專(zhuān)利名稱(chēng)：：衍生自二羥硼烷的新穎肽化合物，制備它們的方法以及含有這類(lèi)化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及二羥硼烷的肽衍生物，它們的制備方法，含有該類(lèi)衍生物的藥物組合物以及作為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的抑制劑的用途。絲氨酸蛋白酶之一的凝血酶是凝結(jié)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，并在靜脈和動(dòng)脈血栓病理學(xué)中起著主要作用，見(jiàn)F.Toti等人(Sang，Throm-bose，Vaisseaux，4，483—494，1992)及T.M.Reilly等人(BloodCoagulationandFibrinolysis3.513—517.1992)的文獻(xiàn)所示。與目前的方法相比，抗凝血方法更加有效且更加安全。在臨床研究中表明，凝血酶的直接抑制劑比用肝素有許多優(yōu)點(diǎn)，但是該類(lèi)物質(zhì)，水蛭素及其同類(lèi)物(hirulog—1)的缺點(diǎn)是口服給藥后無(wú)效。此外，已知含有(D)—Phe—Pro—Arg序列的多肽是凝血酶催化點(diǎn)的抑制劑(C.Kettneretal，J.BiolChem，265(30)，18289—18297，1990)。具有抗凝血活性的二羥硼烷肽衍生物已在文獻(xiàn)中有所披露。特別可參見(jiàn)專(zhuān)利EP293,881及EP471,651中所述的化合物。進(jìn)一步地，M.A.Hussain等指出，AC—(D)—Phe—Pro—Arg—二羥硼烷(DUP714)是凝血酶抑制劑(Peptides，12，1153—1154，1991)。因此，合成新型的絲氨酸蛋白酶抑制劑很有意義，以增加文獻(xiàn)中已知化合物在口服給藥時(shí)的作用強(qiáng)度，選擇性及活性。明確地說(shuō)，本發(fā)明涉及式(I)化合物它們的對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體以及和藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽。其中R1表示氫原子，直鏈或支鏈的C1—C6?；?，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧羰基，芐氧羰基，苯氧羰基或直鏈或支鏈的C1—C6烷基(未取代的或被一或多個(gè)苯基，羧基，直鏈或支鏈C1—C6烷氧羰基，苯氧羰基，芐氧羰基或嗎啉磺酰基所取代的)，或?yàn)镽6SO2基團(tuán)，其中R6為直鏈或支鏈C1—C6烷基，萘基，苯基，芐基或嗎啉基(萘基，苯基，或芐基本身可任意地被一或多個(gè)鹵原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧基，三鹵甲基，氨基，烷氨基或二烷氨基所取代)，R2表示氫原子或下列基團(tuán)之一—苯基，—芐基(未取代的或在苯環(huán)上被一或多個(gè)鹵原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧基，羥基，氨基，硝基或羧基所取代)，—噻吩甲基，—吡啶甲基，—二苯甲基，—芴基，—萘甲基，—苯并環(huán)丁基，—(二環(huán)丙甲基)甲基，—2，3—二氫化茚基，或—(C3—C7環(huán)烷基)甲基，R’2表示氫原子或其它R2和R’2一起表示C6H5—CH＝，R3表示下列基團(tuán)之一其中1≤m≤6R表示氫原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，R’表示直鏈或支鏈的C1—C6烷基，X表示硫原子或氨基，R4和R5各自為氫原子或直鏈或支鏈C1—C6烷基，或形成蒎烷二醇的硼酸酯A表示下列基團(tuán)其中n為1或2，A2表示苯基，2，3—二氫茚基，C3—C7環(huán)烷基(未取代的或被一或多個(gè)直鏈或支鏈C1—C6烷基所取代的)，C3—C7—環(huán)烯基，雙環(huán)[2.1.1]己基或雙環(huán)[2.2.1]庚基或基團(tuán)其中X和Y是不同的，表示氧或硫原子或NH，或CH2基團(tuán)。本發(fā)明還涉及式(I)衍生物的制備方法，其中，具式(II)的保護(hù)氨基酸(其異構(gòu)體通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)已經(jīng)選擇地被分離)其中，R’1表示直鏈或支鏈的C1—C6酰基，芐基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧羰基，芐氧羰基或苯氧羰基，R2和R’2定義同式(I)，按照W.Konig和R.Geiger(Ber.