專利名稱：重組的感染性不分節(jié)段的負鏈rna病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種遺傳工程得到的感染性復(fù)制性不分節(jié)段的負鏈RNA病毒突變體，和這種突變體的制備方法。
狂犬病病毒(RV)是棒狀病毒科的不分節(jié)段的負鏈RNA病毒的一個實例。屬于此科的其它病毒種為水泡性口炎病毒(VSV)，傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)，病毒性出血性敗血病病毒(VHS，Egtved病毒)，牛暫時性發(fā)熱病毒(BEFV)，和苦苣菜黃網(wǎng)病毒(SYNV)。
除棒狀病毒科以外，屬于副粘病毒(如sendai病毒(SV)，2型和3型副流感病毒(PIV)、新城疫病毒(NDV)、流行性腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MEV)和犬熱瘟病毒(CDV)和絲狀病毒科的病毒，以及幾種未歸于某科的病毒(如Borna病病毒；BDV)均具有不分節(jié)段的負鏈RNA基因組。
各類的不分節(jié)段的負鏈RNA病毒中全基團結(jié)構(gòu)是有可比的。特別是在副粘病毒和棒狀病毒之間，在全基因結(jié)構(gòu)上僅有很小的區(qū)別(Tordo等，Seminars in Virology 3341－357，1992)。
RV可感染所有溫血動物，在出現(xiàn)癥狀后這種感染最后幾乎都導(dǎo)致死亡。犬狂犬病在世界上許多地方仍很重要全世界每年發(fā)生的約75,000例人狂犬病例的大部分是由感染的狗引起的。在歐洲許多國家、和在美國加拿大，野生動物狂犬病的重要性日益增加。
在大部分物種中，狂犬病的臨床特征相似，但在個體間存在很大的差異。在被狂犬病動物咬傷后，潛伏期一般為14-90天，但也可以相當(dāng)長，有潛伏期超過一年的記錄。該疾病的兩個臨床形式為狂暴性和早癱性或麻痹性。在狂暴性形式中，動物變得不安、煩燥、富攻擊性，并且通常是危險的，因為它失去了對人的一切恐懼，會咬任何引起其注意的東西。該動物經(jīng)常不能吞咽，引起該病的癥狀“恐水癥”。經(jīng)常有過量的唾液、對光和聲反應(yīng)過度、及感覺過敏。隨著腦炎的發(fā)展，癱瘓取代了狂暴，如從該病的早癱性形式的全過程中所見，動物顯示相同的臨床特征。最后，常有抽搐發(fā)作、昏迷、和呼吸停止，臨床癥狀開始后2-7天發(fā)生死亡。
當(dāng)被狂犬病動物咬傷或偶發(fā)的抓傷，或當(dāng)狂犬動物的帶病毒唾液進入傷口時，狂犬病毒進入體內(nèi)。在咬傷部位(肌肉)中病毒復(fù)制后，開始侵入外周神經(jīng)末稍，及病毒基因組在軸突胞漿中向中樞神經(jīng)系統(tǒng)運動。病毒進入脊髓再進入腦(特別是緣系統(tǒng))與神經(jīng)障礙的臨床癥狀有關(guān)。一般，大約在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起狂暴的同時，病毒顆粒從唾液腺中的粘液分泌細胞的頂端散發(fā)出來，以高濃度運送至唾液中。
在狂犬病的整個過程中，僅輕微地激起宿主炎癥和特異的免疫應(yīng)答；對此最合理的解釋是因為此感染在肌肉中和在神經(jīng)細中是非致細胞病變的，而且因為此感染大量集中在神經(jīng)系統(tǒng)的免疫隱蔽區(qū)中。
像所有的棒狀病毒那樣，RV病毒由兩個主要結(jié)構(gòu)成分組成核衣殼或核蛋白(RNP)核心和圍繞RNP核心的雙層膜形式的包膜。所有棒狀病毒的感染性成分為RNP核心。此基因組RNA是反義的，因此不能作為信使，但要求其自身內(nèi)源性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA。核衣殼(N)蛋白結(jié)合兩種小蛋白(即RNA依賴性RNA聚合聚(L)和磷蛋白(P))包裝此RNA基因組，形成RNP核心。膜部分含兩種蛋白質(zhì)跨膜糖蛋白(G)和位于膜內(nèi)側(cè)的基質(zhì)(M)蛋白。G蛋白在RV中負責(zé)細胞附著和膜融合，另外還是宿主免疫系統(tǒng)的主要靶點。
在轉(zhuǎn)錄過程中，此基因組指導(dǎo)一短的先導(dǎo)RNA和含5個單順反子的、加帽的多聚腺苷化的mRNA的序列合成。在復(fù)制過程中，順反子間的條件性轉(zhuǎn)錄終止和啟動信號不被病毒聚合酶所識別。對于轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)和復(fù)制酶反應(yīng)，都要求與RNA基因組復(fù)合的N-蛋白以及L-蛋白和P-蛋白的存在。已測定了RV基因組上的基因順序，其為如圖1所示的3’-先導(dǎo)序列-N-P-M-G-L-5’。轉(zhuǎn)錄后，RV的每個mRNA立即被翻譯。與復(fù)制過程中相繼發(fā)生兩個過程先產(chǎn)生與基因組互補的衣殼化的完整的正鏈RNA，然后產(chǎn)生同樣由N、L和P蛋白衣殼化的完整的負鏈RNA。最后，新組成的RNP核心在組裝和芽殖過程中與M-蛋白及G-蛋白結(jié)合，導(dǎo)致裝配好的感染性RV病毒顆粒的釋放。
11.9Kb的基因組RVRNA含有5個開放閱讀框架(ORF)，編碼N、P、M、G和L蛋白，另外在G和L基因之間存在假基因區(qū)(ψ)(圖1)。
對不分節(jié)段的負鏈RNA病毒的現(xiàn)代疫苗包含化學(xué)滅活病毒疫苗或含減毒的病毒株的改造的活病毒疫苗，其中減毒病毒株的致病性已經(jīng)細胞培養(yǎng)中的多次傳代而減低?；瘜W(xué)滅活的狂犬病疫苗有，如Rabivac，Behringwerke(人)，HDC，Rhone-Poulenc(人)，Bayovac-LT，Bayer(獸)，Madivac，Hoechst(獸)，Epivax-LT，Pitman-Moore，Rabisin，Phone-Merieux。對于RV，這種減毒病毒的實例有疫苗株SAD B19和ERA。滅活的疫苗一般僅誘導(dǎo)低水平的免疫，要求重復(fù)免疫接種。另外，經(jīng)滅活處理后，誘導(dǎo)病原體的抗原決定簇的中和作用可能改變，從而減低的疫苗的保護能力。
一般優(yōu)選減毒活病毒疫苗，因為它們激發(fā)?；隗w液和細胞反應(yīng)的免疫應(yīng)答。但在細胞培養(yǎng)傳代過程中，可能向病毒基因組中引入不可控制的突變，從而產(chǎn)生不同的毒力和免疫特性的病毒顆粒群。在細胞培養(yǎng)傳代過程中過度減毒也是這些疫苗的一個問題。必須取得保證疫苗為無毒的和確保其仍有保護性之間的微妙平衡。另外，人們已知這種傳統(tǒng)的減毒活病毒疫苗可能回復(fù)毒力，在接種動物中引起疾病暴發(fā)，并可能將病原體擴散到其它動物中。
另外，活病毒疫苗的一個問題是，抗原組分間的相互影響導(dǎo)致一種或多種組成成分的效力下降。
更進一步講，對于現(xiàn)今施用的活的減毒RV疫苗或滅活的RV病毒，不可能確定某具體動物是RV類病毒攜帶者，還是已接種的動物。因此，能夠區(qū)別用RV疫苗接種的動物和被該類病毒感染的動物是很重要的，以便采取適當(dāng)?shù)拇胧p小有毒的病毒的擴散。在某RV(糖)蛋白的編碼基因中產(chǎn)生突變，能夠引入例如血清學(xué)上可鑒別的標記，該蛋白一般在被感染宿主動物中引起抗體的產(chǎn)生。
