專利名稱：葡聚糖引發(fā)子受體和編碼該受體的dna分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡聚糖引發(fā)子受體(下文有時稱為“ER”)，編碼ER的DNA分子，含該DNA分子的載體和用該DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。更具體地說本發(fā)明涉及得自大豆根原生質(zhì)膜組分的ER，編碼ER的DNA分子，含該DNA分子的載體和用該DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
背景技術(shù)：
已知植物對病原體感染作出的反應(yīng)是合成并積累稱為植物抗毒素的抗菌劑(M.Yoshikawa(1978)Nature 257546)。發(fā)現(xiàn)有些植物病原體含有誘導(dǎo)其完成所述抗性反應(yīng)的物質(zhì)(N.T.Keen(1975)Science 18774)，稱為“引發(fā)劑”。據(jù)認(rèn)為從病原體感染植物到合成并積累植物抗毒素的生化過程如下病原體的菌絲體侵入植物細(xì)胞時，植物細(xì)胞中的葡聚糖酶啟動以便裂解病原體菌絲體壁表面上的多糖，從而釋放引發(fā)子。如果引發(fā)子與植物細(xì)胞中的受體結(jié)合，則產(chǎn)生在信號傳導(dǎo)中起作用的第二信使。信號傳導(dǎo)物質(zhì)被摻入植物細(xì)胞核中，然后激活編碼植物抗毒素合成酶之基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄以誘導(dǎo)植物抗毒素的合成。同時，抑制植物抗毒素降解，從而有效地積累植物抗毒素。
在大豆抗性中起重要作用的植物抗毒素被稱為glyceollin，而且已確定了其結(jié)構(gòu)(M.Yoshikawa et al.，(1978)Physiol.Plant.Pathol.1273)。引發(fā)子是一種葡萄糖的多糖，而且據(jù)報道是含有β-1，6和β-1，3鍵的葡聚糖(J.K.Sharp et al.(1984)J.Biol.Chem.25911321，M.Yoshikawa(1990)Plant CellTechnology 1.2695)。據(jù)認(rèn)為有關(guān)大豆致病霉菌大雄疫霉(phytophthora megasperma)f.sp.glycinea之葡聚糖引發(fā)子的特異性受體是一種在合成和積累抗菌劑glyceollin中起重要作用的蛋白質(zhì)。已公開了純化所述引發(fā)子特異性之ER的方法(E.G.Cosioet al.(1990)FEBS 264235，E.G.Cosio et al.(1992)Eur.J.Biochem.2041115，T.Frey et al.(1993)Phytochemistry32543)。然而還未確定所述ER的氨基酸序列，而且為其編碼的基因也是未知的。
本發(fā)明的一個目的是提供葡聚糖引發(fā)子受體。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子。
本發(fā)明的再一目的是提供含編碼葡聚糖引發(fā)子受體之DNA分子的載體。
本發(fā)明還有一目的是提供用編碼葡聚糖引發(fā)子受體之DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。本發(fā)明的公開內(nèi)容為解決上述問題而進(jìn)行的各種研究的結(jié)果是，本發(fā)明人成功地純化了大豆根衍生的ER并從大豆cDNA文庫克隆了ER基團(tuán)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了葡聚糖引發(fā)子受體，它具有基本上如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子，和其片段，所述受體具有基本上如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的，摻入質(zhì)粒pER23-1中的DNA分子和其片段。本發(fā)明還提供含編碼葡聚糖引發(fā)子受體之DNA分子的載體和用編碼葡聚糖引發(fā)子受體之DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。


圖1表示三種純化步驟的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖2是質(zhì)粒pER23-1和pER23-2的圖譜。
圖3表明構(gòu)建質(zhì)粒pKV1-ER23的方法。
圖4表示將引發(fā)子加入到培養(yǎng)的大豆細(xì)胞中后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有暫時的增加。
圖5表示將引發(fā)子加入到轉(zhuǎn)化的西紅柿培養(yǎng)細(xì)胞中后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有暫時的增加。
圖6表示在E.coli中表達(dá)的全長或部分ER的引發(fā)子-結(jié)合活性。
圖7表示用抗引發(fā)子-結(jié)合區(qū)的抗體抑制引發(fā)子與大豆子葉膜組分中引發(fā)子結(jié)合蛋白的結(jié)合。
圖8表示用抗引發(fā)子-結(jié)合區(qū)的抗體抑制引發(fā)子誘導(dǎo)的植物抗毒素在大豆子葉中的積累。
完成本發(fā)明的優(yōu)選實施方案本發(fā)明的葡聚糖引發(fā)子受體是一種具有作為衍自于植物病原體，特別是疫霉屬之葡聚糖引發(fā)子受體的功能的蛋白質(zhì)。更具體地說，它是一種在植物病原體，尤其是疫霉屬的微生物侵入時，與由植物細(xì)胞中β-1，3-葡聚糖酶裂解的部分病原體菌絲體壁產(chǎn)生的葡聚糖引發(fā)子結(jié)合并隨后使植物細(xì)胞中的微粒體和核產(chǎn)生數(shù)量增加的植物抗毒素的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的葡聚糖引發(fā)子受體具有基本如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列?！盎救鏢EQ ID NO1所示的氨基酸序列”包括示于SEQ ID NO1的氨基酸序列，其中可以有氨基酸缺失、取代或疊加，只要它們能保持葡聚糖引發(fā)子受體的功能。
例如可以用部分改進(jìn)的Cosio′s方法(E.J.B.(1992)2041115)生產(chǎn)本發(fā)明的葡聚糖引發(fā)子受體。簡而言之，將大豆優(yōu)選的是仔荷麥鴿(green homer)品種的根、葉和莖，勻漿，然后從所得漿液中收集膜組分，用離子交換層析純化，接著再用引發(fā)子為配體的親和層析進(jìn)行進(jìn)一步純化。親和層析中所用的引發(fā)子優(yōu)選地是得自大雄疫霉(Phytophthora megasperma)f.sp.glycinea種1(ATCC34566)，因為它對于green homer是不相容的(即對該病原體有抗性)。
按如下可確定因此所得的葡聚糖引發(fā)子受體的氨基酸序列用電印跡將純化的ER轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore Co.)上，然后用賴氨酸內(nèi)肽酶(AP-I)消化。從PVDF膜回收切割的肽，然后用反相HPLC(μ-Bondasphere 5μC8)分級分離。用氣相蛋白測序儀(Applied Biosystems Co.)分析峰組分。
本發(fā)明的ER在說明植物對真菌的抗性機(jī)制并研制能誘導(dǎo)對真菌有抗性的引發(fā)子衍生物方面是有用的，而且用其可作為生產(chǎn)抗ER抗體的抗原。
本發(fā)明包括含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子和其片段。本發(fā)明的DNA分子優(yōu)選地至少有一個與3′末端相連的終止密碼子(如TAG)。
更具體地說，本發(fā)明涉及含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子和其片段，所述受體具有基本上如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列?！昂芯幋a葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子”包括所有簡并異構(gòu)體。術(shù)語“簡并異構(gòu)體”指由不同簡并密碼子編碼相同多肽的DNA分子。以具有SEQ ID NO2之核苷酸序列的DNA分子為例，將其中編碼任何氨基酸的密碼子，如編碼Asn的AAC密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)楹啿⒚艽a子AAT的DNA分子被稱為簡并異構(gòu)體。所述簡并異構(gòu)體的實例包括含有SEQ ID NO2所示之核苷酸序列的DNA分子。
另一方面，本發(fā)明提供摻入質(zhì)粒pER23-1的含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子和其片段。用質(zhì)粒pER23-1轉(zhuǎn)化的E.coli DH5αEKB633于1994年6月15日被保藏于NationalInstitude of Bioscience and Human-Technology the Agency ofIndustrial Science and Technology，保藏號為FERM BP-4699。
含有編碼本發(fā)明葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子片段可含有編碼SEQ ID NO1之氨基酸序列的核苷酸序列。
含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列和其片段的本發(fā)明DNA分子可選擇地在朝5′末端的上游區(qū)與起始Met的ATG密碼子和轉(zhuǎn)譯框架結(jié)合，而且也在朝5′末端的上游區(qū)和朝3′下端的下游區(qū)與作為非轉(zhuǎn)譯區(qū)的有適當(dāng)長度的其它DNA分子相連。
含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列和其片段的本發(fā)明DNA分子通?？勺鳛橘|(zhì)?；蚴删wDNA分子的組成部分形式或作為導(dǎo)入微生物(尤其是，包括E.coli和農(nóng)桿菌的細(xì)胞)、噬菌體顆?；蛑参锏馁|(zhì)粒、噬菌體或基團(tuán)組DNA分子的組成部分形式存在。
為了在植物中穩(wěn)定地表達(dá)編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子和其片段，可以以適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合將啟動子，編碼啟始密碼子的DNA分子(ATG)和終止子加到本發(fā)明的DNA分子的其片段中。啟動子的實例包括編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位基團(tuán)的啟動子(Fluhret al.，Proc-Natl.Acnd.Sci.USA(1986)832358)，胭脂堿合成酶基因的啟動子(Langridge et al.，Plant Cell.Rep.(1985)4355)，生產(chǎn)花椰菜花葉病毒19S-RNA的啟動子(Guilley etal.，Cell(1982)30763)，生產(chǎn)花椰菜花葉病毒35S-RNA的啟動子(Odell et al，Nature(1985)313810)等。終止子的實例包括胭脂堿合成酶基因的終止子(Depicker et al.，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章魚堿合成酶基因的終止子(Gielenet al.，EMBO J.(1984)3835)。
