專利名稱：一種新的抗腫瘤抗生素——云南霉素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一個新的具有抗腫瘤作用的胞嘧啶核苷二肽抗生素。
迄今已發(fā)現(xiàn)的來源于微生物的抗生素已近萬余種之多，其中許多已作為醫(yī)藥，農(nóng)藥等得到了廣泛應(yīng)用，但療效好、毒性低的抗腫瘤抗生素仍為數(shù)甚少。因此進(jìn)一步尋找理想的抗腫瘤作用的新品種仍日趨迫切。
本發(fā)明是在從云南放線菌篩選抗腫瘤抗生素的過程中，由鏈霉菌菌株2321的培養(yǎng)液中分離到具有抗腫瘤及抗菌作用的活性物質(zhì)，從該物質(zhì)的酸水解產(chǎn)物中分離得到了具有抗腫瘤作用的新抗生素2321C，定名為云南霉素(Yunnanmycin)。(該云南霉素的產(chǎn)生菌已保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，北京中關(guān)村。100050，保藏日期1995年，7月26日，編號0234)。
經(jīng)光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，確定云南霉素具有如式(1)R＝H所示結(jié)構(gòu)式，該結(jié)構(gòu)式可將云南霉素與迄今已知的胞嘧啶核苷二肽結(jié)構(gòu)的所有醫(yī)用和農(nóng)用抗生素如谷氏菌素(Gougerotin)、慶豐霉素(Qingfengmycin)及寧南霉素(Ningnanmycin)等相區(qū)別，故確認(rèn)云南霉素為一個新的抗生素。 式中R＝H(云南霉素)，R可以是K，Na，NH4及CH3，C2H5等本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)如下一.云南霉素的產(chǎn)生菌，發(fā)酵，抗菌活性及制造方法1.產(chǎn)生菌來源云南關(guān)坪自然保護(hù)區(qū)土壤形態(tài)特征孢子絲螺旋形。孢子呈多型性橢圓形、園形、瓜子形，孢子表面有刺。
培養(yǎng)特征見表1表1培養(yǎng)基生長 產(chǎn)生菌絲 基內(nèi)菌絲 可溶性色素Isp.1號培養(yǎng)基 好白色 無色微黃Isp.2號培養(yǎng)基 好白至褐灰 無色 無Isp.3號培養(yǎng)基 適度 白至褐灰 無色至微灰 無Isp.4號培養(yǎng)基 好白至褐灰 無色至微灰 無Isp.5號培養(yǎng)基 好白至褐灰 無色至乳脂 微黃Isp.6號培養(yǎng)基 好白色 無色 無H2SIsp.7號培養(yǎng)基 好淺灰 軟皮色 污黃葡萄糖天門冬素瓊脂 適度 淺灰 無色 無蔗糖查氏瓊脂 差褐灰 無色 無葡萄糖查氏瓊脂 好褐 淺黃灰斑 淺黃甘油查氏瓊脂 好白至淺灰 淺黃褐 污黃高氏1號瓊脂 適度 灰白至灰 無色或乳脂 無或淡黃不形成黑色素，不產(chǎn)生H2S。
2.發(fā)酵孢子傳代培養(yǎng)Isp.5號培養(yǎng)基，28℃10天培養(yǎng)。
種子培養(yǎng)培養(yǎng)基成分葡萄糖1％，淀粉1.5％，肉膏0.5％，胨(魚)0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0.28℃振蕩培養(yǎng)48小時。
發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基成分葡萄糖2％，淀粉1％，肉膏0.5％，酵母粉0.5％，胨(魚)0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.028℃振蕩培養(yǎng)96小時?；钚詸z定檢定菌大腸桿菌B培養(yǎng)基肉膏0.3％，胨1％，瓊脂1.6％，無鹽水，PH7.0-7.2。檢定方法紙碟法。3.抗菌活性云南霉素只對大腸桿菌B有較弱的活性。