希望以可控制的方式向RV RNA基因組中引入突變，以便例如形成的突變體RV是減毒的，或含有編碼外源蛋白如免疫標記蛋白或病原體抗原的異源核酸序列。為此目的，在DNA病毒和正鏈RNA病毒中已廣泛使用了重組DNA技術(shù)。重組的DNA病毒實例有Aujeszky病毒(PRV)；腺病毒；牛痘病毒。重組的正鏈RNA病毒的實例有α-病毒(Sindbis V.，Semliki forest virusH.V.Huang，C.M.Rice，C.Xiong，S.Schlesinger(1989)作為基因表達載體的RNA病毒。Virus Genes 3，85-91)，微小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、A型肝炎病毒、口蹄疫病毒J.W.Almond和K.L.Burke(1990)，脊髓灰質(zhì)炎病毒作為遞呈外源抗原的載體，Semin.Virol.1，11-20)。RNA病毒基因組的定向遺傳工程取決于產(chǎn)生能被特異RNA-依賴性RNA聚合酶接受作為模板的重組RNA的能力。用許多標準的DNA依賴性RNA聚合酶(如T7RNA聚合酶或細胞RNA聚合酶II)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本和模擬(mim-icking)病毒基因組為許多正鏈RNA病毒的聚合酶所識別。這使得可以從cDNA轉(zhuǎn)錄本中回收感染性病毒或復(fù)制子，應(yīng)用重組DNA技術(shù)以位點特異性的方式對這些基因組進行操作。因為相應(yīng)于正鏈RNA病毒的基因組的RNA可作為病毒聚合酶翻譯的mR-NA，感染循環(huán)可以通過向細胞中引入基因組類似物而啟動。而負鏈RNA病毒的聚合酶的模板絕不是RNP復(fù)合體。而且與正鏈RNA病毒不同，它們的基因組或反基因組RNA不能作為mRNA，因此人工RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中涉及的所有病毒蛋白必須以反式形式提供。
最近Palese，P等(WO 91/03552)公開了一種具有分節(jié)段基因組的負鏈RNA病毒的基因組RNA類似物的適當(dāng)包裝系統(tǒng)，以提供適當(dāng)?shù)哪０?。來自流感病毒基因組節(jié)段的RNA轉(zhuǎn)錄本在體外用純化蛋白包裝，其可用于與輔助病毒一起轉(zhuǎn)染細胞。但發(fā)現(xiàn)該途徑對于RV這種共有不分節(jié)段的基因組的病毒是不成功的。缺少RNA基因組的主要部分含有病毒蛋白編碼基因的VSV和RV的短模型(model)基因組可被質(zhì)粒編碼的蛋白所包裝并表達(Pattnaik，A.K.等，Cell 69，1011-1020，1992；Conzelmann，K-K和M.schnell，J.Virology 68，713-719，1994)。此途徑涉及任選含受體基因插入的基因組類似物，和來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的特異病毒蛋白的共同表達，以產(chǎn)生缺損病毒顆粒。Ballart等描述了一種從克隆的cDNA得到感染性麻疹病毒的方法，該病毒也是一種不分節(jié)段的負鏈RNA病毒(The MEBO Journal，9379-384(1990))。此作者作為發(fā)明人之一提交了一項關(guān)于此方法的歐洲專利申請。
但此論文和專利申請都已撤回，因為進一步研究表明所有推定的重組病毒根本不是重組子，而僅是原始所用疫苗株的后代病毒。
因此，應(yīng)得出這樣的結(jié)論，迄今為止為得到具有大的不分節(jié)段的基因組的感染性重組負鏈RNA病毒的努力(這需要整個基因組的操作)都失敗了。
本發(fā)明提供一種遺傳工程的感染性復(fù)制性不分節(jié)段的負鏈RNA病毒突變體，其可通過重組DNA技術(shù)得到，其在RV基因組的ORF，假基因區(qū)或非編碼區(qū)含有插入和/或缺失。
更具體地講，本發(fā)明提供副粘病毒和棒狀病毒科的不分節(jié)段的負鏈RNA病毒。
如上所解釋的那樣，在不分節(jié)段的RNA病毒科之間基因組結(jié)構(gòu)存在大的同源性。當(dāng)在復(fù)制、組裝、細胞附著或細胞融合過程中的被編碼蛋白質(zhì)的功能可此時，將稱這些蛋白質(zhì)為“類似物”。例如一個科中的兩種蛋白質(zhì)的功能可能在另一科中合并在一種蛋白質(zhì)中。這例如為下面這種情況副粘病毒的F和HN蛋白一起與棒狀病毒的糖蛋白G具有相同的功能。在此情形下，該科的這兩種蛋白質(zhì)將被視為另一科中那一種蛋白質(zhì)的類似物。
通過在相應(yīng)的病毒ORF，假基因區(qū)或非編碼區(qū)摻入適當(dāng)?shù)耐蛔?，可向RV基因組中引入一種或多種核酸殘基的插入和缺失。此改變應(yīng)理解為親本RV的RV ORF或假基因中遺傳信息的改變，從而得到本發(fā)明的插入或缺失RV突變體。
一突變體，其中一個或多個核苷酸被另外的核苷酸所代替，所謂的取代替換可認為是插入和缺失作用的結(jié)合。因此，這種突變也被認為包括在術(shù)語缺失和(/或)插入中。
很明顯，這里定義的任何突變包括改變適當(dāng)?shù)腞V序列使形成的RV突變體仍有感染性和復(fù)制性，即突變的RV有感染敏感細胞的能力，其突變的RNA基因組有自發(fā)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的能力，即不需要RVN，P和L蛋白的共同表達。
不用說，本發(fā)明也包括能夠僅感染一個循環(huán)，然后復(fù)制的突變RV(參見下文)。
不同RV株的基因組結(jié)構(gòu)是相同的。已測定了疫苗株SAD B19和毒性株P(guān)V的核苷酸序列和推測的氨基酸序列(Conzelmann等，Virology 175，485-499，1990和Tordo等，Nucleic Acids Res.14，2671-2683，1986；Proc.Natl.Acad.Sci USA 83，3914-3918，1986；Virology 165，565-567，1988)。在Conzelmann等，1990(見上文)中，測得SAD B19株的病毒基因組含有11，928個核苷酸，推斷的5個病毒蛋白N，P，M，G和L的氨基酸序列與致病的PV株的高度相似。文中已測定了RV中每個ORF、假基因區(qū)和基因間非編碼區(qū)的位置編碼區(qū)RVN，P，M，G和L基因分別相當(dāng)于位置71-1423，1514-2407，2496-3104，3317-4891，5414-11797。假基區(qū)位于4961-5359的位置，而分隔五個順反子的基因間區(qū)域，其旁側(cè)為含轉(zhuǎn)錄啟動和終止/多聚腺苷化信號的非編碼序列，其位于1483-1484；2476-2480；3285-3289；5360-5383的位置。雖然這里用于引入突變的親本RV株的ORF，假基因區(qū)或非編碼區(qū)的編號和核苷酸序列不必與SAD B19或PV株的相同，但這些區(qū)域的上述特征明確定義了其在任何RV株的基因組中的定位。
一種從有毒的親本RV株得到減毒的RV的方法是向編碼病毒蛋白的ORF中引入插入和/或缺失，例如使病毒蛋白對宿主細胞附著和膜融合的活性得以改變，如減低。已知改變RV的跨膜糖蛋白G的氨基酸序列對RV的致病性有明顯影響。另外對于減毒來說，基質(zhì)(M)蛋白中的變化也可影響G蛋白的構(gòu)象，致使病毒減毒。因此，這里優(yōu)選在編碼G或M蛋白的ORF中含有缺失或插入的突變體RV。
本發(fā)明也包括僅能夠感染一個循環(huán)，然后復(fù)制的感染性復(fù)制性狂犬病病毒突變體。其優(yōu)點解釋如下雖然一般說來已證明重組活疫苗是安全有效的，但存在該疫苗病毒擴散到更易感染此病毒的其它動物的危險。
因此，出于政治、道德和部分科學(xué)的原因，非常不愿允許在此領(lǐng)域中使用重組病毒。
特別是，管理當(dāng)局對于遺傳改造的疫苗病毒，特別是表達外源基因的活病毒的風(fēng)險評價研究中，這些病毒擴散到環(huán)境中的可能性是一個非常重要的方面。
因此，認識到強烈期望有這樣的狂犬病病毒疫苗，它顯示出活病毒疫苗的所有優(yōu)點，但其被限于接種動物而不會擴散。
通過例如編碼M(基質(zhì))蛋白的M-基因突變可制得這種病毒。M-蛋白在病毒組裝中起主要作用，另外它還影響糖蛋白G的摻入和構(gòu)象。
當(dāng)缺乏功能性M-蛋白的M(-)突變體在反式產(chǎn)生M-蛋白的遺傳工程細胞中生長時，產(chǎn)生完整的病毒顆粒，關(guān)于其對于它們的天然宿主的感染性特征而言，它們的行為象野生型病毒。但一旦它們已感染了宿主細胞，它們不可能產(chǎn)生新的感染性病毒，因為它們?nèi)狈铣蒑-蛋白的遺傳信息。
所以它們保持留在宿主中。下面將討論這種病毒的優(yōu)點。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案涉及在編碼基質(zhì)蛋白M的開放閱讀框架中的插入和/或缺失，以形成無功能的基質(zhì)蛋白M，或甚至不存在基質(zhì)蛋白M。具有無功能基質(zhì)蛋白M或無基質(zhì)蛋白M的M(-)突變病毒必須在提供反式補充的基質(zhì)蛋白M的細胞中生長，以在表型上互補此病毒。
