專利名稱：刺激和增強保護(hù)性免疫反應(yīng)和il-12產(chǎn)生的化合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般來說，本發(fā)明涉及用于在患者及在分離的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物中刺激免疫反應(yīng)和用于評價Leishmania感染之患者的化合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及及包含與真核起始因子4A(eIF4A)同源的Leishmania braziliensis抗原(LbeIF4A)之全部或部分的化合物，并涉及該化合物在刺激Th1免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的背景Leishmania是巨噬細(xì)胞的專性細(xì)胞內(nèi)原生動物寄生蟲，它引起一系列的人類疾病，包括自體愈合性皮膚損傷，彌散性皮膚和粘膜表現(xiàn)形式以及嚴(yán)重的內(nèi)臟疾病。在過去20年中，利什曼病例數(shù)顯著增大，每年大約診斷出2萬新病例?，F(xiàn)在在全世界存在許許多多的病例，主要在巴西，中國，東非，印度和中東地區(qū)。該疾病在地中海區(qū)域也是一種地方性流行病，包括法國南部，意大利，希臘、西班牙，葡萄牙和北非。
感染人類的Leishmania有20種。在這些種類中，Leishmaniabraziliensis通常引起局部皮膚的利什曼病(CL)?；加蠧L的患者具有強烈的遲后型超敏反應(yīng)(DTH)且在發(fā)作和治愈疾病的過程中對Leishmania抗原具有體外增殖反應(yīng)。大多數(shù)患有CL的病人自發(fā)治愈。然而，在一些感染的患者中，產(chǎn)生發(fā)作性皮膚疾病或粘膜利什曼病(ML)，其特征在于鼻，口和/或咽粘膜出現(xiàn)嚴(yán)重和進(jìn)行性破壞。
對于成功的治療而言利什曼病的早期診斷可能是關(guān)鍵的，但這難以實現(xiàn)，因為該疾病沒有明顯的跡象或癥狀。已使用了寄生蟲檢測法，但這類方法不靈敏或不實用。目前的血清學(xué)試驗(例如，使用ELISA或免疫熒光技術(shù))典型地使用整體或裂解的寄生蟲，但一般不靈敏且證明與其它許多疾病發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，這類方法通常不能足夠早地檢測潛在的致命性疾病以允許進(jìn)行有效治療，因為它們依賴于存在于疾病急性期的抗體的檢測。
在發(fā)作性粘膜疾病的例子中，對Leishmania抗原的皮內(nèi)皮膚試驗和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)異常強。事實上，與粘膜損傷相聯(lián)系的組織破壞可能部分地是對Leishmania抗原的超敏反應(yīng)造成的。然而，對Leishmania之細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中所涉及的特異性抗原尚未得到表征。
因此，在本領(lǐng)域中需要表征免疫反應(yīng)中所涉及的Leishmania抗原，確定它們在疾病表現(xiàn)形式中的作用。還需要鑒定用于評價該疾病早期的患者和用于治療利什曼疾病的改進(jìn)的方法。本發(fā)明滿足了這些需要并進(jìn)一步提供了其它有關(guān)優(yōu)勢。
本發(fā)明的簡述簡單地說，本發(fā)明提供了涉及Leishmania抗原LbeIF4A的化合物和方法、LbeIF4A與真核核糖體蛋白質(zhì)eIF4A具有同源性。在本發(fā)明的一個方面，提從了包含編碼LbeIF4A或其部分或其它變異體之DNA序列的DNA分子。該DNA序列選自(a)SEQ ID NO1的核苷酸115至1323；(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1核苷酸115至1323之互補核苷酸序列雜交的DNA序列，其中DNA序列編碼在從Leishmania感染的個體獲得的外周血單核細(xì)胞中刺激Th1免疫反應(yīng)的多肽；和(c)編碼一種多肽的DNA，該多肽由任意上述DNA序列編碼。
在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了包含上述DNA分子的重組表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞和制備由上述DNA分子編碼之多肽的方法，包含在啟動表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞并回收多肽。還提供了包含由上述DNA分子編碼的氨基酸序列或SEQ ID NO2氨基酸49-403的純化的多肽(或其區(qū)別僅在于保守取代和/或修飾的變異體)。另外，公開了特異性地結(jié)合該多肽的單克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供了評價患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力的方法，包含將從患者獲得的生物學(xué)樣品與本文所述的多肽接觸并測量該細(xì)胞的反應(yīng)。