，103，788，1970)所述肽偶聯(lián)技術(shù)，與具式(III)的第二個(gè)保護(hù)氨基酸反應(yīng)，HA-CO2-CH2C6H5(III)其中，A的定義同(I)(其異構(gòu)體通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)已經(jīng)任意地被分離)，以生成式(IV)化合物，其中，R’1，R2，R’2和A的定義同上，其間，酸性功能基通過(guò)催化氫化或皂化脫去，以生成式V化合物，其中，R’1，R2，R’2和A的定義同上其在1，3—二環(huán)己基碳化二亞胺存在下，在無(wú)水介質(zhì)中，與N—羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，生成式VI化合物，其中，R’1，R2，R’2和A的定義同上，Suc代表琥珀酰亞胺基，然后在堿性介質(zhì)中式(VI)化合物與式(VII)化合物反應(yīng)，其中，R’3表示基團(tuán)Br—(CH2)m—，其中m的定義同式(I)，R’4和R’5各自表示直鏈或支鏈C1—C6烷基，或?yàn)檩逋槎嫉呐鹚狨?，以生成?VIII)化合物，其中，R’1，R2，R3，R’2，A，R’4，R’5定義同上，然后其與任意取代的硫脲或適合于獲得一個(gè)恰如其分取代的胺衍生物反應(yīng)，以生成式(I/a)化合物，即一個(gè)具體的式(I)化合物，其中，R’1，R2，R’2，R’3，A，R’4，R’5，R以及m的定義同上式(I/a)化合物的末端胺功能基如需要可以脫保護(hù)，并且可在惰性介質(zhì)中借助于三氯化硼，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榫呤?I/b)的二羥硼烷(boronicacid)衍生物，即一個(gè)具體的式(I)化合物，其中，R’1，R2，R’2，A和R3定義同式(I)，式(I/a)或式(I/b)化合物；其可用常規(guī)的純化技術(shù)被任意純化，如有需要，可用常規(guī)的分離技術(shù)將其對(duì)映異構(gòu)體分離，并且如果恰當(dāng)?shù)脑?huà)，利用藥學(xué)上可接受的酸或堿將其轉(zhuǎn)變?yōu)榧映甥}。藥學(xué)上可接受的酸包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，三氟乙酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，丁二酸，戊二酸，富馬酸，酒石酸，馬來(lái)酸，檸檬酸，抗壞血酸，甲磺酸，樟腦酸，草酸及類(lèi)似的酸，但不僅僅限于此范圍。藥學(xué)上可接受的堿包括氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，但不限于此范圍。根據(jù)M.W.Rathke等人(Jorganomet.Chem.，122，145—149，1976)所述的方法，由式(IX)化合物，(其中R’4和R’5定義同上)，與式(X)有機(jī)鎂化合物反應(yīng)，R′3MgCl(X)其中R’3定義同上，制得式(XI)化合物其中R’3，R’4及R’5定義同上，式(XI)化合物與1，1，1，3，3，3—六甲基二硅氮烷(HMDS)在正丁基鋰存在下進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)酸處理后得到式(VII)化合物。也可采用D.S.matteson等人(Organometallics，3，1284—1288，1984)及W.Rathke等人(J.Biol，Chem.，265(30)，18289—18297，1990)所述的方法來(lái)制得式(XI)化合物。除了新穎是事實(shí)之外，本發(fā)明化合物還具有特別良好的藥理性質(zhì)。它們是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的強(qiáng)抑制劑，與其它凝血絲氨酸蛋白酶相比，本發(fā)明化合物具有高度的凝血酶選擇性，與對(duì)照化合物DUP714相比，經(jīng)口服給藥后它們的活性更強(qiáng)。這些特性使其可用于治療穩(wěn)定性或非穩(wěn)定性的心絞痛，治療凝血源病和/或凝血綜合癥，治療或預(yù)防心肌梗塞和靜脈或動(dòng)脈凝血。它們也可與抗血栓劑合用。本發(fā)明還延伸至藥物組合物，該組合物中含有至少一個(gè)作為活性成分的式(I)化合物及一或多種惰性的無(wú)毒且適當(dāng)?shù)馁x形劑。所制得的該藥物組合物可呈不同的劑型，較好的是片劑，包衣片劑，膠囊、栓劑，口服懸浮液等等。所采用的劑量按病人的體質(zhì)及病情，給藥途徑，及病人的年齡和體重來(lái)決定。該劑量隨每日1—500mg而變，分單次或多次劑量。用下列實(shí)例描述本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明在任何情況下有所限制。所采用的起始物是已知的，或是按已知方法制備的起始物?！爸苽銩”的方法可產(chǎn)生用于制備本發(fā)明化合物的合成中間體?！皩?shí)例”中所描述的化合物及其中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式均已通過(guò)常用光譜技術(shù)確證。制備A(＋)—α—蒎烷二醇(R)—1—氨基—4—溴丁基二羥硼酸酯(boronate)鹽酸鹽按照C.Kettner等人(J.Biol.Chem.265(30)，18289—18297，1990)所描述的方法，可以制得此化合物，即使烯丙基溴與兒茶酚甲硼烷進(jìn)行反應(yīng)，接著用(＋)—α—蒎烷二醇進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，然后在二氯甲基鋰化物存在下進(jìn)行同系化反應(yīng)，(增長(zhǎng)一個(gè)帶氯原子的碳鏈)，最后與六甲基二硅氮烷進(jìn)行反應(yīng)。