專利名稱：用氘代方法增強藥物效果的制作方法
本申請是依賴和合并申請?zhí)枮?8/217897申請日為1994年3月25日的我們的美國專利作為一個整體繼續(xù)申請。
背景技術：
本發(fā)明涉及用于增強已知藥用化合物或藥物效果的方法及通過改變已知藥物分子結(jié)構(gòu)中的同位素形式而生成的增強效果的藥物。特別是，本發(fā)明涉及用一個或一個以上的氘原子取代已知藥物所含的一個或一個以上的氫原子，使其改變原藥物的分子結(jié)構(gòu)，所得藥物產(chǎn)生顯著變化，它的活性比原藥物有較大改進。更具體地說本發(fā)明涉及氘代二氫吡啶的方法(例硝苯地平)，氘代后的硝苯地平有增加降血壓作用并且濃度在比硝苯地平低的情況下，可延長對哺乳類動物的作用持續(xù)時間。
合成的藥物，其碳骨架是由各種取代基團其中包括碳、氫、氧、氮等集合而成。人們采用多種方法進行藥物設計和合成，包括諸如隨機和分子修飾，采用這些和其他一些方法導致大量藥物問世。這種變化能使個別的公司在市場中維持競爭優(yōu)勢，公司化費大量時間和財富在某些藥理領域例如抗高血壓劑尋找新藥。這種新藥劑往往與原型化合物有不同的生物活性，使其在開發(fā)中的投資得到應有回報。
發(fā)明概要目前市場上銷售的所有藥物基本上都含有許多個分子質(zhì)量為1的氫原子的藥物。業(yè)已發(fā)現(xiàn)藥物的一個或一個以上的氫原子的質(zhì)量已被改變?yōu)?，該藥的活性產(chǎn)生顯著變化，甚至有很大改善。例如，硝苯地平的二氫吡啶部分經(jīng)同位素改變后與硝苯地平自身比較，其對哺乳動物降壓作用有一個意想不到的變化，這種效果也應適用于人體。
硝苯地平作為治療心絞痛和高血壓的重要藥物在世界市場銷售，它的結(jié)構(gòu)如下 當硝苯地平甲基上的一個或更多的氫被氘置換或由CD3取代一個或更多的甲基時，其治療性質(zhì)可被改變甚至改進很多。例如硝苯地平環(huán)上的2-位和6-位上的二個甲基由二個氘代的基團(CD3)取代，即6個氘原子取代6個氫原子，氘代的硝苯地平結(jié)構(gòu)如下 上面二個分子結(jié)構(gòu)均為硝苯地平，而后一結(jié)構(gòu)為前者的同位素形式。
附圖簡單說明本發(fā)明可由參考附圖進一步理解

圖1表示不同濃度的氘代硝苯地平與硝苯地平對試驗大鼠降壓效果的比較；圖2和圖3表示對照硝苯地平(硝苯地平B)和氘代的硝苯地平(硝苯地平D)對T型鈣通道的使用—依賴性抑制；圖4顯示對照硝苯地平和氘代硝苯地平對鈣流抑制作用作為脈沖頻率函數(shù)的影響；圖5表示對照硝苯地平與氘代硝苯地平對使用一依賴性的影響；
圖6(a)和(b)顯示對照硝苯地平和氘代硝苯地平對平均動脈壓的作用；圖7(a)和(b)顯示應用非對稱性乙狀模型擬合的對照硝苯地平圖7(a)和氘代硝苯地平圖7(b)的濃度-效果關系；圖8(a)和(b)顯示用對數(shù)劑量應答模型擬合的對照硝苯地平圖8(a)和氘代硝苯地平圖8(b)的濃度-效果關系；圖9(a)和(b)顯示尼卡地平和氘代尼卡地平的劑量—反應關系；圖10顯示氘代尼卡地平比對照尼卡地平的作用持續(xù)時間更長；圖11表示不同濃度的氘代維拉帕米與對照維拉帕米對試驗大鼠的降壓作用比較；圖12表示氘代維拉帕米比對照維拉帕米的作用持續(xù)時間更長；圖13顯示七種硝苯地平產(chǎn)品的三維指紋圖；圖14表示九種硝苯地平產(chǎn)品二維指紋圖；圖15表示索他洛爾(Sotalol)粗品片劑的二維(氧對碳)指紋圖；圖16表示三個不同人的頭發(fā)樣品的指紋圖；圖17表示三種酒的二維碳氧指紋圖。
發(fā)明詳細描述硝苯地平(和其他二氫吡啶例如尼卡地平、尼莫地平、尼魯?shù)仄健⒛崴鞯仄健⒛崛旱仄?、非羅地平、意弗拉地平(ifradipine)和氨氯地平等)的這種改變是采用硝苯地平溶于氘化管中的氘代氯仿和重水的混合物中，然后加入少量的三氟醋酐和氘代丙酮混和，混和后管內(nèi)的溶液被冷凍，最好將管子浸入液氮中然后封口，封管被加熱，加熱溫度范圍大約從50℃至65℃，最合適范圍大約55℃至60℃，在此溫度下維持足夠時間使硝苯地平上的2-位和6-位上的甲基被CD3取代，大約150至180小時反應完全，更合適反應時間為大約160至170小時。
氘代硝苯地平用下列方法合成例1放置80毫克粉狀硝苯地平于特制氘化管內(nèi)，將其溶于2毫升氘代氯仿和0.5毫升重水的混合物中，然后加入0.2毫升三氟醋酐和2毫升氘代丙酮，加畢混和均勻，溶液用液氮冷凍，在氮氣下由火焰封口，封口的管子在57℃加熱168小時，反應畢后冷卻，打開封管。管內(nèi)反應物轉(zhuǎn)入園底燒瓶中，溶劑在減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，全部操作在避光下進行，應用常規(guī)的′H核磁共振(NMR)測定上述C-2和C-6甲基已有95％被氘取代。