通過包括用合成核酸的常規(guī)方法化學(xué)合成至少部分DNA分子并用常規(guī)方法(例如免疫學(xué)方法或雜交方法)用合成的DNA分子為探針從適當(dāng)?shù)腸DNA文庫中得到所需DNA分子的方法可以得到編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子。在上述方法中所用的某些質(zhì)粒、各種限制酶，T4 DNA連接酶和其他酶可從商業(yè)途徑獲得?？梢杂迷贛olecular Cloning，J.Sambrook et al.，CSH Laboratory(1989)，Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel et al.，Johu Wiley & Sons(1987)及其他文獻(xiàn)中描述的方法完成DNA克隆，質(zhì)粒的構(gòu)建、宿主的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)、從培養(yǎng)物中回收DNA分子及其他步驟。
更具體地說，可以按如下所述得到含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的本發(fā)明DNA分子從葡聚糖引發(fā)子受體的氨基酸序列篩選兩種部分氨基酸序列。制備可編碼所選部分序列之C末端的所有堿基組合物引物和可編碼所選部分序列之N末端的所有堿基之組合的引物。以這些合成的引物作為混合引物，用合適的大豆DNA文庫的DNA分子為模板完成兩次PCR。隨后檢出預(yù)期擴(kuò)增的所給長度的兩個擴(kuò)增片段(這些片段與編碼上述兩種部分氨基酸序列的DNA分子相對應(yīng))，然后確定其核苷酸序列。以所確定的核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成具有編碼定位于葡聚糖引發(fā)子受體的C末端測面的氨基酸部分序列之C末端的核苷酸序列的引物和編碼位于葡聚糖引發(fā)子受體的N末端側(cè)氨基酸部分序列之N末端的核苷酸序列的引物。用上述大豆cDNA文庫的DNA分子作為模板，用這兩種合成引物進(jìn)行PCR。用所得的擴(kuò)增片段為探針與上述大豆cDNA文庫雜交，由此得到含編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子。
可以用任何已知方法，例如Maxam-Gilbert法(MethadsEnzymol，65499，1980)，使用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法(J.Messing et al.，Gene，19269，1982)并將所得的含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子測序。
由于對葡聚糖引發(fā)子所進(jìn)行的各種研究表明葡聚糖引發(fā)子受體在植物對真菌的抗性中起重要作用，所以如果用常規(guī)方法將本發(fā)明編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子及其片段導(dǎo)入沒有葡聚糖引發(fā)子受體的植物細(xì)胞(特別是高等植物細(xì)胞)并在其中表達(dá)，則它們可賦予植物對真菌的抗性。已經(jīng)有人提示，能夠感染植物的真菌通常有抑制劑，由此獲得了抑制植物之真菌抗性的能力。希望通過導(dǎo)入并表達(dá)編碼本發(fā)明葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子和其片段以使ER發(fā)揮作用或通過修飾DNA分子及其片段或通過調(diào)節(jié)其表達(dá)數(shù)量可以研制具有真菌抗性的植物。另外，如果將本發(fā)明的DNA分子和其片段與提高真菌抗性的基因或賦予植物真菌抗性的特性，如葡聚糖酶基因一起導(dǎo)入植物細(xì)胞，特別是高等植物細(xì)胞，并在其中表達(dá)，則預(yù)期植物可獲得比僅導(dǎo)入葡聚糖酶情況更高的真菌抗性。
可以構(gòu)建用于導(dǎo)入編碼葡聚糖引發(fā)子受體及其片段之DNA分子的載體以便在植物中可以穩(wěn)定地表達(dá)葡聚糖引發(fā)子受體。更具體地說，以適當(dāng)?shù)慕M合將啟動子，編碼啟動密碼子(ATG)的DNA分子和終止子與編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子及其片段相連。啟動子的實例包括編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位的基團(tuán)的啟動子(Fluhr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)832358)，胭脂堿合成酶基因的啟動子(Langridge et al.，Plant Cell.Rep.(1985)4355)。生產(chǎn)花椰菜花葉病毒19S-RNA的啟動子(Guilley et al.，Cell(1982)30763)，生產(chǎn)花椰菜花葉病毒35S-RNA的啟動子(Odell et al.，Nature(1985)313810)等。終止子的實例包括胭脂堿合成酶基因的終止子(Depicker et al.，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章魚堿合成酶基因的終止子(Gielen et al.，EMBO J.(1984)3835)。
用已知方法，例如在“Plant genetic transformation andgene expression；a laboratory manual”，J.Draper等人編，Blackwell Scientific出版社1988中描述的方法，可將編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子及其片段導(dǎo)入植物細(xì)胞。所述方法還包括生物學(xué)方法，如用病毒或農(nóng)桿菌的方法以及生理化學(xué)方法如電穿孔、聚乙二醇法、微注射法等。
參考下列實施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明，所述實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1純化大豆根衍生的ER1)測量ER的葡聚糖引發(fā)子受體結(jié)合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引發(fā)子(平均分子量10,000)和酪胺(TOKYO KASEI KOGYOCO.，LTD)的復(fù)合物，用使用氯胺T的碘標(biāo)記引發(fā)子-酪胺復(fù)合物。
將樣品(蛋白質(zhì)量＜500μg)懸于500μl檢測緩沖液(50mMTris-HCl pH 7.4，0.1M糖，5 mM MgCl2，1mM PMSF和5mMEDTA)中，然后于0℃保溫2小時，將7.0nM(70Ci/mmol，其于推測引發(fā)子的分子量為10,000而計算摩爾數(shù)，這也用于下列描述)的I標(biāo)記的引發(fā)子-酪胺復(fù)合物加到懸浮液中，并將混合物于4℃保溫2小時，將反應(yīng)溶液通過Whatman GF/B過濾，如同用0.3％聚乙烯亞胺水溶液至少處理一小時一樣。用5ml冰冷緩沖液(10mMTris-HCl pH7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)將殘留物洗滌3次。用γ計數(shù)器計數(shù)濾器上剩余的放射活性(計數(shù)A)。為了消除非特異性結(jié)合的影響，除將17μM引發(fā)子加到相同的樣品中外，完成與上述相同的過程，將混合物懸于檢測緩沖液中，然后將懸浮液于0℃保溫2小時。用所得的計數(shù)減去計數(shù)A以得到引發(fā)子特異性結(jié)合的計數(shù)(Δcpm)。所得的計數(shù)(Δcpm)除總計數(shù)，然后乘以實驗中所用的引發(fā)子總量以計算引發(fā)子結(jié)合的蛋白質(zhì)量(以摩爾計)。
用上述方法檢測ER的純度。2)純化大豆根衍生的ER將大豆(Glycine max cv.Gree Homer)種子(Takayama SeedCo.)在蛭石上種植1周，然后水培養(yǎng)15天以收集根(約40kg，濕重)。在將其用于純化ER前，將收集的根貯存于-80℃。將1.25L冰冷緩沖液(25mM Tris-HCl pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏亞硫酸氫鉀和1mM PMSF)加到根(2kg，濕重)中，然后用Waring Blander將混合物勻漿2分鐘。
將所得的漿液通過Miracloth(Calbiochem Co.)過濾，然后以9,000rpm，于4℃將濾液離心15分鐘。將上清液以37,000rpm于4℃超離心20分鐘。將沉淀懸于160ml冰冷緩沖液(25mMTris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)以得到膜組分。將兩性洗滌劑ZW3-12(Boehringer Co.)以0.25％的終濃度加到膜組分中以溶解來自膜組分的ER，將混合物于8℃攪拌30分鐘。將所得混合物以37,000rpm，于4℃超離心20分鐘以收集含溶解的ER的上清液(可溶的組分)。將可溶的組分(165ml)對2L緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.2％ZW3-12，4℃)透析4次。將5ml Protrap(TAKAPA Situzo Co.LTD)加到樣品中，將混合物于8℃攪拌30分鐘以除去樣品中的蛋白酶并穩(wěn)定ER。于4℃，將所得混合物以2,800rpm離心2分以收集上清液。用超濾膜YM-10(Amicon Co.)將所得的上清液(160ml)濃縮到約50ml，然后將濃縮物對-A緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.1M蔗糖，5mMMgCl2，1mM PMSF，5mM EDTA和0.2％ZW3-12，4℃)透析。
將透析物加到Q-Sepharose HP 26/10(Pharmacia Co.)，然后用0-1M NaCl的線性梯度洗脫ER(Q-Sepharose活性組分)。ER在約0.45M的NaCl濃度被洗脫。用A緩沖液將Q-Sepharose活性組分稀釋3倍，再將稀釋的組分加到Mono Q10/10(PharmaciaCo.)。用0-1M NaCl線性梯度洗脫ER(Mono Q活性組分，8ml)。ER于約0.25M的NaCl濃度被洗脫。
按如下所述用引發(fā)子為配體經(jīng)親和凝膠純化ER按N.T.Keen，經(jīng)某些改動來制備引發(fā)子(Plant Physiol.(1983)71460 Plant Physiol(1983)7466)。簡而言之，用zymolyase 100T(KIRIN BREWERY CO.LTD)處理病原體大雄疫霉(Phytophthora megasperrna)f.sp.glycinea種1(ATCC 34566)的菌絲體壁以釋放引發(fā)子。處理后，通過吸附在裝于柱中的CM-纖維素上而除去Zymdyase 100T。用凝膠滲透層析G-75(PharmaciaCo.)純化所得的流出物組分以收集平均分子量為10,000 Da的引發(fā)子組分。用M.Yoskikawa的方法(Nature(1978)257546)確定所收集組分的glyceollin誘導(dǎo)的引發(fā)子活性。將8μg引發(fā)子加到大豆子葉中會在培養(yǎng)24小時后，誘導(dǎo)550μg的glyceollin。
為了消除在凝膠載體上的非特異性吸附，收集Mono Q活性組分，然后于8℃與約33mg麥芽糖-偶聯(lián)的玻璃凝膠(床體積約100μl)一起攪拌1小時。離心(1000rpm，4℃，2分鐘)沉淀凝膠以收集上清液(麥芽糖-偶聯(lián)的玻璃凝膠流出物組分)。用A.M.Jeffrey等人的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun(1975)62608)制備麥芽糖偶聯(lián)的玻璃凝膠。簡而言之，將120mg麥芽糖和6g GlassAminopropyl(Sigma Co.)懸于36ml水中，在室溫下將懸浮液攪拌過夜。將36ml乙醇加到所得的懸浮液中。緊接著將乙醇(72ml)中的氫硼化鈉(864mg)加到混合物中。將所得的混合物聲處理2分鐘，然后于室溫攪拌5小時。將水(288ml)加到反應(yīng)混合物中，用冰冷卻所得的混合物，用乙酸將pH調(diào)到5.6。用1.8L水洗滌凝膠以除去游離的麥芽糖。通過使用蒽酮劑的J.H.Roe的方法(J.Biol.Chem.(1955)212335)定量確定洗滌溶液中所含的麥芽糖。由洗滌溶液中所含的麥芽糖量估計凝膠-偶聯(lián)的麥芽糖量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)60mg麥芽糖與6克Gless Aminopropyl偶聯(lián)。