另外，可通過G-基因突變制得這種病毒。如前所述，G蛋白在感染早期，在細胞附著和膜融合過程中起主要作用。
通過插入和/或缺失(或甚至缺失整個G-基因)突變G-基因，可能致使G-突變病毒由于糖蛋白G嚴重損壞(甚至不存在)而不能再成功地感染其它細胞。這種突變體以下稱為G-負(G--)突變體。
因此，這種G-基因突變比前述突變(僅導(dǎo)致毒力減弱)更嚴重真正的G-突變體不具有感染性，因為其缺乏功能性糖蛋白G。
如果這種G-突變體在G蛋白互補的重組宿主細胞中生長，所釋放的后代病毒的表型為G-正，但其基因型為G-負。
這些病毒與G-正病毒相比有重要的優(yōu)點一方面是它們有能力感染非互補宿主細胞，因為它們在膜中具有G-蛋白，在被感染細胞中，G-突變病毒象野生型病毒一樣復(fù)制。這樣的優(yōu)點是包括克隆在重組病毒中的異源基因的整個病毒基因組增殖，象野生型病毒那樣，編碼基因組產(chǎn)物將被表達。
但另一方面，可在宿主中形成無感染性子代病毒，因為一般宿主細胞不合成G-蛋白，突變病毒本身為G-負基因型。
因此，被G-突變病毒感染的動物不會向環(huán)境中擴散感染性病毒。這使得G-突變體(以及以上討論的M(-)突變體)作為疫苗的基礎(chǔ)是非常安全的。
另外，本發(fā)明的G-突變體可用其它非狂犬病的已知起細胞附著作用的糖蛋白表型互補。
因為已知從病毒膜伸出進入環(huán)境的糖蛋白決定細胞特異性，所以通過選擇適當(dāng)?shù)幕パa糖蛋白，可以將重組的感染性狂犬病病毒突變體定向于特異的細胞，而不是狂犬病的天然宿主細胞。
這些糖蛋白以下將稱為“糖蛋白G類似物”，以表明它們象糖蛋白G一樣參與細胞特異性附著。
應(yīng)注意，在某些病毒中決定細胞特異性的“糖蛋白G類似物”不是糖蛋白，而是非糖基代的蛋白質(zhì)。很清楚，這些蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，編碼糖蛋白G的開放閱讀框架中的插入和/或缺失造成無功能的糖蛋白G，或甚至不存在糖蛋白G。此具有無功能糖蛋白G或無糖蛋白G的G(-)突變病毒必須在能反式提供糖蛋白G類似物的細胞中生長，以表型互補此病毒。
在本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案中，用于互補的糖蛋白類似物為狂犬病病毒糖蛋白G本身。
具有糖蛋白G的重組感染性狂犬病病毒具有幾個重要的優(yōu)點a)根據(jù)所選用的糖蛋白G類似物的靶點，可將它們特異性地定向于某些細胞、器官或宿主。
這意味著例如可以特異性地定向于呼吸道或消化道。因此例如可在預(yù)定位點得到粘膜反應(yīng)。
另外，可定向于免疫系統(tǒng)的特異細胞。
b)如上所述，它們另外可作為編碼非狂犬病病原體的表位的外源遺傳信息的載體。
另外，它們可作為編碼毒性物質(zhì)的外源遺傳信息的載體。
本發(fā)明的病毒的一個非常重要的應(yīng)用是用既具有a)的糖蛋白G類似物，又有b)的外源遺傳信息的病毒得到的。
根據(jù)本發(fā)明可以得到這樣的重組的感染性狂犬病病毒，其定向于一般被非狂犬病病毒所侵襲的特異細胞型，同時帶有非狂犬病病毒的免疫保護性決定簇。
這種病毒在宿主內(nèi)誘導(dǎo)對非狂犬病病毒的免疫，而同時非常安全，因為它缺少糖蛋白G類似物的遺傳信息。
本發(fā)明的另一個重要的實施方案是例如通過與HIV gp 120基因型互補定向于CD 4-細胞(代表HIV的靶細胞)的本發(fā)明的病毒，其中HIV gp 120可能編碼一種細胞毒性蛋白質(zhì)。
這種病毒將選擇性地攻擊CD4-細胞，一旦進入這些細胞中，將將其殺死。
另外，本發(fā)明的重組感染性狂犬病病毒可提供現(xiàn)在還沒有安全活疫苗的有毒的致病病毒的非常安全的疫苗通過以BRSV糖蛋白G類似物互補定向于如牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的天然靶細胞，表達BRSV的免疫保護性表位的、重組感染性狂犬病病毒，成為對此疾病的非常安全的疫苗。
副流感病毒疫苗面臨著與BRSV-疫苗相同的問題。因此，具有副流感糖蛋白G類似物，還有副流感病毒免疫原性表位的，重組感染性狂犬病病毒提供抗此疾病的良好的安全的疫苗。
基于重組感染性病毒的其它重要的獸用疫苗，可通過向重組狂犬病病毒中引入下列病毒的免疫原性決定簇而制得i)環(huán)曲病毒；馬、牛和豬的環(huán)曲病毒，ii)冠狀病毒；牛、狗、豬和貓的冠狀病毒，特別是其刺突蛋白。
因此，本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方案是用糖蛋白G類似物互補的，帶有編碼病原病毒或微生物的表位或多肽的異源核酸序列的，重組感染性狂犬病病毒糖蛋白G(-)突變體。
另外，改變RV復(fù)制酶或轉(zhuǎn)錄酶的酶活性使其活性降低，從而產(chǎn)生對宿主動物感染性小的病毒顆粒，從而達到RV的減毒。因為RV聚合酶活性涉及N，P和L蛋白，本發(fā)明也包括在編碼N，P或L蛋白的ORF中有插入或缺失的RV突變體。
為了區(qū)別(血清學(xué)上)施用了含有所述RV突變體的疫苗的宿主和被親本RV感染的宿主，也用本發(fā)明的RV缺失和/或插入突變體接種宿主。在本發(fā)明的這一實施方案中，RV插入突變體中的插入可編碼一種能夠在接種宿主中激發(fā)非-RV免疫應(yīng)答的異源表位，或者可編碼一種有酶活性的蛋白質(zhì)，如CAT或lac Z(Conzel-mann and Schnell，1994，參看上文)。摻入這種插入的優(yōu)選區(qū)域是RV假基因區(qū)。如實施例中所講明的，可在此區(qū)進行插入和缺失，而不會干擾RV的基本功能，如感染或復(fù)制所必需的那些功能。RV缺失突變體可缺少某RV蛋白的一表位，該表位一般在接種后將引起免疫反應(yīng)，特別是在編碼G蛋白的ORF中含缺失的RV突變體適用于此目的。在RV插入突變體中，插入包含編碼血清學(xué)標記抗原或其表位的核酸序列。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供能夠表達特定的病原體的一個或多個不同的異源表位或多肽的RV突變體。這種突變體可用于接種動物(家養(yǎng)或非家養(yǎng)動物)，以抵抗野生動物狂犬病和所述病原體。
用這種活載體疫苗接種后，首先在接種的宿主中復(fù)制RV突變體，在體內(nèi)表達異源表位或多肽以及RV多肽。在接種宿主中所表達的多肽然后將激發(fā)抗RV和特定病原體兩者的免疫應(yīng)答。如果來自特定病原體的異源多肽能刺激保護性免疫應(yīng)答，用本發(fā)明的RV突變體接種的動物將對隨后此病原體的感染以及RV的感染免疫。因此，將異源校酸序列插入RV基因組的適當(dāng)區(qū)域，可在體內(nèi)連續(xù)表達，產(chǎn)生對此病原體的有效的、安全和持久的免疫。
具體講，本發(fā)明提供包括編碼特定病原體的表位或多肽的核酸序列的插入的RV載體，其中插入在假基因區(qū)。
如果需要，可從上述RV載體中缺失部分或全部假基因區(qū)。
希望將優(yōu)選的編碼犬微小病毒、犬冠狀病毒和傳統(tǒng)的豬熱瘟病毒(CSFV)的表位或多肽的核酸序列摻入RV基因組的適當(dāng)區(qū)域。
迄今為止還不可能在DNA水平上用重組DNA技術(shù)操作RV的不分節(jié)段的負鏈RNA基因組，因為不能產(chǎn)生感染性復(fù)制性病毒。但現(xiàn)提供一種方法，它允許在DNA水平用重組DNA技術(shù)在病毒基因組的編碼區(qū)或非編碼區(qū)產(chǎn)生突變，然后產(chǎn)生在其基因組中帶有突變的感染性可復(fù)制RV。本發(fā)明的這種方法包括以下步驟a)向表達RNA聚合酶的細胞中引入1)一種或多種編碼RVN，P和L蛋白的DNA分子，及2)含RV cDNA基因組的DNA分子和b)從細胞中分離所產(chǎn)生的病毒。
一般，通過在基因組中引入突變來改造狂犬病病毒基因組的cDNA。