熔點(diǎn)160℃旋光性[α]D25＝＋16.5°(C＝1％，乙醇)元素分析C％H％N％Cl％計(jì)算值45.887.153.829.67實(shí)測(cè)45.827.094.139.85實(shí)例中應(yīng)用的縮寫(xiě)如下AC代表乙?；現(xiàn)moc代表9—芴基甲氧基羰基，Bz代表芐基，Suc代表琥珀酰亞胺基，(R)Phe代表(R)—苯基丙氨酰基殘基，Gly代表甘氨酰殘基，BOC代表叔丁氧羰基，實(shí)施例1(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼酸酯步驟ABOC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ采用W.Konig及R.Geiger(Ber.，103，788，1970)提供的肽連接(DCC/HOBT)技術(shù)，以無(wú)水二甲基甲酰胺作溶劑，從73mmol的(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ和BOC—(R)Phe——OH可以制得所期產(chǎn)品，其經(jīng)硅膠柱層析純化，以97/3的CH2Cl2/乙醇混合物作洗脫液，可得純品。產(chǎn)率76％步驟BH—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ置冰浴內(nèi)，在1小時(shí)內(nèi)將氯化氫氣體鼓氣泡于31mmol上述步驟中制得產(chǎn)品的150ml無(wú)水乙酸乙酯中，使之脫保護(hù)?；謴?fù)至室溫并攪拌1小時(shí)，蒸發(fā)混合物，殘?jiān)靡颐烟崛〔⒅卣舭l(fā)。產(chǎn)率99％步驟CAC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ將5mmol上述步驟中獲得的化合物溶于一個(gè)含有10ml二惡烷，5ml水，24ml乙酸酐和25mmolNaHCO3的混合物中，在室溫下攪拌3小時(shí)，蒸發(fā)后殘?jiān)盟?乙酸乙酯混合物提取。有機(jī)相用水洗滌，然后用飽和NaCl洗滌。干燥蒸發(fā)后得所需產(chǎn)品。產(chǎn)率89％。步驟DAC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OH將5mmol的上述產(chǎn)品溶于25ml甲醇中，在氫氣壓力為4kg并有150mg10％無(wú)水Pd/C存在下氫化12小時(shí)。過(guò)濾掉催化劑，蒸發(fā)溶劑后得所期產(chǎn)品。步驟EAC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OSuc將4.46mmol上述步驟中獲得的產(chǎn)品溶于20ml無(wú)水CH2Cl2中，向其中加入4.46mmol(N—羥基琥珀酰亞胺的50ml無(wú)水CH2Cl2溶液，然后加入4.46mmol二環(huán)己基碳化二亞胺的CH2Cl2溶液?；旌衔镉谑覝叵聰嚢?2小時(shí)，過(guò)濾掉形成的二環(huán)己基尿素，蒸發(fā)后得所期產(chǎn)品。步驟F(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—溴丁基二羥硼酸酯將4mmol制備A中所得的化合物的10ml無(wú)水CH2Cl2和4mmol上述步驟中所得化合物一起置于—20℃下的氬氣氛中，向其中滴加56ml三乙胺，混合物于—20℃下保持30分鐘?；謴?fù)至室溫后，混合物在氬氣氛中攪拌過(guò)夜，用乙酸乙酯提取后，依次用水，NaHCO3，水，0.2NHCl及水洗滌，有機(jī)層干燥蒸發(fā)。產(chǎn)品經(jīng)“Sephadex”樹(shù)脂純化得所期化合物。產(chǎn)率90％。步驟G(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼酸酯將2.4mmol前述步驟中制得的化合物和7.3mmol硫脲的6ml乙醇溶液一起于室溫下攪拌60小時(shí)。蒸發(fā)溶劑(經(jīng)“Sephadex”樹(shù)脂純化，以甲醇作洗脫液，得所期產(chǎn)品。產(chǎn)率85％實(shí)施例21—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼基乙酸酯(boronicacidacetate)氬氣氛下，將2mmol實(shí)施例1中所得的化合物的25ml無(wú)水CH2Cl2溶液冷卻至-78℃，30分鐘內(nèi)加入8mmolBCl3。將溫度升至0℃，混合物攪拌30分鐘，然后加入10ml冰水。攪拌15分鐘，恢復(fù)至室溫，分出有機(jī)層，用10ml水/乙酸(90/10)混合物提取，余下的水相用醚洗滌，合并水層并蒸發(fā)。殘?jiān)?jīng)Bio—gel純化，以水/乙酸(90/10)混合液作洗脫液，生成所期產(chǎn)品，其經(jīng)過(guò)冷凍干燥。