專利名稱：得到經(jīng)過修飾降低了鼠抗體可變區(qū)之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有免疫球蛋白的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及得到經(jīng)過修飾降低了鼠抗體可變區(qū)之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有這些免疫球蛋白的組合物。
免疫系統(tǒng)產(chǎn)生以高親和力和特異性與很大范圍的抗原結(jié)合并激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞機(jī)制的抗體。醫(yī)學(xué)中已將抗體用作診斷和治療劑，并且隨著新技術(shù)的出現(xiàn)而成功地提高了它們的應(yīng)用潛力。
雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用得以分離產(chǎn)生單一特異性抗體的細(xì)胞系(Koehler G.，Milstein C.(1975)，Natare(London)256，495—497)，并且基因技術(shù)允許自雜交瘤構(gòu)建一系列工程化抗體。
抗體的區(qū)域結(jié)構(gòu)有利于對(duì)抗體進(jìn)行工程化改造，并且通過得到或丟失其某些性質(zhì)而進(jìn)一步改善許多抗體的實(shí)用性?？贵w的抗原結(jié)構(gòu)特性提供了識(shí)別功能，并可將其連接到一種或多種效應(yīng)劑上。然后則必須基于效力、特異性和免疫原性標(biāo)準(zhǔn)來檢驗(yàn)抗體是否同時(shí)具有這兩種性質(zhì)。
已很容易從被免疫的嚙齒動(dòng)物得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。目前已將幾種鼠單克隆抗體廣泛用于惡性腫瘤的影像診斷和治療、抗中毒性休克預(yù)防給藥、修飾移植物排斥部分，以及緩解急性炎癥反應(yīng)。在使用嚙齒動(dòng)物抗體進(jìn)行治療的大多數(shù)病例中，接受者體內(nèi)都引發(fā)了針對(duì)抗體的免疫反應(yīng)。這些反應(yīng)已限制了治療期限和效果。
雖然存在幾種選擇，例如使用SCID—hu小鼠、體外免疫、重組的文庫，或這些方法的某些有用結(jié)合，但因?yàn)橛性S多已明確鑒定的嚙齒動(dòng)物單克隆抗體已可以得到(如果能夠排除免疫反應(yīng)，即可將其用于臨床)，所以開發(fā)人來源的相似制劑的努力已受到挫拆，而生產(chǎn)工程化改造的抗體則引起了很大關(guān)注。
已設(shè)計(jì)了工程化抗體，以盡可能地用等同的人序列取代外源序列。在基團(tuán)工程化抗體中，大都是將來自不同種的免疫球蛋白的片段連接在一起的嵌合抗體。
首先，構(gòu)建了包含與人恒定區(qū)融合之嚙齒動(dòng)物可變區(qū)的嵌合抗體。特別是小鼠/人嵌合抗體因表現(xiàn)出同樣的特異性，但與其小鼠對(duì)應(yīng)物相比又降低了免疫原性，故可用于免疫治療。下列參考文獻(xiàn)描述了嵌合抗體技術(shù)Lobuglio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220—4224(1989)；美國專利4,816,567；PCT國際公開WO 87/02671(1987年5月7日)；歐洲專利公開255,694(1988，2，10)；歐洲專利公開274,394(1988年7月13日)；歐洲專利公開323,806(1989年7月12日)；PCT國際專利公開WO89/00999(1989年2月9日)；歐洲專利公開327,000(1989年8月9日)；歐洲專利公開328,404(1989年8月16日)和歐洲專利公開332,424(1989年9月12日)。
值得注意的是，用人等同物取代恒定區(qū)也可能不降低它們的免疫原性，而仍有大約一半的接受者產(chǎn)生了對(duì)嚙齒動(dòng)物可變區(qū)的免疫反應(yīng)。因此，已廣泛地操作嚙齒動(dòng)物抗體，以使之更加相似于人抗體。
已實(shí)現(xiàn)的進(jìn)一步降低嵌合抗體之免疫原性的方法是，首先只將嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))移植到人框架區(qū)上，然后再與適當(dāng)?shù)暮愣▍^(qū)融合(Jones et al.，Nature 321522—525(1986))。這樣完成CDR移植的方法常常產(chǎn)生不完善的人抗體，即是說所得到的抗體失去了親和性，或者在保留其原有親和性的嘗試中，許多鼠框架殘基已取代了相應(yīng)的被選擇之人框架的殘基(Winter，歐洲專利申請(qǐng)，239,400；Riechmann，et al.，Nature332323—327(1988))。
就鑒定用于轉(zhuǎn)移的最小數(shù)目的殘基，以達(dá)到對(duì)免疫原性有最小潛在影響的有用結(jié)合親和性這一目的來說，已經(jīng)發(fā)展了許多戰(zhàn)略，但從所顯示的結(jié)果看，每個(gè)戰(zhàn)略都只在重建親本親和性中取得一定程度上的成功。
雖然也已發(fā)現(xiàn)某些鄰近框架殘基參予抗原結(jié)合，但主要還是根據(jù)CDR的結(jié)構(gòu)和相對(duì)變位來確定抗體結(jié)合位點(diǎn)的配基結(jié)合特性(Davies et al.，Ann.Rev.Biochem.59439—473(1990))。因此，如果能夠嚴(yán)格地保留其CDR結(jié)構(gòu)及某些鄰近殘基、它們彼此間的相互作用，以及它們與可變區(qū)的相互反應(yīng)，便可以維持抗體的精確特異性。
Padlan(Padlan，歐洲專利申請(qǐng)0519596A1；Padlan，Molecular Immunology 28489—498(1991))提出了抗體人源化的進(jìn)一步方法，該方法是基于蛋白質(zhì)的抗原性取決于其表面的性質(zhì)，并且其中在嚙齒動(dòng)物可變區(qū)中許多可接近溶劑的殘基被人抗體的殘基所取代這一事實(shí)。通過觀察人抗體KOL和鼠抗體J539的高分辨率X射線結(jié)構(gòu)來鑒定這些殘基的定位。通過鑒定最大同源性抗體群實(shí)現(xiàn)對(duì)人表面殘基的選擇。
蛋白質(zhì)表面的性質(zhì)對(duì)于其被抗原加工細(xì)胞，特別是抗原特異性B細(xì)胞識(shí)別和在這些細(xì)胞中內(nèi)在化都是很重要的，由T細(xì)胞識(shí)別特定線性結(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白質(zhì)的免疫原性也是很重要的。
已建立了幾組鑒定在輔助T細(xì)胞抗原肽的MHC限制中起作用的序列特征和結(jié)構(gòu)性決定基的計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析方法(Berssofskyetal.，The Journal of Immunology 1382213—2229(1987)；Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952(1987)；Reyeset al，The Journal of Biological Chemistry 26412854—12858(1989))。使用這些計(jì)算方法有可能鑒定推測(cè)的T細(xì)胞提呈肽。
分析已知原子結(jié)構(gòu)的抗體已闡明了抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列與三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系(Chothia et al.，J.Biol.Chem.196901—917(1987))。這種關(guān)系揭示，在VH區(qū)中除第三區(qū)域外，結(jié)合位點(diǎn)環(huán)還具有小數(shù)目的主鏈構(gòu)象之一，即“典型結(jié)構(gòu)”(“CanonicalStructures”)。在特定環(huán)中形成的典型結(jié)構(gòu)是根據(jù)其大小和在環(huán)與骨架區(qū)中的關(guān)鍵位點(diǎn)上存在某些殘基而確定的。
已將一個(gè)附加的骨架殘基亞組定義為“游標(biāo)”帶，其可能調(diào)整CDR結(jié)構(gòu)并精調(diào)與抗原的配合性(Foot et al.，J.Mol.Biol.224487—499(1992))。取代這些殘基已顯示對(duì)于恢復(fù)CDR移動(dòng)抗體的親和性是很重要的。因此游標(biāo)帶對(duì)于設(shè)計(jì)人源化抗體有著明顯的意義。