氘代硝苯地平對大鼠血壓的影響測定如下例2自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)用苯巴比妥(65mg/kg腹腔注射)麻醉，頸動脈和靜脈分別插管。通過頸動脈導管連續(xù)監(jiān)測血壓。氘代和非氘代的硝苯地平樣品溶解于二甲基亞砜中，并用生理鹽水稀釋，使注射時二甲基亞砜溶液的體積百分濃度小于0.025％。自發(fā)性高血壓大鼠通過靜注給藥，對血壓的影響在注射后至少觀察2小時。在對照組和試驗組中，每個大鼠的劑量為0.00001、0.00002、0.000025和0.00005毫摩爾。所有大鼠相互間體重的差異在25g以內(nèi)。
結(jié)果如圖1所示，在三個低濃度中，氘代硝苯地平的降壓作用大于普通硝苯地平(P＝0.08，wilcoxon秩和檢驗)，根據(jù)上述劑量的實驗結(jié)果計算大鼠的半數(shù)有效劑量(ED50)如下(1).氘代硝苯地平的Log ED50為-4.48(95％的可信限為-4.53至-4.43)；(2).普通硝苯地平的Log ED50為-4.36(95％的可信限為-4.40至-4.31)。由于可信限區(qū)間不重疊，兩種硝苯地平產(chǎn)品的效能存在統(tǒng)計學上的差異，氘代的硝苯地平出乎意料地具有更強的效能。
采用全細胞斑片鉗方法研究氘代硝苯地平對鈣通道阻斷活性詳述如下例3采用NIE-115細胞(成神經(jīng)細胞瘤細胞株)及常規(guī)組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化和傳代后6-8小時用于實驗，在這種情況下，表達的主要鈣通道為T型，并用于本實驗研究。運用下列電極內(nèi)、外液進行斑片鉗實驗外液組成(mM)BaCl220，Tris105，KCl 5，CsCl 5，HEPES 20，葡萄糖20和河豚毒0.0005。內(nèi)液組成(mM)CsCl 130，ATP-Na22，HEPES 20，葡萄糖5，MgCl25，CAMP 0.25，和EGTA10。所有溶液的滲透壓調(diào)節(jié)至310-320毫滲克分子，按需要采用鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化銫或氫氧化鋇調(diào)節(jié)pH至7.4。將含有細胞的平板碟置于倒置式相差顯微鏡平臺上。電極用薄壁硼化硅玻璃制備，用微操縱器將含內(nèi)液的電極移置于選定的細胞表面，用負壓吸引使膜片形成20-30GΩ的阻抗。試驗脈沖波寬200ms，增幅為10mv，為使通道恢復兩次脈沖間隔至少5秒。根據(jù)內(nèi)向峰電流測定基礎通道活性，加入硝苯地平溶液使之達到確定的濃度，經(jīng)3分鐘使藥物達到平衡濃度。然后再次測定電流-電壓關系，實驗結(jié)果用對照電流值的百分比表示(例100％表示對通道沒有阻斷活性)。
初步結(jié)果顯示在1×10-6和1×10-5兩個濃度氘化和非氘化硝苯地平對通道傳導性的作用沒有統(tǒng)計學差異(分別為70％比77％和35％比43％，P值不顯著)。但是，兩種硝苯地平化合物對通道激活的依賴性確實存在著差別。通常情況下，普通硝苯地平的阻斷活性依賴于通道的激活狀態(tài)(一般情況下，在通道更為激活時，阻斷作用增強)。在氘代硝苯地平則觀察不到這種作用；而顯示出持續(xù)性最大作用，與通道的狀態(tài)無關。這一結(jié)果提示，即使效能沒有差異，氘代硝苯地平與鈣通道的結(jié)合是被增強的。在臨床上，這意味著氘代硝苯地平具有更長的受體半衰期，或者說它可能在很大的血壓范圍內(nèi)均有穩(wěn)定的效果。(一般情況下，血壓越高，鈣通道阻斷劑的降壓作用越強)?？梢灶A見，氘代硝苯地平對患有高血壓的病人將以相似的方式產(chǎn)生作用。
人們已經(jīng)注意到氘代一個或多個已知藥物化合物中的氫原子可以增強或改變這些化合物的活性。相信用不同的同位素取代化合物中一個或多個其它原子同樣改變這些化合物的活性。眾周所知，其它原子，如碳、氮、氧、錫等也存在不同原子質(zhì)量的種屬，這些原子的不同種屬即為同位素，它們之間的差別僅為原子核中中子數(shù)量不同。
例4鈣通道抑制-再激活的作用依賴性可使鈣通道的內(nèi)向峰電流逐漸降低。這種作用在通道刺激頻率較大的情況下更為明顯。在一種“使用依賴性”拮抗劑存在時，重復刺激可使電流降低作用增強。使用依賴性是指在連續(xù)通道激活過程中，拮抗劑累積結(jié)合逐漸少量地增加，例如鈣通道在2或3個通道激活后，抑制作用可以達到穩(wěn)態(tài)，使用依賴性現(xiàn)行的概念為一種已知的拮抗劑(藥物)對激活通道具有更強的結(jié)合力。一個藥物表現(xiàn)出較強的使用依賴性通道抑制作用，則對激活的鈣通道具有較強的親和力。
在下列一組例子中，采用一定間隔的多重電流脈沖使鈣通道去極化。這一實驗研究用全細胞斑片鉗進行，在沒有任何藥物的情況下作為對照值，以內(nèi)向電流的減少作為脈沖間隔時間的函數(shù)。對照(例如非氘代)和氘代硝苯地平5μM加入細胞液中，從內(nèi)向電流的降低作為刺激頻率的函數(shù)(例如，使用依賴性)，然后對兩種硝苯地平樣品進行比較。