但此方法還用于如純化污染的RV庫。這種情況下，將使用原始的未突變的cDNA。
由于含異源插入的標準的RV微小基因組使用編碼蛋白的質(zhì)粒的拯救效率極低，并且與插入長度相關(guān)(Conzelmann和Schnell，1994，參見上文)，不能期望通過與編碼RVN，P和L蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可以從轉(zhuǎn)染的全長基因組RNA開始有效感染。因為預(yù)期與同時被表達的負鏈基因組RNA轉(zhuǎn)錄體雜交從編碼轉(zhuǎn)染蛋白的質(zhì)粒產(chǎn)生了大量正義的N，P和L特異RNA，所以以上情況更可能發(fā)生。但這種能與大半基因組進行的可能的雜交，干擾關(guān)鍵的包裝步驟。另外還可能影響N，P和LmRNA的翻譯。實際上，發(fā)現(xiàn)用標準轉(zhuǎn)染實驗得不到感染性病毒。但如實施例中所述，使用別的轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)合使用產(chǎn)生正鏈反基因組RNA轉(zhuǎn)錄體的RV cDNA基因組，可產(chǎn)生可復(fù)制的遺傳工程RV。
上述方法使得可以在體外用重組DNA技術(shù)在親本RV基因組中引入突變，然后產(chǎn)生帶有所述突變的感染性復(fù)制性RV突變體。該突變包括但不限于在親本RV基因組的編碼RV蛋白的ORF、非編碼區(qū)如假基因區(qū)、或轉(zhuǎn)錄信號序列中插入、缺失或取代核酸殘基。
在非編碼的基因間區(qū)中的突變操作可影響特異病毒基因的轉(zhuǎn)錄，使mRNA的轉(zhuǎn)錄和隨后蛋白質(zhì)的翻譯減低。(其中蛋白質(zhì)可為包膜蛋白如M和G蛋白，或涉及聚合酶活性的蛋白如N，P或L蛋白)使生成的突變體具有減毒的特征，因為此突變體產(chǎn)生感染性子代病毒的能力減低了。特別是，在基因間區(qū)和/或轉(zhuǎn)錄信號序列中取代一個或多個核酸殘基可影響轉(zhuǎn)錄的效率。
另外，應(yīng)用此處所描述的方法，在毒性RV的基因組中涉及毒力的區(qū)域(如編碼G蛋白的ORF)中，取代一個或多個核酸殘基也是本發(fā)明的一部分。
這種突變可引起RV毒株的G蛋白中單個氨基酸的置換，導(dǎo)致(部分)喪失致病性，例如Arg(333)用Ile，Glu或Gln代替，或Leu(132)由Phe或Trp代替。
在本發(fā)明的方法中，含有RV遺傳信息的DNA分子優(yōu)選包含提供適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄啟動子和終止子序列的質(zhì)粒，所述序列可被轉(zhuǎn)染宿主細胞共同表達的聚合酶所識別。
本發(fā)明的一個優(yōu)選方法包括使用RV DNA轉(zhuǎn)染的宿主細胞，所述細胞能夠表達噬菌體T7 DNA依賴性RNA聚合物，例如從牛痘病毒重組子胞漿中表達。在此例中，含RV DNA的質(zhì)粒含有T7啟動子和終止子序列(Conzelmann和schnell，1994，參見上文)。
為了制備活疫苗，本發(fā)明的重組RV突變體可在來自例如BHK或人二倍體細胞的細胞培養(yǎng)物上生長。通過收集組織細胞培養(yǎng)液和/或細胞，可收獲這樣生長后的病毒?？蓪⒒钜呙缰苽涑蓱乙盒问?，或冷凍干燥。
除致免疫有效量的重組RV外，疫苗可含有藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明中有用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的實例包括穩(wěn)定劑如SPGA，碳水化合物(如，山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，蛋白質(zhì)如牛血清或脫脂奶和緩沖液(如磷酸緩沖液)。
任選地，可向疫苗中加入一種或多種具有佐劑活性的化合物。適宜的佐劑的實例有氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁，油乳液(如Bay-ol F或Marcol 52的乳液)，皂素或維生素E溶解液。
有用的給藥劑量將根據(jù)接種的脯乳動物類型、年齡、體重和給藥方式而變化。劑量可在廣泛的范圍內(nèi)變化如102-107pfu/個動物可能是適宜劑量。具體劑量例如為約106pfu/個動物。
本發(fā)明的RV突變體還可用于制備滅活疫苗。
至于動物的給藥，可能過特別是口服、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)途徑給以本發(fā)明的RV突變體。
本發(fā)明的RV疫苗可施用于狗，但還可施用于主要媒介動物，即浣熊、臭鼬和狐貍。另外，還希望用能夠表達豬病原體如傳統(tǒng)豬熱瘟病毒的異源基因的活RV載體來接種野豬。
實施例1感染性復(fù)制性RV病毒顆粒的制備全長RV cDNA的構(gòu)建(圖2)狂犬病毒SAD B 19株全基因組cDNA的克隆以前已描述過(Conzelmann等，1990，上述；GenBank登記號M31046)。這里所用的狂犬病毒核苷酸和氨基酸編號與Conzelmann等，1990(上述)的相對應(yīng)。使用含有狂犬病毒微小基因組的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pSDI—1(Conzelmann和Schmell，1994，上述)作為SAD B19全長DNA克隆構(gòu)建的基礎(chǔ)(圖2)。pSDI—1含有SDA B19的3’和5’末端(分別為SAD B 19核苷酸1～68和11760—11928)，它們插入到T7 RNA聚合酶啟動子和丁型肝炎病毒反基因組核酶序列之間。為了構(gòu)建可產(chǎn)生正鏈的SDI—1轉(zhuǎn)錄本的質(zhì)粒(PSDI—1+)，利用一11個堿基的引物(5’—ACGCTTAACAA—3’)通過PCR技術(shù)擴增pSDI—1中的狂犬病毒序列，由于狂犬病毒基因組末端的互補性，所用該引物與正義和反義病毒RNA的5’末端都對應(yīng)。將合成的帶有后跟3個G殘基(劃線)的T7啟動子序列的EcoRI/平端銜接子(T7/3)(5’—AATTCC TGCAGTAA TACGACT CAC-TATAGGG—3’)部分連接到擴增的狂犬病毒序列后，連接產(chǎn)物被克隆到pX8dT的EcoRI/Smal位點上。質(zhì)粒pX8dT是從pBluescipt II(Stratagene)缺失含有原T7啟動子的多克隆位點的BssH II/ClaI片段衍生而來的。該質(zhì)粒在SmaI位點上含有84堿基的HDV反基因組核酶序列，緊隨其后在BamHI位點上克隆了T7轉(zhuǎn)錄終止子序列。含有正義狂犬病毒序列上游的T7啟動子的結(jié)構(gòu)通過限制內(nèi)切酶分析和測序進行了鑒定。然后pSDI—1的MunI/BglII片段(SAD B19核苷酸40—48)被來自不同的SAD B19 cD-NA克隆的三個片段(MunI—SphI(SAD B19核苷酸40～482，來自pZAD 1—9)；SphI—AatII(4041～4273來自PSDAD 13)，和AatII-BglII(11472—11759來自pSAD85))組裝在pBluescript II所形成的1 kb MunI/BglII cDNA所替換產(chǎn)生pSDI—1170。SphI片段是由克隆pSAD 25和pSAD13經(jīng)NcoI位點組裝而成(SAD B19核苷酸482—4041)，AatII片段是由克隆pSAD 49和pSAD 85經(jīng)XhoI位點組裝而成(SAD B19核苷酸4273～11472)，將這兩個片段插入到pSDI—1170的SphI和AatII特異酶切位點上，從而最終構(gòu)建了基本的全長克隆pSAD L16。利用環(huán)狀質(zhì)粒進行體外轉(zhuǎn)錄并用變性瓊脂糖凝膠對產(chǎn)物進行分析。RNA轉(zhuǎn)錄本與12kb狂犬病毒基因組RNA的共遷移說明了T7聚合酶轉(zhuǎn)錄了全長反基因組RNA。