因此，本發(fā)明的目的是提供將一種哺乳動(dòng)物的單克隆抗體轉(zhuǎn)化為另一個(gè)種的單克隆抗體的方法。另一個(gè)目的是推測(cè)可變區(qū)序列上的潛在的T抗原決定基。另一個(gè)目的是鑒定負(fù)責(zé)T免疫原性的單克隆抗體序列上，負(fù)責(zé)種特異性或免疫原性的氨基酸殘基。再一個(gè)目的是用第二個(gè)種的T抗原決定基序列上的氨基酸殘基取代第一個(gè)種的T抗原決定基序列上的氨基酸殘基，從而使第一個(gè)種的抗體在第二個(gè)種中不再有免疫原性。再一個(gè)目的只在重和輕鏈的框架區(qū)中而不在互補(bǔ)決定區(qū)中造成取代，屬于游標(biāo)帶的氨基酸和參予典型結(jié)構(gòu)的氨基酸可不被取代。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供摻入取代氨基酸殘基的新的DNA序列。再一個(gè)目的是提供含有改變了抗體之DNA序列的載體。再一個(gè)目的是用含有被修飾的抗體之DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。
公開了一種鑒定和取代T細(xì)胞抗原序列的獨(dú)特方法，該方法將第一種哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白抗原性轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙N哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白抗原性。該方法將同時(shí)改變免疫原性并嚴(yán)格保留配基結(jié)合性質(zhì)。審慎地取代可變區(qū)的T細(xì)胞抗原序列上的那些與三維結(jié)構(gòu)未牽連的氨基酸殘基，沒有影響配基結(jié)合性質(zhì)但大大改變了免疫原性。


圖1推測(cè)的IOR egf—IOR EGF—R3單克隆抗體之可變區(qū)的氨基酸序列。
(a)可變區(qū)κ輕鏈。
(b)可變區(qū)重輕鏈。
互補(bǔ)決定區(qū)已被劃下線并用粗體鉛字表示。
圖2和3對(duì)抗體IOR egf—R3重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR egf—R3單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白之可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR egf—R3可變區(qū)的序列。
陰影部分推測(cè)的T細(xì)胞抗原序列。
加下線的氨基酸殘基參予三級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸。
粗體鉛字互補(bǔ)決定區(qū)。
方框中的氨基酸殘基提議的取代。
對(duì)于重鏈和輕鏈的描述同上。
圖4mAB IOR egf—R3可變區(qū)的分子模型。
以直方圖展示分子模型，其中VH在右邊并且比VL暗。該模型顯示了鼠殘基的側(cè)鏈，這些殘基經(jīng)過突變以使預(yù)測(cè)的兩親和性片段人源化。
圖5通過RRA檢測(cè)嵌合和突變IOR egf—R3與EGF—R的結(jié)合。
以不同濃度的純化的鼠IOR egf—R3(—■—)、嵌合IOR egf—R3(+)和突變VHR3/muR3VK(—*—)進(jìn)行抗原結(jié)合活性檢測(cè)，并將結(jié)合的125I—EGF的CPM數(shù)對(duì)各抗體濃度的對(duì)數(shù)作圖(以ELISA法定量IgG的濃度)。
圖6用鼠IOR egf—R3、嵌合IOR egf—R3和突變體IOREGF—R3免疫猴。
縱座標(biāo)405nm吸光率。
橫座標(biāo)采血的天數(shù)。
ELISA按實(shí)施例9所述步驟進(jìn)行。
箭頭指示每種MAb各注射2mg的間隔時(shí)間。
使用的血清稀釋度為1/10,000。
圖7和8對(duì)抗體IOR—T1的重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR—T1單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR—T1抗體可變區(qū)的序列。
各標(biāo)號(hào)的意義同圖2。
對(duì)重鏈和輕鏈的描述同上。
圖9和10對(duì)抗體IOR—CEA1重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR—CEA1單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR—CEA1抗體可變區(qū)的序列。
各標(biāo)號(hào)的意義同圖2。
對(duì)重鏈和輕鏈的描述同上。
本發(fā)明涉及降低嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的免疫原性，同時(shí)又在整體上保留其配基結(jié)合特性的方法。因?yàn)槊庖咔虻鞍椎目乖匀Q于其序列上T細(xì)胞抗原肽的存在，故可經(jīng)取代包括不同于通常見于另一種哺乳動(dòng)物抗體中的T細(xì)胞抗原序列上的殘基，來降低異種或同種異體抗體的免疫原性。
殘基的取代并不包括參予到典型結(jié)構(gòu)或游標(biāo)帶(VernierZone)中的殘基。這種殘基的適宜取代沒有影響結(jié)構(gòu)決定基或區(qū)域內(nèi)接觸，因此，配基結(jié)合性質(zhì)沒有因只限于可變區(qū)框架殘基的改變而受到影響。
(1)可變區(qū)同源性的分析本方法中使用了由Kabat等人(“Sequence of ProteinsofImmunological Interest”Fifth edition Bethesda，Maryland；National Inst.of Health，1994)收集的人抗體可變區(qū)的序列資料。
第一步驟中，將第一種動(dòng)物即小鼠的重或輕鏈可變區(qū)與第二種動(dòng)物即人的相應(yīng)可變區(qū)進(jìn)行比較。預(yù)定本發(fā)明將允許對(duì)任何種動(dòng)物的抗體進(jìn)行抗原改變。
借助自動(dòng)化計(jì)算機(jī)分析方法(PC—DOS HIBIO PROSIS 06—00，Hitachi)進(jìn)行比較。然后將最同源的人可變區(qū)殘基與相應(yīng)的小鼠可變區(qū)殘基相比較。如此也將確定與各小鼠序列更加相類似的人可變區(qū)亞組。
(2)T—抗原決定基的預(yù)測(cè)第二步驟中，分析小鼠和人的兩同源可變區(qū)序列，以便預(yù)測(cè)T抗原序列。
AMPHI計(jì)算程序(Bersofsky el al.，The JournalofImmunology 1382213—2229，(1987))用于預(yù)測(cè)a螺旋序列。SOHHA計(jì)算程序則推測(cè)螺旋疏水性的條帶(Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952，(1987))。這些計(jì)算程序可預(yù)測(cè)抗原蛋白質(zhì)的T細(xì)胞提呈片段。
(3)對(duì)免疫原性降低的分析用人對(duì)應(yīng)物中存在的殘基取代小鼠框架中不同于其人對(duì)應(yīng)物的那些殘基。發(fā)生這種變換只是涉及那些存在于T抗原序列上的殘基。
最后，取代負(fù)責(zé)典型結(jié)構(gòu)的那些殘基或卷入游標(biāo)帶中的那些殘基可能對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)有重要影響。因此，它們不能被包括在該取代中。有關(guān)所提議的取代對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)合位點(diǎn)的影響的附加信息，可從可變區(qū)的分子模型中獲得。
在運(yùn)行UNIX和利用分子模型包“QUANTA”(Polygen corp)的Silicon Graphics Iris 4D工作站構(gòu)建所說的分子模型。
(4)構(gòu)建和表達(dá)被改變之抗體的方法使用下述方法制備將第一種哺乳動(dòng)物，小鼠mAb輕和重鏈的CDR摻入第二種哺乳動(dòng)物人中的重組DNA序列，呈現(xiàn)可用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的框架，以表達(dá)有較小免疫原性并有該動(dòng)物單克隆抗體之抗原特異性的重組抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步包括構(gòu)建和表達(dá)經(jīng)修飾的抗體的方法，該方法包括a)誘變并組裝包括CDR和FR區(qū)域的可變區(qū)。較好地使用PGR誘變方法(Kamman et al.，Nucleic Acids Res，175404—5409，(1989))以在不同的位置引入改變。
b)制備包括一個(gè)可變區(qū)和相應(yīng)的人恒定區(qū)的表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后即導(dǎo)致分泌足可供親和性和特異性檢測(cè)的蛋白質(zhì)。
c)將重和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中。約兩周后，用ELISA方法分析細(xì)胞上清液中有無人IgG產(chǎn)生。然后用任何已知方法分析樣品中能夠與特異性抗原結(jié)合的人IgG。
