直接合成DNA序列，并且可選擇的方法是合成cDNA序列。分離所感興趣的cDAN序列的標(biāo)準(zhǔn)方法中有一種是形成質(zhì)?；蚴删w攜帶的cDNA文庫，這種文庫來自在宿主細(xì)胞中大量存在并具有高水平遺傳表達(dá)的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)與多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，甚至是稀有的表達(dá)產(chǎn)物也可克隆。在多肽的氨基酸序列的重要部分已知情況下，從被推斷存在于目標(biāo)cDNA中的序列復(fù)制的標(biāo)記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列產(chǎn)物可用于DNA/DNA雜交程序，該程序在已被變性為單鏈形式的cDNA的克隆拷貝上進(jìn)行(Tag等，Nucl.Acid.Res.112325，1983)。
編碼本發(fā)明融合多肽的DNA序列可通過DNA傳遞入合適的宿主細(xì)胞而在體外表達(dá)?！八拗骷?xì)胞”是載體可在其中繁殖并且表達(dá)其DNA的細(xì)胞。該術(shù)語也包括該受體宿主細(xì)胞的任何后代?？衫斫馑械暮蟠赡懿慌c親代細(xì)胞完全相同，因?yàn)樵趶?fù)制過程中可能發(fā)生突變。然而，當(dāng)使用術(shù)語“宿主細(xì)胞”時(shí)，這種后代也被包括在內(nèi)。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌，然而也可使用本領(lǐng)域中熟知的其它革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物，只要該表達(dá)載體含有復(fù)制起點(diǎn)以允許在宿主中表達(dá)。穩(wěn)定傳遞，換言之即外源DNA連續(xù)地維持于宿主中的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
在本發(fā)明中，多聚核苷酸序列可插入到重組的表達(dá)載體中。術(shù)語“重組的表達(dá)載體”指本領(lǐng)域中公知的通過插入或摻入TCRα的遺傳序列如載體肽和剪切位點(diǎn)而構(gòu)建的質(zhì)粒，病毒，或其它載體。這種表達(dá)載體含有一個(gè)啟動(dòng)序列，可易化宿主的插入遺傳序列的有效轉(zhuǎn)錄。該表達(dá)載體典型地包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)啟動(dòng)子，和允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表型選擇的特定基因。適合用于本發(fā)明的載體包括但不限于用于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg等，Gene 56125，1987)，為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521，1988)和為在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的baculovirus衍生的載體。DNA片段可存在于載體中可操作地連接于調(diào)節(jié)元件，例如，啟動(dòng)子(如T7，金屬硫因I，或polyhedrin啟動(dòng)子)。
例如，本發(fā)明的融合多肽的表達(dá)可被置于包含乳糖或lac操縱子的大腸桿菌染色體DNA控制下，此操縱子通過發(fā)揮β-半乳糖苷酶的作用而調(diào)節(jié)乳糖利用。此lac控制系統(tǒng)可被IPTG誘導(dǎo)?？蓸?gòu)建一種含lac Iq阻遏子基因的質(zhì)粒，允許阻遏lac啟動(dòng)子直至IPTG被加入。其它本領(lǐng)域中公知的啟動(dòng)子系統(tǒng)包括β內(nèi)酰胺酶，λ啟動(dòng)子，蛋白A啟動(dòng)子，和色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)。這些是最常用的，但其它微生物啟動(dòng)子也可使用。該載體含有來源于與宿主細(xì)胞相容的種屬的復(fù)制子位點(diǎn)和控制序列。另外載體可攜帶可供在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表型選擇的特異基因。例如，β-內(nèi)酰胺酶基因?qū)逼S青霉素抗藥性傳遞給那些含有帶有β內(nèi)酰胺酶基因的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
編碼本發(fā)明的融合多肽的多聚核苷酸可在原核或真核生物中表達(dá)。宿主可包括微生物，酵母菌，昆蟲和哺乳動(dòng)物有機(jī)體。在原核生物中表達(dá)具有真核的或病毒的序列的DNA序列的方法在本領(lǐng)域中是公知的。能在宿主中表達(dá)和復(fù)制的生物學(xué)上有功能的病毒和質(zhì)粒DNA載體是本領(lǐng)域中熟知的。這種載體被用于摻入本發(fā)明中的DNA序列。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可天然地編碼一種識別該融合蛋白剪切位點(diǎn)的酶。然而，如果希望在其中表達(dá)融合多肽的宿主細(xì)胞遺傳上下具有識別剪切位點(diǎn)的酶，則編碼這種酶的遺傳序列可與融合蛋白的多聚核苷酸序列一起被轉(zhuǎn)染至該宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞用重組體DNA的轉(zhuǎn)化可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，有DNA攝取能力的細(xì)胞可通過本領(lǐng)域中公知的程序從指數(shù)生長期后收獲并隨后用CaCl2方法處理的細(xì)胞制備。另外，也可使用MgCl2或RbCl。轉(zhuǎn)化還可在形成宿主細(xì)胞的原生質(zhì)后或通過電穿孔進(jìn)行。
當(dāng)宿主為真核生物時(shí)，可使用的DNA的轉(zhuǎn)染方法如磷酸鈣共沉淀，傳統(tǒng)的機(jī)械方法如顯微法注射，電穿孔，包被于脂質(zhì)體中的質(zhì)粒的插入，或病毒載體。真核生物細(xì)胞也可用編碼本發(fā)明融合多肽的DNA序列和編碼可選擇性表型的第二外源DNA分子如單純皰疹胸腺嘧啶激酶基因共轉(zhuǎn)染。另一方法是使用真核生物的病毒載體，如猴病毒40(SV40)或牛乳頭狀瘤病毒以暫時(shí)感染或轉(zhuǎn)化真核生物細(xì)胞和表達(dá)蛋白質(zhì)(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。
分離和提純微生物或真核細(xì)胞表達(dá)的本發(fā)明的多肽的技術(shù)可以是通過任何常規(guī)方法如，制備性色譜分離和免疫學(xué)分離如那些涉及使用單克隆或多克隆抗體者。
上面揭示的內(nèi)容總體描述了本發(fā)明，更完全的理解可通過參考下列特定實(shí)施例獲得，這些實(shí)施例在此只為闡明而提供，而不限制本發(fā)明的范圍。6.實(shí)施例通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移證實(shí)的TCRα鏈免疫調(diào)節(jié)活性6.1材料和方法6.1.1動(dòng)物C57B1/10和C57B1/6動(dòng)物購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。6.1.2細(xì)胞系A(chǔ)1.1(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)，B9(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)，BW1100(White等，1989，J.Immunol.1431822-1825)，175.2(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)，和這些細(xì)胞系表達(dá)A1.1 TCR基因的衍生物(見下文6.1.4部分)維持于RPMI 1640加10％胎牛血清中。很多細(xì)胞系也適應(yīng)無蛋白，無血清培養(yǎng)基(Cell Biotechnologies，Rockville，MD)。6.1.3.抗體和抗原對CD3ε具有特異性的單克隆抗體(145-2C11，倉鼠IgG)(Leo等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841374-1378)，和TCRα(H28-710.16，倉鼠IgG)(Becker等，1989，細(xì)胞58911-921)用蛋白A親和色譜法提純(蛋白A Superose，Pharmacia)，表面CD3的熒光染色和FACS分析(Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.863758-3762)和用H28-710的抗體親和色譜法(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)按以前的描述施行。SRBC購自Morse Biologicals(Edmonton，AB)或購自Colorado Serum Co.(Denver，CO)。非隨機(jī)合成的多肽，poly-18，和基于其結(jié)構(gòu)的肽類(列于圖4中)按以前的描述產(chǎn)生(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)。6.1.4.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移TCR基因進(jìn)入T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞總RNA通過傳統(tǒng)的異硫氰酸胍和氯化銫法從109個(gè)細(xì)胞中分離。多聚A+RNA通過寡-dT纖維素親和色譜法回收。第一條鏈合成是使用寡dT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的而第二條鏈則使用DNA聚合酶I和RNA酶H。該甲基化的平末端雙鏈(ds)cDNA與EcoRI連接子相連。在EcoRI消化后，該雙鏈cDNA在瓊脂糖凝膠上選擇大小，通過精胺沉淀提純，并克隆入λgt10。該λDNA被體外包裝(Gigapack Gold，Stratagene，La Jolla，CA)。通過使用32P放射性標(biāo)記的Cα和Cβ探針的原位雜交篩選了大約200,000噬菌斑。將Cβ探針和Cα探針用于篩選cDNA文庫(從牛胰島素特異性T細(xì)胞雜交瘤制備)。得自陽性克隆的插入DNA連接入M13mp18和M13mp18以供標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧序列分析使用。