紙碟法檢測結(jié)果見表2表2試驗(yàn)菌最低抑制濃度(ug/ml)Bacillus subtilis6633 ＞500Staphylococcus aureus 229p ＞500Sarcinalutea＞500Escherichia coia B 500Escherichia coli 0111 ＞500Proteus vulgaris ox19 ＞500Pseueomonas aeruginosa11 ＞500Klebsiella pneumoniae ＞500Candida albicans ＞500Penecillium avallaneum 5404 ＞5004.制造方法鏈霉菌菌株2321的發(fā)酵培養(yǎng)液的濾液，用2％(克/毫升)活性炭裝柱吸附，50％丙酮洗脫，減壓濃縮除去丙酮后的水溶液，調(diào)PH3，通過強(qiáng)酸陽離子樹脂(NH4+型)，進(jìn)行交換，用1N氨水洗脫，洗脫液對大腸桿菌顯示活性部分除去氨，冷凍干燥，冷干品用中性氧化鋁柱吸附層析，75％甲醇洗脫，去甲醇后水溶液冷凍干燥，干燥后再用葡聚糖凝膠G-10柱層析，活性部分冷凍干燥，冷干品加適量濃鹽酸，于室溫下水解60小時，去除過量的鹽酸氣，水溶液通過強(qiáng)酸陽離子樹脂(NH4+型).進(jìn)行交換，0.1N氨水洗脫，冷凍干燥，干燥品用葡聚糖凝膠G-10柱層析分離，水?dāng)U展，活性部分再冷凍干燥，干燥品用硅膠薄板層析分離制備(自制硅膠GF254板，20×20cm)，60％甲醇展開，分離出活性部分的冷干品純度達(dá)95％以上，稱云南霉素。二.云南霉素的結(jié)構(gòu)及理化數(shù)據(jù)
云南霉素具有如式(1)所示結(jié)構(gòu)，其UV，IR，F(xiàn)AB-MS，分子式，1HNMR，13CNMR及13C-DEPT數(shù)據(jù)如下，(1)式是根據(jù)這些數(shù)據(jù)及1H-1H相關(guān)譜(COSY)及反相檢測遠(yuǎn)程1H-13C異核多鍵相關(guān)譜(HMBC)的分析確定的。
UV 258nmλmnax0.1N NaOH258nmλmax0.1NHCl275nm(見附圖1)IR(KBr)3200-3400， 1640-1660，1485，1275， 1060-1080，940， 840， 780cm-1(見附圖2)FAB-MS(m/z)445(M+H)-443(M-H)-(見附圖3)分子式C16H24K5O91H-NMR(400MHz in D2O，30℃)，見表3及附圖4表31H-NMR(400 MHz in D2O，30℃)ppm multi assignment7.83 1H，d，8HzH-65.12 1H，d，8HzH-55.70 1H，m H-1′4.56 1H，t，5HzSer-α4.05 1H，m H-4′4.02 1H，d，11Hz H-5′3.98 1H，d，16Hz Gly-α3.93 1H，d，16Hz Gly-α3.87 2H，m Ser-β3.81 2H，m H-2′,3′2.77 3H，s NCH313C-NMR(100MHz in D2O，30℃)，見附圖5。13C-DEPT (100MHz in D2O，30℃)，見附圖6。1H-1H COSY見附圖7。1H-13C-HMBC 見表4及附圖8。
表413C-NMR (100MHz in D2O，30℃)ppm muiti Correlations observed in HMBC(δH)assignment176.83s4.02(H-5′)C-6′174.13s4.56(Ser-α) 3.87(Ser-β) Ser-CO169.88s4.56(Ser-α) 3.98(Gly-α) 3.93(Ser-α)Gly-CO168.89s7.83(H-6) 6.12(H-s) C-4160.69s7.83(H-6) 5.70(H-1′) C-2144.78d6.12(H-s) 5.70(H-1′) C-699.92 d7.83(H-6) C-585.92 d7.83(H-6) 3.81(H-2′or3′) C-1′80.83 d4，05(H-4′)C-5′76.65 d5.70(H-1′) 4.05(H-4′) 3.81(H-2′or3′) C-2′or3′74.66 d5.70(H-1′) 3.81(H-2′or3′) C-2′or3′64.15 t4.56(Ser-α)Ser-β58.47 d3.87(Ser-β)Ser-α56.35 d4.02(H-s′) 3.81(H-2′or3′) C-4′52.63 t2.77(NCH) Gly-α35.84 g3.98(Gly-α) 3.93(Gly-α) NNH3三.