生物學(xué)樣品可包含外周血液單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或其組合。所測量的反應(yīng)可以是(1)增殖反應(yīng)；(2)一種或多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12p70，白細(xì)胞介素-12p40亞基，白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α的分泌；或(3)編碼一種或多種細(xì)胞因子，如干擾素γ，白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素12p40亞基，白細(xì)胞介素，或腫瘤壞死因子α之mRNA的表達(dá)。
還有另一方面，提供了用于增強患者對抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的方法，包含給患者施用本文所述的多肽和抗原。多肽的用藥可與異源性抗原制品結(jié)合，或與其它Leishmania抗原結(jié)合。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于在患者中刺激結(jié)合Leishmania寄生蟲的抗體產(chǎn)生的方法，包含給患者施用本文所述的多肽。
在另一方面，提供了在患者中刺激Th1免疫反應(yīng)，IL-12生產(chǎn)和/或下調(diào)白細(xì)胞介素-10表達(dá)的方法，包含給患者施用本文所述的多肽。在有關(guān)方面，提供了在生物學(xué)樣品中刺激Th1免疫反應(yīng)，IL-12生產(chǎn)，和/或下調(diào)白細(xì)胞介素-10表達(dá)的方法，包含將生物學(xué)樣品與本文所述的多肽接觸。生物學(xué)樣品可包含外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或其組合。
在另一方面，本發(fā)明提供了測定用于制備疫苗組合物之抗原適宜性的方法，包含測定抗原是否能刺激從未感染Leishmania的個體獲得的諸如外周血單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞之類的細(xì)胞生產(chǎn)白細(xì)胞介素-12。
在其它方面中，還提供了包含本文所述的多肽和一種生理上可接受的載體的藥用組合物以及包含本文所述多肽和一種抗原的疫苗。
還有另外一方面，提供了治療患有與IL-12刺激反應(yīng)的疾病的患者之方法，包含給患者施用本文所述的多肽。
參考下面詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將是顯而易見的。本文公開的全部參考文獻(xiàn)以其全文編入以供參考，與單獨分別編入一樣。
附圖的簡要描述

圖1表示Leishmania spp.DNA Southern印跡分析的結(jié)果，顯示了Leishmania eIF4A同源性是保守的且L·braziliensis基因組DNA含至少2個LbeIF4A拷貝。
圖2顯示了免疫印跡分析的結(jié)果，表明LbeIF4A免疫兔血清與不同Leishmania種類～45KDa大小的一種主要蛋白質(zhì)種類反應(yīng)。
圖3表明了純化的重組LbeIF4A刺激L·braziliensis感染的個體PBMC增殖的能力。
圖4A和4B代表經(jīng)分析具有證實為L·braziliensis感染的病人PBMC之細(xì)胞因子mRNA表達(dá)方式所獲得的結(jié)果。
圖5顯示了用LbeIF4A或寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激后L·braziliensis感染的個體PBMC分泌的IFN-γ的上清水平。
圖6顯示了用LbeIF4A或寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激后L·braziliensis感染的個體PBMC上清中檢測到的TNF-α水平。
圖7A-7D顯示了LbeIF4A也刺激患者PBMC在培養(yǎng)上清中分泌IL-12，且在數(shù)量上明顯高于經(jīng)寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激的IL-12水平，且顯示了IL-10抑制這種IL-12的產(chǎn)生。
圖8A和8B顯示了在所有試驗的患者PBMC中，IFN-γ產(chǎn)生是IL-12依賴型且受IL-10抑制。
圖9A和9B顯示了在培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞和貼壁PBMC中LbeIF4A刺激IL-12產(chǎn)生。
圖10顯示了在人髓樣白血病細(xì)胞系THP-1中LbeIF4A刺激IL-12產(chǎn)生且與IFN-γ協(xié)同刺激THP-1細(xì)胞分泌IL-12。
圖11提供的結(jié)果表明用LbeIF4A致敏的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞增殖并分泌幾乎唯一的Th1細(xì)胞因子分布型。而用另一重組L·braziliensis抗原(8E)致敏的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞取決于所用的佐劑產(chǎn)生Th0或Th1/Th2型細(xì)胞因子分布型，而用寄生蟲溶胞產(chǎn)物致敏的小鼠產(chǎn)生混合的細(xì)胞因子分布型。