感染性重組狂犬病毒的回收如Conzelmann和Schnell，1994(上述)所述進行質(zhì)粒pSADL16和編碼狂犬病毒N、P和L蛋白的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染實驗的進行如先前所述?？寺〉腂SR，細胞BHK—21在直徑3.2cm的培養(yǎng)皿中以添加10％小牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，直到80％細胞交會，用重組牛痘病毒v TF7-3以m.o.i5來感染(Fours等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 83，8122-8126，1986)。處理一小時后，用不含小牛血清的培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染試劑盒(stratagene；CaPO4法)，按照產(chǎn)品指導(dǎo)，用含5μg pT7T-N，5μg pT7T-P和25μg pT7T-L的混合物，及用2μg pSAD-L16質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染4小時后移去沉淀并洗滌細胞并培養(yǎng)在含10％小牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基中。來自T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄本的pSAD-L16可能的衣殼化和來自核衣殼的狂犬病毒蛋白的表達結(jié)果可通過間接熒光法檢測。運用抗只能由重組狂犬病基因組表達的狂犬病毒G蛋白的單殼降抗體來篩選培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染一天后對細胞染色，證實來自狂犬病毒基因組的基團的表達。但在一系列20個轉(zhuǎn)染實驗中只發(fā)現(xiàn)一個陽性細胞。無熒光的細胞病灶表明這些實驗中能得到感染性病毒。而且兩天后從用轉(zhuǎn)染細胞的完全上清液培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物中均不能回收到感染性病毒。因此，為了分離由轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生的假定為小量的感染性病毒，修正的實驗方法。為了分離病毒轉(zhuǎn)染子，細胞和上清液在轉(zhuǎn)染兩天后收集。細胞用橡膠淀帚刮起并懸浮在上清中。懸液經(jīng)三次凍融(-70℃/37℃，每次5分鐘)。細胞碎片和這一條件下過剩的牛痘病毒形成的聚合體可通過10,000g離心10分鐘沉淀下來。全部上清用于培養(yǎng)一培養(yǎng)四中匯合單層細胞。培養(yǎng)兩小時后，用2ml新鮮培養(yǎng)基代替上清液。感染一兩天后，可以觀察到由牛痘病毒引起的細胞病變作用(cpe)。10,000g離心后，平均只能觀察到十個空斑。沒有產(chǎn)生可檢測的細胞病變作用的細胞RV病毒感染可在感染一兩天后，用抗N偶聯(lián)物(centocore)對整個單層細胞進行直接免疫熒光染色加以證實。在20個實驗中的兩個發(fā)現(xiàn)有熒光病灶，并且每個上清液中都含有感染性狂犬病毒(SAD L16)，假定這些病毒是由cDNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染子病毒。
將有病灶的培養(yǎng)物一半上清10000g離心后用于第二次傳代，根據(jù)狂犬病毒感染的程度，在以后的傳代中(每兩天一次)，減少使用上清的量。為了完全除去牛痘病毒，全部細胞都感染的培養(yǎng)物上清液(第三次傳代)14,000g 10分鐘離心兩次。接著將最終的上清液用滅菌的MILEX—VV 0.1μm的過濾單位(Millipore Pro-ducs，Bedford，MA01730)過濾后，用以產(chǎn)生高滴度的重組狂犬病毒。
后面的轉(zhuǎn)染和分離方法用于下面的實施例中。實施例2在RV假基因區(qū)插入寡核苷酸ψ的操作在含有pSAD L16的2.8kb xhoI-ScaI片段即SADB19核苷酸3823至6668的亞克隆pPSiX8上進行。改造過的pPsix8質(zhì)粒的StuI片段被分離后用于替換全長克隆pSAD L16(圖1)中的相應(yīng)片段(SAD B19)位置4014到6364)。用Hind III降解pPdix8，用Klenow酶補平突出端并重連以實現(xiàn)在ψ內(nèi)插入4個核苷酸，并產(chǎn)生一個新的NheI位點。通過重復(fù)核苷酸5338到5341，使最終的全長克隆pSAD U2與SAD L16相區(qū)別。
將轉(zhuǎn)感細胞連同上清液的抽提物轉(zhuǎn)入到新鮮細胞后，可證明有感染性病毒產(chǎn)生。在一個實驗中可以觀察到病灶的形成。通過轉(zhuǎn)移上清液到新鮮細胞中兩次，將轉(zhuǎn)染子病毒(克隆SAD U2—13和SAD U2—32)轉(zhuǎn)代，幾乎100％細胞感染。為了證實在SAD U2病毒基因組中的插入，從SAD U2—13感染的細胞中提取分離總RNA并進行ψ的逆轉(zhuǎn)錄酶—PCR(RT—PCR)實驗。應(yīng)用引物G3P和L4M(圖1)，它們分別對G和L基因特異，可以從轉(zhuǎn)染了病毒SAD U2和SAD L16及標準狂犬病毒SAD B19的基因組中得到約730bp的DNA片段。但接著發(fā)現(xiàn)只有從SAD B19和SADL16得到的PCR DNA可以用Hind III酶解，而從SAD U2來的PCR DNA則不行。相反，只有從SAD U2來的DNA可以用NheI酶切，產(chǎn)生兩個分別約為530和200bp的片段(圖3)。對轉(zhuǎn)染子病毒SAD U2的基因組RNA直接RT測序進一步證實了在預(yù)定的位點上存在預(yù)期的4個殘基的插入，同是測定的序列的其余部分與原SAD B19基因組相對應(yīng)。因此，顯而易見SAD U2病毒為基因組來自于改造過的cDNA的轉(zhuǎn)染子病毒。
靠近狂犬病毒ψ區(qū)未端引入4個額外的核苷酸既不影響轉(zhuǎn)染子病毒SAD U2的活力，又不干擾正常的G mRNA轉(zhuǎn)錄終止。實施例3通過G和L編碼區(qū)之間的插入和缺失改變狂犬病毒的轉(zhuǎn)錄用Sty1和Hind III雙酶切，Klenow補平并重新連接，缺失396個堿基(SAD B19核苷酸4942到5337)，最終的結(jié)構(gòu)為pSADW9。為了構(gòu)建pSAD V*，從pSAD 13(Conzelmamm等，1990，上述)中分離到包括SAD B19 N/P順反子邊界區(qū)的一個180 bpBglII-AsuII片段。該片段包括N編碼區(qū)的97個核苷酸，全部的3’端非編碼區(qū)和由N轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷化信號、基因間區(qū)及包括轉(zhuǎn)錄起始信號的P順反子的前16個核苷酸組成的N/P順反子邊界區(qū)。該片段用Klenow酶(pNigP-180)補平3’端退縮性末端后亞克隆到pBluescript的EcoRI位點上。用HindIII/XbaI從pNigP上酶切并制成平端，得到一含有狂犬病毒插入，旁側(cè)分別帶有載體序列的16和34bp，將該片段克隆到pPsiX8補平的Sty1位點上。與pSAD L16相比，最終的全長結(jié)構(gòu)(pSAD V*)帶有一234 bp的插入。