在本文中描述的實(shí)施例中使用的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是N2載體的衍生物(Keller等，1985，Nature 318149-154)。A1.1 TCRα和βcDNAs被完全測序。簡言之，A1.1αcDNA使用Vα1，2(Arden等，1985，Nature 316783-787)和JαTA65而A1.1βcDNA使用Vβ6(Barth等，1985，Nature 316517-523)，Dβ2(Sui等，1984，Nature 311344-349)，和Jβ2.7(Gascoigne等，1984，Nature 310387-391)基因片段。αcDNA的表達(dá)被去除了逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，而β鏈的表達(dá)在TCRV β2啟動(dòng)子和TCRβ增強(qiáng)子的控制下。兩種插入體被克隆入N2載體的XhoI位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系φ2(Mann等，1983，Cell 33153-159)和PA317(Miller和Buttimore，1986，Mol.Cell.Biol.62895-2902)。用標(biāo)準(zhǔn)方法測定被克隆的生產(chǎn)細(xì)胞系具有5×105～1×106的滴度(Millimore，1986，Mol.Cell.Biol.62895-2902)接受者T細(xì)胞雜交瘤用指示的生產(chǎn)系上清液感染(Keller等，1985，Nature 318149-154)并在G418(0.1-1.0mg/ml)中選擇10天。在表達(dá)A1.1α的175.2細(xì)胞中，進(jìn)一步的選擇是通過抗CD3分子的熒光染色實(shí)施的，隨后是用FACStar Plus進(jìn)行細(xì)胞分選(Becton-Dickinson)。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCR基因的表達(dá)通過使用抗Vβ6單克隆抗體(Payne等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857695-7698)或抗CD3抗體確定，或通過來自對照的和被感染的接受者T細(xì)胞雜交瘤的RNA的PCR分析確定。對Vα1和Cα基因片段特異的引物被用于PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物與對A1.1αcDNA連接區(qū)特異的5’末端標(biāo)記的反義寡核苷酸雜交。6.1.5.抗原特異性調(diào)節(jié)活性的體外測定為測定A1.1來源的抗原特異性調(diào)節(jié)活性，而采用了一種簡單的抗原特異性系統(tǒng)(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907；Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86375 8-3762)，得自(57B1/6或57B1/10小鼠的脾細(xì)胞(1×107)在1mL RPMI 1640中培養(yǎng)，該RPMI 1640用10％胎牛血清和5×10-5M2-ME補(bǔ)充。每份培養(yǎng)物接受50μl與poly-18或替換多肽偶聯(lián)的1％SRBC。通過向培養(yǎng)物加入含或不含“輔助成分”(10-15％)的濾過滅菌的雜交瘤上清液測定抑制活性。如上文5.1.1部分中所描述的，輔助成分的制備來源于SRBC免疫的小鼠T細(xì)胞培養(yǎng)物，隨后用SRBC吸附該上清液。(也見Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907〕。另外，T細(xì)胞雜交瘤3-1-V的培養(yǎng)上清液(見下文8部中所述)，也可用作輔助上清液(圖1A和B)。培養(yǎng)物在37℃飽和溫度，92％空氣/8％CO2條件下溫育，并且抗SRBC PFC在5天后予以測定。在本文顯示的所有實(shí)驗(yàn)中，不論單獨(dú)加入T細(xì)胞雜交瘤上清液還是輔助上清液都不顯著影響免疫反應(yīng)。因此，本文描述的對照和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)物都含有輔助成分，而未加入輔助上清液的結(jié)果未顯示。6.1.6生物素偶聯(lián)的肽對T細(xì)胞來源的蛋白的直接結(jié)合肽EYE(EYA)4EYK(SEQ ID NO3)和EYKEYAEYAAYAEYAEYK(SEQ ID NO4)按所述與生物素偶聯(lián)(Bayer和Wilcheck，1980，Methods Biochem.Anal.261-45)，并且在上清液中抗原結(jié)合活性通過改良的ELISA測定法測定(Gallina等，1990，J.Immunol.1453570-3577)。在無蛋白，無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞系的上清液在Centricon30(Amicon，Danvers，MA)濾過系統(tǒng)上濃縮約50-200倍并在碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中以各種稀釋度在Immunolon II板(Dynatech，Chantilly，VA)上在37℃包被2小時(shí)。在用PBS加0.05％吐溫20洗滌后，結(jié)合材料與100μl生物素化的肽在1∶500稀釋度在37℃溫育1小時(shí)，洗滌，與Extravidin堿性磷酸酶軛合物(Sigma)1∶2000稀釋物溫育，洗滌，并用硝苯基磷酸鹽底物(Sigma)顯象。經(jīng)適當(dāng)溫育(通常為在4℃過夜)后測定OD410nm。在一些實(shí)驗(yàn)中，以100ng至1μg/每孔加入肽(無生物素)，同時(shí)加入活性生物素化的肽以取得結(jié)合競爭。6.2結(jié)果6.2.1.帶或不帶TCRβ的TCRα的轉(zhuǎn)移授予產(chǎn)生抗原特異性活性的能力如圖3B所示當(dāng)與EYK(EYA)4偶聯(lián)的SRBC存在于培養(yǎng)液中時(shí)，可觀察到A1.1上清液對抗-SRBC PFC反應(yīng)的抑制，但當(dāng)存在未偶聯(lián)的SRBC或與另一種肽偶聯(lián)的SRBC時(shí)觀察不到。由A1.1證實(shí)的免疫調(diào)節(jié)活性的抗原精細(xì)特異性已在以前被描述(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2903)，這些結(jié)果中的一些匯編在圖4中。
細(xì)胞系175.2表達(dá)TCRβ和CD3成分，但缺乏功能性TCRα基因(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)。175.2細(xì)胞用表達(dá)A1.1-TCRα的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(見上文6.1.4部分)并在G418中選擇這些細(xì)胞，隨后通過CD3+進(jìn)行細(xì)胞分選而進(jìn)一步選擇。在被選擇的細(xì)胞上CD3的表達(dá)(圖3A)，證實(shí)該TCRα鏈在所選擇的細(xì)胞中表達(dá)(175.2-A1.1α)。收集175.2-A1.1 α的上清液并在體外測定中檢測。如圖3B中所示，這些上清液顯示與A1.1的上清液同樣的抗原特異性調(diào)節(jié)活性，而得自175.2的上清液無活性。由于175.2的最初的TCR和特異性與A1.1的那些特征完全無關(guān)(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)這些結(jié)果證實(shí)A1.1 TCRα鏈基因的表達(dá)導(dǎo)致抗原特異性調(diào)節(jié)活性的產(chǎn)生。另外，這種免疫活性可通過加入針對TCRα的抗體被中和，表明上清液中分泌的TCRα鏈對這些活性負(fù)責(zé)(圖5)。作為對照，圖6A和B顯示T細(xì)胞雜交瘤BB19的TCRα基因的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)在175.2的2個(gè)亞克隆的細(xì)胞表面上CD3的表達(dá)(AF5和AF6)，該BB19對poly 18的一個(gè)表位特異，該表位與A1.1所識別的不同。然而，象親本克隆BB19一樣，轉(zhuǎn)染體(transtectants)在它們的上清液中也不產(chǎn)生任何免疫調(diào)節(jié)活性(圖7A和B)。因此，不是所有的poly-18-特異性T細(xì)胞都分泌具有免疫調(diào)節(jié)活性的TCRα鏈。
為進(jìn)一步探索本發(fā)明，用攜帶A1.1的TCRα的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染另一細(xì)胞系B9。象A1.1一樣，B9表達(dá)TCRα和β，并產(chǎn)生針對δI-Ad一起呈遞的抗原poly 18的IL2(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)。如圖8中顯示，是A1.1的上清液，而不是B9的上清液，顯示抗原特異性調(diào)節(jié)活性，但表達(dá)A1.1 TCRα鏈的B9細(xì)胞(B9-A1.1α)也產(chǎn)生這種活性，而那些表達(dá)A1.1 TCRβ鏈的細(xì)胞(B9-A1.1β)不產(chǎn)生這種活性。后者不是因?yàn)門CRβ的阻斷作用，因?yàn)橥瑫r(shí)表達(dá)來自A1.1的TCRα和TCRβ(B9-.A1.1αβ)的B9細(xì)胞產(chǎn)生這種調(diào)節(jié)活性。
B9-A1.1α的上清液通過抗體親和層析在固定的抗TCRα抗體上分離并檢測抗原特異性調(diào)節(jié)活性，在測定中使用含有與SRBC偶聯(lián)的4肽的板。如圖9中所示，得自B9-A1.1α的可溶性活性被結(jié)合并從抗TCRα抗體上洗脫。對未被取代的肽和氨基酸7被取代的肽(但不是那些在殘基3或10被取代的)的所觀測到的特異性是來自A1.1抗原特異性活性的特征(Bissonette等，1991，J.Immunol，14628-98-2907)(見圖4)。如以前所討論的，這種特異性與A1.1 TCR識別的poly 18的表位相互關(guān)聯(lián)(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。