本發(fā)明提供了將動(dòng)物單克隆抗體的CDR摻入似乎為天然人免疫球蛋白的框架中，從而使所得重組抗體在用于人時(shí)只有微弱免疫原性或無免疫原性的方法。當(dāng)用于治療目的時(shí)，重組體免疫球蛋白被較好識(shí)別為自身蛋白質(zhì)。因?yàn)橹亟M體抗體在給人使用時(shí)將是有微弱免疫原性的或無免疫原性的，所以該方法可使重組抗體作為治療劑使用。
本發(fā)明還期望包括任何動(dòng)物單克隆抗體向提供適當(dāng)框架區(qū)之顯現(xiàn)重組人的單克隆抗體的重組轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明意欲包括任何動(dòng)物免疫球蛋白向顯現(xiàn)人的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)化。另外還試圖使顯現(xiàn)人的免疫球蛋白不合有κ或λ輕鏈，或者下列任何重鏈異型(α、σ、ε、γ和μ)之一。
下列實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1測(cè)得的IOR egf—R3單克隆抗體DNA序列的鼠可變區(qū)按Faloro等人(Faloro，J.et al.，Methods in Enzymology65718—749(1989))所述方法從大約106個(gè)R3(抗表皮生長因子受體)雜交瘤細(xì)胞中提取胞漿RNA。
cDNA合成反應(yīng)混合物由5μgRNA、50mM TrisHCl pH7.5、75mMKCl、10mMDTT、3mMMCl2、25pmol重鏈可變區(qū)的CG2AFOR引物(5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3′)或輕鏈可變區(qū)的CK2FOR引物(5′GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3′)、各250μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、15U核糖核酸酶抑制劑(RNA保護(hù)劑，Pharmacia)組成，總體積50μl。樣品于70℃加熱10分鐘并經(jīng)30分鐘緩慢冷卻至37℃。然后加入100單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)并于37℃持續(xù)保溫1小時(shí)。
使用Orlandi等人(Orlandi，R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))所述PCR擴(kuò)增VH和VKcDNA。用于VH的PCR擴(kuò)增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CG2A FOR (5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3′)和VH1BACK引物(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′組成。用VK的PCR擴(kuò)增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CK2 FOR (5’GGAAGCTTGAAGATGGATA C AGTTGGTGCAGC3’)和KIOBACK(5’TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3’)引物組成。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10X嗜熱酶(thermolase)緩沖液成分和1單位嗜熱酶(IBI)，終體積為50μl。樣品在94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘進(jìn)行25次熱循環(huán)，并于72℃持續(xù)保溫5分鐘。在Prep.A Gene純化藥盒(BioRad)上純化擴(kuò)增的VH和VK DNA。
將純化的VH和VK cDNA克隆到M13載體中。使用T7DNA Pol(Pharmacia)經(jīng)二脫氧方法測(cè)定克隆的序列。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例2嵌合基因的構(gòu)建我們使用擴(kuò)增VH的VH1 BACK(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′)和VH1FOR(5′TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′)引物，和用于擴(kuò)增VK的VK3 BACK(5′GACATTCAGCTGACCCA3′)與VK3FOR(5′GTTAGATCTCCAGTTTGGTGCT3′)引物，經(jīng)PCR再次擴(kuò)增cDNA。用Pst I和BstEII消化VH基因的擴(kuò)增的cDNA，或用PvuII和Bg1II消化VK基因的擴(kuò)增的cDNA。將消化的片段克隆到M13—VHPCR1(用PstI和BstEII消化過的)中或M13—VKPCR1(用PvuII和Bc1I消化過的)中。有關(guān)這些載體詳見Orlandi等人的報(bào)導(dǎo)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))。經(jīng)序列分析直接鑒定含有可變區(qū)基因的M13VHPCR—R3和M13VKPCR—R3。
經(jīng)用HindIII和BamHI消化，從M13載體上切掉VH基因連同Ig重鏈啟動(dòng)子、適用的切接位點(diǎn)及信號(hào)肽序列，并克隆到表達(dá)載體(pSVgpt)中。然后加進(jìn)作為BamH I片段的人IgG1恒定區(qū)(Takahashi，N.et al.，Cell 29718—749(1982)。所得到的構(gòu)建體是R3VH—pSVgpt。R3VK—pSVhyg的構(gòu)建方法基本相同，不同的是用潮霉素抗性基因取代gpt基因，并加入人κ鏈恒定區(qū)(Hieter，P.A.et al.，Cell 22197—207(1980))。
實(shí)施例3修飾IOR egf—R3鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列以使預(yù)測(cè)的T細(xì)胞抗原序列人源化。
根據(jù)T細(xì)胞抗原序列分析IOR egf—R3之重和輕鏈的可變區(qū)序列。使用計(jì)算機(jī)AMPHI計(jì)算程序進(jìn)行分析，推測(cè)帶有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的長度中序列11氨基酸的片段，該片段有一個(gè)疏水側(cè)和一個(gè)與MHCII分子結(jié)合的親水側(cè)。
推測(cè)重鏈可變區(qū)序列上有5個(gè)片段，它們是(使用Kabat的序列編號(hào))1.氨基酸3—13間的FR1，
2.氨基酸8—20間的FR1，3.氨基酸39—55之間的FR2和CDR2，4.氨基酸74—84間的FR3，5.氨基酸100c—110之間的FR4和CDR3。
圖2顯示相當(dāng)于重鏈的序列。
將該鼠序列與包括在GeneBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的免疫球蛋白序列相比較。確定最同源的人可變區(qū)序列并限定與小鼠序列最密切相似的人亞類序列。在這種情況下所發(fā)現(xiàn)的人序列是稱為HUMIGHVA的胎兒免疫球蛋白，其可變區(qū)與鼠免疫球蛋白IORegf—R3的FR區(qū)有75％的同源性。
然后比較人和鼠可變區(qū)序列的殘基，并選擇出那些在FR區(qū)不參予游標(biāo)帶或與典型結(jié)構(gòu)相關(guān)的殘基。因此，它們可以被在人序列上同一位置的那些殘基所改變。
最后，該分析用結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模型設(shè)計(jì)而得以充實(shí)?；谠摲肿幽Ｐ陀锌赡芟薅切_亂結(jié)合位點(diǎn)之三級(jí)結(jié)構(gòu)的取代。
對(duì)于鼠IOR egf—R3的重鏈，我們提出6處取代1.11位上的LEU被VAL取代，2.12位上的VAL被LYS取代，只有這兩處取代有可能破壞兩親性螺旋，因此推測(cè)的T抗原決定基在FR1處。
3.75位上的SER被THR取代，4.76位上的THR被SER取代，5.78位上的ALA被VAL取代，6.83位上的THR被ARG取代。
在這種情況下，取代提示在FR3中，其為人源化的。
FR2中的T細(xì)胞抗原序列包含兩個(gè)PRO，而它們?cè)诖蠖鄶?shù)螺旋抗原位點(diǎn)中是很罕見的氨基酸殘基，所以我們認(rèn)為它不是真正的T細(xì)胞抗原決定基。
在FR4的108位中出現(xiàn)存在于某些人免疫球蛋白同一位置上的THR，在人免疫球蛋白中只有109位(LEU)是很罕見的，除了這一個(gè)點(diǎn)差異處，大多數(shù)推測(cè)的T細(xì)胞抗原決定基是人的，基于此不需要對(duì)其進(jìn)行修飾。