如前述，pSAD W9和pSAD V*每一個去轉(zhuǎn)染二十個培養(yǎng)平皿，隨后從三個SAD V*轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物和一個SAD W9轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中分離到活病毒，表明病毒存活。連續(xù)五次傳代后，從感染的細胞和上清液中分離到RNA，使用與前述實驗中相同的引物通過RT—PCR進行分析。與標準的SAD B19病毒相比，用SAD V*所感染細胞的RNA產(chǎn)生的0.9kb的增大的DNA片段，因此表明這一轉(zhuǎn)染子病毒的ψ區(qū)存在插入序列(圖4)。相反，從SAD W9感染的細胞的RNA，只能得到0.3kb的DNA片段；這一大小與在cDNA基因組拷貝中造成缺失是一致的。PCR產(chǎn)物的測序進一步證實了起初改造的cDNA序列已被拯救到SAD V*和SAD W9轉(zhuǎn)染子病毒的基因組中。因此，在G開放讀碼框架和ψ區(qū)間存在包括50個載體序列核苷酸的插入序列和整個ψ區(qū)的缺失對轉(zhuǎn)染子狂犬病毒的感染能力和繁殖都沒有影響。以某種方式設(shè)計了SAD V*和SADW9基因組中的遺傳改造，造成在轉(zhuǎn)錄行為中的表型改變，研究這是否影響每個轉(zhuǎn)染衛(wèi)病毒的生長特征。但是感染性SAD V*和SADW9在細胞培養(yǎng)物中的繁殖以及最終滴度都與標準的SAD B19 RV的相似。用0.01的m.o.i感染3天后，上清液中SAD B19、SADV*和SAD W9的滴度都達到108病灶形成單位(ffu)，這說明狂犬病毒ψ區(qū)對細胞培養(yǎng)中的繁殖是不重要的。
使用ψ區(qū)特異性探針，沒有檢測到與來自ψ—缺失的SAD W9病毒感染的細胞的RNA發(fā)生雜交。但其它病毒的基因組RNA及SAD B19和SAD L16的GmRNA都能通過這一探針找到，而SADV*GmRNA無反應(yīng)。相反，一個弱的RNA帶表明與新的額外的ψ—mRNA大小相一致，這被在SAD V*ψ序列的前面一額外的P基因轉(zhuǎn)錄起始信號的存在所預(yù)測。與天然存在的狂犬病毒相反，轉(zhuǎn)染子病毒SAD V*是一基因組含有六個功能性順反子的狂犬病毒。實施例4重組狂犬病毒中外源蛋白編碼基因的表達用Klenow酶產(chǎn)生平端后，將實施例3所述的含有N/P順反子交界區(qū)、旁側(cè)帶有多限制性酶切位點的230 bp cDNA片段引入到全長cDNA pSAD L16的假基因區(qū)的Bst XI位點上(SAD B19位置4995)。形成的cDNA pSAD V作為引入細菌氯霉素—2酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的基礎(chǔ)。為了得到pSAD X CAT，將pCM7(Pharma-cia)帶有完整的CAT編碼區(qū)的0.8kb DNA片段克隆到在N/P順反子交界區(qū)假基因序列上游含有的pSAD V的AsuII位點上。為了構(gòu)建pSAD VCAT，將AsuII位點和靠近假基因序列末端的HindIII位點(SAD B19位置5337)間的cDNA的缺失，并經(jīng)過Klenow酶產(chǎn)生平末端后用pCMT的編碼CAT的Hidn III DNA取代。因此，重組體RV SAD XCAT的轉(zhuǎn)錄本應(yīng)該產(chǎn)生帶有假基因序列作為非翻譯的3’區(qū)的CAT mRNA，而SAD VCAT應(yīng)該轉(zhuǎn)錄成一沒有假基因序列的CAT mRNA。
分別如實施例1所述，轉(zhuǎn)染編碼RV N，P和L蛋白的質(zhì)粒和pSAD—XCAT，及pSAD-VCAT，以拯救重組狂犬病毒。除去牛痘病毒后，通過Northern雜交分析重組體RV的轉(zhuǎn)錄方式。兩種病毒都轉(zhuǎn)錄了預(yù)期大小和組成的CAT mRNA(圖5)。通過標準的CAT分析(Conze-lmann和Schnell，1994，上述)，在兩種病毒感染的細胞中，分別測定了CAT酶活性的表達。發(fā)現(xiàn)兩個都有效地表達了CAT酶活的表達。發(fā)現(xiàn)兩個都有效地表達了CAT。細胞培養(yǎng)連續(xù)轉(zhuǎn)代中，細胞表現(xiàn)出導(dǎo)入的外源序列是遺傳穩(wěn)定的。既使經(jīng)過40次轉(zhuǎn)代，兩種病毒都有效地表達CAT(圖6)。為了檢測在感染的動物中重組子病毒的表達和行為，又進行了另外的實驗。六周成年小鼠(每組五只)分別腦內(nèi)注射104ffu的SAD VCAT，SADXCAT和標準序列RV SAD L16。注射后七天，所有動物都表現(xiàn)出典型的狂犬病癥狀，在下一周內(nèi)死于狂犬病。分別用SAD VCAT和SADXCAT感染的小鼠腦部都證實有CAT活性。從小鼠腦部和表達CAT的細胞培養(yǎng)中這兩種病毒都可以被再分離到。因此，外源基因可以導(dǎo)入到感染性RV的基因組中并被穩(wěn)定表達，還可用作區(qū)分重組子病毒的標記。實施例5異種病毒的抗原在重組RV中的表達及誘導(dǎo)對RV和異種病毒的免疫應(yīng)答典型的豬熱瘟病毒(CSFV)基因組編碼三個結(jié)構(gòu)糖蛋白(E0，E1和E2)。CSFV感染的動物，其中和抗體是針對E2的，而E0誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，如實施例4所述，分別用CSFV Alfort株的包含E2和E0蛋白編碼區(qū)的cDNA替換位于pSADV的AsuII位點和Hind III位點間的假基因區(qū)。重組病毒(分別為SAD—VE0和SAD—VE2)如實施例1所述從轉(zhuǎn)染實驗中回收。在感染細胞中，病毒分別表達CSFV E0蛋白和CSFV E2蛋白(圖7)。
通過口服，用重組病毒SAD VE0和SAD VE2免疫豬。標準的狐餌常用于加入減毒的RV SAD B19株口服免疫狐鋰，將狐餌分別加入107 pfu的SAD—VE0、SAD—VE2和SAD B19。每種制備物分兩份餌喂給每組的兩頭豬(豬#1和#2SAD VE0，#3和#4，SAD B19，#5和#6，SAD VE2)。免疫四周后，分析抗RV和CS-FV的中和抗體。除了#5外，所有豬都有RV中和抗體(滴度＞250)，證明攝入了疫苗餌。因此不再考查豬5。豬#6產(chǎn)生滴度＞16的CSFV中和抗體。如同所料，豬#1到4沒有產(chǎn)生CSFV中和抗體。免疫后第五周用107pfu的CSFV Alfort株鼻內(nèi)攻擊。攻擊后，監(jiān)測豬的白細胞數(shù)和體溫，分別示于圖8和9中。所有的豬開始發(fā)熱，但豬#1，和#2還有#6很快恢復(fù)。對照動物#4有典型的CSFV癥狀，死于攻擊后的第十五天，對照#3在21天時死亡。喂以SAD VE2的豬產(chǎn)生CSFV中和抗體，及接受SADVE0或SADVE2的豬的部分保護，都證實了通過口服應(yīng)用，可由重組RV活疫苗誘導(dǎo)對兩異種病毒產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答。實施例6通過在G基因序列中引入突變產(chǎn)生減毒RV為了產(chǎn)生一比標準病毒SAD B19繁殖能力低的病毒構(gòu)建了具有突變的G蛋白的重組體。
為這一目的，編碼G蛋白的最后46個氨基酸的序列被缺失。首先編碼G蛋白的質(zhì)粒pT7T-G(Conzelmann和Schnell，1994，上述)用Afl III(SAD B19序列的位置4752)和EcoRV(后一個位點位于質(zhì)粒多克隆位點)消化，用Klonow酶產(chǎn)生平端。連接得到的Afl III和EcoEV末端在前Afl III序列處形成一個翻譯終止密碼子。用帶有修飾區(qū)的0.3kb DNA PuMI-SmaI片段替代pSAD16真正的PpuMI-BstXI片段4469—4995。這一操作使得編碼G蛋白胞質(zhì)區(qū)尾部的羧基端46個氨基酸的SAD B19核苷酸4753～4995和一部分假基因序列缺失。另一結(jié)果是將18個來自載體的核苷酸引入到新的G翻譯終止子的緊下游。