圖2顯示對照硝苯地平(B)和氘代硝苯地平(D)對NIE 115細胞T型鈣通道的使用依賴性抑制作用。該圖表明了內(nèi)向電流及其硝苯地平對它的抑制作用。隨著刺激頻率的增加，內(nèi)向電流依照重復刺激而降低(使用依賴性)。硝苯地平對內(nèi)向電流有降低作用，但是，在增加刺激頻率時，氘代硝苯地平較對照硝苯地平具有更強的作用(C)。這些區(qū)別在圖3-5中得到了進一步的顯示。
圖3顯示了兩種硝苯地平對重復間隔1秒的脈沖(去極化)引起內(nèi)向電流的抑制作用。在這種脈沖頻率下，氘代硝苯地平對鈣電流的阻斷作用較對照電流更強(P＜0.05通過重復測定方差分析)。兩組的硝苯地平濃度均為5μM。
圖4顯示兩種硝苯地平對以鈣電流抑制作用作為脈沖頻率函數(shù)的影響。在1和0.3秒間隔時，氘代硝苯地平對鈣通道的阻斷作用較對照硝苯地平更強。
圖5顯示兩種硝苯地平對使用依賴性的影響。在所有的頻率中，氘代硝苯地平均表現(xiàn)出更強的使用依賴性鈣通道抑制作用。隨著刺激頻率的增加，這種抑制作用更為明顯。根據(jù)上述結(jié)果，氘代硝苯地平顯示出更強的鈣通道使用依賴性抑制作用。這表明隨著刺激頻率的增加，氘代硝苯地平對鈣通道的阻斷作用較普通硝苯地平更強。由于在病理狀態(tài)下，鈣通道的激活更多如高血壓或心絞痛，所以預期氘代硝苯地平比普通硝苯地平對這些疾病更為有效。在非病理狀況下，通道的激活不多，因此，氘代硝地平的活性與普通硝苯地平相近。這種特征極具吸引力，因為它意味著藥物(如氘代硝苯地平)的相對效能將直接按照病情嚴重性變化。在這種情況下，藥物似乎“知道”需要降低血壓多少程度以達到特定血壓水平的目標。目前，隨著病情(如高血壓、心絞痛)嚴重性的增加，所需用于治療這些疾病的硝苯地平劑量也隨之增加。對于氘代的硝苯地平，則情況將不同。
例5氘代和對照硝苯地平對正常SD大鼠血壓的影響。對照和氘代硝苯地平溶解于最小體積的乙醇中，稀釋后使乙醇的濃度小于0.04％，SD大鼠用苯巴比妥麻醉，體重為300～350g，兩種硝苯地平按規(guī)定劑量1毫升劑量注射給藥，通過動脈導管直接測定平均動脈壓的最大變化和降壓作用的延續(xù)時間。每個大鼠給予一個藥物劑量，且至少用60分鐘使血壓恢復到基礎水平。圖中顯示的結(jié)果討論如下在每個時期中，氘代硝苯地平的作用持續(xù)時間較對照硝苯地平更長。但是，由于反應的時間依賴于降壓幅度，所以對兩種樣品等效劑量進行比較。比較結(jié)果，對照硝苯地平濃度為2×10-3摩爾，氘代硝苯地平濃度為1×10-3摩爾(相對效能-45.8比-40.3mmHg，對照與氘代比較P值不顯著)。在這些劑量中，盡管降壓作用相同，但對照硝苯地平作用的持續(xù)時間為46.5分鐘，而氘代硝苯地平的作用時間為62.2分(P＝0.02)。這表明氘代硝苯地平作用時間大于對照硝苯地平，而與降壓效應無關(即效能和作用的持續(xù)時間二者不同)。
圖6顯示對照和氘代硝苯地平對平均血壓的影響圖6(a)示實測結(jié)果，圖6(b)示對數(shù)劑量-效應回歸數(shù)據(jù)的擬合曲線。每個試驗劑量共6個大鼠。如圖所示，所有劑量的氘代硝苯地平的效能均強于對照硝苯地平(P＜0.05通過重復測定方差分析)。MAP＝平均動脈壓。
圖7顯示用不對稱模型擬合的對照和氘代硝苯地平濃度-效應關系。所示為擬合值加95％的可信限。從這兩圖看，由于可信限不重合，所以很明顯，兩種硝苯地平的濃度—效應關系是不同的。為了精確起見，運用下列方程式同曲線擬合y＝a＋b(1－(1＋實驗值((x＋dln(2l/e－1)－c)/d))-e)。
在此基礎上，參數(shù)a、b和c均具有統(tǒng)計學差別(在P＜0.05水平上)。圖8顯示用對數(shù)劑量反應模型擬合的對照硝苯地平和氘代硝苯地平的濃度-效應關系。所示為擬合值加95％可信限。從這兩圖可知，由于可信限不重合，兩種硝苯地平的濃度-效應關系是明顯不同的。為了精確，用方程式y(tǒng)＝a＋b/(1＋(x/c)d)進行曲線擬合。結(jié)果表明參數(shù)a和b均有統(tǒng)計學差異，(在P＜0.05水平上)。
例6氘代和對照尼卡地平的正常SD大鼠血壓的影響。對照和氘代尼卡地平(制法和氘代硝苯地平相似，下面將有描述)溶解于最小體積的乙醇中，稀釋后使乙醇的終濃度小于0.04％。SD大鼠苯巴比妥麻醉，體重為300～350g，兩種尼卡地平的下述劑量經(jīng)注射給藥。通過動脈導管直接測定平均動脈壓的最大變化和降壓作用的持續(xù)時間，每個大鼠僅給予一個藥物劑量，且至少用60分鐘使血壓恢復到基礎水平。
效能—圖9a和9b顯示對照和氘代尼卡地平的劑量—反應關系。盡管曲線的可信限區(qū)間相互重疊，但ED16；ED50和ED84的統(tǒng)計學比較有以下的差別
95％CI＝95％可信限區(qū)間從上表可見，兩個藥物的ED16和ED84可信限區(qū)間互不相交。這表明劑量反應關系的性質(zhì)是不同的，不同的斜率函數(shù)也證明了這一點，對照尼卡地平為416而氘代尼卡地平為46(用Litchfield-wilcoson法計算)，這說明兩個藥物的效能是不同的。