除B9外，還使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將該A1.1TCRα基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入另一poly18特異性細(xì)胞系B1.1。在用G418選擇后，發(fā)現(xiàn)B1.1-A1.1α系可產(chǎn)生抗原特異性免疫調(diào)節(jié)活性，盡管親本的細(xì)胞系(B1.1)不能產(chǎn)生這種活性。因此在轉(zhuǎn)移A1.1 TCRα基因后，兩種TCRα+β+T細(xì)胞雜交瘤(B9，B1.1)和一種TCRα-β+T細(xì)胞雜交瘤(175.2)產(chǎn)生poly-18特異性調(diào)節(jié)活性。為進(jìn)一步說明在缺少TCRβ時(shí)是否A1.1 TCRα的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生抗原特異性活性，而將A1.1 TCRα或A1.1 TCRβ轉(zhuǎn)移至BW1100細(xì)胞內(nèi)。因?yàn)锽W1100細(xì)胞缺乏完整的TCRα和β(White等，1989，J.Immunol.1431822-1825)，任何TCRα基因轉(zhuǎn)移的效應(yīng)都應(yīng)直接歸因于TCRα。如圖10A和B中所示，BW1100-A1.1α的上清液，而不是BW1100-A1.1β的上清液，顯示免疫調(diào)節(jié)活性。與其它基因傳遞實(shí)驗(yàn)一樣，這種活性表現(xiàn)出A1.1的抗原特異性。6.2.2 TCRα的基因轉(zhuǎn)移與直接的抗原結(jié)合活性的產(chǎn)生相關(guān)本文描述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)從A1.1釋放的TCRα鏈直接與抗原結(jié)合。是這種區(qū)別特征賦予這種TCRα鏈生物活性，而不賦予其它細(xì)胞的TCRα鏈活性。如圖11A中所示，A1.1和表達(dá)A1.1 TCRα的細(xì)胞系的上清液含有可用改良ELISA測定法測定的抗原結(jié)合成分(見上方6.1.6部分)。這種抗原的結(jié)合可被未標(biāo)記的肽有效地競爭，但不被兩種不合適的肽競爭(圖11，B)，其中一種與該抗原性肽只差一個(gè)殘基。這種取代已在以前被證實(shí)可破壞肽對A1.1TCR(在抗原呈遞測定中)(Boyel等，1990，Eur.J.Immunol.202145-2148)和對A1.1來源的調(diào)節(jié)活性的抗原性(Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2907)的該肽的抗原性。這些結(jié)果顯示抗原結(jié)合活性是表達(dá)A1.1 TCRα的細(xì)胞的生物活性產(chǎn)物，并且是這種分子的抗原結(jié)合特性賦予其生物活性。6.3討論本文給出的數(shù)據(jù)明確證實(shí)TCRα鏈從A1.1細(xì)胞釋放，與特異性抗原結(jié)合(在我們的生物測定中偶連于SRBC)，并參予在體外誘導(dǎo)對SRBC的免疫反應(yīng)的抑制。CD4+T細(xì)胞雜交瘤A1.1組成性釋放一種對合成抗原poly 18和相關(guān)肽特異的免疫調(diào)節(jié)活性(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2907)。如本文所述A1.1 TCRα基因轉(zhuǎn)移入其它細(xì)胞系授予它們組成性產(chǎn)生這種抗原特異性調(diào)節(jié)活性的能力(圖3，8，9和10)。A1.1 TCRβ的轉(zhuǎn)移既不產(chǎn)生也不干擾這種作用(圖8)。由每種轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體T細(xì)胞系產(chǎn)生的可溶性活性的抗原特異性與A1.1產(chǎn)生的相同。這種活性被一種單克隆抗TCR-α抗體結(jié)合(圖9)并且被洗脫的活性表現(xiàn)出與A1.1上清液同樣的抗原精細(xì)特異性(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。
本實(shí)施例結(jié)論性地證實(shí)TCRα鏈以不信賴CD3/TCR復(fù)合體的形式從細(xì)胞釋放，并且調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)。特別地，將A1.1 TCRα基因轉(zhuǎn)進(jìn)完全缺乏TCRβ的BW1100細(xì)胞仍可組成性的產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)活性(圖10)。本文描述的結(jié)果還表明是A1.1 TCRα鏈對抗原的直接識別(圖11)給了這種分子在PFC測定中的活性，并且，其它細(xì)胞釋放的TCRα鏈不能直接結(jié)合于表位上從而不表現(xiàn)這種活性。
雖然并不意在限制本發(fā)明的范圍，對于TCRα如何介導(dǎo)免疫反應(yīng)，在此至少可提出兩種模式。例如，有可能，TCRα和抗原的復(fù)合物是免疫原性的，導(dǎo)致對TCR的調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)。最近的研究表明，用特異性T細(xì)胞(Lider等，1988，Science 239181-183；Sun等，1988，Nature 322843-845)或?qū)?yīng)于TCR可變區(qū)中的區(qū)的肽(Vandenkark等，1989，Nature 341541-544)；Howell等，1989，Science 246668-670)免疫接種可導(dǎo)致體內(nèi)顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。與A1.1 TCRα鏈相關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)作用可代表這種TCR體外“接種”的一種類型。
替代地，也可能有一種未鑒定的分子δ抗原結(jié)合的TCRα鏈相關(guān)聯(lián)并且這第二種分子給予該系統(tǒng)生物功能。例如，Iwata等(Iwata等，1989，J.Immunol.1433917-3924)已描述一種釋放入一些T細(xì)胞雜交瘤上清液的可溶性復(fù)合物，它由一個(gè)具糖基化抑制活性的分子和一個(gè)帶有TCR決定簇的分子組成。7.實(shí)施例通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯生產(chǎn)具生物活性的TCRα鏈7.1材料和方法7.1.1體外轉(zhuǎn)錄和翻譯DNA寡核苷酸探針在小鼠Cα和Cβ已知序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)。這些探針被合成并用于篩選來自poly 18特異性A1.1雜交瘤細(xì)胞的cDNA文庫。全長的來自A1.1的TCRα和TCRβ cDNA被描述特征并克隆入Bluescript載體(Stratagene，LaJolla，CA)。Cα和Cβ的RNA是在體外使用真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(BRL，Gaitherburg，MD)轉(zhuǎn)錄的。該RNA隨后使用兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)(BRL，Gaithersburg，MD)進(jìn)行體外翻譯。為放射自顯影，在翻譯中包括了35S-Met(New England Nuclear，Boston，MA)。作為生物測定，這些材料在沒有放射性核苷酸情況下翻譯。
體外翻譯的產(chǎn)物隨后通過使用單克隆抗TCRα或抗TCRβ抗體的親合層析法濃縮。標(biāo)記的物質(zhì)通過SDS-PAGE分析，使用增感屏(Enhance)并使X-光片曝光。生物活性在上文6.1.5部分中描述的系統(tǒng)中進(jìn)行測定。7.2結(jié)果除上文6部分中的發(fā)現(xiàn)，即，將TCRα基因從T細(xì)胞雜交瘤A1.1轉(zhuǎn)移至其它細(xì)胞系可轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抗原特異性免疫調(diào)節(jié)能力以外，確定由這種基因產(chǎn)生的純的重組TCRα蛋白在此系統(tǒng)中是否具有生物活性是非常重要的。以前的研究已顯示來自T細(xì)胞的產(chǎn)生這種生物活性因子的mRNA可在體外翻譯以產(chǎn)生調(diào)節(jié)活性。那么，類似地，TCRαRNA的體外翻譯可能產(chǎn)生生物活性蛋白。7.2.1體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生32000道爾頓預(yù)期大小的未糖基化的TCRα蛋白，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白特異性地結(jié)合抗TCRα抗體而不結(jié)合抗TCRβ抗體(圖12和13)。7.2.2體外翻譯產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性已發(fā)現(xiàn)該TCRα蛋白在PFC測定中具有生物活性，并且此活性被抗TCRα抗體完全結(jié)合(和洗脫)(圖13A和B)。在圖13A中，來自體外翻譯的TCRα的免疫調(diào)節(jié)活性存在于抗TCRβ抗體柱的濾過液中和抗TCRα抗體柱的洗脫液中?；钚詾V過液(抗TCRβ)和洗脫液(抗TCRα)的滴定顯示它們的活性是類似的。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的TCRα顯示免疫調(diào)節(jié)活性，而從TCRβ RNA產(chǎn)生的蛋白不顯示。7.3討論上面詳述的實(shí)驗(yàn)與上文第6部分中描述的研究一起證實(shí)重組的TCRα具有生物功能。因此，編碼這種生物活性因子的TCRα鏈基因可在多種表達(dá)系統(tǒng)中被表達(dá)以產(chǎn)生具生物活性的產(chǎn)物；即；能特異性地抑制針對其目標(biāo)抗原的免疫反應(yīng)的TCRα鏈。8.實(shí)施例產(chǎn)生輔助成分活性的T細(xì)胞雜交瘤的產(chǎn)生8.1材料和方法8.1.1動(dòng)物C57B1/6動(dòng)物購自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。8.1.2細(xì)胞系和試劑BW1100和T細(xì)胞雜交瘤維持于加10％FCS的PRMI-1640中。針對CD4(GK1.5)的單克隆抗體(Dialynas等，1983，Immunol.Rev.7429)得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)。兔和豚鼠補(bǔ)體分別得自SciCan(Edmonton，Alberta，加拿大)和GIBCO(Grand Island，紐約)。兩種補(bǔ)體樣本在使用前先篩選低本底活性。包被抗大鼠IgG抗體的磁珠購自Dynal。8.1.3 T細(xì)胞雜交瘤的產(chǎn)生取得SRBC免疫的C57B1/6小鼠脾細(xì)胞并在補(bǔ)體存在時(shí)用針對CD4的抗體(GK1.5)處理。去除CD4的細(xì)胞隨后與包被抗大鼠IgG抗體(的磁珠(Dyalbeads)反應(yīng)以去除所有的IgG+細(xì)胞。剩下的細(xì)胞在lympholyteM(Cedarlane Laboratories，PA)上離心，并將存活的T細(xì)胞與BW1100在存在PEG下以1∶1的比例融合。雜交瘤在次黃嘌呤，胸腺嘧啶，氨基喋呤和ouabin存在下選擇。小鼠紅細(xì)胞被用作填充細(xì)胞。生長陽性的孔的上清液與A1.1上清液一起在上文第6.1.5部分中詳述的PFC測定中測定其替代輔助成分的能力。具活性的培養(yǎng)物被分開再培養(yǎng)，并再測定亞系的活性。具有活性的亞系再分開并將其中具有活性者以0.4細(xì)胞/孔予以克隆。再篩選這些克隆的活性。8.2結(jié)果8.2.1一種T細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生輔助成分活性SRBC免疫接種的耗盡CD4+T細(xì)胞和IgG+B細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞與BW1100融合?？寺『?，一種這樣的T細(xì)胞雜交瘤3-1-V顯示可在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生輔助活性，在A1.1上清液存在下進(jìn)行測定可在介導(dǎo)抗原特異性免疫調(diào)節(jié)活性方面替代輔助上清液(圖1)。3-1-V上清液與A1.1上清液一起起作用，不管此A1.1上清液是自然分泌產(chǎn)物還是A1.1 TCRα基因的體外翻譯產(chǎn)物。因此，可得到可重復(fù)和組成性分泌與抗原特異性TCRα鏈一起使用的輔助成分的T細(xì)胞單克隆群。9.實(shí)施例TCRα基因的cDNA克隆可使用本領(lǐng)域公知技術(shù)從T細(xì)胞制備cDNA文庫。由于在人類和小鼠中編碼TCRα的單一的恒定區(qū)(Cα)核苷酸序列是已知的(Willson等，Immunol.Rev.101149-172，1988)，與Cα同源的DNA探針可使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成并用于篩選這種文庫以鑒定TCRαcDNA替代地，從特異性TCRα序列來源的寡核苷酸探針可在PCR(多聚酶鏈反應(yīng))方法(Millis等，Methods in Enzymol.155335-350，1987)中用作引物以產(chǎn)生可被指導(dǎo)性克隆的TCRα序列的cDNA(Roman-Roman等，Eur.J.Immunol.，21927-933，1991)。