產(chǎn)品的理化分析表明其符合所期的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油—2H2O＋H+]m/Z＝561實(shí)施例3(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R，S)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥基硼酸酯采用實(shí)施例1所述方法，步驟A中用(N—環(huán)己基)Gly—OBZ代替(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ，用BOC—(R，S)Phe—OH代替BOC—(R)Phe—OH可以獲得所期化合物。實(shí)施例41—(R)—{[AC—(R，S)Phe—(N—環(huán)己基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼基乙酸酯從實(shí)施例3所述化合物開(kāi)始，采用實(shí)施例2中所述方法，可以制得所期化合物。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油—2H2O＋H+]m/Z＝576實(shí)施例5(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼酸酯采用實(shí)施例1所述方法，在步驟A中用(N—環(huán)己基)Gly—OBZ代替(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ，可以獲得所期化合物。實(shí)施例61—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)己基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，從實(shí)施例5所述化合物開(kāi)始，可以獲得所期產(chǎn)品。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油—2H2O＋H+]m/Z＝576實(shí)施例7(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥基硼酸酯步驟A至F同實(shí)施例1中步驟A至F。步驟G(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—疊氮基丁基二羥基硼酸酯步驟H(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—氨基丁基二羥基硼酸酯步驟G和H中的預(yù)期產(chǎn)品是通過(guò)專(zhuān)利EP615978中所述方法獲得的。步驟1(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基氨基)丁基二羥基硼酸酯苯磺酸酯將5.793埃分子篩和3.75ml40％的甲醛溶液加入1mmol上述步驟中所得的化合物的20ml無(wú)水乙醇溶液中，混合物于室溫下攪拌過(guò)夜。過(guò)濾后，向醇相中加入1mmol苯磺酸，室溫和常壓下混合物于100mg10％Pd/C存在下氫化過(guò)夜，過(guò)濾催化劑后用Sephadex樹(shù)脂純化，得所需化合物。步驟J(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥基硼酸酯采用實(shí)施例2中所述的專(zhuān)利EP615978的方法，使上述步驟中所得的化合物與氨基氰進(jìn)行反應(yīng)，得所期產(chǎn)品。實(shí)施例81—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例7中所述化合物作起始物，得所期化合物。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油—2H2O＋H+]m/Z＝559實(shí)施例9(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)己基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼酸酯采用實(shí)施例7所述方法，以(N—環(huán)己基)Gly—OBZ作起始原料，得所期產(chǎn)品。實(shí)施例101—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)己基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例9中所述化合物作起始物，得所期產(chǎn)品。質(zhì)譜FAB+[I+][M＋H+]m/Z＝516實(shí)施例11(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)(3—氨基)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼酸酯步驟A(R，S)(3—硝基)Phe—OH鹽酸鹽在無(wú)水乙醇介質(zhì)中，使3—硝基芐基溴與乙酰氨基丙二酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)，然后用6NHCl在乙酸存在下對(duì)形成的丙二酸二乙酯進(jìn)行水解，得到3—硝基苯基丙氨酸。步驟BFmoc—(R)(3—硝基)Phe—OH將14.4ml10％的Na2CO3水溶液加入4mmol由上述步驟所得的化合物中，冷卻后，加4mmolFmoc—Cl。