以劑量和藥物作為自變量，平均動脈壓的降低作為應變量進行二維變異分析，結(jié)果如下列方差分析表因素 自由度方差和平均方差 F值 P值藥物1323323 3.110.082劑量17 5531 3255 30.80.0001藥物×劑量 17 6464 380 3.6 0.0001盡管藥物間的差異在P＜0.05水平無顯著性(但在0.1水平有顯著性)，這可能是由于許多劑量均接近ED50，ED50處的曲線沒有差別。在藥物與劑量間存在著明顯相互作用，這表明劑量—反應曲線的性質(zhì)是不同的。
作用持續(xù)時間—在大部分的時間內(nèi)，氘代尼卡地平較對照尼卡地平的作用持續(xù)時間更長(圖10)。由于效應的持續(xù)時間依賴于降壓的幅度，所以對兩種藥物的等效劑量進行比較。在這一比較中，對照尼卡地平劑量為1×10-9摩爾，氘代尼卡地平劑量為3×10-9摩爾(相對效能-13.8比-13.8mmHg，對照與氘代比較P值不顯著)。在這些劑量中，盡管降壓作用相同，但對照尼卡地平作用的持續(xù)時間為5.4＋3.8(標準差)分鐘，而氘代尼卡地平作用持續(xù)時間為15.0＋6.4(標準差)分鐘，(P＝0.049)。這表明氘代尼卡地平作用時間大于對照尼卡地平，而與降壓效應無關。
以劑量和藥物作為自變量，作用時間作為應變量進行二維變異分析，比較作用持續(xù)時間，結(jié)果如下列方差分析表因素 自由度 方差和 平均方差F值 P值藥物 1 5697 5697 24.0 0.0001劑 14 682924878 20.6 0.0001藥物×劑量 14 10678237 3.20.0002這些結(jié)果表明兩種藥物的作用持續(xù)時間存在顯著差異。同樣，劑量—作用時間關系曲線的性質(zhì)也是不同的。
根據(jù)以上的數(shù)據(jù)，在降壓的劑量—效應關系和劑量—作用時間關系方面，氘代尼卡地平有別于對照尼卡地平。
例7制備氘代尼卡地平尼卡地平(和其他二氫吡啶)的此種變化可由尼卡地平溶于氘化管中的氘代氯仿和重水混合物中，然后加入等量的三氟醋酐和氘代丙酮混和，混和后管內(nèi)的溶液被冷凍，最好將管子浸入液氮中然后封口，封管被加熱，加熱溫度范圍從大約50°至65℃，最合適范圍大約55°至60℃，在此溫度下維特足夠時間使尼卡地平上2-位和6-位甲基氘代為CD3，大約150至180小時反應完全，更合適的反應時間大約為160至170小時。
用下述方法合成氘代尼卡地平放置80毫克粉狀尼卡地平于特殊氘化管中并溶于2毫升氘代氯仿和0.5毫升重水混合物中，加畢后，將0.2毫升三氟醋酐和2毫升的氘代丙酮加入到上述溶液中。溶液用液氮冷凍，在氮氣流下用火將管口封住。然后封管在57℃反應168小時，反應畢將管子冷卻并打開封管。反應物轉(zhuǎn)入到園底燒瓶中，溶劑在減壓下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去。所有操作在減壓和避光下進行。使用常規(guī)的1H核磁共振(NMR)測定出上述C-2和C-6甲基95％被氘取代。
二氫吡啶環(huán)上與2-位和6位連接的甲基上的氫被氘取代導致極大的效果，已知所有二氫吡啶類鈣通道阻斷劑，至少在這些位置上有一個甲基(事實上，除氨氯地平則只有一個6-位甲基外，所有二氫吡啶都有2個甲基，有趣的是2-位甲基由CH2OCH2CH2NH2取代，大大地增加了這—二氫吡啶的作用持續(xù)時間。)任何其他二氫吡啶的這些基團被氘取代，預計將產(chǎn)生與硝苯地平同樣結(jié)果。
例8氘代和對照維拉帕米對正常SD大鼠血壓的影響。
氘代維拉帕米—將維拉帕米加入到體積百分濃度為25％的氘代硫酸/重水和氘代甲醇溶液中，在90℃攪拌140小時。pH值調(diào)節(jié)到12.0后，以乙酸乙酯提取混合物。合并的提取液經(jīng)水洗、干燥(硫酸鎂)和濃縮后得粘性油狀物。此油狀物溶于乙醚后再加入鹽酸乙醚以析出產(chǎn)物的鹽酸鹽沉淀，經(jīng)濾集和以乙酸乙酯重結(jié)晶獲氘代維拉帕米鹽酸鹽白色固體。
對照和氘代維拉帕米(在維拉帕米的苯環(huán)上氘代)溶解于最小體積的乙醇中，稀釋后使其最終濃度小于0.04％。SD大鼠體重在300～350g之間，用苯巴比妥麻醉，兩種維拉帕米經(jīng)注射給藥。通過動脈導管直接測定平均動脈壓的最大變化和降壓作用的持續(xù)時間。每個大鼠僅給予一個藥物劑量，且至少觀察60分鐘使血壓恢復到基礎水平。
在每個劑量中，氘代維拉帕米的作用(效能)小于對照維拉帕米(見圖11)。按照劑量反應，以大約-90mmHg作為最大效應，對照維拉帕米的ED50為2.89×10-4mM，而氘代維拉帕米ED50為2.16×10-3mM。這種差異，以及用Litchfield-wilcoxon分析整個劑量效應曲線的差異均是有顯著性的。用這種技術測定的氘代與對照維拉帕米的效能比為0.133(95％可信限區(qū)間為0.07～0.25，p＜0.01)。這表明氘代維拉帕米的效能較對照維拉帕米的小。
按照作用持續(xù)時間以Litchfield-Wilcoxon分析，氘代維拉帕米的作用持續(xù)時間更長(見圖12)。此外，劑量-時間曲線也有顯著差異，得出的氘代與對照維拉帕米的效能比為4.95(95％可信限區(qū)間2.3～10.7，P＜0.01)。用另一種方法比較，在等效劑量對照維拉帕米為0.3×10-4mM，氘代為0.3×10-3M，降壓幅度分別為-52.8mmHg和-57.0mmHg)時，氘代與對照維拉帕米作用持續(xù)時間為12.5比6分鐘(P＜0.01)。