一種輔助T細(xì)胞雜交瘤A1.1已在下面描述過(Fodelar等，J.Immunol.1353028-3033，1985)并表達(dá)對合成多肽poly-18(poly(Glu-Tyr-Lys-(Glu-Tyr-Ala)5))特異的TCRα和β分子，還在特異性抗原和1-Ad存在下釋放淋巴因子。這種T細(xì)胞雜交瘤也組成性產(chǎn)生一種在抗原特異性抑制中涉及的poly-18-特異性可溶因子。已顯示A1.1產(chǎn)生的因子表現(xiàn)與TCR對A1.1細(xì)胞展現(xiàn)的同樣的抗原精細(xì)特異性(Zheng等，J.Immunol.1401351-1358，1988)，而且A1.1衍生因子的免疫調(diào)節(jié)活性至少部分地被TCRα蛋白編碼(Bissonette等，J.Immunol.1462898-2907，1991)。
使用Cα探針從cDNA文庫中克隆A1.1細(xì)胞的TCRαcDNA。mRNA通過常規(guī)的異硫氰酸胍和氯化銫方法從109細(xì)胞分離并通過寡dT纖維素親和色譜法回收。cDNA的第一條鏈?zhǔn)褂霉裠T引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成而第二條鏈?zhǔn)褂肈NA聚合酶I和RNA酶H合成。甲基化的平末端雙鏈cDNA連結(jié)在EcoRI連接子上。接著用EcoRI消化后，該DNA在瓊脂糖凝膠上選擇大小，通過精胺沉淀提純，并克隆入λ-gt10。該噬菌體在體外使用Gigapack GoldTM(Stratagene〕包裝。使用32P-放射標(biāo)記的Cα探針通過原位雜交篩選了約200000個(gè)噬菌斑。將陽性克隆的插入DNA連接入M13mp18做標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧序列測定。A1.1TCRαcDNA的完整核苷酸序列顯示于圖14中。
已建立一種產(chǎn)生蜂毒磷脂酶A2(PLA-A2)特異性糖基化抑制因子(GIF)的雜交瘤，(3B3)，它表達(dá)對PLA2特異的TCRα和β鏈(Mori等，Int.Immunol，5833-842，1993)。這種T細(xì)胞雜交瘤在用同源抗原和抗原呈遞細(xì)胞刺激后組成性產(chǎn)生免疫抑制因子，GIF，和結(jié)合GIF的PLA2。積累的證據(jù)顯示抗原結(jié)合GIF在體內(nèi)特異地抑制對該抗原的免疫反應(yīng)，以及，此抗原結(jié)合GIF至少可部分地由表達(dá)于細(xì)胞上的TCRα編碼(Iwata等，J.Immunol.，1413270-3277，1988；Iwata等，J.Immunol.，1433917-3924，1989；Mori等，Int.Immunol.，5833-842，1993)。
3B3細(xì)胞的TCRαcDNA按照下述Mullis等人描述的PCR方法(Nucl.Acid.Res，83895-3950，1980)克隆。mRNA是用FastTrackTMmRNA分離試劑盒(Invitrogen)從5×1073B3細(xì)胞中分離的。cDNA則使用cDNA合成系統(tǒng)(Pharmacia)產(chǎn)生。在被產(chǎn)生后，使用T4連接酶(Takara)在這些cDNA5’端和3’端連接以構(gòu)建成環(huán)狀DNA。編碼小鼠CαDNA的寡核苷酸引物通過DNAA/RNA合成儀(AppliedBiosystems)使用氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)法(Beaucage等，Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)合成。這些引物的序列為5’-GTGGTCCAGTTGAGGTCTGCAAGA-3’5’-TTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3’PCR通過TaqI DNA聚合酶(Takara)在模板cDNA，引物和dNTP存在下在熱循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR的爭件是變性步驟為94℃，1分鐘；退火步驟為54℃，1分鐘；和延伸步驟為72℃，2分鐘，進(jìn)行35次循環(huán)。擴(kuò)增的cDNA被亞克隆入TA克隆系統(tǒng)TM(Invitrogen)的PCR1000載體。插入的DNA序列通過雙脫氧序列測定技術(shù)(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467，1977)證實(shí)。3種不同的TCRαcDNA被克隆并測序。它們中的2種被鑒定是來自3B3雜交瘤的融合伴侶細(xì)胞BW5147(Chien等，Nature，31231-35，1984；Kumar等，J.Exp.Med.，1702183-2188，1989)。另一TCRαcDNA通過使用編碼此TCRα基因的不同部分的幾種PCR引物證實(shí)不在BW5147中表達(dá)，表明此TCRα來源于PLA2特異性T細(xì)胞。分離了兩株編碼此TCRαcDNA的獨(dú)立克隆并證實(shí)它們的DNA序列是一致的。3B3衍生的TCRαcDNA的DNA序列顯示于圖15中。此TCRαcDNA編碼268個(gè)氨基酸的開放閱讀框并且證實(shí)前20氨基酸為一個(gè)信號肽(McElligott等，J.Immunol.1404123-4131，1988)。10.重組體TCRα在大腸桿菌中的表達(dá)--直接表達(dá)10.1構(gòu)建TCRα表達(dá)質(zhì)粒為構(gòu)建編碼A1.1 TCRα細(xì)胞外區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒，寡核苷酸被用作通過PCR擴(kuò)增DNA片段的引物。A1.1 TCRαcDNA編碼細(xì)胞外區(qū)26至240氨基酸，并包括1個(gè)Cla1限制性酶切位點(diǎn)，Shine Dalgano序列(Scherer等，Nucl.Acids.Res.，83895-3950，1980)和5’端甲硫氨酸起始密碼子和3’端2個(gè)終止密碼子和BamHI限制性酶切位點(diǎn)，該cDNA可通過兩個(gè)引物PCR的PCR擴(kuò)增獲得。這些引物的序列為5′-AACATCGATTAATTTATTAAAACTTAAGGAGGTATATTATGAGCCCAGAATCCCTCAGTGTCC-3′(SEQ ID NO5)5′-AACGGATCCCTATTATTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3′(SEQ ID NO6)除另外指出，每一PCR循環(huán)中變性步驟設(shè)定為94℃，1分鐘，延伸設(shè)定為72℃，2分鐘。DNA片段用Cla1和BamHI消化，并在唯一的Cla1和BamHI位點(diǎn)被克隆入攜帶trp啟動(dòng)子和trpA終止子(圖16，日本專利，Kokaikoho 63269983)的表達(dá)質(zhì)粒pST811載體中。這種新的質(zhì)粒，稱為pST811-A1.1TCRαS5(圖17)被轉(zhuǎn)化入足夠的RRI大腸桿菌宿主細(xì)胞中。含質(zhì)粒細(xì)胞的選擇基礎(chǔ)是pST811載體攜帶的抗生素(氨芐青霉素)抗藥性標(biāo)記基因。合成寡核苷酸和整個(gè)TCRα基因的DNA序列通過質(zhì)粒DNA的DNA序列測定被證實(shí)。
使用3’末端引物構(gòu)建了含有編碼26～203氨基酸的A1.1 TCRα的不同平頭形式的另一種表達(dá)質(zhì)粒5’-CGTTGGTCTGTTCGAAGTGGATTATCCGTAGGCAA-3’(SEQID NO7)將被擴(kuò)增的DNA插入pST811載體并產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒，稱為pST811-A1.1 TCRαS3。10.2產(chǎn)TCRα的大腸桿菌的培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pST811-A1.1TCRαS5或pST811-A1.1 TCRαS3的RRI大腸桿菌在50ml含50μg/ml氨芐青霉素的Luria液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)過夜。將接種物培養(yǎng)物無菌地轉(zhuǎn)移至1升含0.8％葡萄糖，0.4％酪蛋白水解物，10mg/升硫胺和50mg/升氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)3小時(shí)。在最初的溫育結(jié)束時(shí)，加入40mg吲哚丙烯酸并將培養(yǎng)物在37℃再溫育5小時(shí)。11.在大腸桿菌中重組體TCRα的表達(dá)-融合表達(dá)系統(tǒng)11.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Matsuki等人開發(fā)了大鼠鈣調(diào)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pTCAL7，它攜帶鈣調(diào)蛋白cDNA和trp啟動(dòng)子(Matsuki等，Biotech.Appl.Biochem.，12284-291，1990)(圖18)。為表達(dá)融合蛋白，在鈣調(diào)蛋白cDNA的3’末端產(chǎn)生數(shù)個(gè)克隆位點(diǎn)，它也含有一個(gè)凝血酶剪切序列。詳細(xì)地說，插入pTCAL7的鈣調(diào)蛋白通過PCR使用兩種引物擴(kuò)增，一種編碼含有Cla1位點(diǎn)的鈣調(diào)蛋白cDNA5’末端，另一種提供鈣調(diào)蛋白cDNA3’末端序列，凝血酶剪切位點(diǎn)和BamHI，Xba1，Not1和BglII位點(diǎn)。5′CGCAATCGATTAATTTATTAAAACTTAAGGAGGTATATTATGGCA-3′(SEQ ID NO8)5′-GAAGATCTGCGGCCGCTCTAGAGGATCCACGCGGAACCAGTTTTGCAGTCATC-3′(SEQ ID NO9)