云南霉素的抗腫瘤作用及毒性1.云南霉素的抗腫瘤作用(1).體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)使用KB細(xì)胞系(來源于人的口腔鱗癌)，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在含5％CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)采用克隆生成測定(Clonogenic assay)判斷藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。取對數(shù)生長期的KB細(xì)胞加入96#培養(yǎng)板內(nèi)，每#50個細(xì)胞/0.2ml，培養(yǎng)24小時后加入藥物，6天后在倒置顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞集落(含30個細(xì)胞以上者)，計算集落抑制率，結(jié)果證明，云南霉素對KB細(xì)胞有殺傷作用，其作用強(qiáng)度呈濃度依賴性；云南霉素對KB細(xì)胞的IC50(半數(shù)集落抑制濃度)為3μg/ml(見附圖9)。
(2).體內(nèi)的試驗(yàn)對腫瘤的療效實(shí)驗(yàn)使用18-20g體重的昆明種小鼠，取小鼠肉瘤180腹水加生理鹽水(1∶3)稀釋，接種于小鼠腋部皮下，每鼠0.2ml。接種中瘤24小時后口服(po)給藥，2次(分別在1、6天給藥)或3次(分別在1、4、7天給藥)，首次給藥10天后處死動物，取腫瘤稱重量，計算腫瘤抑制率。結(jié)果表明，云南霉素對小鼠肉瘤180(實(shí)體型)有顯著療效，使用可耐受劑量(135mg/kg，po，x2)，對腫瘤生長抑制率達(dá)87％(P＜0.01)。見表5表5.云南霉素對小鼠肉瘤180生長的抑制作用實(shí)驗(yàn)劑量給藥動物數(shù)體重瘤重(g) 抑瘤率批號 組別 (mg/kg) 次數(shù) 開始/結(jié)束 改變(g) 均數(shù)±SD (％)1對照 10/10+10.13.80±1.08云南霉素603 10/10+5.7 2.03±0.48 47**903 10/10+4.5 1.74±0.31 54**1203 9/10 +4.3 0.84±0.24 78**II對照 10/10+7.3 2.94±0.83云南霉素 1052 10/10+2.0 0.71±0.16 76**1202 10/10-0.3 0.55±0.24 81**1352 10/10+1.8 0.38±0.11 87**小鼠腋部皮下接種腫瘤，口服(po)給藥。
**P＜0.01(3).云南霉素與5-氟脲嘧啶的抗腫瘤作用及毒性比較采用等毒性劑量(1/3LD50)進(jìn)行比較。同二.1.(2)體內(nèi)試驗(yàn)方法，在小鼠腋部皮下接種肉瘤180腹水0.2ml，24小時后開始口服給藥(po)，共2次(分別在1，6天給藥)。