這些結(jié)果提示，氘代可使效能和作用持續(xù)時間發(fā)生改變。與二氫吡啶類相比，氘代可使作用時間延長，但不同于二氫吡啶類是效能降低。根據(jù)氘代的位點，效能可能被增強。
綜上所述，(1).氘代(對所有的試驗藥物來源)使作用持續(xù)時間延長；(2).氘代影響效能在二氫吡啶類效能增強在維拉帕米(一種苯烷基胺)則減弱；(3).二氫吡啶類的使用依賴性改變(未測維拉帕米)。
用同位素延長藥物的作用持續(xù)時間。引言藥物制造商經(jīng)?；M數(shù)百萬美元來研究藥物使其具有更長的作用時間。有這樣幾個原因值得人們?nèi)で缶哂休^長作用時間的藥物，如延長有益的治療效果；新藥劑型得到的新專利使得享有的藥品市場得到保護；增加病人對藥物的接受(以每天一次的劑型替代每天三或四次的劑型使服藥更為方便)。
三種試驗藥物(如硝苯地平、尼卡地平、維拉帕米)現(xiàn)均用于高血壓的治療。由于在北美心血管疾病是死亡的主要原因，而高血壓是主要的危險因子，使用這些藥物的病人在他們的血液保持藥物濃度，以使他們在一天24小時中能抵御高血壓的影響是很重要的。盡管一些廠商提供了一天中服用二、三或四次的制劑，但也有一些廠商通過改變劑型來制造具有更長作用時間的藥物(半衰期較長)。這些劑型改變包括內(nèi)含減緩藥物釋放的賦型劑，制劑的包衣、更新的制劑(如滲透泵)和包被顆粒。許多發(fā)展和制造這些制劑改變的費用是極其昂貴的。
利用這里披露的氘代藥物，我們證明可以改變多種不同類型的藥物(例如1，4-二氫吡啶和苯烷基胺)并且相信這種改變適用于所有藥物，因為藥物雖不同但它的原理是相同的。不被理論所束縛，通過藥物的氘化，我們認為很可能產(chǎn)生兩種作用增加分子的親脂性質(zhì)，并使C-H鍵的H被氘取代后熱力學更加穩(wěn)定。
前一觀點使藥物分布到較“深”的組織內(nèi)貯芷，(例如脂細胞脂肪)并較長地滯留在體內(nèi)。而后一種想法將更應值得注意。用氘原子取代氫原子得到的碳(C)氘(D)鍵變得更強，對H增加一個原子質(zhì)量單位成D，C-D鍵可更強，這里用D作為氫的非放射性穩(wěn)定性同位素，有意義的是C-D鍵熱力學比C-H鍵更穩(wěn)定，它不易在代謝(或破壞性)過程中斷裂，因此，延長了藥物排泄半衰期，增加了藥物治療效果。雖然我們也觀察到藥效改變，但藥物作用的延長是最主要的，總之，上述被研究的三個化合物通過簡單的D代H，延長了作用維持時間，產(chǎn)生了一種新的“改進釋放”藥物。本方法的另一突出優(yōu)點是避免了目前改進釋放配方中需要加入的一些有毒的賦形劑。
例9化合物的指紋圖，由于藥物的取代基通常是碳、氫、氮、氧等元素而這些元素可能以一種以上的同位素形式存在，這些同位素形式的精確性質(zhì)取決于每一化學品是怎樣和在哪里被制備，特別是，因為生產(chǎn)藥物的每一場所，一般使用當?shù)鼗瘜W供應商供應的原料作為合成的原料，每一個藥物分子有自己的同位素分布形式。一個生產(chǎn)廠生產(chǎn)藥物與市場上的相似藥物比較，可確定第二個藥物由相同生產(chǎn)廠生產(chǎn)還是由另一個廠生產(chǎn)，這是可能的，因為每一藥物有它自己的獨特的同位素分布形式(指紋圖)氣相層析—同位素比質(zhì)譜(GC-IRMS)可用于搞清藥物制備過程中所用原料。雖然普藥在批準上市之前必須通過某些專門試驗，由病人消耗的普藥產(chǎn)品可能和該藥的創(chuàng)制廠商產(chǎn)品質(zhì)量不盡相同。質(zhì)量不同涉及雜質(zhì)或藥物的化學生產(chǎn)過程不同，這種不同不能用標準試驗步驟測出，但可通過用GC—IRMS(上面敘述)檢測來測定藥物分子結(jié)構(gòu)。
綜上所述很顯然含有相同量藥物的制備不一定生物效價相同是不難理解的，這種效價不等可能完全由特定藥物中所有元素的同位素混合物所致。普藥和一個已知具有該藥發(fā)明權(quán)的生產(chǎn)廠生產(chǎn)的藥物之間這種同位素的不同如一種配方被另一配方替代可導致劑量超過可減少，這意味著，例如一個配方換成另一個配方使以前完全控制的心絞痛或高血壓變得不能控制，使得內(nèi)科醫(yī)生感到困惑于為什么藥物不再起到預期的作用。相反，病人以前沒有不良藥物反應而在新配方中開始產(chǎn)生藥物付作用。另外，二個不同配方之間臨床作用的維持時間也有可能不同，按照本發(fā)明具體表現(xiàn)新藥在市場上出現(xiàn)并作為在市場上銷售的某廠商生產(chǎn)已知藥物的同等物銷售，可以及時測定其與已知藥物的等同性。
同位素比質(zhì)譜法的基本原理同位素比質(zhì)譜法是一種高精度的分析方法，它能測定少量樣品(低于毫微克水平)。例如測定單碳分子，二氧化碳氣體的13C/12C的比例。因此，有機碳必須在氧化亞銅上燃燒轉(zhuǎn)化為二氧化碳氣體(Cu2O，在線燃燒爐或者元素分析儀)并經(jīng)冷阱法或色譜法純化，然后此CO2氣體立即直接送入連續(xù)流動同位素比質(zhì)譜測定(也稱CF—同位素比質(zhì)譜)。