恢復(fù)至室溫后，混合物攪拌過(guò)夜，然后傾入250ml水中。水相用乙醚洗滌，并用濃鹽酸酸化至PH＝1。過(guò)濾所期產(chǎn)品(以外消旋形式存在)，干燥，用HPLC分離異構(gòu)體，采用制備柱DAICELOD(洗脫液庚烷/異丙醇/三氟乙酸650/350/0.5)。步驟C(R)(3—硝基)Phe—OH在哌啶存在下，上述所得產(chǎn)品在二惡烷介質(zhì)中脫保護(hù)。步驟DBOC—(R)(3—硝基)Phe—OH在碳酸二叔丁酯存在下，上述步驟中獲得的產(chǎn)品可以很容易地被保護(hù)。步驟EBOC—(R)(3—硝基)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly—OBZ采用實(shí)施例1步驟A所述方法，以上述步驟中所得產(chǎn)品為原料可以得所期產(chǎn)品。步驟F至M用實(shí)施例7步驟B至J所述方法可以獲得這些步驟的所期產(chǎn)品。實(shí)施例121—(R)—{[AC—(R)(3—氨基)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例11中所述化合物作起始物，可以獲得所期產(chǎn)品。質(zhì)譜FAB+[I+][M＋H+]m/Z＝517實(shí)施例13(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[嗎啉代磺?；?R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼酸酯采用實(shí)施例7所述方法，在步驟A中以嗎啉代磺?；?R)—Phe—OH代替BOC—(R)Phe—OH，前者在J.Med.Chem.(Vol.34，NO.7，P.1937，1991)中有描述，得所期產(chǎn)品。實(shí)施例141—(R)—{[嗎啉代磺?；?R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例13中所述化合物為原料，可以制得所期化合物。實(shí)施例15(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(亞胺甲基氨基)丁基二羥硼酸酯步驟A至H這些步驟與實(shí)施例7中的步驟A至H一致。步驟1(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(亞胺甲基氨基)丁基二羥硼酸酯采用專(zhuān)利PCT/US94/04058所述方法，使亞氨甲酸乙酯鹽酸鹽與上述步驟中獲得的產(chǎn)品進(jìn)行反應(yīng)，即可制得所期產(chǎn)物。實(shí)施例161—(R)—{[AC—(R)Ple—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(亞胺甲基氨基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例15中所述化合物作起始物，可以獲得所期化合物。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油－2H2O＋H+]m/Z＝544實(shí)施例17(＋)—α—蒎烷二醇l—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基—N—亞胺甲基氨基)丁基二羥硼酸酯步驟A至I這些步驟同實(shí)施例7中步驟A至I。步驟J(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基—N—亞胺甲基氨基)丁基二羥硼酸酯采用實(shí)施例15中步驟I所述方法，以上述步驟中所述化合物為起始原料、可以制得所期化合物。實(shí)施例181—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(亞胺甲基氨基)丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，以實(shí)施例17中所述化合物為起始原料，得所期產(chǎn)品。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油—2H2O＋H+]m/Z＝545實(shí)施例19(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4[(2—咪唑基)氨基]丁基二羥硼酸酯采用實(shí)施例1所述方法，在步驟G中用1—三苯甲基—2—氨基咪唑代替硫脲，然后進(jìn)行酸性水解，得所期化合物。實(shí)施例201—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—[(2—咪唑基)氨基]丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，從實(shí)施例19中所述化合物出發(fā)，可以制得所期化合物。質(zhì)譜FAB+[M＋甘油－2H2O＋H+]m/Z＝555實(shí)施例21(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—[(1—甲基—2—咪唑基)硫代]丁基二羥硼酸酯步驟A至F這些步驟同實(shí)施例1中A至F步驟。