將約17mg引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠(床體積約50μl)加到8ml麥芽糖偶聯(lián)的玻璃凝膠流出物組分中，將混合物于8℃緩慢攪拌過夜。離心(1,000rpm，4℃，2分)收集凝膠，然后用2倍床體積的緩沖液A洗滌2次。另外再用4倍床體積的0.1％SDS將凝膠洗滌3次以收集凝膠偶聯(lián)的ER(引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠洗脫組分)。用A.M.Jeffrey等人的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)制備引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠。簡單地說，將引發(fā)子(37mg)和Glass Aminopropyl(490mg)懸于6ml水中，然后于室溫攪拌過夜。將乙醇(6ml)加到懸浮液中，緊接著加入氫硼化鈉(144mg)溶于乙醇(12ml)中的溶液。用聲處理混合物2分鐘，然后于室溫攪拌5小時。將48ml水加到所得的混合物中。用冰冷卻混合物，用乙酸將pH調(diào)到5.6。用蒽酮試劑定量確定游離的引發(fā)子。從洗滌液中所含的游離引發(fā)子量確定凝膠偶聯(lián)的引發(fā)子量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)34mg引發(fā)子與490mg Glass Aminopropyl偶聯(lián)。
表1中總結(jié)了上述純化步驟中的蛋白質(zhì)和ER量。
表1.上述純化步驟中的蛋白質(zhì)和ER量(用濕重為40kg的大豆根為起始材料)蛋白質(zhì)(mg) ER(pmol)膜組分 17900 30可溶組分 2000214Q-Sepharose活性組分 190 205Mono Q活性組分 49 233麥芽糖偶聯(lián)的玻璃凝膠流出物組分45 220引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠洗脫組分 0.004*45*通過SDS-PAGE后，銀染色所得到的帶強(qiáng)度估測。
在電泳梯度凝膠，SDS-PAGE板10/20(Daiich Kagaku YakuhinCo.)上電泳Mono Q活性組分，來自麥芽糖偶聯(lián)的玻璃凝膠的流出物組分和來自引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠的洗脫組分(各10μl)，然后用銀(Daiich Kagaku Yakuhin Co.)染色。電泳圖示于圖1。圖1中，道1是Mono Q活性組分，道2來自麥芽糖偶聯(lián)的玻璃凝膠的流出物組分和道3來自引發(fā)子偶聯(lián)的玻璃凝膠的洗脫組分。圖1表明在分子量為約70,000Da時，檢測到ER帶。
通過使用125I標(biāo)記的攝影親和劑SASD(Pierce Co.)和引發(fā)子的復(fù)合物，用125I標(biāo)記分子量為約70,000的蛋白質(zhì)。用Western印跡將膜組分的SDS-PAGE帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后與在測量PVDF膜上ER的引發(fā)子結(jié)合活性中所用的相同的125I標(biāo)記的引發(fā)子一起保溫以便用125I標(biāo)記分子量為約70,000Da的蛋白質(zhì)。這些事實表明分子量為約70,000Da的蛋白質(zhì)具有引發(fā)子結(jié)合活性。
用上述方法從約40kg濕重的大豆根中純化了約4μg ER。3)分析ER片段的肽通過用蛋白酶消化而使ER成片段得到肽。用Iwamatsu的方法(Akihiro Iwamatsu，Seikagaku(1991)63139，A.Iwamatsu，Electrophoresis(1992)13142)確定形成片段肽的氨基酸序列。用Centricon-30(Amicon Co.)將用上述方法純化的ER溶液濃縮到約100μl，然后經(jīng)10-20％聚丙烯酰胺SDS電泳。用電印跡裝置(Sartrias Co.)將所得的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore Co.)上。用0.1％Ponceau S(Sigma Co.)/1％乙酸將轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的帶染色。切下分子量為70,000Da的主帶，用0.5mM NaOH脫色。將該帶還原性地進(jìn)行S-羧甲基化。以酶∶底物(mol∶mol)為1∶100的比率將賴氨酰內(nèi)肽酶(AP-1)加到所得的帶中，使混合物于30℃反應(yīng)16小時。將所得成片段的肽加到經(jīng)98％溶劑A和2％溶劑B平衡的μ-Bondasphere 5μC8-300(2.1×150mm，水)柱，用2-50％溶劑B線性梯度以0.25ml/分的流速洗脫30分鐘(溶劑A0.05％TFA溶液；溶劑B在2-丙酸∶乙腈＝7∶3(v/v)中的0.02％TFA)。用214nm的吸收值檢測洗脫肽，手工收集各峰組分。用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Model 470A of Applied Biosystems)分析所得的峰組分。所有所得峰組分的分析結(jié)果是明確地確定了成片段的肽的下列氨基酸序列。#1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln(N-末端)#5Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser#6Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp#7Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys(混合序列)實施例2大豆ER基因的克隆1)制備大豆mRNA在蛭石上將大豆(Glycine max cv.Green Homer)種子(Takayama Seed Co.)種植1周，然后水培養(yǎng)15天以收集根(約40kg，濕重)。將收集的根貯于-80℃直到使用。用Ishida的方法(Cell Technology Laboratory Manipulation Manual，KodanshaScientific)得到總RNA。簡而言之，在研缽中邊加入液氮邊磨碎貯存的根(28.5g，濕重)。同時向所得的粉中加入65℃的35.6ml GTC溶液，然后用Waring Blender將混合物勻槳。將所得的懸浮液于室溫6,000rpm離心15分鐘以收集40ml的上清液。在離心管中銫緩沖溶液墊層上緩慢鋪上一層上清液，然后以35,000rpm；于25℃離心20小時。將所得的沉淀溶于9ml TE/0.2％SDS中。酚/氯仿提取2次后，經(jīng)乙醇沉淀回收總RNA(4.37mg)。
用oligotex dT30(Japan Roche Co.)按手冊所述純化所得的總RNA(2.2mg)以得到60μg的poly(A)+RNA。2)制備大豆cDNA文庫按手冊用cDNA合成盒(Pharmacia Co.)從5μg poly(A)+RNA合成cDNA分子。將合成的cDNA片段用T4連接酶(TAKARASHUZO CO.，LTD)與λ噬菌體載體λgt10(Stratagene Co.)相連。用Gigapack(Stratagene)將DNA混合物包裝到噬菌體顆粒中以制備約1.5×106pfu的大豆cDNA文庫。將文庫擴(kuò)增到160ml的1.6×1011pfu/ml的大豆cDNA文庫。
按如下所述制備cDNA文庫中的總DNA以等量將氯仿/異戊醇(24∶1)加到500μl噬菌體溶液(1.6×1011pfu/ml)中。將混合物振蕩30秒，然后離心收集水層。再用氯仿/異戊醇(24∶1)提取水層。向所得的水層加入5μl 3M乙酸鈉溶液(pH 5.4)和125μl乙醇，將混合物離心收集沉淀。用70％乙醇洗滌沉淀，然后將其溶于含1μg/ml RNase A(SigmaCo.)的10mM Tris-HCl溶液(pH8)中。用該溶液作為PCR模板。3)用PCR擴(kuò)增并克隆大豆ER cDNA片段以實施例1所得的成片段肽的氨基酸序列(#5和#6)為基礎(chǔ)，用自動核酸合成儀(Applied Biosystems Co.的Model 394)合成下列四種寡脫氧核苷酸(混合引物U5，U7，U10，和U12)引物 U5 5′-AARAGYATHGAYGGNGA-3′引物 U7 5′-WRTCNCCNACNAC-3′引物 U10 5′-GTNAAYAARATNCARAC-3′引物 U12 5′-ARRTTNAGRAARTCYTC-3′(RA/G，YC/T，WA/T，HA/C/T，NA/G/T/C)將0.5μg cDNA文庫中的總DNA溶于79μl蒸餾水中。將引物U5和U7或者引物U10和U12(各100pmol)的組合和0.5μl TaqDNA聚合酶(TAKAPA SHUZO CO.LTD)加到溶在10μl的10×PCR緩沖液(TAKAPA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附的)中的8μl2.5mM dNTP中以得到100μl的總量。用Gene Amp PCR System 9600(Perkin-Elmer Co.)進(jìn)行50個循環(huán)的PCR反應(yīng)，每循環(huán)包括1)于94℃變性30秒，2)于47℃變性30秒和3)于72℃延長分鐘。反應(yīng)后，在15％聚丙烯酰胺凝膠上電泳15μl的反應(yīng)溶液。用0.5μg/ml溴化乙錠溶液將凝膠染色10分鐘。在UV光下觀察同時切下表明有預(yù)期擴(kuò)增的40bp和47bp特異性擴(kuò)增片段的帶。用塑料棒將凝膠切片磨碎，用洗脫緩沖液(0.5M乙酸銨，10mM乙酸鎂，1mM EDTA和1％SDS)洗脫過夜，收集含DNA的溶液。
將收集的DNA片段用pT7Blue T-載體盒(Novagene Co.)克隆到質(zhì)粒pT7Blue(R)中。用熒光自動DNA測序儀(Applied BiosystemCo.的Model 373A)將所得的質(zhì)粒P#5-1，2，和P#-1，2，3，4，5，6，7，8，和9測序。結(jié)果表明所得的擴(kuò)增DNA片段除含引物外還編碼肽片段#5和#6的氨基酸序列。
以DNA測序結(jié)果為基礎(chǔ)，用自動核酸合成儀合成下列兩種寡脫氧核苷酸(混合的引物U18和U19)引物 U18 5′-AAGTAYAAGCCRCAAGCCTATTCA-3′引物 U19 5′-ATCGCCRACAACMCCAA-3′(Y和R如上定義，MA/C)將0.5μg cDNA文庫中的總DNA溶于79μl蒸餾水中。將引物U18和U19(各100pmol)組合和0.5μl Taq DNA聚合酶加到溶于10μl 10×PCR緩沖液中的8μl 2.5mM dNTP中以得到100μl的終量。完成40個循環(huán)的PCR反應(yīng)，每循環(huán)包括1)于94℃變性30秒，2)于52℃變性30秒和3)于72℃延長1分。在1％瓊脂糖凝膠上電泳15μl反應(yīng)溶液。
用0.5μg/ml溴化乙錠溶液將凝膠染色15分鐘，在紫外光下觀察同時切下約540bp的特異性擴(kuò)增片段帶。用Gene Clean II(Bio101 Co.)處理切下凝膠以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T載體盒將收集的DNA片段克隆到質(zhì)粒pT7Blue(R)中。用熒光測序儀將所得的質(zhì)粒P#5-P#6測序。結(jié)果表明該擴(kuò)增的DNA片段由539bp組成并且不僅編碼在兩側(cè)的肽片段#5和#6之氨基酸序列，也編碼在擴(kuò)增部分的肽#7。4)通過雜交篩選并克隆文庫用限制酶BamHI和PstI消化在其中克隆了ER cDNA片段的質(zhì)粒#5-#6?；厥占s540bp的DNA片段并用作為探針。用MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham Co.)按手冊所述用[α-32P]dCTP標(biāo)記回收的DNA片段，將所得的反應(yīng)溶液用于雜交實驗。
用E.coli C600hf1(Invitrogen Co.)感染cDNA文庫的噬菌體，然后接種在含10mg/ml MgCl2的直徑約15cm的平板上，以形成共約1×106個噬菌斑。將噬菌斑吸印在尼龍膜(Hybond-NAmersham Co.)上。將所述膜與32P-dCTP標(biāo)記的ER cDNA片段反應(yīng)，再用相同的方法篩選經(jīng)自顯影檢測到的陽性噬菌體以得約30個有不同信號強(qiáng)度的噬菌體克隆。篩選含有最長插入DNA片段的克隆λER23。