二氧化碳中的碳(13C/12C)和氧的同位素(16O、17O、18O)不同組合，會形成具有不同分子量的同位素異構(gòu)物，它們的質(zhì)量分別是44、45、46，所以為了測定碳同位素比，根據(jù)CO2的不同同位素的質(zhì)量把產(chǎn)生的三個離子束強度記錄下來。
為了獲得高精確和高準確度，應用絕對已知同位素組成的為參考氣體和雙路進樣系統(tǒng)將樣品和參考氣體通過氣體開關閥交替進入離子源。測定不同的離子束作為計算樣品中13C的富集度，計算值用δ13C(‰)表示，δ13C豐度用δC(‰)表示δ13C(‰)＝([(13C/12C)樣品/(13C/12C)PDB]-1)×1000δ13C(‰)值是以標準品測定每一千個碳同位素比中的變化。對碳采用PDB作國際標準，PDB是白堊系皮狄層的美洲擬箭石(從南卡羅來納洲白堊系皮狄層形成的化石)。此化石碳酸鈣的13C/12C比例是0.011237，與PDB比較，絕大部分天然化合物為負的δ值。上面方程式中，13C/12C稱作同位素體異構(gòu)。
測定15N不同離子束用δ15N(‰)表示。按照下列方程式15N豐度用δ15N(‰)表示δ15N(‰)＝[(15N/14N樣品)－(15N/14N標準品)/(15N/14N)標準品]×1000δ15N(‰)值是從標準品測定每一千個氮同位素比中的變化部分，對氮，用空氣作為國際參考。
測定18O不同離子束可用δ18O表示，按照下列方程式18O豐度用δ18O(‰)表示δ18O(‰)＝[(18O/16O樣品)－(18O/16O標準品)/(18O/16O)標準品]×1000δ18O(‰)值是從標準品測定每一千個氧同位素比中的變化部分，即氧豐度是由CO2標準品中推得的，對氧用二氧化碳作為國際參考。
同位素比質(zhì)譜儀、設定同位素比質(zhì)譜儀是Finnigan MAT252(Bremen德國)該儀器裝配有雙路進樣裝置和供非氣體樣品引入的元素分析儀。樣品稱取約為10-20微克(μg)放入錫囊中，封口的錫囊置于自動進樣系統(tǒng)中(元素分析儀型號為NA1500Nc，英國Fisons)，樣品用氧氣和氧化催化劑(CrO＋Cu2O)于1080℃下燃燒，純化的二氧化碳用連續(xù)流動同位素比質(zhì)譜儀進行分析，二氧化碳標準品13C Oztech CO2(dc(PDB)＝-36.49‰；do(PDB)＝-25.56‰；do(SMOW)15.06‰)由美國德州達拉斯Oztech貿(mào)易公司獲得。
儀器的安裝高電壓(HV)，10KV；陰極，5.74A；發(fā)射，1.473mA；捕獲發(fā)射，0.937mA；電子能量，75.0-V；捕獲，50.1V。
同位素比質(zhì)譜法在指紋圖中的應用同位素比質(zhì)譜法已用于調(diào)查許多藥品，包括硝苯地平、環(huán)丙氟哌酸、酮基布洛芬、佐匹克隆和醋丁酰心安的產(chǎn)生來源，用此法產(chǎn)生指紋圖是基于例如從CO2氣體中測定13C/12C同位素比，氧和氮的同位素比亦可用于指紋圖。藥物的有機碳在氧化亞銅上燃燒生成CO2氣體，經(jīng)冷阱法或色譜法純化，純化后的CO2氣體經(jīng)由傳輸線直接連續(xù)流入到同位素比質(zhì)譜儀進行分析。
為了保持CO2同位素比測定的高精確度，一個已知同位素組成的參考氣體可通過雙路進樣系統(tǒng)進入同位素比質(zhì)譜儀，該進樣系統(tǒng)使樣品氣體與參考氣體交替輸入同位素比質(zhì)譜儀。分析的結(jié)果為13C/12C比例(δ‰)以下式表示δ‰＝[(R樣品－R標準品)/R標準品]×1000δ‰值大小由測定標準品的一千個碳同位素比的差異確定，此值用作為藥品的指紋。原料(活性成份)和最終產(chǎn)品(例藥片)同被分析，經(jīng)過處理的藥物其分析結(jié)果如下原料和最終產(chǎn)品的同位素比質(zhì)譜分析結(jié)果指紋圖
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**表示只作二次測定，所以標準偏差難提。
從以上資料證實，同位素比質(zhì)譜可被用作從各種不同制造來源的藥物指紋鑒別，這種資料能用于識別生產(chǎn)來源，不論是原料(活性成份)還是最終產(chǎn)品。
圖13表示七種硝苯地平產(chǎn)品的三維指紋圖，這些產(chǎn)品相互之間具有顯著區(qū)別，這種類型的三維指紋圖為藥品或者任何其他物質(zhì)提供最靈敏的指紋特征。
圖14表示九種硝苯地平產(chǎn)品的二維指紋圖，誤差范圍為95％的可信限，所有產(chǎn)品相互之間均有顯著區(qū)別，雖然三維指紋圖更精確，實際上，二維指紋圖一般已足夠區(qū)別不同的材料。
圖15顯示Sotalol粗制片劑的二維指紋圖(氧對碳)雖碳-氧二維指紋圖精確度比碳-氮指紋圖要差，但大部分藥片用該技術能夠相互區(qū)別開來。
圖16顯示三個不同人的三種不同頭發(fā)樣品的指紋圖，就第一個病人而言(pt.1)，一周后所取第二個樣品與第一個樣品比較，比較結(jié)果表明兩個樣品具有統(tǒng)計學上相同值，由此說明本技術重復性好，并能適用于鑒定頭發(fā)樣品。