步驟G(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—[(1—甲基—2—咪唑基)硫代]丁基二羥硼酸酯將2mmol溴衍生物(由步驟F中制得)加到一個(gè)含有2mmolNaH和2mmol1—甲基—2—巰基咪唑的10mlDMF溶液中，該溶液預(yù)先冷卻至0℃。恢復(fù)至室溫后，加水。用乙酸乙酯提取，干燥蒸發(fā)后得所需產(chǎn)品。實(shí)施例221—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—[(1—甲基—2—咪唑基)硫代]丁基二羥硼基乙酸酯采用實(shí)施例2所述方法，從實(shí)施例21中所述化合物出發(fā)，可以得所期產(chǎn)品。本發(fā)明化合物的藥理學(xué)研究實(shí)施例23抗凝血活性，人體凝血酶和凝血酶原時(shí)間的測(cè)定在標(biāo)準(zhǔn)量的凝血酶或促凝血酶原激酶鈣的存在下，正常的血漿在指定和固定的時(shí)間內(nèi)凝固的時(shí)間分別稱(chēng)作凝血酶時(shí)間(TT)和凝血酶原時(shí)間(PT)。收集肘部的靜脈血，置于檸檬酸三鈉(0.109M)溶液中，除盡血小板的血漿可以通過(guò)血樣離心(3000g，15分鐘)獲得。凝血酶時(shí)間可以通過(guò)ThrombinPrest(Stago)試劑獲得，凝血酶原時(shí)間可以通過(guò)Neoplastine(Stago)試劑獲得。它們可用ST4(Stago)凝固測(cè)量計(jì)來(lái)自動(dòng)測(cè)定。拮抗劑或溶劑(10l)加入到血漿(90l)中，然后在37℃下培養(yǎng)2分鐘。向其中加入100l凝血酶或200l促凝血酶原激酶鈣，起動(dòng)秒表。在這些條件下，獲得的人對(duì)照血漿的TT值為20秒等級(jí)，PT值為12秒等級(jí)。抑制劑的活性是通過(guò)與對(duì)照相比，其延長(zhǎng)這些時(shí)間值的能力來(lái)評(píng)價(jià)的。在這些條件下，本發(fā)明化合物可使凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)50倍和更多，測(cè)定了抑制劑的活性，并對(duì)使凝固時(shí)間加倍的濃度進(jìn)行了測(cè)定(凝血酶的CTT2及凝血酶原CPT2)。結(jié)果列于下表中實(shí)施例24凝血酶抑制作用及絲氨酸蛋白酶凝固和纖維蛋白溶解抑制作用為了評(píng)價(jià)硼—精氨酸產(chǎn)品對(duì)人體凝血酶(Sigma，特定活性3220NlHU/mg)在體外的抑制活性，將純化的人類(lèi)纖維蛋白原(6M，酶研究實(shí)驗(yàn)室)加到指定量(0.7nM)，且預(yù)先加有或無(wú)待測(cè)抑制劑一起經(jīng)過(guò)培養(yǎng)(20℃，10分鐘)的凝血蛋白中。為了在體外評(píng)價(jià)這些產(chǎn)品對(duì)不同絲氨酸蛋白酶的纖維蛋白溶解和凝固的選擇性，可對(duì)下列物質(zhì)應(yīng)用同樣的實(shí)驗(yàn)方案對(duì)純化的人體血漿酶(2nM，Stago)；純化的人體活化蛋白C((2nM，Stago)；純化的人體活化因子X(jué)(2nM，Calbiochem)；血漿酶原的組織活化劑(2nM，Calbiochem)，純化的人類(lèi)尿激酶(2nM，Choay)；純化的人體血漿激肽釋放酶，(2nM，Calbiochem)。使用不同的肽對(duì)硝基苯胺類(lèi)作底物如用＜Glu—Phe—Lys—PNA(0.50mM，S2403，Kabi)于血漿酶；用N—Cbo—Arg—Gly—Arg—PNA(0.39mM，S2765，Kabi)于Xa因子；用＜Glu—Pro—Arg—PNA(0.52mM，S2366，Kabi)于活化蛋白質(zhì)C；用H—D—Pro—Phe—Arg—PNA(0.45mM，S2302，Kabi)于激肽釋放酶；用H—(D)—lle—Pro—Arg—PNA(0.48mM，S2288，Kabi)于血漿酶原組織活化劑以及用＜Glu—Gly—Arg—PNA(0.56mM，S2444，Kabi)于尿激酶。抑制劑，酶和底物用同樣的緩沖劑稀釋(0.10mM磷酸緩沖液，PH＝7.4，含有0.12MNaCl及0.05％的牛白蛋白血清)，然后分散到體積為501由聚苯乙烯制成的微平皿中。在20℃下，分別反應(yīng)5分鐘或30分鐘后，用分光光度方法對(duì)由于凝血蛋白形成的纖維蛋白及絲氨酸蛋白酶作用而釋放的對(duì)硝基苯胺進(jìn)行測(cè)定，所用波長(zhǎng)為405nm。下表給出了在參考物(DUP714)及實(shí)施例2化合物存在下，使酶活性抑制50％時(shí)化合物的濃度，此結(jié)果是與沒(méi)有本發(fā)明產(chǎn)品的對(duì)照組相比較的。表中結(jié)果顯示實(shí)施例2化合物抑制凝血酶的作用與DUP714一樣強(qiáng)，但對(duì)其他絲氨酸蛋白酶的凝固及纖維蛋白溶解的抑制作用不及DUP714。因此，化合物2，6，8比DUP714對(duì)于凝血酶來(lái)說(shuō)是一個(gè)更具選擇性的抑制劑。實(shí)施例25體外抗凝血活性的測(cè)定本品經(jīng)靜脈(i.v.)途徑給予大鼠對(duì)禁食或未禁食的OFA大鼠用戊巴比妥(60mg/kg.i.p)進(jìn)行麻醉。暴露出頸動(dòng)脈和頸靜脈并插入導(dǎo)管，導(dǎo)管用含枸椽酸鹽的生理鹽水(1/40)凈化。