首次給藥10天后處死動物，取腫瘤稱重量，計算腫瘤抑制率；同時取出一側(cè)股骨，檢查骨髓有核細(xì)胞數(shù)，計算骨髓細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，云南霉素的抑瘤作用比5-氟脲嘧啶強(qiáng)，而骨髓毒性較輕，使用相當(dāng)于1/3LD50的劑量，云南霉素(120mg/kg)和5-氟脲嘧啶(80mg/kg)的抑制率分別為81％(P＜0.01)和66％(P＜0.01)，兩者比較，P＜0.01；云南霉素和5-氟脲嘧啶對骨髓有核細(xì)胞的抑制率分別為22％(P＜0.05)和83％(P＜0.01)，兩者比較，P＜0.01，見表6表6云南霉素和5-氟脲嘧啶對小鼠肉瘤180的抑制作用以及對骨髓的毒性比較劑量動物數(shù)腫瘤重量(g) 骨髓有核細(xì)胞數(shù)(107/股骨)(mg/kg) 開始/結(jié)束 X±SD 抑制率(％)X±SD抑制率(％)對照 10/10 2.94±0.831.41±0.27云南霉素 12010/10 0.55±0.24 81**1.10±0.29 22*5-氟脲嘧啶80 10/10 0.99±0.33 66**0.24±0.18 83**小鼠腋部皮下接種腫瘤，灌胃(po)給藥；使用相當(dāng)于1/3LD50的劑量，共2次。
*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較。
上述結(jié)果表明，使用等毒性劑量(1/3LD50，po)進(jìn)行比較，云南霉素對小鼠肉瘤180(實(shí)體型)的抑制作用比5-氟脲嘧啶強(qiáng)，而對骨髓毒性較輕。
2.云南霉素的毒性(1)小鼠急性毒性口服給藥(po)的LD50為360mg/kg。
腹腔給藥(1p)的LD50為65mg/kg。
(2)使用治療劑量(120mg，po，×2，抑制率81％)，對造血系統(tǒng)有輕度抑制作用，(骨髓細(xì)胞抑制率22％)；病理組織學(xué)檢查，治療動物的各種器官包括心、肺、氣管、肝、食官、胃、小腸、脾、腎、腎上腺等均未見毒性病變。
四.制造方法實(shí)施例取發(fā)酵液10立升，加硅藻土過濾，棄去菌絲，濾液通過200克活性炭柱(水濕裝柱，柱5.5×55cm)，進(jìn)行吸附，50％丙酮洗脫，每250毫升收集一份，1-4份活性部分合并，除去丙酮，水溶液約500毫升，調(diào)PH3.0，通過裝有50毫升001×7銨型陽離子交換樹脂柱，少量水沖洗后，用1N氨水洗脫，每100毫升收集一份，1-5份活性部分合并，去除氨氣，水溶液冷凍干燥，全部冷干品通過中性氧化鋁100毫升柱脫色(甲醇濕裝)，75％甲醇展層，每100毫升收一份，1-10份活性部分合并，除去甲醇后，冷凍干燥，得2.3克干燥品，取一克干燥品經(jīng)過葡聚糖凝膠G-10柱層析分離，(柱1.2×100cm)，水洗，每5ml毫升收集一份，7-15份活性部分合并冷凍干燥得冷干品0.56克，純度95％(HPLC檢測，C18Waters柱4.6×250mm，流動相為75％甲醇，流速1毫升/分鐘，檢測UV268nm，保留時間8.3分鐘)。取該95％純度的冷干品1克，加濃鹽酸40毫升，室溫水解60小時后，去掉鹽酸氣后的殘渣，加水200毫升，通過強(qiáng)酸陽離子樹脂Dowex×50w×4(NH4+型)10毫升，進(jìn)行交換，水洗后，用0.1N氨水洗脫，每3毫升收集一份，11-20份活性部分合并，去氨氣后冷凍干燥得到550毫克冷干品，取150毫克該冷干品通過葡聚糖凝膠G-10柱(1.2×100cm)，水洗，括性部分冷凍干燥，冷干品用硅膠薄板層析分離(自制硅膠GF254板，20×20cm)，60％甲醇展層，分離得到活性部分的冷干品60毫克，純度96％(HPLC檢測，C16Waters柱4.6×250mm，流動相為75％甲醇，流速1毫升/分鐘，檢測UV268nm，保留時間2.9分鐘)，稱云南霉素。


圖1是云南霉素的UV；圖2是云南霉素的IR；圖3是云南霉素的FAB-MS；圖4是云南霉素的1H-NMR；圖5是云南霉素的13C-NMR；圖6是云南霉素的13C-DEPT；圖7是云南霉素的1H-1HCOSY；圖8是云南霉素的1H-13CHMBC圖9是云南霉素對KB胞的殺傷作用，克隆生成測定，藥物作用時間6天。
權(quán)利要求
1.一種如下結(jié)構(gòu)式的抗腫瘤抗生素 結(jié)構(gòu)式中R＝H(云南霉素)R可以是K，Na，NH4及CH3，C2H5等