圖3中顯示對(duì)鼠IOR egf—R3之輕鏈的分析結(jié)果。此序列中，推測(cè)相應(yīng)于CDR2和FR3的殘基52—63之間只有一個(gè)兩親性螺旋，并在這個(gè)區(qū)域中，鼠和人序列間在63位只有一個(gè)點(diǎn)差異。因?yàn)樵撌筝p鏈對(duì)人應(yīng)是非免疫原性的，故沒有提出取代(見分子模型設(shè)計(jì))。
實(shí)施例4mAb IORegf—R3 VK和VH的分子模型設(shè)計(jì)使用在150MHz Silicon Graphics Indigo Extreme工作站上運(yùn)行的分子模型設(shè)計(jì)程序QUANTA/CHARm4.0(MolecularSimulations Inc.，(1994))，組構(gòu)小鼠mAb IOR egf—R3可變區(qū)的模型。分別從Fab 26—10(Jeffrey，P.D.et al.，Proc Natl，Acad，Sci.USA，9010310(1993))和Fab36—71(Strong，R.K. et al.，Biochemistry 303739(1993))組構(gòu)VK和VH框架。Fab 26—1O和mAb IOR egf—R3在VK框架中有92％同源性，在完整VK區(qū)中有88％同源性。Fab 36—71和R3 mAb的VH框架有85％同源性。從Brookhaven Protein Data Bank(入口II G1和6FAB)取得等同物(Coordinates)。將Fab 36—70的框架對(duì)接于Fab 26—10的架上，結(jié)果只有那些已發(fā)現(xiàn)常常卷入重和輕鏈可變區(qū)間界面中的殘基相匹配(Chotia，C et al.，J.Mol.Biol.186651(1985))。然后，刪除Fab 26—10的VH區(qū)和Fab 36—71的VK區(qū)以留下必須的雜合體。按最大交迭方法(Snow，M.E.et al.，Proteins 1；267(1986))進(jìn)行側(cè)鏈取代，并且在可能時(shí)與其他結(jié)晶結(jié)構(gòu)相比較。
構(gòu)成IOR egf—R3—可變輕(VL)區(qū)(L1，L2和L3)的高可變區(qū)而保留如Fab 26—10中一樣的主鏈構(gòu)象，因兩種抗體中相應(yīng)的CDR是高度同源的，并且都屬于同一典型結(jié)構(gòu)組群(Chotia，C.etal，Nature.342877(1989))。在mAb IOR egf—R3的VH區(qū)中，CDRH1同在Fab 36—71中一樣屬于典型結(jié)構(gòu)組群1，所以保持了親代分子的主鏈扭轉(zhuǎn)角。CDR H2相當(dāng)于典型結(jié)構(gòu)組群2并且該環(huán)的主鏈構(gòu)象是從Fv片段4D5(入口IFVC)取得的，因?yàn)槠銱2環(huán)基礎(chǔ)與Fab 36—71的框架能良好匹配，所以它是從其他高分辨的結(jié)構(gòu)中選擇的。將所有上文提到的環(huán)與Data Bank中的其他CDR比較，以確定側(cè)鏈的方向。
為了構(gòu)建在mAb R3中有14氨基酸長的CDR H3模型，使用高溫度分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行構(gòu)象選擇(Bruccoler，R.E.et al.，Biopolymers，291847(1990))。首先，對(duì)沒有CDR H3的整個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理以保持被固定的殘基H—94和H—103，并對(duì)主鏈原子使用10Kcal/(mole原子A2)的諧振抑制。然后，從兩個(gè)原先固定的氨基酸開始構(gòu)成一個(gè)有隨機(jī)構(gòu)象的環(huán)。放置這些靠近框架的殘基時(shí)考慮到其他晶體結(jié)構(gòu)，并且構(gòu)成有伸展構(gòu)象的環(huán)的頂部，以避免與分子其他部分的強(qiáng)的空間作用。對(duì)于下一個(gè)模型設(shè)計(jì)步驟，只允許CDR H3和鄰近側(cè)鏈在5A°的距離內(nèi)運(yùn)動(dòng)。首先完成能量最小化，然后在800K進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)運(yùn)行150微微秒。運(yùn)行的時(shí)間間隔定為0.001微微秒，并且每100次間隔存貯協(xié)調(diào)數(shù)據(jù)。提取從動(dòng)力學(xué)運(yùn)行中得到的120個(gè)最低能量構(gòu)象，并使之受到使結(jié)構(gòu)中所有原子均可運(yùn)動(dòng)的能量最小化限制。得到幾個(gè)低能量構(gòu)象并將其中一個(gè)有最低能量者用于繼后的分析。就IOR egf—R3抗體的鼠和人變異體間的差異個(gè)別設(shè)計(jì)模型，以研究它們對(duì)CDR構(gòu)象可能產(chǎn)生的影響。
重鏈可變區(qū)中11，12(FR1)和83(FR3)位的氨基酸取代距CDR—FR邊緣足夠遠(yuǎn)，并且對(duì)結(jié)合親和性不應(yīng)有任何影響。SER75殘基指向外側(cè)，因些被THR取代對(duì)結(jié)合能力似乎并不重要。相反THR76則易受分子頂部的影響，并且可能參予與抗原的相互作用。但是由SER取代THR 76是一個(gè)保守的改變，在結(jié)合親和性上可能不會(huì)導(dǎo)致大的變化。
由VAL取代ALA 78將不需要空間重排。但VAL 78可能向前“推動(dòng)”ILE 34(HI)。一般說來，根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助的分子模型設(shè)計(jì)研究(圖4)，所提出的點(diǎn)突變不應(yīng)影響結(jié)合親和性。
對(duì)IOR EGF—R3的輕鏈可變區(qū)作同樣分析，分子模型設(shè)計(jì)表明于該區(qū)域的任何改變都是不必要的。
實(shí)施例5用PCR誘變法構(gòu)建IOR egf—R3的突變體重鏈可變區(qū)使用PCR誘變技術(shù)(Kammann，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，864220—4224(1989))構(gòu)成突變重鏈可變區(qū)氨基酸的改變。
簡單地說，經(jīng)PCR進(jìn)行兩次擴(kuò)增反應(yīng)混合物是0.5μl在M13中克隆的單股DNA的VH上清液、25pmole誘變的Oligo 1或2、25pmole誘變的Oligo 3或4引物(見下示引物序列)。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10XVent聚合酶緩沖液(NEB)的成分及1單位Vent DNA聚合酶(NEB)，終體積為50μl。樣品于94℃，30秒；50℃，30秒；75℃，1分鐘進(jìn)行12—15次熱循環(huán)；并于75℃持續(xù)保溫5分鐘。將兩次PCR的產(chǎn)物連接到第二個(gè)只使用外部引物(3和4)的PCR產(chǎn)物中。用Prep.A Gene純化試劑盒(BioRad)純化擴(kuò)增的VH DNA。
為造成FR1中由VAL和LYS分別取代LEU11和VAL12的改變，所用引物是引物15′GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG 3′引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′這些引物合用于一個(gè)PCR中。引物25′CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA 3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個(gè)PCR中。
然后，兩PCR的產(chǎn)物合用在一個(gè)使用引物3和4的PCR中。
為造成FR3中分別由THR、SER、VAL和ARG取代SER75，THR76、VAL78和THR86的改變，所設(shè)計(jì)的引物是引物15′GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT 3′，引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′。這些引物合用在一個(gè)PCR中。引物25′ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個(gè)PCR中。
然后，將兩PCR的產(chǎn)物合并在一個(gè)使用引物3和4的PCR中。
誘變后，將VH基因克隆到表達(dá)載體(pSVgpt)中產(chǎn)生質(zhì)粒IORegf—R3 mut VH—pSVgpt。