安好導(dǎo)管后，采集1.5cm3的動(dòng)脈血置于0.109M構(gòu)椽酸鹽(1/9)中。—30分鐘后靜脈給予受試化合物(體積1ml)?！?jiǎng)用}采血(1.5ml)，然后在1分半，5分鐘，15分鐘，30分鐘，和60分鐘時(shí)再進(jìn)行測(cè)試?！看尾杉?.5ml含枸椽酸鹽的生理鹽水，再經(jīng)頸動(dòng)脈重新注射給動(dòng)物?！獙⑹⒀嚬茉?000g下離心5分鐘制備血漿?！獙?00l血漿與100l活性腦磷脂進(jìn)行培養(yǎng)，加入100l鈣后測(cè)定凝血現(xiàn)象出現(xiàn)的時(shí)間。-0.25mg/kg的本發(fā)明受試化合物可以持續(xù)地增加活化腦磷脂時(shí)間(ACT)。結(jié)果列于下表，其顯示了凝固時(shí)間增加的指數(shù)實(shí)施例26體外抗凝血活性測(cè)量本產(chǎn)品經(jīng)靜脈途徑(i.v.)給予狗禁食的狗給予戊巴比妥(30mg/kg，i.v.)進(jìn)行麻醉，暴露股動(dòng)脈和隱靜脈并安上插管。使狗自由呼吸，采血步驟與上述實(shí)施例25中大鼠的采血一致，受試的本發(fā)明化合物在0.5mg/kg的劑量下持續(xù)地使活化腦磷脂時(shí)間(ACT)增加，觀察到的本發(fā)明化合物所引起的ACT的增加在給藥60分鐘后依然很明顯，且其不伴有血小板減少(見(jiàn)表)DUP714在0.25mg/kg劑量下所引起ACT的增加可與實(shí)施例2化合物在0.5mg/kg劑量下所引起結(jié)果相比。DUP714產(chǎn)生作用的同時(shí)伴有血小板減少20％。實(shí)施例27體外抗凝血活性的測(cè)定本品經(jīng)口服途徑給藥予狗采集血樣后，口服給予本產(chǎn)物。在處理后特定的時(shí)間下靜脈采血。制備血漿，進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行凝血酶時(shí)間試驗(yàn)。表中顯示實(shí)施例2產(chǎn)物在2.5mg/kg的劑量下可以引起TT值的增加而不改變血小板數(shù)?；钚允浅志玫?4小時(shí))。</tables>實(shí)施例28藥物組合物制備1000片、每片含10mg(活性成分)的制備配方實(shí)施例2化合物10g羥丙基纖維素2g小麥淀粉10g乳糖100g硬脂酸鎂3g滑石3g權(quán)利要求1.具式(I)的化合物它們的對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體和差向異構(gòu)體以及與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的鹽。其中R1表示氫原子，直鏈或支鏈的C1—C6?；?，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧羰基，芐氧羰基，苯氧羰基或直鏈或支鏈的C1—C6烷基(未取代的或被一或多個(gè)苯基，羧基，直鏈或支鏈C1—C6烷氧羰基，苯氧羰基，芐氧羰基或嗎啉磺?；〈?，或?yàn)镽6SO2基團(tuán)，其中R6為直鏈或支鏈C1—C6烷基，萘基，苯基，芐基或嗎啉基(萘基，苯基，或芐基本身可任意地被一或多個(gè)鹵原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧基，三鹵甲基，氨基，烷氨基或二烷氨基所取代)，R2表示氫原子或下列基團(tuán)之一—苯基，—芐基(未取代的或在苯環(huán)上被一或多個(gè)鹵原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧基，羥基，氨基，硝基或羧基所取代)，—噻吩甲基，—吡啶甲基，—二苯甲基，—芴基，—萘甲基，—苯并環(huán)丁基，—(二環(huán)丙甲基)甲基，—2，3—二氫化茚基，或—(C3—C7環(huán)烷基)甲基，R’2表示氫原子或芐基或R2和R’2一起表示C6H5—CH＝，R3表示下列基團(tuán)之一1≤m≤6R表示氫原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，R’表示直鏈或支鏈的C1—C6烷基，X表示硫原子或氨基，R4和R5各自表示氫原子或直鏈或支鏈的C1—C6烷基，或形成蒎烷二醇的硼酸酯，A表示下列基團(tuán)其中n為1或2，A2表示苯基，2，3—二氫茚基，C3—C7環(huán)烷基(未取代的或被一或多個(gè)直鏈或支鏈C1—C6烷基所取代)，C3—C7—環(huán)烯基，雙環(huán)[2.1.1]己基或雙環(huán)[2.1.1]庚基或基團(tuán)其中X和Y是不同的，表示氧或硫原子或NH，或CH2基團(tuán)。2.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體，及其與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的鹽，其中R1表示乙?；?。3.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體，及其與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其中R2表示芐基。4.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體，及其與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其中A表示—N—(CH2)n—，定義同權(quán)利要求1。