擴(kuò)增的DNA片段用Cla1和BglII酶切并插入pTCAL17質(zhì)粒由Cla1和BglII酶切所獲得的大片段中。新的質(zhì)粒，稱為pCF1(圖19)被轉(zhuǎn)化進(jìn)足夠量的大腸桿菌DH5宿主細(xì)胞中。合成的寡核苷酸的DNA序列由DNA測序測定。11.2 TCRα表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建來源于3B3細(xì)胞的編碼TCRα胞外區(qū)域21～241氨基酸的DNA片段，可用PCR從pCR1000-3B3 TCRα質(zhì)粒中通過兩個(gè)分別包括5’端Xba1位點(diǎn)，終止密碼子和3’端NotI位點(diǎn)的引物擴(kuò)增獲得。這些引物的序列是5′-GCTCTAGAGGACAGCAAGTGCAGCAGAGT-3′(SEQ ID NO10)5′-AAGCGGCCGCTTAGTTTTGAAAGTTTAGGTT-3′(SEQ ID NO11)擴(kuò)增的DNA片段與XbaI和NotI酶切的pCFI質(zhì)粒連接。新的質(zhì)粒，稱為pCFI-3B3 TCRα(圖20)被轉(zhuǎn)化入足夠量的W3110大腸桿菌細(xì)胞中，并且還確定了DNA序列。
A1.1來源的編碼26～240氨基酸的cDNA也通過使用兩個(gè)引物用上述的方法插入pCFI中；5′-GATCTAGACAGAGCCCAGAATCCCTCAGTG-3′(SEQ ID NO12)5′-AAGCGGCCGCTTATTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3′(SEQ ID NO13)并且新的表達(dá)質(zhì)粒pCFI-A1.1 TCRαS5也被構(gòu)建。產(chǎn)TCRα的大腸桿菌的培養(yǎng)在實(shí)施例10中有介紹。在該表達(dá)系統(tǒng)中，融合蛋白鈣調(diào)蛋白-3B3 TCRα或鈣調(diào)蛋白-A1.1 TCRαS5，以可溶形式表達(dá)，并且表達(dá)量大約占總蛋白的10％(圖21)。12.實(shí)施例重組TCRα的提純12.1重組TCRα的提純和再折疊--直接表達(dá)系統(tǒng)約1g濕重的表達(dá)A1.1 TCRαS5的細(xì)胞懸溶于30ml水中并用French-Press在8000磅/英寸2，4次打碎。被打碎的細(xì)胞碎片通過在4℃，15000xg離心10分鐘獲得，并用水洗2次。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，證實(shí)碎片主要是A1.1 TCRαS5蛋白(圖22)。將含有不可溶A1.1 TCRαS5的碎片估計(jì)為1至2mg，加至4ml合適的混合物中，使混合物中各成分的最終濃度為8M尿素，50mM乙酸鈉和0.1mMEDTA。該混合物在室溫保持了3小時(shí)以溶解A1.1 TCRαS5。在室溫以15000×g離心10分鐘去除剩下的不可溶物質(zhì)。
為再折疊/再氧化可溶性A1.1 TCRαS5，上清液碎片被慢慢加入，同時(shí)攪拌，加至40ml合適的混合物中，使混合物中各成分的最終濃度為2.5M尿素，5mM乙酸鈉，0.01mM EDTA 50mM Tris鹽酸pH 8.5，1mM谷胱甘肽(還原形式)和0.1mM谷胱甘肽(氧化形式)。在4℃16小時(shí)后，加入400μl三氟乙酸鹽(TFA)至混合物中。將該混合物在室溫加在已用0.1％(v/v)TFA/水平衡的反相Vydac C4柱(1×10cm)上，流率每分鐘1ml。上樣后，用含10％(v/v)乙腈的0.1％TFA/水洗柱。A1.1與柱結(jié)合的TCRαS5物質(zhì)，用在0.1％TFA/水中的30％至40％(v/v)的乙腈梯度洗脫。從C4柱收集的級分的等分試樣不經(jīng)還原樣本即可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并且純化的A1.1 TCRαS5蛋白在級分25至30中被鑒定。合并這些級分并在真空條件下干燥。干燥的蛋白溶于PBS，然而，也可使用其它類似的緩沖液。
A1.1 TCRαS3通過上述同樣程序提純和再折疊。12.2重組TCRα的提純-融合表達(dá)系統(tǒng)約1g濕重表達(dá)3B3 TCRα的細(xì)胞被懸溶于100ml 50mM Tril鹽酸緩沖液中，pH 8.0，并用French Press在8000磅/英寸2打碎4次。上清液通過在4℃15000xg離心10分鐘收集，并對50mM Tris鹽酸緩沖液透析在4℃過夜，該Tris-HCl緩沖液pH為8.0，含2mM谷胱甘肽(還原形式)和0.2mM谷胱甘肽(氧化形式)。將該樣本溶液加入合適的混合物使混合物中成分的最終濃度為150mM NaCl，1mM CaCl2和5mMMgCl2。此混合物在4℃加至用50mM鹽酸Tris pH 8.0，150mM NaCl，1mM CaCl2和5mM MgCl2平衡過的苯基sepharose 6快流速低膠層柱(Pharmacia，3×6cm)上并以0.5ml/分的流率過柱。用相同緩沖液洗柱后，鈣調(diào)蛋白-TCRα融合蛋白用含4mM EDTA的50ml鹽酸Tris pH 8.0以每分鐘0.5ml的流率洗脫。各級分的等分試樣通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明此融合蛋白被高度濃縮(圖23)。
洗脫級分對含150mM NaCl的50mM鹽酸Tris緩沖液pH 8.0透析4℃過夜。CaCl2被加入至50ml經(jīng)透析的級分至終濃度為2.5mM，并加入1％的凝血酶(Sigma)在25℃溫育6小時(shí)以消化融合蛋白。為中止消化，向反應(yīng)混合物加入EDTA至終濃度為4mM，隨后將此混合物對50mMTris鹽酸緩沖液pH 8.0透析。透析后，通過超濾將混合物濃縮為5ml并加在用2倍PBS緩沖液平衡過的TSK G2000凝膠濾過柱(Toyo Soda)上，并通過HPLC以每分鐘3ml的流率分級。在級分24至26中收集到2mg經(jīng)純化的383 TCRα蛋白。13.實(shí)施例重組的TCRα的生物活性13.1重組的A1.1 TCRα的體外免疫抑制活性為測定重組體A1.1 TCRα的生物活性，使用一種簡單的抗原特異性系統(tǒng)(Zheng等，J.Immunol.，401351-1358，1988；Zheng等，ProcNatl Acad Sci.USA.，863758-3762，1989；Bissonette等，J.Immunol.1462898-2907，1991)。得自C57B1/6或C57B1/10小鼠的1×107脾細(xì)胞被置于1ml添加10％胎牛血清的5×10-5M2-巰基乙醇(2-ME)的RPMI 1640培養(yǎng)液中。每一培養(yǎng)物接受50μl與poly-18(EYK(EYA)5)或替代多肽偶聯(lián)的1％SRBC。通過向培養(yǎng)物加入帶或不帶“輔助成分”(10-15％)的重組TCRα測定抑制活性。這種輔助成分從得自對SRBC免疫的動(dòng)物的小鼠T細(xì)胞培養(yǎng)物制備，隨后用SRBC吸附上清液。此培養(yǎng)物在37℃飽和濕度的92％空氣/8％CO2中溫育并在5天后測定抗-SRBC PFC(斑形成細(xì)胞)。在所有本文顯示的實(shí)驗(yàn)中，A1.1細(xì)胞培養(yǎng)上清液被用作陽性對照。
重組A1.1 TCRαS5(參見實(shí)施例10.1)的免疫抑制活性以劑量依賴形式被觀察到，結(jié)果顯示于圖24a中。此圖顯示得自兩個(gè)被編碼的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中重組TCRα分子被滴定，因而每一稀釋物被編碼。重組A1.1TCRαS3(參見實(shí)施例10.1)的免疫抑制活性也以劑量依賴形式被觀察到(圖24b)。13.2重組TCRα的抗原特異性免疫抑制活性A1.1來源的TCRα鏈的精細(xì)抗原特異性已被描述(Bissonnette等，J.Immunol.，1462898-2907，1991；Green等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888475-8479，1991)。當(dāng)使用poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA時(shí)可觀察到TCRα鏈的免疫抑制活性，但當(dāng)使用替換肽如EYAEYAEYAEYAEYA和EYKEYAEYAAYAEYA時(shí)檢測不到免疫抑制活性。因此重組體A1.1 TCRαS5的抗原特異性通過使用這4種肽而被測定。重組體TCRα蛋白只在有poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA存在下在終濃度為4×10-10M時(shí)顯示抑制活性(圖25)。此圖代表來自4個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其中每一種在左測顯示的肽(或鹽水)被加入編碼的管中。被編碼的樣本隨后被用于與SRBC偶聯(lián)以供在存在輔助上清液情況下測定培養(yǎng)物。在缺乏輔助上清液時(shí)在任何情況下都未觀察到抑制活性。每一實(shí)驗(yàn)的編碼是不同的。13.3重組TCRα的體內(nèi)免疫抑制活性為確定是否重組體TCRα調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)，而將重組3B3 TCRα蛋白用于用蜂毒PLA2免疫接種的小鼠。
作為一種抗原，蜂毒PLA2的DNP(二硝基苯)衍生物(Sigma)按標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Balb/c小鼠通過腹腔內(nèi)注射10μg吸附于2mg明礬的DNP-PLA2被免疫接種。重組的3B3 TCRα在第-1，0，2，4，6天以每次5μg的劑量腹腔內(nèi)注射，而對照小鼠只接受PBS。免疫接種后2周，從每只動(dòng)物取得血清并用ELISA(Iwata等，J.Immunol.，1413270-3277，1988)測定抗DNP-IgGI和抗DNP-IgE的活性?？笵NP-IgGI和抗DNP-IgE被顯著抑制(表1)。為評價(jià)抗原特異性，將DNP-卵清蛋白用作抗原并測定重組體3B3 TCRα的活性。正如所預(yù)期的，用重組的TCRα處理，免疫接種的小鼠不影響抗DNP抗體對DNP-OVA的反應(yīng)。
這些結(jié)果表明了重組體TCRα蛋白是一種抗原特異性方式的免疫抑制活性。沒有動(dòng)物對重組體TCRα蛋白有副反應(yīng)，表明TCRα蛋白具有抑制介導(dǎo)自身免疫疾病和過敏等疾病的免疫反應(yīng)的潛在用途。
表1重組3B3 TCRα對Balb/c小鼠抗-半抗原抗體反應(yīng)的抑制
(a)用明礬吸附的DNP-PLA2免疫接種后2周(b)P＜0.05本發(fā)明不限于例舉的實(shí)施方案范圍內(nèi)，它們意在闡明本發(fā)明的單一方面，任何功能上等價(jià)的微生物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。事實(shí)上，除那些本文已顯示和描述的以外，對本發(fā)明的各種改進(jìn)根據(jù)上述描述和附圖來說對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這種改進(jìn)看來也屬于所附的權(quán)利要求書范圍內(nèi)。
本文引用的所有出版物全文并入本文作為參考。