實(shí)施例6將DNA轉(zhuǎn)染到NSO細(xì)胞中用Pvu I消化后，將4μg R3VH—pSVgpt和8μg R3VK—pSVhyg(嵌合體)或R3突變體VH—pSVgpt和鼠R3Vk—pSVhyg切成線性。將DNA混合在一起，用乙醇沉淀，溶解于25μl水中。使約107個(gè)NSO細(xì)胞(大鼠骨髓瘤NSO是不分泌Ig的細(xì)胞系)生長至半會(huì)合，離心收獲細(xì)胞并連同經(jīng)消化的DNA一起重新懸浮在電穿孔容器內(nèi)的0.5ml DMEN中。在冰上放置5分鐘后，在960μF下給細(xì)胞170V的單一脈沖(Gene—Pulser，Bio—Kad)，并繼續(xù)在冰上放置30分鐘。然后將細(xì)胞倒入20ml DMEN加10％胎牛血清中并使之復(fù)原24小時(shí)。此時(shí)將細(xì)胞分配到96小井平板中并加入選擇培養(yǎng)基，14天后裸眼可見有轉(zhuǎn)染的克隆。
實(shí)施例7人IgG產(chǎn)生的定量分析用ELISA方法檢測(cè)含被轉(zhuǎn)染克隆之小井的培養(yǎng)基中存在的人抗體。用羊抗人IgG(重鏈特異性的)抗體(Sera—Lab)包被微量滴定板的小井。用PBST(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.5)洗滌后，向各小井中加入20μl在100μlPBST稀釋的從含轉(zhuǎn)化體小井中得到的培養(yǎng)基，于37℃保溫1小時(shí)。然后排空各小井，用PBST洗并加入過氧化物酶結(jié)合的羊抗人к(輕鏈特異性的)區(qū)域抗體(Sera—Lab)，37℃保溫1小時(shí)，然后排空各小井，用PBST洗并加入含鄰苯二胺的底物緩沖液。幾分鐘后加入硫酸終止反應(yīng)，并檢測(cè)492nm吸光率。
實(shí)施例8EGF受體放射配基競爭試驗(yàn)用人胎盤微粒體部分，經(jīng)同源性放射受體分析方法(RRA)(Macias，A.et al.，Interferony Biotechnologia 2115—127(1985))檢測(cè)鼠IOR egf—R，嵌合抗體和經(jīng)破壞抗原決定基T突變的抗體對(duì)與其受體結(jié)合的125I—EGF的親和常數(shù)和影響。
使用該技術(shù)檢測(cè)嵌合抗體和破壞抗原決定基T抗體的突變體結(jié)合EGF—R的能力(圖5)。兩種抗體均以如原始鼠抗體的同樣親和力(1O—9M)與EGF—R結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)已克隆了正確的小鼠可變區(qū)，并且新的抗體異型沒有影響結(jié)合。進(jìn)一步說，突變抗體中的改變并沒有影響與抗原的結(jié)合。
實(shí)施例9用鼠抗體、嵌合抗體和VH突變抗體免疫CercopithecusAethiops猴三個(gè)處理組各有2只Cercopithecus aethiops猴，各組分別用鼠IOR egf—R3 mAb、嵌合IOR egf—R3抗體和突變VH IOR egf—R3抗體免疫。在0、14、28和42天，用2mg吸附到5mg氫氧化鋁上的抗體經(jīng)皮內(nèi)注射免疫各組動(dòng)物。第—次免疫前和每次免疫后1周從所有各組動(dòng)物體內(nèi)采血，從每份樣品分離血清并于-20℃保存。以ELISA技術(shù)檢測(cè)抗鼠IOR egf—R3 mAb之抗體的滴度。
用50μl鼠IOR egf—R3單克隆抗體(在碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為10μg/ml)包被Costar平板(Inc.highbinding)，并保溫過夜。然后用PBST洗平板，用含有1％BSA的同樣緩沖液于室溫下封閉1小時(shí)。
重復(fù)洗滌步驟并加入50μl/小井不同的血清稀釋液。37℃保溫2小時(shí)后，再次洗平板并加堿性磷酸酶結(jié)合的抗人IgG Fc區(qū)域特異性抗血清(Sigma，Inc.)37C保溫1小時(shí)。用PBST洗滌后各小并加50μl底物緩沖液(在二乙醇胺緩沖液(pH9.8)中稀釋的1mg/ml對(duì)硝基苯磷酸)保溫。在ELISA記錄儀(Organon Teknika，Inc.)中讀出405nm吸光率。
當(dāng)使用該抗體作為免疫原時(shí)得到對(duì)鼠IOR egf—R3抗體的高IgG反應(yīng)。當(dāng)用嵌合抗體免疫猴時(shí)，與用突變體VH譯本免疫相反，得到較低的但仍可檢測(cè)到的抗鼠IOR egf—R3抗體的IgG反應(yīng)(1/10,000)(圖6)。用突變的VH IOR egf—R3抗體免疫二次后沒有檢測(cè)到抗體反應(yīng)，且在經(jīng)4次免疫后只測(cè)得很小的反應(yīng)(1/10,000)。
實(shí)施例10修飾IOR—T1鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列以使推測(cè)的T細(xì)胞抗原序列人源化分析IOR—T1重和輕鏈可變區(qū)序列的T細(xì)胞抗原序列。
預(yù)測(cè)了重鏈可變區(qū)上的3個(gè)片段，它們是1.氨基酸2—21間的FR—1，2.氨基酸29—43間的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，3.氨基酸97—111間的FR4、CDR3。
圖7中顯示與最同源的人序列的比較和所提出的取代，在FR1上5處，F(xiàn)R2上2處，F(xiàn)R4上2處。
對(duì)于輕鏈(圖8)以同樣方法提出下列T細(xì)胞抗原片段1.氨基酸60—65間的FR3，2.氨基酸79—90間的FR3、CDR3，3.氨基酸93—95A間的CDR3。
分析后，我們提出在FR3中的60，63，83，85和87位上的5處取代。
實(shí)施例11修飾I0R—CEA1鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列，以使推測(cè)的T細(xì)胞抗原序列人源化分析IOR—CEA1重和輕鏈可變區(qū)序列中的T細(xì)胞抗原序列。
推測(cè)重鏈可變區(qū)上的2個(gè)片段，它們是1.氨基酸1—16間的FR1，2.殘基96—110間的FR4和CDR3。
圖9中，顯示與最同源的人序列的比較，和所提出的取代，其FR1上7處(在2，3，5，6，9，10和15位)且在FR4上2處(在108和109位)。
對(duì)輕鏈作同樣分析(圖10)，提出下列T細(xì)胞抗原片段
1.氨基酸1—14間的FR1，2.氨基酸55—70間的FR3—CDR2，3.殘基74—100間的FR—3—CDR 3—FR4。
分析后，我們提出FR1中9，10，11和13位上的4處取代，F(xiàn)R3中58，60，63，70，75，76，78，81，83，85和87位上的11處取代，以及FR4中100位上的1處取代。
實(shí)施例12分析免疫球蛋白家族的可變區(qū)中的兩親性片段AMPHI程序以子程序的形式被包括在一個(gè)為閱讀和加工來自Kabat數(shù)據(jù)庫的免疫球蛋白序列而編制的程序中。在加工序列中制得下列重排—將未限定的GLX型氨基酸(可能是GLN或GLU)限定為GLN(GLN和GLU有相似的親水性(hydrofilicity)指數(shù)分別為—0.22和—0.64)。
—將未限定的ASX型氨基酸(可能是ASN或ASP，分別具有—0.60和—0.77的親水指數(shù))限定為ASN。
—其他未限定的氨基酸(序列中的空位或“奇形”符號(hào))被限定為XXX(未知)。對(duì)該氨基酸，程序AMPHI指定親水值為0.0。
該分析中不包括有5個(gè)以上未知氨基酸(XXX)的序列。
該初步分析后，用程序AMPHI處理各序列，并且對(duì)每個(gè)免疫球蛋白家族以表格形式示出所得結(jié)果。
表I至VI中顯示對(duì)6個(gè)小鼠重鏈家族的分析結(jié)果。基于那些數(shù)據(jù)，可以限定“優(yōu)勢(shì)兩親性區(qū)域”(PAR)在90％以上的可變區(qū)序列屬于每個(gè)家族。例如，比較框架結(jié)構(gòu)1(FR1)，家族I和II的PAR可限定在11和16個(gè)氨基酸殘基之間，相反，家族III和IV一般從第1個(gè)氨基酸到第30個(gè)氨基酸沒有兩親性區(qū)域。在家族V和VI中，較小的PAR可分別限定在12—14和12—15個(gè)殘基。
PAR的人源化將降低在病人體內(nèi)的免疫原性。兩親性區(qū)域群集在免疫球蛋白可變區(qū)框架中，支持所提出的方法的普遍適用性，即通過幾個(gè)點(diǎn)突變使這些預(yù)測(cè)的T細(xì)胞抗原決定基人源化。