如實驗例1所述，回收重組RV(SAD DCD)。如同所料，用SAD DCD感染的細胞表達了一截短的G蛋白(圖10)。與標準序列病毒SAD L16相比，m.o.i為1的SAD DCD病毒感染的細胞所得病毒滴度要低100倍，而且觀察到其在細胞培養(yǎng)物中傳播速度下降(圖11)，表明G蛋白的截短降低了病毒顆粒的裝配或細胞感染能力。為了分析SAD DCD在被感染動物中的行為，對5只小鼠腦內(nèi)注射105ffu的SAD DCD，以同樣劑量的SAD L16注射給5只小鼠。實施例7通過反式互補產(chǎn)生狂犬病病毒G—突變體為了使整個G蛋白編碼區(qū)從RV基因組中缺失，應(yīng)用了全長克隆pSAD UE(實施例2)。這一克隆因在G基因3’端非翻譯區(qū)存在一NheI特異酶切位點(SAD B19位置5339)而與pSAD L16相區(qū)別。用PflMI對pSAD U2進行部分酶切(SAD位置3176)，用NheI作完全酶切，接著用Klenow酶補齊后再連接，從而除去一包括SAD B19 3177～5339核苷酸的cDNA片段。形成的克隆pSAD dG用于轉(zhuǎn)染實驗以拯救重組病毒。但險了編碼N、P和L蛋白的質(zhì)粒外，編碼G蛋白的質(zhì)粒也與pSAD dG共轉(zhuǎn)染，以互補病毒基因組G缺失。
通過Northern印跡實驗分析SAD dG的RNA轉(zhuǎn)錄本。用N特異性探針雜交后，發(fā)現(xiàn)SAD dG基因組比狂犬病毒wt基因組相當(dāng)小，表明了2.1kb的cDNA缺失。但包括全部G編碼區(qū)的探針不能與SAD dG RNA雜交，證明其缺少G編碼序列(圖12)。通過RT—PCR和測序進一步對缺失進行鑒定。
表型互補的SAD dG能感染非互補的BSR細胞，并復(fù)制其基因組，表達基因組編碼的基因。但它不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒，因此，感染不能傳播到其它細胞，或通過培養(yǎng)物上清液的傳代傳遞給其它細胞。實施例8異種糖蛋白對G突變體的互補將病毒定向于特異細胞為了證明異種表面蛋白可有效地摻入到重組病毒的包膜中，如實施例7中對于狂犬病病毒G所述方法，G—突變SAD dG通過重組病毒糖蛋白互補，產(chǎn)生了含有來自Mokola病毒(狂犬病毒屬的另一成員)、棒狀病毒料水泡性口炎病毒(VSV；New Jersey血清型，水泡病毒屬)及人免疫缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV—I，NL—43株)的刺突蛋白的感染性假病毒顆粒。
Mokla和VSV—G蛋白轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達和用SAD dG感染細胞將形成感染性假型病毒。但與狂犬病毒G和密切相關(guān)的Mokola病毒G相比，發(fā)現(xiàn)VSV—G的滴度下降(104/ml對106/ml)。用狂犬病毒G蛋白的相應(yīng)區(qū)取代VSV—G的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)序列后，產(chǎn)生106感染性顆粒，說明RVG的胞質(zhì)區(qū)引導(dǎo)蛋白進入病毒包膜。
沒有發(fā)現(xiàn)含有HIV gp120(gp120/40)刺突的假型顆粒的產(chǎn)生。相反，通過表達由HIV gp的外膜和跨膜區(qū)融合到RV G的胞質(zhì)區(qū)而組成的嵌合蛋白的表達，從而產(chǎn)生RV(HIV)假型。這證實了G蛋白的胞質(zhì)區(qū)與刺突蛋白有效地摻入到棒狀病毒的包膜相關(guān)。RV(HIV)假型顆粒成功地感染表達人CD4表面蛋白(T4+細胞)的Vero細胞，而不感染表達CD8的對照細胞(T8+細胞)(細胞來自AIDS Research and Reference Reagant Programme)。該假型病毒擁有HIV的宿主范圍和細胞特異性。


圖1狂犬病毒假基因區(qū)(ψ)的組成及重組的狂犬病毒基因組的構(gòu)建(按比例繪制)。數(shù)字表示SAD B19反基因組序列中核苷酸的位置。上方所示為具有五個開放閱框架的狂犬病毒的全基因組。在含有部分基因組(3823—6668)的pSsiX8中進行突變，并通過StuI片段(4014—6364)的交換重新引入到pSAD L16全序列克隆上。在詳圖中，灰框表示編碼區(qū)，黑線表示非編碼區(qū)。實心豎條(終止和多聚腺苷化)和箭頭(mRAN轉(zhuǎn)錄起始)表示功能性轉(zhuǎn)錄信號序列。代表ψ區(qū)起始的非功能性信號類似序列用空心豎條表示。箭號表示用來做ψ區(qū)RT—PCR分析的寡聚核苷酸引物G3P系L4M的位置。在SAD U2，補平Hind III的突出端導(dǎo)致了四個核苷酸的插入，從而產(chǎn)生一個獨特的NheI位點。在SAD V*中，含有狂犬病毒N/P順反子邊緣(SAD B19核苷酸1323—1502)的cDNA片段被插入到Sty1位點；SAD W9中StyI/Hind III片段缺失。圖2含有全長狂犬病毒cDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒構(gòu)建的簡單示意。數(shù)字表示SAD B19狂犬病毒反基因組序列的核苷酸的位置(Conzel-mann et al，1990)。質(zhì)粒pSDI-1+是pSDI-1(Conzelmann和Schnell，1994)的復(fù)本，作為重建全長狂犬病毒基因組DNA的基礎(chǔ)。pSDI-1中含有SDI—1狂犬病毒微小基因組，后者包括分別與T7 RNA聚合酶啟動子(T7)和丁型肝炎病毒反基因組核酶序列(HDV)有關(guān)的末端核苷酸1—68和相反方向的11760—11928。pSDI-1+的MunI-BglII片段用由所示的三個SAD B19 cDNA克隆裝配成的1kb cDNA片段代替。從兩個cDNA克隆組裝成3.6kbSphI和7.2kb AatII片段的插入可產(chǎn)生含全長SAD B19 cDNA的最終的質(zhì)粒pSAD L16。用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄這個質(zhì)粒，可得到正鏈(反基因組的)RNA，其中5’端有三個額外的非病毒G殘基，核酶自溶后有一精確的3’末端。T7表示T7啟動子；T7T表示T7轉(zhuǎn)錄終止子；HDV表示HDV反基因組核酶序列。圖3轉(zhuǎn)染子病毒SAD U2基因組中遺傳標記的顯示。用標準的RV SAD B19(B19)和轉(zhuǎn)染子病毒SAD L16(L16)和SAD U2(U2)感染細胞兩天后，分離全RNA，用來作RT—PCR以擴增ψ區(qū)，引物為G3P和L4M。擴增的DNA直接用1％瓊脂糖凝膠分離，然后分別用Hind III和NheI酶切。NheI限制性酶切位點只存在于由SAD U2而得到的DNA中。M表示DNA大小標識。圖4SAD B19(B19)，SAD V*(V*)和SAD W9(W9)基因組的PCR分析。RT—PCR在如圖3中所描述用G3P和L4M作引物來進行。擴增產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中分離。圖5重組的RV轉(zhuǎn)錄的CAT mRNA的圖示用SAD L16(L16)，SAD XCAT(X6)和SAD VCAT(VC18)感染的細胞中提取的全RNA的Northern印跡，分別用對G基因(G)，假基因(Y)和CAT基因特異的探針雜交。左側(cè)所示為病毒基因組(V)和特定的mRNA。SAD XCAT轉(zhuǎn)錄的mRNA中含有CAT和假基因序列(“CAYT”)，而SAD VCAT缺少假基因序列，轉(zhuǎn)錄的mRNA(“CAT”)中只含有CAT序列。RNA大小標識單位為kb。圖6細胞培養(yǎng)多次傳代后，SAD XCAT和SAD CVAT的CAT活性。細胞用經(jīng)過特定傳代的病毒感染(傳代數(shù)如所示)，感染后兩天，用等量的細胞抽提物來分析CAT活性。在電泳槽“—”中分析SAD L16感染的細胞抽提物。圖7重組的RV中E0和E2蛋白的表達細胞分別用SAD VE0(分離物1，2，3)和SAD VE2(分離物a，b，c)感染。兩天后，細胞抽提物在還原條件下用PAA膠分離，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。分別和抗CSFV E0和E2蛋白的單克隆抗體一起孵育后，接著再與偶聯(lián)有堿性磷酸酯酶的第二抗體孵育，加入底物，X射線膠片曝光后，蛋白顯現(xiàn)。桿狀病毒表達和純化的E0和E2蛋白用作對照。此外，用CSFV(V)感染的細胞抽提物作為比較。圖8用SAD VE0(#1和2)，SAD VE2(#6)和標準狂犬病毒SAD B19(#3和#4)免疫并用CSVF攻擊后的豬的白細胞，所給出的白細胞的量是攻擊前(0天)絕對數(shù)字的百分比。*C#1，攻擊后10天沒做，估計值。圖9CSFV攻擊后豬的體溫(0天)a.以SAD VE0免疫的動物(#1和#2)到第11天輕度發(fā)熱(#1)或無發(fā)熱(#2)。以SAD B19(#3和#4)免疫的兩組照組動物表現(xiàn)長期的高熱。#4在攻擊后第15天由于癥狀嚴重死于典型的豬瘟，#3在攻擊后21天死亡。