用LambdaSorb(Promega Co.)從在雜交實驗中分離的陽性克隆λER23溶液中純化的λ噬菌體DNA分子。將10μl 10×EcoRI裂解緩沖液(限制酶EcoRI 10U)加到5μg的DNA溶液中以達(dá)到100μl的總量，將混合物于37℃過夜反應(yīng)。在1％瓊脂糖凝膠上將反應(yīng)溶液電泳。切下約2.3kb的帶，用Gene Clean II(Bio101 Co.)處理以收集含DNA的溶液。用限制酶EcoRI裂解載體pBluescript II ks-(0.02μg)(Stratagere Co.)。
兩種DNA溶液混合后，加入2μl 10×連接酶緩沖和0.2μl T4DNA連接酶(TAKAPA SHUZO CO.LTD)達(dá)到20μl總量?；旌衔镉?6℃反應(yīng)4小時，用反應(yīng)混合物溶液轉(zhuǎn)化E.coli DH5α(Gibco BPLCo.)。用25ml含50μg/ml，氨芐青霉素，40μg/ml IPTG和40μg/ml X-gal的L培養(yǎng)基制備2％瓊脂板培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化的E.coli接種在瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37℃生長過夜。從形成菌落中篩選白色菌落，然后在3ml含50μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)8小時。用堿法從這些細(xì)菌細(xì)胞中回收質(zhì)粒，然后用限制酶確定它們是否是克隆了所需片段的克隆，由此得到與載體反方向的質(zhì)粒pER23-1和pER23-2(52256bp)。質(zhì)粒pER23-1和pER23-2的圖譜示于圖2。5)確定編碼ER克隆的核苷酸序列通過1)使用經(jīng)適當(dāng)限制酶消化的質(zhì)粒pER23-1和pER23-2，(2)使用基于上述確定的核苷酸序列資料而合成的適當(dāng)引物，或(3)用限制酶KpnI和XhoI裂解pER23-1及用限制酶KpnI和ClaI裂解pER23-2，然后用千序列缺失盒(TAKAPA SHUZO CO.LTD)制備缺失了約200-300bp間隔的質(zhì)粒，用熒光測序儀確定兩個方向的質(zhì)粒pER23-1和pER23-2的DNA核苷酸序列。DNA核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO2。結(jié)果表明所述DNA片段含一編碼667個氨基酸的2001bp的開放閱讀框架，從相當(dāng)于用氨基酸測序儀定序的N-末端序列(肽片段#1)開始。氨基酸序列示于序列表SEQ IDNO1。從所得DNA核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與以前確定的大豆ER的氨基酸序列一致。
另外，使用核酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(EntrezNCBI)，用核酸和氨基酸序列分析軟件(MacvectorKodak Co.)檢索高度同源的氨基酸序列。然而，未發(fā)現(xiàn)與到目前為止所知序列高度同源的氨基酸序列，因此，顯然制備的ER是一種新蛋白質(zhì)。實施例3在煙草植物中表達(dá)大豆ER1)植物表達(dá)質(zhì)粒pKV1-ER23的構(gòu)建如圖3所示，從含花椰菜花葉病毒35S啟動子的質(zhì)粒pCaP35J(J.Yamaua et al.，(1988)Mol.Gen.Genet.211520)按如下所述制備本實施例中所用的植物表達(dá)載體pKV1。
用限制酶BamHI完全消化質(zhì)粒pCaP35J以缺失35S啟動子上游的多克隆位點(diǎn)。用PvuII部分消化后，用klenow片段(TAKAPA SHUZOCO.LTD)處理以得到平整末端。經(jīng)連接將所得的質(zhì)粒DNA環(huán)化，然后導(dǎo)入E.coli DH5α中。從所得的克隆中篩選所需的質(zhì)粒。用限制酶PstI消化所選出的質(zhì)粒以插入35S啟動子下游的多克隆位點(diǎn)。用klenow片段處理以得到平整末端。用HindIII消化所得的質(zhì)粒DNA。用自動核苷酸合成儀合成下列合成接頭DNA，退火并與HindIII消化的質(zhì)粒相連。將所得的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入E.coli DH5α。從所得的克隆中篩選所需的質(zhì)粒pCaP35Y(2837bp)。5 ′-GGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′(SEQ ID NO3)5 ′-CCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGA-3′(SEQ IDNO4)為了將胭脂堿合成酶的終止子導(dǎo)入pCaP35Y，用SacI和EcoRI消化質(zhì)粒pBI121(Clontech Co.)，然后用Klenow片段處理SacI-EcoRI片段以得到平整末端，然后將所得的PBI121片段與質(zhì)粒pCaP35Y相連，其中平整末端正好在35S啟動子的HindIII位點(diǎn)下游。將所述質(zhì)粒DNA導(dǎo)入E.coli DH5α。從所得的克隆中篩選所需質(zhì)粒。為了將卡那霉素抗性盒導(dǎo)入所選的質(zhì)粒中，用PvuII消化后者，并與pLGVneo1103(R.Hain et al.(1985)Mol.Gen.Genet.199161)的片段(約1620bp)相連，所述pLGVneo1103的片段是經(jīng)在章魚堿合成酶終止子下游的PvuII位點(diǎn)裂解，用Bal 31(TAKAPA SHUZOCO.LTD)處理以產(chǎn)生一缺失，在胭脂堿合成酶啟動子上游的EcoRI位點(diǎn)裂解，然后在兩端均產(chǎn)生平整末端而得到的。將所得的質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli DH5α。從所得克隆中篩選所需的質(zhì)?；蛑参锉磉_(dá)載體pKV1(4828bp)。
用限制酶BamHI和SalI在特有的位點(diǎn)消化所制備的pKV1，然后與含ER基團(tuán)的片段(即pEB23-1的BamHI-SalI片段，約2.3kbp)相連。將所得的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入E.coli DH5α。從所得克隆中篩選所需的ER-表達(dá)質(zhì)粒pKV1-ER23(約7.1kbp)。2)在培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中瞬時表達(dá)ER經(jīng)電穿孔將ER基因?qū)肱囵B(yǎng)的煙草細(xì)胞中以通過部分修改的Wetanabe法(Y.Wetanabe(1987)FEBS 21965)瞬時表達(dá)ER。用堿法純化質(zhì)粒pKV1-ER23的DNA分子。用Hirai等人的方法(PlantCell Cultivation Manual，Gakkai Shuppan Center，1982)得到用于瞬時表達(dá)ER的培養(yǎng)的煙草細(xì)胞。用1％次氯酸鈉溶液對煙草種子(鮮黃色品種)東京大學(xué)的Hirofumi Uchimiya教授提供的進(jìn)行消毒，然后使其萌發(fā)。將剛萌發(fā)的煙草組織植入煙草栽培瓊脂培養(yǎng)基(Wurashige-Skoog培養(yǎng)基(Flow Laboratories Co.)，該培養(yǎng)基用2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸，3％蔗糖和8％瓊脂補(bǔ)充)以便3周后誘發(fā)愈傷組織。將給1g愈傷物質(zhì)懸于50ml煙草栽培培養(yǎng)基(Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Flow Laboratories Co.)，用2ppm2，4-二氯苯氧乙酸和3％蔗糖補(bǔ)充)以制備培養(yǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)這些煙草細(xì)胞直到它們進(jìn)入對數(shù)生長期。通過離心(600rpm，3分)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，然后懸于由1％Cellulase Onozuka(Yakult Co.)，1％Dricelase(Kyoma Hakko Co.Ltd)，0.1％Pectriase(Seishin Seiyaku Co.)和0.4M D-甘露醇(Wako Pare ChemicalsCo.Ltd.)組成，并用HCl將pH調(diào)到5.7的溶液中。于30℃反應(yīng)90分鐘以制備原生質(zhì)體。經(jīng)3個循環(huán)的離心，于4℃，用0.4M D-甘露醇洗滌反應(yīng)溶液以除去酶溶液。電穿孔操作包括將1×106細(xì)胞懸于0.8ml電穿孔溶液(70mM KCl，5mM MES和0.3M甘露醇)，將懸浮液與10μg pKV1-ER23的DNA分子混合，在電穿孔池(Biorad Co.電極相距0.4cm)中用基因脈沖儀(Biorad Co.)在125μF和300V處理混合物。處理后，用消毒移液管收集溶液，然后在冰上放30分鐘。于30℃反應(yīng)5分鐘，將反應(yīng)溶液再懸于原生質(zhì)體培養(yǎng)基(Murashrige-Skoog培養(yǎng)基(Flow Laboratory Co.)，用0.2ppm2，4-二氯苯氧乙酸，1％蔗糖和0.4M甘露醇補(bǔ)充，pH調(diào)到5.7)中。將細(xì)胞放在黑暗中于25℃過夜。然后離心(8,000rpm，3分)收集。將60μl懸浮緩沖液(25mM Tris-HCl，pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏二亞硫酸鉀和1mM PMSF)加到細(xì)胞中，在旋轉(zhuǎn)儀上將混合物攪拌3分鐘。將所得的樣品貯于-80℃直到進(jìn)行引發(fā)子結(jié)合實驗。
作為對照，重復(fù)上述過程，不同的是用pKV1的DNA分子代替pKV1-ER23導(dǎo)入煙草細(xì)胞。3)在煙草懸浮液培養(yǎng)細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)ER從瞬時表達(dá)ER的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中按如下所述篩選能恒定保留ER基因的轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)的煙草細(xì)胞將在制備能瞬時表達(dá)ER的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中得到的原生質(zhì)體懸于含1％瓊脂糖的原生質(zhì)體培養(yǎng)基(Murashige-Skoog培養(yǎng)基(FlowLaboratory Co.)，用0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸，1％蔗糖和0.4M甘露醇補(bǔ)充，pH調(diào)到5.7)中。在瓊脂糖固化前，用滴管將懸浮液滴在平板上，從而將原生質(zhì)體固定在珠樣的固體培養(yǎng)基中。瓊脂糖固化后，將無瓊脂糖原生質(zhì)體培養(yǎng)基加到平板中，從而將固定了原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基浸沒于液體培養(yǎng)基中。將原生質(zhì)體在暗中培養(yǎng)1周后，加入卡那霉素達(dá)到100μg/ml的終濃度，然后繼續(xù)培養(yǎng)。將從生長菌落中所選的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)。