小鼠重鏈族I名稱 5 10 1520 25 30 35 40 45 5055 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-TF5-139′CL ** ****** *** **--************* ***2-E7′CL** ****** *** **--************* *---------*******3-DFB-6l11′** ****** *** **--************* *----------******4-BALB/C121 ** ****** *** **--*************5-MOPC 450′C ** ****** *** **--************* ********** *** ***6-TF2-36′CL** **--************* ***** ********7-D35′CL ** ****** *** **--************* ** ***8-A/J GERMLI** **********--*************9-H37-92′CL** ****** *** **--*************---*****10-H37-85′CL********** *** **--*************11-36-60 CRI-** **********--******* ******12-JD31′CL ** ****** *** **--************13-H37-78′CL** ****** *** **--*************---*********14-H37-68′CL** ****** *** **--*************---*** *---------*******15-D7′CL** ****** *--*************16-42.7C.11.2*************--************ *****----------------*****17-42.BE.9.2′ *************--************ *****----------------*****18-H37-96′CL** ****** **--************* ****19-HF5.49′CL** **********--******************20-H37-24′CL** ****** *** **--*****************21-H37-42′CL***** *** *******---* *******22-42.7B3.2a′ *************--*****************---------------*****23-A10′CL ** **********--******* *******24-H37-88′CL** ****** *** **--***********25-JD21′CL *** **********--******* ******26-L69′CL ****** *** ************ **----------** ***27-VMS9′CL ********* **--****** ***********--* ***28-264″CL ********* **--****** ***********--***********29-VFM11′CL ********* **--****** ***********--* ***30-VMS2′CL ********* **--****** ********* ******31-VFM1′CL ********* ********* ******32-VMS1′CL *********** **** **** ***33-N-T151′CL****** ** *********--------*****
表2小鼠中鏈族II名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-LB8′CL ****** *-***************------------******2-DF4-29.4′ ** **** *-************ *** ***3-mAb D′CL ****** *-***************** ****4-BAT123′CL ****** *-************ *****--------------****5-35-20 ****** *-******************6-AN02*********-************7-AN02′CL*********-************8-40-120 ****** *-*************---***** ***------------*******9-40-40 ****** *-*************---***** ***------------*******10-H146-24E9** ****** *-*** ***********11-AN07′CL ** ****** *-****** *****12-40-160 ****** *********-********* ***---******------------*******13-S1.2′CL****** *-*************---***** **--------------*****14-40-140 ****** *-*** *******---***** ***------------*******15-37.1.1′CL ****** ****-************------------*****16-GAM3-2′CL ******* *-*** ****** ********------------***17-8-1-12-58′ ****** *-************ ******-------------------------*******18-S27′CL ****** *-************ **--------------*****19-AN03′CL****** ****-************ **----------******20-L11-1A1′CL ****** *-**************--******21-AN01′CL****** ****-************ *---------******22-VHIF′CL****** *-*** ****** *** **----------*****23-MOPC 315′C ****** *****-***************** *******24-MOPC315 ****** *****-************ *** *****
表3小鼠重鏈族III名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45505560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-H220-22′CL **--*** *** ********* ***2-DB1-453.2 **--*** *** ***3-H61-15′CL**--*** *** ******* ***4-1G7′CL **--*** *** ***5-NQ2 20.5.3**--*** *** ***6-E′CL **--*** *** ***7-NQ5 4.3.1′ **--*** *** ***8-NQ2 17.4.1**--*** *** ***9-H26′CL **--*** *** ***10-18G8′CL **--*** *** ****** **--------------**11-NQ5 61.1.2*** *** ****12-NQ2 48.2.2**--*** *** ***13-9G6′CL **--*** *** *** **--------------*14-3B6′CL **--*** *** ***15-2B2′CL **--*** *** ***16-F5-1419′CL **--*** *** ***17-E3′CL*** *** ***-------* ***18-20G9′CL **--*** *** ******19-3E3′CL **--*** *** ***20-12G10′CL **--*** ***21-5.4K 1y p′ **--*** ****--------**** ***22-17s.145′CL **--*** *** *** ******23-NC19FB′CL**--****** *** *** ***24-NPYI-125.3 *** **--*** *** *** *** **** ***25-NPYII-14.1 *** **--*** *** ***** ***-----------*****26-Lym-1′CL **--*** ****27-18-2-3′CL**--*** *** *********-------* *** ***28-PJ14′CL **--****** *** **** ****29-185.6′CL ******* **** *******30-185.6′CL ******* **** *******31-48.2.1′CL *** *** *** ***32-D1.3 **--****** *** *** ****33-PCG1-1′CL ***** *** **** **** *--------** ****34-F5-1336′CL **--****** *********---------**35-F5-444′CL ****--****** ****** *******--------*****36-F5-1126′CL ****--****** **********--------*****37-VD2H9′CL*** *** *** ***38-MOPC141J′CL **--****** *********---*******33-NPYII-269*** **--****** *** *****40-H220-22′CL **--*** *** *** ****** ***