序列表(1)一般信息LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGYAND IMMUNOLOGY and KIRIN BEERKABUSHIKI KAISHA(ii)發(fā)明名稱T-細(xì)胞α鏈抗原特異性免疫調(diào)節(jié)的方法(iii)序列數(shù)目28(iv)通訊地址(A)收信人Spensley Hom Jubas & Lubitz(B)街道1880 Century Park East，Suite 500(C)城市洛杉磯(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編90067(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朠CT/(B)提交日1994年12月12日(C)分類(viii)代理人/事務(wù)所信息(A)姓名Wetherell，Jr.，Ph.D.，John R(B)登記號31，678(C)參考/案號FD-3085(ix)電信信息(A)電話(619)455-5100(B)電傳(619)455-5110(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..5(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Val Pro Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO2Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO3Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度63堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..63(xi)序列描述SEQ ID NO5AACATCGATT AATTTATTAA AACTTAAGGA GGTATATTAT GAGCCCAGAA TCCCTCAGTG60TCC 63(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..36(xi)序列描述SEQ ID NO6AACGGATCCC TATTATTGAA AGTTTAGGTT CATATC 36(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..35(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTTGGTCTG TTCGAAGTGG ATTATCCGTA GGCAA 35(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..45(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCAATCGAT TAATTTATTA AAACTTAAGG AGGTATATTA TGGCA 45(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征
(A)長度53堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..53(xi)序列描述SEQ ID NO9GAAGATCTGC GGCCGCTCTA GAGGATCCAC GCGGAACCAG TTTTGCAGTC ATC 53(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..29(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTCTAGAGG ACAGCAAGTG CAGCAGAGT 29(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..31(xi)序列描述SEQ ID NO11AAGCGGCCGC TTAGTTTTGA AAGTTTAGGT T 31(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..30(xi)序列描述SEQ ID NO12GATCTAGACA GAGCCCAGAA TCCCTCAGTG30(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..34(xi)序列描述SEQ ID NO13AAGCGGCCGC TTATTGAAAG TTTAGGTTCA TATC 34(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度1092堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1092(xi)序列描述SEQ ID NO14GCTAGCAAAG CTGCTTTTTA GTGTTTCCTA TAGGAGATGT CAAAACTTAT GAACAGCAAC60TATATGAGTT TAGGATTGAG AATCTAATCC ACAGCGAAGA GGGAAGAGGA GAGAATGAAA120TCCTTGAGTG TTTTACTAGT GGTCCTGTGG CTCCAGTTAA ACTGCGTGAG GAGCCAGCAG180AAGGTGCAGC AGAGCCCAGA ATCCCTCAGT GTCCCAGAGA GCATGGCCTC TCTCAACTGC240ACTTCAAGTG ATCGTAATTT TCAGTACTTC TGGTGGTACA GACAGCATTC TGGAGAAGGC300CCCAAGGCAC TGATGTCCAT CTTCTCTGAT GGTGACAAGA AAGAAGGCAG ATTCACAGCT360ACCTCAATA AGGCCAGCCT GCATGTTTCC CTGCACATCA GAGACTCCCA GCCCAGTGAC 420TCCGCTCTCT ACTTCTGTGC AGCTAGTGAG CCGGGTTACC AGAACTTCTA TTTTGGGAAA480GGAACAAGTT TGACGTGCAT TCCAAACGAC ATCCAGAACC CAGAACCTGC TGTGTACCAG540TTAAAAGATC CTCGGTCTCA GGACAGCACC CTCTGCCTGT TCACCGACTT TGACTCCCAA600ATCAATGTGC CGAAAACCAT GGAATCTGGA ACGTTCATCA CTGACAAAAC TGTGCTGGAC660ATGAAAGCTA TGGATTCCAA GAGCAATGGG GCCATTGCCT GGAGCAACCA GACAAGCTTC720ACCTGCCAAG ATATCTTCAA AGAGACCAAC GCCACCTACC CCAGTTCAGA CGTTCCCTGT780GATGCCACGT TGACTGACAA AAGCTTTGAA ACAGATATGA ACCTAAACTT TCAAAACCTG840TCAGTTATGG GACTCCGAAT CCTCCTGCTG AAAGTAGCCG GATTTAACCT GCTCATGACG900CTGAGGCTGT GGTCCAGTTG AGGTCTGCAA GACTGACAGA GCCTGACTCC CAAGCTCCAT960CCTCCTCACC CCTCCGCTCC TTCTTCAAGC CAAAAGGAGC CCTCCCACCT CGTCAAGACG1020GCTGTCTGGG GTCTGGTTGG CCCTGATTCA CAATCCCACC TGGATCTCCC AGATTTGTGA1080GGAAGGTTG TG 1092(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO15Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO16Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Ala(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..12(xi)序列描述SEQ ID NO17Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO18Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO19Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO20Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO21Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO23Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glt Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..16(xi)序列描述SEQ ID NO24Asp Tyr Thr Gly Lys Ile Met Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度696堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置37..681(xi)序列描述SEQ ID NO25CATCGATTAA TTTATTAAAA CTTAAGGAGG TATATT ATG AGC CCA GAA TCC CTC 54Met Ser Pro Glu Ser Leu1 5AGT GTC CCA GAG AGC ATG GCC TCT CTC AAC TGC ACT TCA AGT GAT CGT 102Ser Val Pro Glu Ser Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg10 15 20AAT TTT CAG TAC TTC TGG TGG TAC AGA CAG CAT TCT GGA GAA GGC CCC 150Asn Phe Gln Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Glu Gly Pro25 30 35AAG GCA CTG ATG TCC ATC TTC TCT GAT GGT GAC AAG AAA GAA GGC AGA198Lys Ala Leu Met Ser Ile Phe Ser Asp Gly Asp Lys Lys Glu Gly Arg40 45 50TTC ACA GCT CAC CTC AAT AAG GCC AGC CTG CAT GTT TCC CTG CAC ATC246Phe Thr Ala His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Val Ser Leu His Ile55 60 65 70AGA GAC TCC CAG CCC AGT GAC TCC GCT CTC TAC TTC TGT GCA GCT AGT294Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ala Ser75 80 85GAG CCG GGT TAC CAG AAC TTC TAT TTT GGG AAA GGA ACA AGT TTG ACG342Glu Pro Gly Tyr Gln Asn Phe Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Thr90 95 100TGC ATT CCA AAC GAC ATC CAG AAC CCA GAA CCT GCT GTG TAC CAG TTA390Cys Ile Pro