得到兩個用pKV1-ER23穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞的克隆(I1和I6)和2個由pKV1穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞的克隆(C2-1和C2-4)。4)引發(fā)子結(jié)合活性實驗按如下所述測量引發(fā)子結(jié)合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引發(fā)子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD)復(fù)合物。使用氯胺T，用125I標(biāo)記引發(fā)子-酪胺復(fù)合物。將所得樣品(蛋白質(zhì)量＜500μg)懸于500μl檢測緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)中，于0℃保溫2小時。以100nM(70Ci/mmol)的量將碘標(biāo)記的引發(fā)子-酪胺復(fù)合物加到懸浮液中，于4℃將混合物保溫2小時。將反應(yīng)溶液通過Whatman GF/B過濾(與用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時一樣)，然后用5ml冰冷緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，1MNaCl，10mM MgCl2)洗滌3次。用γ計數(shù)器計數(shù)在濾膜上保留的放射活性(計數(shù)A)。為了清除非特異性結(jié)合的影響，完成與上述相同的過程，不同的是將17μM引發(fā)子加到相同的樣品中，混合物懸于檢測緩沖液，然后將懸浮液于0℃保溫2小時。所得的計數(shù)減去計數(shù)A，得到引發(fā)子特異性結(jié)合的計數(shù)(Δcpm)。所得的計數(shù)(Δcpm)除以計數(shù)總值，然后乘以實驗中所用的引發(fā)子總量，從而計算出引發(fā)子結(jié)合蛋白的量(mol計)。
結(jié)果，在用pKV1-ER23的DNA分子轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞中觀察到與引發(fā)子的特異性結(jié)合，而在導(dǎo)入pKV1之DNA分子的對照煙草細(xì)胞中未觀察到與引發(fā)子的特異性結(jié)合(表2)。這一結(jié)果表明上述所得的基因編碼具有引發(fā)子結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。
表2.培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的引發(fā)子結(jié)合活性組分 轉(zhuǎn)化DNA結(jié)合活性(fmol/mg)瞬時表達(dá) pKV1 ＜0pKV1-ER23 90.5穩(wěn)定表達(dá)C2-1 pKV1 ＜0C2-4 pKV1 ＜0I1pKV1-ER23 150I6pKV1-ER23 1965)通過加入葡聚糖引發(fā)子在轉(zhuǎn)化的煙草培養(yǎng)細(xì)胞中瞬時增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度植物識別受體特異性的引發(fā)子，然后促進(jìn)植物抗毒素的積累中誘導(dǎo)超敏反應(yīng)以防止真菌侵染。已有一些有關(guān)植物的報道，認(rèn)為在所述抗性反應(yīng)早期，Ca2+流入細(xì)胞是很重要的(U.Conrath et al.，(1991)FEBS LETTERS 279141，M.N.Zook et al.，(1987)Plant Physiol 84520，F(xiàn).Furosaki et al.(1987)Phytochemistry 261919；C.L.Preisig and R.A.Moreau(1994)Phytochemistry 36857)。還有報告說明Ca2+流入細(xì)胞可促使在本發(fā)明人用于得到ER的大豆中植物抗毒素的積累(M.R.Stab and J.Ebel(1987)Archi.Biochem.Biophys.257416)。因此，如果通過將ER基因?qū)霟oER的煙草培養(yǎng)細(xì)胞而制備轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞以表達(dá)ER，而且如果通過加入葡聚糖引發(fā)子而改變細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，則預(yù)料所述改變通過葡聚糖引發(fā)子而引發(fā)在除大豆外的植物(如煙草中的抗性反應(yīng)，由此使它們對用葡聚糖為菌絲體壁組分的各種真菌表現(xiàn)出抗性。
檢測通過加入引發(fā)子而在轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞之細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度方面的改變。
在該實驗中，使用經(jīng)卡那霉素篩選而得到的轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞(I6)和含質(zhì)粒的培養(yǎng)煙草細(xì)胞(C2-4)。
按下述所述用用于Ca2+檢測之熒光螯合劑(Fura-2)的乙酰氧基甲基衍生物(Fura-2AM)檢測培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度經(jīng)離心(600rpm，30秒)從約2ml轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞培養(yǎng)物(保持10分鐘后，細(xì)胞體積相當(dāng)于約250ml)中收集細(xì)胞，然后除去上清液。向細(xì)胞中加入2ml煙草培養(yǎng)基，緩慢攪動混合物，離心(600rpm，30秒)除去上清液。重復(fù)同樣的操作以洗滌培養(yǎng)細(xì)胞。將洗過的培養(yǎng)細(xì)胞均勻懸于2ml培養(yǎng)基中。向1ml培養(yǎng)細(xì)胞懸于培養(yǎng)基中的懸浮液中加入1ml培養(yǎng)基和4μl 1mM Fura-2AM(終濃度2μM Dijin Chemical Co.)，然后將混合物在喑中培養(yǎng)30分鐘，同時偶爾攪拌。隨后，經(jīng)離心(600rpm，30秒)用2ml培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌2次以除去未摻入細(xì)胞的游離Fura-2AM。將洗滌的培養(yǎng)細(xì)胞均勻懸于2ml培養(yǎng)基中，然后將上懸浮液(2ml)轉(zhuǎn)移到熒光檢測細(xì)胞中。通過用細(xì)胞內(nèi)酯酶水解可以將摻入的Fura-2AM轉(zhuǎn)變成Fura-2。在335nm激發(fā)光下，于505nm熒光波長測量通過Fura-2與細(xì)胞內(nèi)Ca2+結(jié)合而產(chǎn)生的熒光，在測量同時攪拌培養(yǎng)細(xì)胞以使培養(yǎng)細(xì)胞不沉淀。在將50μl葡聚糖引發(fā)子(1mg/ml)或去離子水加到培養(yǎng)細(xì)胞中后，以特定的時間間隔，通過測量熒光強(qiáng)度而檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變。作為對照，用與上述相同的方法，在含質(zhì)粒的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變。作為另一對照，用與上述相同的方法，不同的是用有下列配方的用于大豆細(xì)胞的培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)細(xì)胞，在培養(yǎng)的大豆細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變。NaH2PO4·H2O 75mg/ml，KH2PO4170mg/ml，KNO32,200mg/ml，NH4NO3600mg/ml，(NH4)2SO467mg/ml，MgSO4·7H2O310mg/ml，CaCl2·2H2O 295mg/ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 28mg/ml，EDTA·Na237.3mg/ml，KI 0.75mg/ml，MnSO4·4H2O 10.0mg/ml，H3BO33.0mg/ml，ZnSO4·7H2O 2mg/ml，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/ml，CuSO4·5H2O 0.025mg/ml，CoCl2·6H2O0.025mg/ml，肌醇100mg/ml，煙酸1.0mg/ml，吡哆素·HCl 1.0mg/ml，硫胺素·HCl 10.0mg/ml，葡萄糖5g/ml，蔗糖25g/ml，木糖250mg/ml，丙酮酸鈉5.0mg/ml，檸檬酸10.0mg/ml，蘋果酸10.0mg/ml，延胡素酸10.0mg/ml，N-Z-胺500.0mg/ml，2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/ml和玉米素核苷0.1mg/ml，用KOH調(diào)整到pH 5.7。
作為所述實驗的結(jié)果，在加入引發(fā)子3分鐘后，在培養(yǎng)的大豆細(xì)胞中觀察到熒光強(qiáng)度瞬時增加約7％，而在加入去離子水后，未觀察到所述改變(圖4)。所得的結(jié)果表明在該實驗中可觀察到ER與葡聚糖引發(fā)子結(jié)合導(dǎo)致Ca2+瞬時流入細(xì)胞中的現(xiàn)象，從而支持Ca2+在由培養(yǎng)之大豆細(xì)胞中的引發(fā)子引起的抗性反應(yīng)中起重要作用的報告。在轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中，加入引發(fā)子3分鐘后，觀察到熒光強(qiáng)度瞬時增加約10％，而加入去離子水后，沒有所述的變化。
在含質(zhì)粒的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中，加入引發(fā)子后，把轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞中未觀察到熒光強(qiáng)度的變化(圖5)。
這些結(jié)果表明除大豆外的與葡聚糖引發(fā)子沒有反應(yīng)性的植物(如煙草)通過導(dǎo)入用于ER表達(dá)的大豆衍生的葡聚糖引發(fā)子受體基因而獲得了反應(yīng)性。盡管還不完全了解各植物的信號傳導(dǎo)途徑，期望通過導(dǎo)入用于ER表達(dá)的本發(fā)明ER基因而使除煙草外的植物獲得了與葡聚糖引發(fā)子的反應(yīng)性(即細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬時增加)，由此可以研制獲得了對以葡聚糖為菌絲體壁組分的各種真菌的抗性的植物。實施例4在E.coli中表達(dá)大豆ER并確定引發(fā)子結(jié)合區(qū)1)在E.coli中表達(dá)引發(fā)子結(jié)合區(qū)為了在E.coli中表達(dá)大豆ER的部分片段，用Protein Fusion& Purification System(Naw England Biolabs Co.)制備大豆ER的部分片段與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白。用pER23-1為模板，完成PCR以得到各種長度的DNA片段。通過在DNA分子外的5′側(cè)加一個BamHI位點(diǎn)，在3′側(cè)加一個SalI位點(diǎn)而設(shè)計引物以在克隆到質(zhì)粒pMAL-2中后生產(chǎn)MBP和融合蛋白，所述DNA分子編碼圖6所示的全長大豆ER和大豆ER的片段。用自動核酸合成儀(AppliedBiosystems Co.的Model 394)合成這些引物。在DNA鏈的擴(kuò)增中使用下列引物。引物 U35 5′-ATGGATCCATGGTTAACATCCAAACC-3′；引物 U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′；引物 U37 5′-ATGGATCCCCAGCATGGGGTAGGAAG-3′；引物 U38 5′-TAGTCGACTACTTCTCCCAGTTATATTC-3′；引物 U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′；引物 U40 5′-TAGTCGACTATTCATCACTTCTGCTATG-3′；引物 U41 5′-ATGGATCCGCCCCACAAGGTCCCAAA-3′；和引物 U42 5′-ATGGATCCAATGACTCCAACACCAAG-3′將pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸餾水中。將引物U5和U7的組合或引物U10和U12(各100pmol)組合和0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.LTD)加到溶于10μl 10×PCR緩沖液(TAKARA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附)中的0.8μl 2.5mM dNTP中以得到100μl終體積。用Gene Amp PCRSystem 9600(Perkin-Elmer Co.)進(jìn)行30個循環(huán)的PCR反應(yīng)，每循環(huán)包括1)于94℃變性30秒，2)于55℃變性30秒和3)于72℃延長1分鐘。反應(yīng)后，用限制酶BamHI和SalI消化15μl的反應(yīng)溶液，然后在1％瓊脂糖凝膠上電泳。