表4小鼠重鏈族IV名稱51015 20 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 8085 90 95 100 1011-FAC1′CL *** ** ***2-D23′CL *********3-AB.1′CL *** ****-------------*******4-AB.2′CL *** *** *****---------*****5-JV10′CL*** *** ********6-MA-1505′CL **** *** *****-------------*****7-163.69′CL *** **-----------*******8-Mik-81(Fv) **** *** ***-----------**9-VH101′CL*** *** ***----------***10-MC101′CL*** *** ***----------***11-BPPI-6.4′C *** ***12-36.1.2D′CL *** **** ******13-36.5.7Bu′C *** **** ******
表5小鼠重鏈族V名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-HDEX31 **** ****--****** *** *** ***2-MOPC104E **** ****--****** *** *** ***3-HDEX1**** ****--****** *** ****----------******4-HDEX25 **** ****--****** *** *** ***5-HDEX4**** ****--****** *** *** *****6-HDEX7**** ****--****** *** *** ***7-HDEX5**** ****--****** *** ****----------*****8-HDEX6**** ****--****** *** *** ***9-HDEX11 **** ****--****** *** *** *****10-HDEX3**** *****--***** *** *** ***11-HDEX24 **** ****--****** *** ****----------*****12-J558 **** ****--****** *** *** ***13-HDEX37 **** ****--****** *** ****----------*****14-HDEX2**** ****--****** *** *** ***15-HDEX12 **** ****--****** *** *** ***16-414.2′CL**** ****--****** ******** ****----------*****17-262.9′CL**** ****--****** ***** *** ***18-126.33′CL **** ****--****** ***** *** ****----------*****19-9.14.7′CL *******--****** *** ***20-HDEX10 **** ****--****** *** *** ***21-HDEX14 **** ****--****** *** *** ***22-16.3′CL **** ****--****** ***** **** ***23-HDEX9**** ****--****** *** *** ***24-AC38 205.1 *******--****** *** *** ***---------******25-9.4.5′CL*******--****** *** ****--------*******26-4.1.3C4′CL *******--****** *** ******* ***27-3.2.3E5′CL *******--****** *** *** ***28-45.21.1′CL *******--****** *** ***29-4.8.1′CL*******--****** *** *** ***30-3.4.1G6′CL *******--****** *** ***31-42.5D4.2a′ *******--****** *** *** *******32-4.3F1′CL*******--****** *** ***33-37.1E5.2a′ *******--****** *** ***34-59.102.2′C *******--****** *** ***35-2.31.1′CL *******--****** *** ****---------** ***36-MRA1OH′CL **** ****--****** ******** ** *****37-165.60′CL **** ****--****** ******** ** *******38-A5.B12.1′C *******--****** *** *** **---------** ***39-A6/24′CL ****--****** *** *** **---------******40-163.72′CL******* ****--****** ******* *** ********---------******41-17s.93g′CL **** ****--****** ******** ** ***42-A20/44′CL ****--****** *** ***43-106-10E′CL ***********--****** ******** **44-I.29′CL **** **** *********--****** *** ********* ***45-L1.15′CL**** **** *********--****** ***46-HDEX8**** ****--****** *** *** ***
表6小鼠重鏈族VI名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 7580 85 90 95 10010l1-202.135′CL ******* **********--****** *** ****----------*******2-202.61′CL******* **********--****** *** *** **-----------******3-202.80′CL******* **********--****** *** *** *******4-202s.38′CL ******* **********--****** *** *** *** ***5-111.34′CL******* **********--****** *** *** ** ***6-111.109′CL********** **********--****** *** ******* *----------***7-17p.101′CL********** **********--****** *** *******---------------** ***8-C′CL ******* **********--****** *** **********9-AN11′CL ******* **********--****** ******* ***10-D44′CL **** **** **** **********--****** *** *** ***11-D14A031VH ******* **********--*********** *** ***12-AM29′CL **** ** *********** *** ******--------** ***13-AM28′CL ******* ******** *--******* *** ******--------** ***14-BWR4.H′CL*********** *** **-------------******15-D444′CL ******* *********--****** ******** **---------------******16-PL2-8′CL **** **** ***** *** ***---------*****17-PL2-3′CL ********* *** *** ***---------*****18-PL2-6′CL ********* *** *** ***---------*****19-34-28′CL ******* **********--** ******
權(quán)利要求
1.鑒定免疫球蛋白的T細(xì)胞抗原序列上哺乳動(dòng)物種特異性氨基酸殘基的差異的方法，包括a.比較第一種哺乳動(dòng)物的可變區(qū)框架氨基酸與第二種哺乳動(dòng)物的可變區(qū)的框架氨基酸；b.確定與第一種哺乳動(dòng)物最密切對(duì)應(yīng)的第二種哺乳動(dòng)物的亞群；c.確定最相似于第一種哺乳動(dòng)物序列的第二種哺乳動(dòng)物序列；d.鑒定不同于第二種哺乳動(dòng)物之氨基酸殘基的第一種哺乳動(dòng)物的氨基酸殘基，其中所說的氨基酸是在免疫球蛋白可變區(qū)中的T細(xì)胞抗原序列上；e.只鑒定不在互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)或不直接與典型結(jié)構(gòu)或游標(biāo)帶相關(guān)聯(lián)的那些氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第一種哺乳動(dòng)物是小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第二種哺乳動(dòng)物是人。