Asn Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu105 110 115AAA GAT CCT CGG TCT CAG GAC AGC ACC CTC TGC CTG TTC ACC GAC TTT438Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe120 125 130GAC TCC CAA ATC AAT GTG CCG AAA ACC ATG GAA TCT GGA ACG TTC ATC486Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile135 140 145 150ACT GAC AAA ACT GTG CTG GAC ATG AAA GCT ATG GAT TCC AAG AGC AAT534Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn155 160 165GGG GCC ATT GCC TGG AGC AAC CAG ACA AGC TTC ACC TGC CAA GAT ATC582Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile170 175 180TTC AAA GAG ACC AAC GCC ACC TAC CCC AGT TCA GAC GTT CCC TGT GAT630Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp185 190 195GCC ACG TTG ACC GAG AAA AGC TTT GAA ACA GAT ATG AAC CTA AAC TTT678Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe
200 205 210CAA TAATAGGGAT CCGTT696Gln215(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度215氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Ser Pro Glu Ser Leu Ser Val Pro Glu Ser Met Ala Ser Leu Asn1 5 10 15Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Phe Gln Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln20 25 30His Ser Gly Glu Gly Pro Lys Ala Leu Met Ser Ile Phe Ser Asp Gly35 40 45Asp Lys Lys Glu Gly Arg Phe Thr Ala His Leu Asn Lys Ala Ser Leu50 55 60His Val Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu65 70 75 80Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Glu Pro Gly Tyr Gln Asn Phe Tyr Phe Gly85 90 95Lys Gly Thr Ser Leu Thr Cys Ile Pro Asn Asp Ile Gln Asn Pro Glu100 105 110Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu115 120 125Cys Leu Phe Thr Asp The Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met130 135 140Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala145 150 155 160Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser165 170 175Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser180 185 190Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr195 200 205Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln210 215(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度807堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..804(xi)序列描述SEQ ID NO27ATG AAG AGC CTG CTG AGC TCT CTG CTG GGG CTT CTG TGC ACC CAG GTT 48Met Lys Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Leu Leu Cys Thr Gln Val1 5 10 15TGC TGG GTG AAA GGA CAG CAA GTG CAG CAG AGT CCT GCA TCC TTG GTT 96Cys Trp Val Lys Gly Gln Gln Val Gln Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val20 25 30CTG CAG GAG GGG GAG AAC GCA GAG CTG CAG TGT AAC TTT TCC TCC ACA 144Leu Gln Glu Gly Glu Asn Ala Glu Leu Gln Cys Asn Phe Ser Ser Thr35 40 45GCA ACC CAG CTG CAG TGG TTT TAC CAA CGT CCT GGG GGA AGC CTC GTC 192Ala Thr Gln Leu Gln Trp Phe Tyr Gln Arg Pro Gly Gly Ser Leu Val50 55 60AGC CTG TTG TAC AAT CCT TCT GGG ACA AAG CAC ACT GGA AGA CTG ACA240Ser Leu Leu Tyr Asn Pro Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Arg Leu Thr65 70 75 80TCC ACC ACA GTC ACT AAA GAA CGT CGC AGC TCT TTG CAC ATT TCC TCC288Ser Thr Thr Val Thr Lys Glu Arg Arg Ser Ser Leu His Ile Ser Ser85 90 95TCC CAG ATC ACA GAC TCA GGC ACT TAT TTC TGT GCT ATG GAA GAC ACT336Ser Gln Ile Thr Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Met Glu Asp Thr100 105 110GGA GCT AAC ACT GGA AAG CTC ACG TTT GGA CAC GGC ACC ATC CTT AGG384Gly Ala Asn Thr Gly Lys Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Ile Leu Arg115 120 125GTC CAT CCA AAC ATC CAG AAC CCA GAA CCT GCT GTG TAC CAG TTA AAA432Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys130 135 140GAT CCT CGG TCT CAG GAC AGC ACC CTC TGC CTG TTC ACC GAC TTT GAC480Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160TCC CAA ATC AAT GTG CCG AAA ACC ATG GAA TCT GGA ACG TTC ATC ACT528Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr165 170 175GAC AAA ACT GTG CTG GAC ATG AAA GCT ATG GAT TCC AAG AGC AAT GGG576Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly180 185 190GCC ATT GCC TGG AGC AAC CAG ACA AGC TTC ACC TGC CAA GAT ATC TTC624Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe195 200 205AAA GAG ACC AAC GCC ACC TAC CCC AGT TCA GAC GTT CCC TGT GAT GCC672Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala210 215 220ACG TTG ACC GAG AAA AGC TTT GAA ACA GAT ATG AAC CTA AAC TTT CAA720Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln225 230 235 240AAC CTG TCA GTT ATG GGA CTC CGA ATC CTC CTG CTG AAA GTA GCG GGA768Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly245 250 255TTT AAC CTG CTC ATG ACG CTG AGG CTG TGG TCC AGT TGA807Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度268氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO28Met Lys Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Leu Leu Cys Thr Gln Val1 5 10 15Cys Trp Val Lys Gly Gln Gln Val Gln Gln Sar Pro Ala Ser Leu Val20 25 30Leu Gln Glu Gly Glu Asn Ala Glu Leu Gln Cys Asn Phe Ser Ser Thr35 40 45Ala Thr Gln Leu Gln Trp Phe Tyr Gln Arg Pro Gly Gly Ser Leu Val50 55 60Ser Leu Leu Tyr Asn Pro Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Arg Leu Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Val Thr Lys Glu Arg Arg Ser Ser Leu His Ile Ser Ser85 90 95Ser Gln Ile Thr Asp Sar Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Met