5.權(quán)利要求1中的式(1)化合物其對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體，及其與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其中R3表示3—(異硫脲基)丙基。6.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其異構(gòu)體，及其與藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其為1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼烷，AC表示乙酰基，(R)Phe表示(R)苯丙氨?；?，Gly表示甘氨?；?.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其為1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)己基)Gly]氨基}—4—(異硫脲基)丁基二羥硼酸。8.權(quán)利要求1中的式(I)化合物其異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的酸或堿形成的加成鹽，其為1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—環(huán)戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羥硼酸。9.權(quán)利要求1中式(I)化合物的制備方法，其中，具式(II)保護(hù)氨基酸，其異構(gòu)體通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)已經(jīng)任意地被分離其中，R’1表示直鏈或支鏈的C1—C6?；?，芐基，直鏈或支鏈的C1—C6烷氧羰基，芐氧羰基或苯氧羰基，R2和R’2定義同式(I)，按照肽偶聯(lián)技術(shù)，與具式(III)的第二個(gè)保護(hù)氨基酸反應(yīng)，HA—CO2—CH2C6H5(III)其中，A的定義同(I)(其異構(gòu)體通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)已經(jīng)任意地被分離)，以生成式(IV)化合物，其中，R’1，R2，R’2及A的定義同上，其間，酸性功能基通過(guò)催化氫化或皂化脫去，以生成式V化合物，其中，R’1，R2，R’2和A的定義同上其在1，3—二環(huán)己基碳化二亞胺存在下，在無(wú)水介質(zhì)中，與N—羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，生成式VI化合物，其中，R’1，R2，R’2和A的定義同上，Suc代表琥珀酰亞胺基，其在堿性介質(zhì)中與式(VII)化合物反應(yīng)，其中，R’3表示基團(tuán)Br—(CH2)m—，其中m的定義同式(I)，R’4和R’5各自表示直鏈或支鏈C1—C6烷基，或形成蒎烷二醇的硼酸酯，以生成式(VIII)化合物，其中，R’1，R2，R’2，R’3，A，R’4，R’5定義同上，其與任意取代的硫脲或適合于獲得一個(gè)恰如其分取代的胺衍生物反應(yīng)，以生成式(I/a)化合物，即一個(gè)具體的式(I)化合物，其中，R’1，R2，R3，R’2，A，R’4，R’5，以及m的定義同上式(I/a)化合物的末端胺功能基，如需要可以脫保護(hù)，并且可在惰性介質(zhì)中借助于三氯化硼，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榫呤?I/b)的二羥硼酸(boronicacid)衍生物，即一種具體的式(I)化合物，其中，R’1，R2，R’2，A和R3定義同式(1)，式(I/a)或式(I/b)化合物；其可用常規(guī)的純化技術(shù)被任意純化，如有需要，可用常規(guī)的分離技術(shù)將其對(duì)映異構(gòu)體分離，并且如果恰當(dāng)?shù)脑?huà)，利用藥學(xué)上可接受的酸或堿將其轉(zhuǎn)變?yōu)榧映甥}。10.藥物組合物，其至少含有一種象權(quán)利要求1—8中提到的作為活性成分的化合物，或結(jié)合一或若干種藥學(xué)上可接受的無(wú)毒惰性載體配伍。11.權(quán)利要求10中的藥物組合物，用作為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的抑制劑。12.權(quán)利要求10中的藥物組合物，用作為凝血酶的抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及式(I)化合物，其中基團(tuán)定義見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。文檔編號(hào)C07K5/065GK1121077SQ95106659公開(kāi)日1996年4月24日申請(qǐng)日期1995年6月21日優(yōu)先權(quán)日1994年6月22日發(fā)明者G·迪南泰爾,C·利拉,P·格勞耐克申請(qǐng)人:阿迪爾公司