4.將具有第一種哺乳動(dòng)物之免疫原性的免疫球蛋白轉(zhuǎn)化成具有第二種哺乳動(dòng)物之免疫原性的抗體的方法，包括用按權(quán)利要求1方法鑒定的最相似的第二種哺乳動(dòng)物的相應(yīng)氨基酸殘基取代第一種哺乳動(dòng)物框架中不同于第二種哺乳動(dòng)物之氨基酸殘基的氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第一種哺乳動(dòng)物是小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第二種哺乳動(dòng)物是人。
7.一種方法，包括a.制備編碼對(duì)已知抗原有特異性的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的DNA序列，其中不同于第二種哺乳動(dòng)物同一位置上的氨基酸殘基的第一種哺乳動(dòng)物的T細(xì)胞抗原序列上的某些殘基被按權(quán)利要求1的方法鑒定的最相似的第二種哺乳動(dòng)物的相應(yīng)氨基酸殘基取代；b.將該序列插入經(jīng)操作連接到與宿主細(xì)胞相容之適當(dāng)啟動(dòng)子上的可復(fù)制的表達(dá)載體中；c.用b的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；d.培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；e.從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收經(jīng)修飾的免疫球蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中第一種哺乳動(dòng)物是小鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中第二種哺乳動(dòng)物是人。
10.一種包含對(duì)已知抗原有特異性之修飾的免疫球蛋白的組合物。
11.編碼識(shí)別EGF—R之鼠IOR—R3抗體的DNA序列。
12.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的經(jīng)修飾之嵌合IOR—R3抗體的DNA序列。
13.按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—R3抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的經(jīng)修飾的嵌合IOR—R3抗體，其重鏈框架區(qū)中有下列點(diǎn)突變FR1.11位LEU由VAL取代，12位VAL由LYS取代，F(xiàn)R3.75位SER由THR取代，76位THR由SER取代，78位ALA由VAL取代，且83位THR由ARG取代。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求13的經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的藥物組合物。
16.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體的DNA序列。
17.按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求17的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體，其兩鏈的框架區(qū)域中有下列點(diǎn)突變重鏈FR13位上LYS被GLN取代5位上VAL被LEU取代6位上GLN被GLU取代13位上LYS被GLN取代19位上LYS被ARG取代FR240位上THR被ALA取代42位上GLU被GLY取代FR4108位上THR被LEU取代109位上LEU被VAL取代輕鏈FR360位上ASP被ALA取代63位上THR被SER取代83位上LEU被PHE取代85位上GLU被VAL取代87位上PHE被TYR取代。
19.包含根據(jù)權(quán)利要求17之經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的醫(yī)藥組合物。
20.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法制得的經(jīng)修飾之嵌合IOR—CEA1抗體的DNA序列。
21.按權(quán)利要求1、4和7的方法制得的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—CEA1抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的經(jīng)修飾的嵌合IOR—CEA1抗體，其兩鏈的框架區(qū)域中有下列點(diǎn)突變重鏈FR12位上的PRO被VAL取代3位上的LYS被GLN取代5位上的LEU被VAL取代6位上的GLU被GLN取代9位上的GLY被ALA取代10位上的ASP被GLU取代15位上的GLU被GLY取代FR4108位上的THR被LEU取代109位上的LEU被VAL取代輕鏈FR19位上的LYS被SER取代10位上的PHE被THR取代11位上的SER被LEU取代13位上的THR被ALA取代FR358位上的VAL被ILE取代60位上的ASP被SER取代63位上的THR被SER取代70位上的ASP被GLU取代75位上的ILE被VAL取代76位上的SER被ILE取代78位上的VAL被LEU取代81位上的GLN被ASP取代83位上的LEU被PHE取代85位上的GLU被THR取代87位上的PHE被TYR取代FR4100位上的ALA被GLN取代。
23.包含根據(jù)權(quán)利要求21或22的經(jīng)修飾的單克隆抗體的藥物組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求13、14、17、18、21和22的經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的治療應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求13、14、17、18、21和22的經(jīng)修飾的嵌合抗體用于制造抗腫瘤藥物。
26.包括衍生于第一種哺乳動(dòng)物的重和輕鏈可變區(qū)及衍生于第二種哺乳動(dòng)物的重和輕鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體，其中在T細(xì)胞抗原序列內(nèi)重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，或兩者被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動(dòng)物之抗體相應(yīng)區(qū)域中的氨基酸序列相適應(yīng)，并除外在互補(bǔ)決定區(qū)中的修飾，以及在框架區(qū)內(nèi)典型結(jié)構(gòu)或游標(biāo)帶中的修飾。
27.包括衍生于第一種哺乳動(dòng)物的重鏈可變區(qū)和衍生于第二種哺乳動(dòng)物的重鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體重鏈，其中T細(xì)胞抗原序列內(nèi)的重鏈可變區(qū)被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動(dòng)物之抗體的相應(yīng)重鏈區(qū)域中的氨基酸序列相適應(yīng)，但除外在互補(bǔ)決定區(qū)的修飾以及在框架區(qū)內(nèi)典型結(jié)構(gòu)或游標(biāo)帶中的修飾。
28.包括衍生于第一種哺乳動(dòng)物的輕鏈可變區(qū)和衍生于第二種哺乳動(dòng)物的輕鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體輕鏈，其中T細(xì)胞抗原序列內(nèi)的輕鏈可變區(qū)被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動(dòng)物之抗體的相應(yīng)輕鏈區(qū)域中的氨基酸序列相適應(yīng)，并且其中除外在互補(bǔ)決定區(qū)中的修飾以及在框架區(qū)內(nèi)的典型結(jié)構(gòu)或游標(biāo)帶中的修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定免疫球蛋白的T細(xì)胞抗原序列上哺乳動(dòng)物種特異性氨基酸殘基的差異的方法，它包括a.比較第一種哺乳動(dòng)物和第二種哺乳動(dòng)物的可變區(qū)框架氨基酸；b.確定與第一種哺乳動(dòng)物最密切對(duì)應(yīng)的第二種哺乳動(dòng)物的亞群；c.確定最相似于第一種哺乳動(dòng)物序列的第二種哺乳動(dòng)物序列；d.鑒定不同于第二種哺乳動(dòng)物之氨基酸殘基的第一種哺乳動(dòng)物的氨基酸殘基。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1133886SQ95109148
公開日1996年10月23日 申請(qǐng)日期1995年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月30日
發(fā)明者R·P·羅德里古, C·M·德考思塔·戴里奧, J·L·瓦拉達(dá)列 申請(qǐng)人:分子免疫中心