圖17表示三種酒的二維碳-氧指紋圖，雖其中兩種酒是同樣牌子，但按原產(chǎn)地不同，指紋圖還是能把它們區(qū)別開來。
對上述發(fā)明的進一步變化和改進，對于該領域的熟練技術人員是很自然的，并且這些變化和改進已包括在后附的權(quán)利要求之中。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改由國際局于1996年1月4日收到；原來的權(quán)利要求1-17由修改的權(quán)利要求1-19替換(3頁)1.一個化合物中至少一個氫原子被氘原子取代，所述的化合物是二氫吡啶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫吡啶化合物是具有下列分子式的氘代硝苯地平。 其中至少有一個氫原子是氘原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氘代硝苯地平至少一個甲基是CD3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其甲基連接在二氫吡啶環(huán)的2位和6位上，其中至少一個甲基被CD3取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氘代二氫吡啶是具有下列分子式的氘代硝苯地平。 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫吡啶化合物是硝苯地平，尼卡地平、尼莫地平、尼魯?shù)仄?、尼索地平、尼群地平、非羅地平、意弗拉地平(ifradipine)或氨氯地平。
7.一種制備至少一個氫原子被氘取代的氘代二氫吡啶的方法，包括下列步驟二氫吡啶溶于氘代氯仿和重水的混合物中形成溶液，將三氟醋酐和氘代丙酮加入上述溶液，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，上述溶液在一定溫度下和足夠的反應時間內(nèi)使所述二氫吡啶環(huán)的2-位和6-位的全部氫原子被氘取代，并獲得上述的氘代二氫吡啶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述氘代二氫吡啶為氘代硝苯地平，它的制備方法包括下列步驟將硝苯地平溶于氘代氯仿和重水的混合物中形成溶液，加入三氟醋酐和氘代丙酮到上述溶液中，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，上述溶液在一定溫度下和足夠反應時間內(nèi)使所述硝苯地平2-位和6-位甲基上的氫原子全部被氘取代，并獲得上述的氘代硝苯地平。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法包括下列步驟將80毫克硝苯地平溶于大約2ml的氘代氯仿和大約0.5毫升的重水的混合物中形成溶液，將0.2毫升三氟醋酐和2毫升氘代丙酮加入到上述溶液中并混和，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，在大約50℃-65℃下加熱上述溶液大約150-180小時，冷卻上述加熱溶液，獲得上述的氘代硝苯地平。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述反應溫度大約為55℃至60℃。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述反應時間大約為160小時至170小時。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述反應溫度大約為57℃和反應時間大約為168小時。
13.一種治療動物高血壓的方法，包括給予動物一個治療有效量的氘代硝苯地平，其中至少有一個氘原子取代氫原子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中二氫吡啶環(huán)上2-位和6-位連接的甲基，它們其中至少一個甲基被CD3所取代。
15.檢測藥用的化合物與已知藥用化合物是否等同和/或生物等效的方法，包括下列步驟(a).用氣相層析-同位素比質(zhì)譜法測定所述已知藥用化合物的分子和同位素結(jié)構(gòu)，(b).用氣相層析-同位素比質(zhì)譜法測定所述接受檢測藥用化合物的分子和同位素結(jié)構(gòu)，(c).比較上述兩個測定結(jié)果，以檢測上述藥用化合物對已知藥用化合物分子結(jié)構(gòu)中的任何同位素的變化。
16.至少一個氫原子被氘取代的氘代硝苯地平用作抗高血壓藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗高血壓藥物氘代硝苯地平，其二氫吡啶環(huán)上2-位和6-位連接的甲基至少被一個CD3取代。
18.至少一個氫原子被氘取代的氘代硝苯地平用于制備抗高血壓藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗高血壓藥物氘代硝苯地平，其甲基在二氫吡啶環(huán)上的2-和6-位，其中至少有一個被CD3取代。