Glu Asp Thr100 105 110Gly Ala Asn Thr Gly Lys Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Ile Leu Arg115 120 125Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys130 135 140Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr165 170 175Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly180 185 190Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe195 200 205Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala210 215 220Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln225 230 235 240Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly245 250 255Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 26權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)對抗原的免疫反應(yīng)的方法，它包括將抗原與對抗原特異的有效量的TCRα鏈接觸，以使TCRα鏈以抗原特異性方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中TCRα鏈在輔助成分存在下與抗原接觸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中輔助成分包括由被刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子，這種因子在無TCRα?xí)r不具免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中輔助成分包括由去除了可溶性TCRα鏈的被刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子。
5.權(quán)利要求4的方法，其中輔助成分由一種T細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4或5的方法，其中TCRα鏈以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4或5的方法，其中TCRα鏈以抗原特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
8.一種增強(qiáng)TCRα鏈抑制的抗原特異性免疫反應(yīng)的方法，包括將有效量的可結(jié)合TCRα鏈的對TCRα鏈特異的抗體與TCRα鏈接觸，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中抗體被固定而TCRα鏈被去除。
10.權(quán)利要求8的方法，其中抗體結(jié)合TCRα鏈并中和其活性。
11.一種增強(qiáng)被T細(xì)胞分泌的TCRα鏈所抑制的抗原特異性免疫反應(yīng)的方法，包括將T細(xì)胞與和TCRα鏈信使RNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸接觸，使TCRα鏈的表達(dá)和分泌受抑制。
12.權(quán)利要求11的方法，其中反義寡核苷酸與TCRα鏈信使RNA的可變區(qū)互補(bǔ)。
13.一種在體液中檢測調(diào)節(jié)對抗原的免疫反應(yīng)的可溶性抗原特異性TCRα鏈的方法，它包括(a)將含有偶聯(lián)于可溶解載體上的抗原的脾細(xì)胞被測培養(yǎng)物暴露于懷疑含有TCRα鏈的樣本中，在輔助成分存在下達(dá)足夠時(shí)間，以使通過PFC產(chǎn)生指示的免疫反應(yīng)能發(fā)生；和(b)比較被測培養(yǎng)物和不加樣本的對照培養(yǎng)物中的PFC的產(chǎn)生，其中與對照物相比較PFC產(chǎn)生減少表明，存在以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)的TCRα鏈。而與對照物比較PFC產(chǎn)生的增加表明存在以抗原特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)的TCRα鏈。
14.權(quán)利要求13的方法，其中TCRα鏈以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中TCRα鏈以抗原特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
16.一種經(jīng)提純的TCRα鏈，它能與抗原結(jié)合并調(diào)節(jié)如體外測定系統(tǒng)評價(jià)的對該抗原的免疫反應(yīng)，它包括(a)將含有偶聯(lián)于可溶解載體的抗原的脾細(xì)胞被測培養(yǎng)物在輔助成分存在下暴露于經(jīng)純化的TCRα鏈，達(dá)到足夠通過PFC產(chǎn)生指示的免疫反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間；和(b)比較被測培養(yǎng)物和不加經(jīng)提純的TCRα鏈的對照培養(yǎng)物中的PFC產(chǎn)生，其中與對照物相比PFC產(chǎn)生減少表明TCRα鏈以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)，而與對照物相比PFC產(chǎn)生增加表明TCRα鏈以抗原特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
17.權(quán)利要求16的經(jīng)提純的TCRα鏈，它以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)。
18.權(quán)利要求16的經(jīng)提純的TCRα鏈，它以抗原特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
19.一種通式為R1-[X1]-R2的基本純的融合多肽；其中R1是載體肽，X1是蛋白水解酶識別序列，R2是結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽。
20.權(quán)利要求19的融合多肽，其中載體肽是鈣調(diào)蛋白。
21.權(quán)利要求19的融合多肽，其中由結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽是T細(xì)胞受體α(TCRα)鏈。
22.權(quán)利要求21的融合多肽，其中TCRα鏈?zhǔn)窃摱嚯牡募?xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求19的融合多肽，其中蛋白水解酶識別序列被凝血酶識別。
24.權(quán)利要求23的融合多肽，其中蛋白水解酶識別序列是Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)
25.一種編碼權(quán)利要求19的融合多肽的已分離的多核苷酸序列。
26.一種含有權(quán)利要求25的多核苷酸序列的重組表達(dá)載體。
27.權(quán)利要求26的載體，其中該載體為病毒。
28.權(quán)利要求26的載體，其中該載體為質(zhì)粒。
29.權(quán)利要求28的載體，其中該載體包含表型選擇標(biāo)記DNA序列。
30.權(quán)利要求29的方法，其中表型選擇標(biāo)記選自β-內(nèi)酰胺酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
31.含有權(quán)利要求26的載體的宿主細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是真核生物。
33.權(quán)利要求31的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是原核生物。
34.權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其中原核細(xì)胞選自大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌。
35.生產(chǎn)基本純的，有生物活性的TCRα鏈的方法，包括(a)培養(yǎng)被含有以可操作形式連接的編碼TCRα鏈的多核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(b)分離基本純的有生物活性的TCRα鏈。
36.權(quán)利要求35的方法，其中編碼TCRα鏈的多核苷酸可操作地連接于編碼具有下列通式的多肽的多核苷酸上R1-[X1]；其中R1是載體肽而X1是蛋白水解酶識別序列。
37.權(quán)利要求36的方法，其中載體肽是鈣調(diào)蛋白。
38.權(quán)利要求36的方法，其中蛋白水解酶識別序列被凝血酶識別。
39.權(quán)利要求38的方法，其中蛋白水解酶識別序列是Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)。
40.權(quán)利要求35的方法，其中TCRα鏈?zhǔn)嵌嚯牡募?xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域。
41.權(quán)利要求36的方法，還包括從融合蛋白剪切TCRα鏈。
42.一種藥用組合物，包括免疫抑制劑量的基本純的TCRα鏈和一種藥用惰性載體。
43.一種權(quán)利要求42的藥用組合物，其中TCRα鏈?zhǔn)羌?xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域部分。
44.權(quán)利要求1，8或13任何一個(gè)的方法，其中TCRα鏈?zhǔn)羌?xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域。
45.權(quán)利要求16的TCRα鏈，其中TCRα鏈?zhǔn)羌?xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
以抗原特異性方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法被公開。該方法使用能與抗原特異地結(jié)合，并在輔助成分存在下以抗原特異性方式抑制免疫反應(yīng)的可溶性TCRα鏈。介紹了已證實(shí)具此種活性的TCRα鏈在治療超免疫和免疫缺陷疾病的治療方案中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/435GK1145589SQ94194995
公開日1997年3月19日 申請日期1994年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月13日
發(fā)明者D·格林, A·福蒂達(dá), R·比索奈特, T·三個(gè)山, Y·石井 申請人:拉霍拉敏感及免疫學(xué)研究所, 麒麟麥酒株式會(huì)社