用0.5μg/ml溴化乙錠將凝膠染色15分鐘。切下有所預(yù)期的特定擴(kuò)增的帶，該過程是在紫外光下觀察的同時進(jìn)行的。用GeneCleanII(Bio101 Co.)處理凝膠切片以收集合DNA的溶液。將收集的DNA片段克隆到質(zhì)粒pMAL-C2的BamHI-SalI位點(diǎn)，然后將克隆導(dǎo)入E.coli DH5α。2)從E.coli中制備可溶的蛋白質(zhì)組分在表達(dá)培養(yǎng)基(10g/l胰胨(Gibco Co.)，5g/l酵母提取物(Gibco Co.)，5g/l NaCl，2g/l葡萄糖和100μg/ml氯芐青霉素)中預(yù)培養(yǎng)其中導(dǎo)入了質(zhì)粒的E.coli細(xì)胞。將預(yù)培養(yǎng)溶液(0.4ml)加到40ml表達(dá)培養(yǎng)基中，然后于37℃振蕩培養(yǎng)直到OD600達(dá)到0.55。將異丙基硫代半乳糖苷加到培養(yǎng)溶液中，達(dá)到0.3mM的終濃度，然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時以誘導(dǎo)表達(dá)。通過離心收集E.coli，然后用洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl和1mMEDTA)洗滌E.coli細(xì)胞。聲處理細(xì)胞共2分鐘(15秒×8)。將ZW3-12加到經(jīng)聲處理的細(xì)胞中以達(dá)到0.25％的終濃度，然后將混合物于4℃培養(yǎng)30分鐘。離心(10,000rpm，5分鐘)收集上清液以得到E.coli可溶的蛋白質(zhì)組分。用抗-麥芽糖結(jié)合蛋白抗體(New Englard Biolab Co.)，經(jīng)免痰印跡技術(shù)確定融合蛋白的表達(dá)。3)引發(fā)子-結(jié)合實驗按如下所述確定引發(fā)子-結(jié)合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引發(fā)子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.LTD.)的復(fù)合物。使用氯胺T，用125I標(biāo)記引發(fā)子-酪胺復(fù)合物。將所得的樣品(蛋白質(zhì)量＜80μg)懸于500μl檢測緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)中，然后于0℃溫育2小時。以100nM(70Ci/mmol)量的I標(biāo)記的引發(fā)子-酪胺復(fù)合物加到懸浮液中，使混合物于4℃保溫2小時。通過Whatman GF/B過濾反應(yīng)溶液(與用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時一樣)，用5ml冰冷緩沖液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)洗滌3次。用γ計數(shù)器計數(shù)濾膜上保留的放射活性(計數(shù)A)。為了消除非特異性結(jié)合的影響，除將17μM引發(fā)子加到同樣的樣品中外，重復(fù)與上述相同的過程，將混合物懸于檢測緩沖液，將懸浮液于0℃溫育2小時。所得的計數(shù)減去計數(shù)A以得到引發(fā)子特異性結(jié)合的計數(shù)(Δcpm)。所得的計數(shù)(Δcpm)除以計數(shù)總值，然后乘以實驗中所用的引發(fā)子總量以計算引發(fā)子-結(jié)合蛋白的數(shù)量(以mol計)。
結(jié)果，在用編碼ER(圖6)之DNA分子轉(zhuǎn)化的E.coli中觀察到與引發(fā)子的特異性結(jié)合。因此，再次肯定所得的基因編碼具有引發(fā)子結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，而且表明在SEQ ID NO1的239-442氨基酸序列，有一個引發(fā)子結(jié)合區(qū)。實施例5抑制在大豆子葉膜組分中葡聚糖引發(fā)子與引發(fā)子結(jié)合蛋白的結(jié)合以及用抗引發(fā)子結(jié)合區(qū)的抗體抑制大豆子葉中植物抗毒素的積累1)在E.coli中表達(dá)引發(fā)子結(jié)合區(qū)為了在E.coli中表達(dá)大量的引發(fā)子結(jié)合區(qū)，用Prtein Fusion& Purification System(New England Biolabs Co.)制備得自ER的引發(fā)子結(jié)合區(qū)與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白。進(jìn)行PCR以生產(chǎn)編碼引發(fā)子結(jié)合區(qū)的DNA分子。用自動核酸合成儀(AppliedBiosystems Co.的Model 394)合成下列引物引物 U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′；和引物 U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′將pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸餾水中。將引物U5與U7的組合或引物U10與U12(各100pmol)的組合以及0.5μl Taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.LTD)加到在10μl 10×PCR緩沖液(TAKARA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附)中的8μl 2.5mM dNTP中，終體積達(dá)100μl。用Gene Amp PCR System9600(Perkin-Elmer Co.)完成30個循環(huán)的PCR，每循環(huán)包括1)于94℃變性30秒，(2)于55℃變性30秒和3)于72℃延長1分鐘。反應(yīng)后，用限制酶BamHI和SalI消化15μl的反應(yīng)溶液，然后在1％瓊脂糖凝膠上電泳。
用0.5μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基6-苯基菲啶鎓溶液將凝膠染色15分鐘。在紫外光下觀察的同時切下有特異性擴(kuò)增的帶。用Gene CleanII(Bio101 Co.)處理凝膠切片以收集含DNA的溶液。將收集的DNA片段克隆到質(zhì)粒pMAL-C2的BamHI-SalI位點(diǎn)，然后將克隆導(dǎo)入E.coli DH5α。2)純化在E.coli中表達(dá)的融合蛋白并生產(chǎn)抗體在表達(dá)培養(yǎng)基(10g/l胰胨(Gibco Co.)，5g/l酵母提取物(Gibco Co.)，5g/l NaCl，2g/l葡萄糖和100μg/ml氯芐青霉素)過夜預(yù)培養(yǎng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞。將預(yù)培養(yǎng)液(150ml)加到1.5L表達(dá)培養(yǎng)基中，于37℃在Sakaguchi瓶中振蕩培養(yǎng)，直到OD600達(dá)到0.55。將異丙基硫代半乳糖苷加到培養(yǎng)液中，使終濃度為0.3mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時以誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集E.coli，用洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl和1mM EDTA)洗滌E.coli細(xì)胞。聲處理細(xì)胞2分鐘(15秒×8)。離心得到可溶的蛋白質(zhì)組分。用直鏈淀粉樹脂從該組分中純化MBP融合的蛋白質(zhì)。用因子Xa裂解MBP-和引發(fā)子結(jié)合區(qū)，然后用凝膠過濾柱層析純化引發(fā)子結(jié)合區(qū)。用E.Harlow和D.Lane的方法(Antibody(1988)Cold Spring Harbor Co.，pp53-137)將純化蛋白質(zhì)注射到小鼠腹腔，注射2次以進(jìn)行免疫接種。用ELISA法確定效價增加后，獲取腹水，然后用50％飽和的硫酸銨沉淀并用Protein A Sepharose(Pharmacia Co.)處理以生產(chǎn)純化的抗體。在用Protein ASepharose處理時，抗體與Protein A Sepharose和0.1M磷酸鈉(pH 8.0)結(jié)合，然后用檸檬酸(pH 3.5)洗脫。用免疫印跡證明所得的抗體在大豆中僅認(rèn)識ER蛋白質(zhì)。3)制備大豆子葉膜組分按如下所述制備大豆子葉膜組分將大豆種子在土壤中培養(yǎng)9天，收集子葉(36g，濕重)。將子葉懸于47ml冰冷緩沖液(25mM Tris-HCl pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏二亞硫酸鈉和1mMPMSF)中。用與用于從大豆根中制備膜組分相同的方法制備子葉膜組分。將所得的子葉膜組分懸于1ml冰冷緩沖液(10mM Tris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mMMgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)并貯于-80℃。4)測量葡聚糖引發(fā)子與大豆子葉膜組分引發(fā)子結(jié)合蛋白結(jié)合的抑制作用按如下所述測量引發(fā)子結(jié)合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引發(fā)子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.LTD.)的復(fù)合物。
用氯胺T，以125I標(biāo)記引發(fā)子-酪胺復(fù)合物。將大豆子葉膜組分(100μl，820μg)懸于500μl檢測緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)，然后于0℃溫育2小時。將7.4ng(143nM；70Ci/mmol)I-標(biāo)記的引發(fā)子-酪胺復(fù)合物加到懸浮液中，然后將混合物于4℃溫育2小時。采用Whatman GF/B過濾反應(yīng)溶液(與用0.3％聚乙烯亞胺水溶液至少處理1小時一樣)，然后用5ml冰冷緩沖液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)洗滌3次。用γ計數(shù)器計數(shù)濾膜上保留的放射活性(計數(shù)A)。為了消除非特異性結(jié)合的影響，完成與上述相同的過程，不同的是將100倍mol(75μg，15μM)的冷引發(fā)子加到樣品中，將混合物懸于檢測緩沖液中，然后懸浮液于0℃保溫2小時，所得的計數(shù)減去計數(shù)A，得到引發(fā)子特異性結(jié)合的計數(shù)(Δcpm)。通過加入3.6，7.1，10.8，14.4，28.8μg純化抗體而不是冷引發(fā)子而得到的結(jié)合計數(shù)減去計數(shù)A。將所得的結(jié)果與冷引發(fā)子的比較，然后表達(dá)成百分?jǐn)?shù)，取引發(fā)子特異性結(jié)合的計數(shù)(Δcpm)為100％(圖7)。加入28.8μg抗體對引發(fā)子結(jié)合的抑制達(dá)到約51％。結(jié)果表明抗引發(fā)子結(jié)合的抑制達(dá)到約51％。結(jié)果表明抗引發(fā)子結(jié)合區(qū)的抗體抑制引發(fā)子與引發(fā)子結(jié)合蛋白的結(jié)合。5)用抗引發(fā)子結(jié)合區(qū)的抗體抑制植物抗毒素的積累用M.G.Hahn等人((1992)Moleculav Plant PathologyVolumeII A Practical Approach，IRL Press，pp.117-120)的方法用大豆子葉檢測因葡聚糖引發(fā)子的作用而積累的植物抗毒素量。