權(quán)利要求
1.一個化合物中至少一個氫原子被氘原子取代或至少一個碳原子、氮原子或氧原子被不同的同位素取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物是二氫吡啶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物， 其中所述二氫吡啶是具有下列分子式的氘代硝苯地平； 其中至少一個氫原子是氘原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中所述的氘代硝苯地平中至少有一個甲基是CD3。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中連接在二氫吡啶環(huán)上2-位和6-位的甲基至少一個被CD3取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中所述的氘代二氫吡啶是具有下列分子式的氘代硝苯地平
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述的二氫吡啶是硝苯地平；尼卡地平、尼莫地平、尼魯?shù)仄?、尼索地平、尼群地平、非羅地平、意弗拉地平(ifradipine)或氨氯地平。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備氘代二氫吡啶的方法，包括下列步驟二氫吡啶溶于氘代氯仿和重水的混合物中形成溶液，將三氟醋酐和氘代丙酮加入上述溶液中，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，溶液在一定溫度和足夠的反應時間使所述二氫吡啶的2-位和6-位的全部氫原子被氘取代，獲得所述氘代二氫吡啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述氘代二氫吡啶是氘代硝苯地平及所述方法，包括下列步驟將硝苯地平溶于氘代氯仿和重水的混合物中形成溶液，加入三氟醋酐和氘代丙酮到上述溶液中，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，上述溶液在一定溫度下和足夠反應時間內(nèi)使所述硝苯地平2-位和6-位氫原子全部被氘取代，并獲得上述氘代硝苯地平。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，包括將80毫克硝苯地平溶于大約2毫升氘代氯仿和大約0.5毫升重水的混合物中形成溶液，加入大約0.2毫升三氟醋酐和2毫升的氘代丙酮到上述溶液中，并搖勻混和，冷凍并將上述溶液裝入封管封閉，在大約50℃至65℃下加熱上述溶液大約150小時-180小時，冷卻上述加熱溶液，并獲得上述氘代硝苯地平。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述反應溫度大約為55℃至60℃。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述反應時間大約為160小時至170小時。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述反應溫度大約為57℃，反應時間大約為168小時。
14.一種治療動物高血壓的方法包括給予動物一個治療有效量的具有權(quán)利要求2或5所述分子式的氘代硝苯地平。
15.檢測藥用化合物與已知藥用化合物是否等同和/或生物等效的方法包括下列步驟(a).用氣相層析-同位素比質(zhì)譜法測定所述已知藥用化合物的分子和同位素結(jié)構(gòu)；(b).用氣相層析-同位素比質(zhì)譜法測定所述接受檢測藥用化合物的分子和同位素結(jié)構(gòu)；(c).比較上述兩個測定結(jié)果，以檢測上述藥用化合物對已知藥用化合物分子結(jié)構(gòu)中的任何同位素的變化。
16.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述分子式的氘代硝苯地平用作抗高血壓藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述分子式的氘代硝苯地平用于制備抗高血壓藥物。
全文摘要
一種增強藥物(例如二氫吡啶)效果和延長藥物作用時間的方法，更具體是硝苯地平中的一個或多個氫原子被氘取代，當使用氘代的硝苯地平濃度比硝苯地平低時，氘代硝苯地平的降壓作用有一個意想不到的效果。同時公開了測定新藥的特征和生物等價的方法，它采用氣相層析—同位素比質(zhì)譜法測定新藥的分子和同位素結(jié)構(gòu)并與已知藥物的分子和同位素結(jié)構(gòu)相比較。
文檔編號C07D215/56GK1148843SQ95193186
公開日1997年4月30日 申請日期1995年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月25日
發(fā)明者羅伯特R·福斯特, 理查德·路文祖克, 吉爾斯·凱利 申請人:同位素技術有限公司