2.一種如權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)式的抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是將鏈霉菌菌株2321在葡萄糖、淀粉等培養(yǎng)基成份上，中性條件下振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂提取，葡聚糖凝膠層析分離，濃鹽酸水解，純化得到成品。
3.一種如權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)式的化合物的抗腫瘤作用，其特征是將腫瘤細(xì)胞(KB細(xì)胞)在體外培養(yǎng)，采用克隆生成測定，判斷藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；取小鼠肉瘤180細(xì)胞接種到受試小鼠腋部皮下繁殖生長，形成實(shí)體瘤，使用云南霉素治療，通過稱取瘤體重量，計算腫瘤抑制率。
4.按照權(quán)利要求2所述的抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是鏈霉菌菌株2321孢子絲呈螺旋形，其表面有刺，不形成黑色素，不產(chǎn)生硫化氫，孢子傳代是在Isp5號培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)10天；種子培養(yǎng)基成份為葡萄糖1％，肉膏0.5％，魚胨0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0，28℃振蕩培養(yǎng)48小時；發(fā)酵培養(yǎng)基成份葡萄糖2％，淀粉1％，肉膏0.5％，酵母0.5％，胨0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0，28℃振蕩培養(yǎng)96小時。
5.按照權(quán)利要求2所述的抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是將鏈霉菌2321發(fā)酵液經(jīng)炭吸附，含水丙酮洗脫，強(qiáng)酸型陽離子樹脂交換，氧化鋁脫色，葡聚糖凝膠層析分離，濃鹽酸水解，再通過強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂交換，凝膠柱分離，硅膠GF254薄層層析，分離純化，冷凍干燥即得成品。
6.按照權(quán)利要求3所述化合物的抗腫瘤作用，其特征是云南霉素對KB細(xì)胞的殺傷作用呈濃度依賴性，對KB細(xì)胞的IC50為3μg/ml；體內(nèi)試驗(yàn)對小鼠肉瘤180(實(shí)體型)有顯著療效，使用可耐受劑量(135mg/kg，po，×2)對腫瘤生長抑制率達(dá)87％(P＜0.01)。采用等毒性劑量比較，云南霉素的抑瘤作用較5-氟脲嘧啶強(qiáng)，而骨髓毒性較輕。
全文摘要
本發(fā)明是從云南鏈霉菌菌株2321的發(fā)酵液中，經(jīng)離子交換樹脂提取，層析分離純化，濃鹽酸水解，再經(jīng)離子交換樹脂提取，層析制備等方法，分離到胞嘧啶核苷二肽新抗生素——云南霉素，體外對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，體內(nèi)對小鼠肉瘤180(實(shí)體型)有顯著療效，使用可耐受劑量對腫瘤生長抑制率達(dá)87％，比等毒性劑量的5-氟脲嘧啶的抑瘤作用強(qiáng)，而對骨髓毒性較輕，使用治療劑量對造血系統(tǒng)有輕度抑制作用，病理組織學(xué)檢查，治療動物的各種主要器官均未見毒性病變。
文檔編號C07H19/06GK1124778SQ9510942
公開日1996年6月19日 申請日期1995年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月3日
發(fā)明者戚長菁, 甄永蘇, 陳文君, 胡繼蘭, 薛玉川, 張春穎 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所