以抗引發(fā)子-結(jié)合區(qū)的純化抗體(0，1，2，3，4，10和20μg/25μl/子葉)或抗酵母衍生的dsRNAse，pac1的純化抗體(4，10和20μg/25μl/子葉)作為對照，加到大豆子葉中，將混合物溫育1小時。將葡聚糖引發(fā)子(200ng/25μl/子葉)加到大豆子葉中，將混合物溫育20小時以確定因葡聚糖引發(fā)子的作用而積累的植物抗毒素是否受到抗體的抑制。將因加入引發(fā)子，隨后加入抗體而誘導(dǎo)的植物抗毒素積累的量表示成百分?jǐn)?shù)，以只加入引發(fā)子而積累的植物抗毒素為100％(圖8)。若以20.0μg/大豆子葉的量加入抗引發(fā)子結(jié)合區(qū)的抗體時，積累的植物抗毒素量降低了約53％。在對照中，植物抗毒素的積累量幾乎沒什么變化，即使加入20.0μg/大豆子葉抗pac1抗體時，也是如此。這些結(jié)果表明所得的基因并不只編碼引發(fā)子結(jié)合蛋白，而是編碼大豆中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的ER。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供了葡聚糖引發(fā)子受體，編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子及其片段，含有DNA分子或其片段的載體，用DNA分子或其片段轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
本發(fā)明的ER對于說明真菌抗性以及開發(fā)能誘導(dǎo)真菌抗體的引發(fā)子衍生物是有用的，而且可用其作高抗源生產(chǎn)抗ERs的抗體。
含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的本發(fā)明DNA分子及其片段可作為用于建立開發(fā)真菌抗體植物技術(shù)的材料。換句話說，可導(dǎo)入本發(fā)明的DNA分子及其片段并在各種植物中表達(dá)以提高其真菌抗性。
抗本發(fā)明葡聚糖引發(fā)子受體的抗體，含編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的本發(fā)明DNA分子、其突變體和反義DNA可用于研究ER的引發(fā)子結(jié)合位點(diǎn)和信號傳導(dǎo)。
此外，ER的氨基酸序列及編碼其的核苷酸序列資料可用于研究ER的引發(fā)子結(jié)合位點(diǎn)和涉及ER的信號傳導(dǎo)。
序列表SEQ ID NO1的資料長度667個氨基酸類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val1 5 10 15Leu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro20 25 30 35Thr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr40 45 50Ile His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro55 60 65 70Ser Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr75 80 85 90Ile Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser95 100 105Ser Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe110 115 120 125Phe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn145 150 155 160Thr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr165 170 175 180Ser Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser185 190 195Gly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val200 205 210 215Leu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu220 225 230Pro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu235 240 245 250Leu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys255 260 265 270Ile Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val275 280 285Gly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile290 295 300 305Lys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp310 315 320Val Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly325 330 335 340Lys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr345 350 355 360Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp365 370 375Leu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly380 385 390 395Ile Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile400 405 410Tyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu415 420 425 430Thr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile435 440 445 450Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu455 460 465Arg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe470 475 480 485Thr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser490 495 500Ala Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser505 510 515 520Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu525 530 535 540Gly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val545 550 555Leu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys560 565 570 575Glu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile580 585 590Phe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu595 600 605 610Asp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu615 620 625 630Gly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe635 640 645Asp Gly Gly Asn Ser Leu Thr Asn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp650 655 660 665Glu667SEQ ID NO2的資料長度2004個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA生物源生物大豆(Glycine max L.)品系Green Homer序列描述SEQ ID NO29 18 27 36 45 54GTT AAC ATC CAA ACC AAT ACA TCT TAC ATC TTC CCT CAA ACA CAA TCC ACT GTTVal Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val63 72 81 90 99 108CTT CCT GAT CCC TCC AAA TTC TTC TCC TCA AAC CTT CTC TCA AGT CCA CTC CCCLeu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAC TCT TTC TTC CAA AAC TTT GTC CTA AAA AAT GGT GAC CAA CAA GAA TACThr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr
171 180 189 198 207 216ATT CAT CCT TAC CTC ATC AAA TCC TCC AAC TCT TCC CTC TCT CTC TCA TAC CCTIle His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro225 234 243 252 261 270TCT CGC CAA GCC AGT TCA GCT GTC ATA TTC CAA GTC TTC AAT CCT GAT CTT ACCSer Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr279 288 297 306 315 324ATT TCA GCC CCA CAA GGT CCC AAA CAA GGT CCC CCT GGT AAA CAC CTT ATC TCCIle Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser333 342 351 360 369 378TCC TAC AGT GAT CTC AGT GTC ACC TTG GAT TTC CCT TCT TCC AAT CTG AGC TTCSer Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe387 396 405 414 423 432TTC CTT GTT AGG GGA AGC CCC TAT TTG ACT GTG TCT GTG ACT CAA CCA ACT CCTPhe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro441 450 459 468 477 486CTT TCA ATT ACC ACC ATC CAT TCC ATT CTC TCA TTC TCT TCA AAT GAC TCC AACLeu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn495 504 513 522 531 540ACC AAG TAC ACC TTT CAG TTC AAC AAT GGT CAA ACA TGG CTT CTT TAT GCT ACCThr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr
549 558 567 576 585 594TCC CCC ATC AAG TTG AAC CAC ACC CTT TCT GAG ATA ACT TCT AAT GCA TTT TCTSer Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser603 612 621 630 639 648GGC ATA ATC CGG ATA GCT TTG TTG CCG GAT TCG GAT TCG AAA CAC GAG GCT GTTGly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val657 666 675 684 693 702CTT GAC AAG TAT AGT TCT TGT TAC CCC GTG TCA GGT AAA GCT GTG TTC AGA GAALeu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu711 720 729 738 747 756CCT TTC TGT GTG GAA TAT AAC TGG GAG AAG AAA GAT TCA GGG GAT TTG CTA CTCPro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu765 774 783 792 801 810TTG GCT CAC CCT CTC CAT GTT CAG CTT CTT CGT AAT GGA GAC AAT GAT GTC AAALeu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys819 828 837 846 855 864ATT CTT GAA GAT TTA AAG TAT AAA AGC ATT GAT GGG GAT CTT GTT GGT GTT GTCIle Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val873 882 891 900 909 918GGG GAT TCA TGG GTT TTG AAA ACA GAT CCT TTG TTT GTA ACA TGG CAT TCA ATCGly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile
927 936 945 954 963 972AAG GGA ATC AAA GAA GAA TCC CAT GAT GAG ATT GTC TCA GCC CTT TCT AAA GATLys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp981 990 999100810171026GTT GAG AGC CTA GAT TCA TCA TCA ATA ACT ACA ACA GAG TCA TAT TTT TAT GGGVal Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly103510441053106210711080AAG TTG ATT GCA AGG GCT GCA AGG TTG GTA TTG ATT GCT GAG GAG TTG AAC TACLys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr108910981107111611251134CCT GAT GTG ATT CCA AAG GTT AGG AAT TTT TTG AAA GAA ACC ATT GAG CCA TGGPro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp114311521161117011791188TTG GAG GGA ACT TTT AGT GGG AAT GGA TTC CTA CAT GAT GAA AAA TGG GGT GGCLeu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly119712061215122412331242ATT ATT ACC CAA AAG GGG TCC ACT GAT GCT GGT GGT GAT TTT GGA TTT GGA ATTIle Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile125112601269127812871296TAC AAT GAT CAC CAC TAT CAT TTG GGG TAC TTC ATT TAT GGA ATT GCG GTG CTCTyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu
130513141323133213411350ACT AAG CTT GAT CCA GCA TGG GGT AGG AAG TAC AAG CCT CAA GCC TAT TCA ATAThr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile135913681377138613951404GTG CAA GAC TTC TTG AAC TTG GAC ACA AAA TTA AAC TCC AAT TAC ACA CGT TTGVal Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu141314221431144014491458AGG TGT TTT GAC CCT TAT GTG CTT CAC TCT TGG GCT GGA GGG TTA ACT GAG TTCArg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe146714761485149415031512ACA GAT GGA AGG AAT CAA GAG AGC ACA AGT GAG GCT GTG AGT GCA TAT TAT TCTThr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser152115301539154815571566GCT GCT TTG ATG GGA TTA GCA TAT GGT GAT GCA CCT CTT GTT GCA CTT GGA TCAAla Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser157515841593160216111620ACA CTC ACA GCA TTG GAA ATT GAA GGG ACT AAA ATG TGG TGG CAT GTG AAA GAGThr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu162916381647165616651674GGA GGT ACT TTG TAT GAG AAA GAG TTT ACA CAA GAG AAT AGG GTG ATG GGT GTTGly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val
168316921701171017191728CTA TGG TCT AAC AAG AGG GAC ACT GGA CTT TGG TTT GCT CCT GCT GAG TGG AAALeu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys173717461755176417731782GAG TGT AGG CTT GGC ATT CAG CTC TTA CCA TTG GCT CCT ATT TCT GAA GCC ATTGlu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile179118001809181818271836TTC TCC AAT GTT GAC TTT GTA AAG GAG CTT GTG GAG TGG ACT TTG CCT GCT TTGPhe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu184518541863187218811890GAT AGG GAG GGT GGT GTT GGT GAA GGA TGG AAG GGG TTT GTG TAT GCC CTT GAAAsp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu189919081917192619351944GGG GTT TAT GAC AAT GAA AGT GCA CTG CAG AAG ATA AGA AAC CTG AAA GGT TTTGly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe195319621971198019891998GAT GGT GGA AAC TCT TTG ACC AAT CTC TTG TGG TGG ATT CAT AGC AGA AGT GATAsp Gly Gly Asn Ser Leu Thr Asn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp2004GAA TAGGluSEQ ID NO3的資料長度54個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成的DNA序列描述SEQ ID NO3GGAATTCGAG CTCGGTACCC GGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGCASEQ ID NO4的資料長度58個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成的DNA序列描述SEQ ID NO4CCTTAAGCTC GAGCCATGGG CCCCCTAGGA GATCTCAGCT GGACGTCCGT ACGTTCGA
權(quán)利要求
1.具有基本示于SEQ ID NO1之氨基酸序列的葡聚糖引發(fā)子受體。
2.含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子或其片段，所述受體具有基本如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的DNA分子，其中編碼葡聚糖引發(fā)子受體的核苷酸序列或其片段示于SEQ ID NO2。
4.摻入質(zhì)粒pER23-1的含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子或其片段。
5.含有權(quán)利要求2-4任一編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子或其片段的載體。
6.用權(quán)利要求2-4任一編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子或其片段轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
全文摘要
具有基本如SEQ ID NO1所示之氨基酸序列的葡聚糖引發(fā)子受體；含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸的DNA分子或其片段，所述受體具有基本示于SEQ ID NO1的氨基酸序列；摻入質(zhì)粒pER23-1的含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體之核苷酸序列的DNA分子或其片段，含有編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子或其片段的載體；用編碼葡聚糖引發(fā)子受體的DNA分子或其片段轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
文檔編號C07K14/435GK1131970SQ95190741
公開日1996年9月25日 申請日期1995年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月17日
發(fā)明者柿谷誠, 梅基直行, 石田功, 巖松明彥, 吉川正明 申請人:麒麟麥酒株式會社