b.以SAD E2免疫的動物在第6至8天輕度發(fā)熱。對照同a。圖10感染SAD DCD的細胞中截短的G蛋白的表達。用SAD DCD或SADL16以m.o.i.為1感染BSR細胞，并在感染后16小時以50μci的[35S]甲硫氨酸標記3小時。細胞提取物同抗狂犬病毒G單克隆抗體培育，免疫沉淀樣品或以PNGaseF(+PF)消化以闡明蛋白骨架；或模擬處理(-)以證明糖基化蛋白。+TM感染細胞在標記前和標記的三小時間在2μg/ml衣霉素存在下分別溫育90分鐘。用10％SDS—PAGE分離蛋白質(zhì)，放射自顯影觀察。細胞提取物分析同上。L16SAD L16病毒；ΔCDSAD DCD突變病毒。M蛋白大小標識。圖11SAD L16和SAD DCD在細胞培養(yǎng)中的擴散。分別用SAD L16(L16)和SAD DCD(DCD)以0.05m.o.i感染培養(yǎng)細胞，在感染后指定的時間以抗狂犬病毒N蛋白的偶聯(lián)物(Centocor)通過直接免疫熒光進行分析?？梢杂^察到感染SAD DCD的細胞對鄰近細胞發(fā)生較慢的感染擴散。圖12SAD dG(實施例7)和SAD dCD(實施例6)專一性RNA的分析。以1個m.o.i用SAD L16(例1)，SAD dCD(ΔCD)和表型互補的SAD dG病毒(ΔG)感染BSR細胞，兩天后分離總RNA并以Northern雜交分析。正如以上N基因特異性探針(A)雜交所顯示的，SAD dG的基因組明顯小于標準的狂犬病毒基因組(V)，反映出G基因2.1 kb的缺失，包括整個G蛋白編碼序列的探針不能和SAD dG RNA雜交。比標準狂犬病毒GmRNA短的GmRNA(G)的生成說明了SAD dCD基因組胞質(zhì)區(qū)編碼區(qū)小的缺失，V基因組RNA；N，G單順反子mRNA；N＋P，M＋G，G＋L雙順反mRNA。圖13G-突變SAD dG的不擴散性用表型互補的SAD dG感染BSR細胞，感染36小時后用免疫熒光鏡檢分析。在(A)中，用抗N蛋白FI TC偶聯(lián)抗體(Cento-core)與細胞孵育后顯示N蛋白的表達。只有單個細胞被感染，沒發(fā)現(xiàn)病毒傳播到附近的細胞。(B)以G特異性抗體作對照。圖14
用以產(chǎn)生RV(HIV)假型病毒顆粒的功能性HIV/RV嵌合糖蛋白的組成。除了緊接跨膜區(qū)下游的三個氨基酸外，整個HIV—NL43 gp160胞質(zhì)區(qū)被完整的RV—G胞質(zhì)區(qū)所取代?！皃”代表脯氨酸殘基，它不存在于親本蛋白質(zhì)中。胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)序列用斜線(/)分開。
權(quán)利要求
1.一種遺傳工程產(chǎn)生的感染性復(fù)制性不分節(jié)段負鏈RNA病毒突變體，其包括在病毒基因組的開放閱讀柜架、假基因區(qū)或基因間區(qū)中的插入和/或缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的病毒突變體，其特征為該突變體在假基區(qū)含有插入和/或缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的病毒突變體，共特征為該病毒突變體在開放閱讀框架中含有插入和/或缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的病毒突變體，其特征為該病毒突變體在編碼基質(zhì)蛋白或其類似物的開放閱讀框架中含有插入和/或缺失，導(dǎo)致功能性基質(zhì)蛋白的缺失，所述的突變體與基質(zhì)蛋白表型互補。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的病毒突變體，其特征為該病毒突體在編碼糖蛋白G的開放閱讀框架中含有插入和/或缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的病毒突變體，其特征為插入和/或缺失導(dǎo)致缺少功能性糖蛋白G，所述突變體與糖蛋白G類似物表型互補。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的病毒突變體，其特征為糖蛋白G類似物是指狂犬病糖蛋白G。
8.根據(jù)權(quán)利要求1－7之一的病毒突變體，其特征為其攜帶有編碼致病病毒或微生物的表位或多肽的異源核酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1－8之一的病毒突變體，其特征為該病毒突變體屬于副粘病毒科。
10.根據(jù)權(quán)利要求1－8之一的病毒突變體，其特征為該病毒突變體屬于棒狀病毒科。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的病毒突變體，其特征為該病毒突變體為狂犬病毒。
12.一種用以預(yù)防哺乳動物由不分節(jié)段的負鏈RNA病毒引起的感染的疫苗，其特征為該疫苗包括權(quán)利要求1－11之一的病毒突變體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
13.感染性復(fù)制性不分節(jié)段的負鏈RNA病毒的制備方法，其包括以下步驟a)向一表達RNA聚合酶的宿主細胞中導(dǎo)入1)編碼病毒N，P和L蛋白或其類似物的一種或多種DNA分子；及2)含有不分節(jié)段的負鏈RNA病毒基因組的cDNA的DNA分子，及b)分離由細胞產(chǎn)生的病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒基因組的cDNA通過導(dǎo)入突變加以改造。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其特征為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒cDNA基因組的轉(zhuǎn)錄本為正鏈反基因組RNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求13－15之一的方法，其特征為RNA聚合酶是優(yōu)選從重組牛痘病毒表達的T7 RNA聚合酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求13－16之一的方法，其特征為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒基因組是從副粘病毒科中得到的。
18.根據(jù)權(quán)利要求13－16之一的方法，其特征為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒基因組是從棒狀病毒科中得到的。
19.根據(jù)權(quán)利說明18的方法，其特征為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒基因組是從狂犬病毒中得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供了完全從cDNA克隆中產(chǎn)生感染性復(fù)制性不分節(jié)段的負鏈RNA病毒的方法。這一方法提供了通過重組DNA技術(shù)將突變引入該病毒基因組中的可能性。
文檔編號C07K14/16GK1121959SQ9510895
公開日1996年5月8日 申請日期1995年7月18日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月18日
發(fā)明者K·K·松澤曼 申請人:阿克佐諾貝爾公司