圖12表明在認(rèn)為與人疾病有關(guān)的動物模型中LbeIF4A對L.major感染提供明顯的保護(hù)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明涉及在評價患者及刺激和增強在患者及分離的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物之免疫應(yīng)答中有用的化合物和方法。本發(fā)明的化合物一般包括在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中刺激Th1免疫反應(yīng)的多肽或編碼該多肽的DNA序列。具體地說，公開了包含Leishmaniabraziliensis同源的真核核糖體蛋白質(zhì)eIF4A全部或刺激部分的多肽(本文稱為LbeIF4A)。本文所用的術(shù)語“PBMC”指存在于外周血中的核細(xì)胞制品。在本發(fā)明說明書中的術(shù)語“多肽”包含任意長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質(zhì)和其部分，其中氨基酸殘基由共價肽鍵連接。因此，“LbeIF4A多肽”包含LbeIF4A或其保留刺激活性的部分或其它變異體。優(yōu)選的是，該多肽基本上不含污染的內(nèi)源材料。還公開了該多肽用于評價患者免疫反應(yīng)和用于刺激和增強各種免疫反應(yīng)的用途。
本發(fā)明的多肽包括保留在PBMC中刺激Th1免疫反應(yīng)之能力的LbeIF4A變異體。這類變異體包括前面蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)形式。例如，由于可離子化的氨基和羧基存在，LbeIF4A多肽可以是酸性或堿性鹽的形式，或可以是中性形式。單個的氨基酸殘基也可以經(jīng)氧化或還原修飾。
本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體還包括LbeIF4A一級氨基酸結(jié)構(gòu)或其片段經(jīng)過與其它多肽或諸如糖基，脂，磷酸，乙?；皖愃频幕瘜W(xué)基團(tuán)形成共價鍵或聚集連接物而修飾的多肽。例如經(jīng)過將特定的功能基團(tuán)與氨基酸側(cè)鏈或N或C端連接可制備共價衍生物。作為選擇，對于多肽連接到LbeIF4A多肽上的衍生物，可使用如下所述的重組DNA制備融合蛋白質(zhì)。在一個這類實施方案中，LbeIF4A多肽可在該蛋白質(zhì)的N端區(qū)域連接到信號(或先導(dǎo))多肽序列上，經(jīng)共同翻譯或翻譯后指導(dǎo)該蛋白質(zhì)從其合成位點轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜或壁內(nèi)部或外部的其功能位點處(例如，酵母α-因子先導(dǎo)序列)。
本發(fā)明的融合蛋白還可包含為利于LbeIF4A多肽純化或鑒定而加上的肽(例如，多聚His)。例如，Hoppetal.，Bio/Techno1ogy 61204(1988)所述的肽是高抗原性肽，可用于幫助鑒定。這種肽提供了經(jīng)特異性單克隆抗體可逆結(jié)合的抗原決定基，能迅速測定并利于表達(dá)的重組蛋白質(zhì)純化。Hopp等的序列也能被牛粘膜腸激酶特異性地裂解，允許從純化蛋白質(zhì)上去掉該肽。前面加上該肽的融合蛋白質(zhì)還可抵抗大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)降解。
例如，本發(fā)明包含的融合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括與免疫球蛋白Fc區(qū)域連接的LbeIF4A多肽。如果用抗體重鏈和輕鏈制備LbeIF4A融合蛋白質(zhì)，可形成具有4個LbeIF4A蛋白質(zhì)區(qū)域的蛋白質(zhì)寡聚體。在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有與亮氨酸拉鏈區(qū)連接的LbeIF4A多肽。亮氨酸拉鏈區(qū)的描述，例如可見公開的PCT申請WO94/10308。例如，包含亮氨酸拉鏈的LbeIF4A多肽可以是寡聚體，二聚體或三聚體。所有上面融合蛋白質(zhì)可經(jīng)過化學(xué)鏈或作為融合蛋白質(zhì)制備，如下面所述。
本發(fā)明還包括具有或不具有與天然型糖基化相關(guān)的LbeIF4A多肽。在酵母或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多肽取決于表達(dá)系統(tǒng)可以在分子量和糖基化型式上與天然分子相似或稍有不同。例如，在諸如大腸桿菌的細(xì)菌中編碼LbeIF4A多肽的DNA的表達(dá)產(chǎn)生未糖基化的分子。真核蛋白質(zhì)的N-糖基化位點特征為氨基酸三聯(lián)體Asn-A1-Z，其中A1是除Pro外的任意氨基酸，Z是Ser或Thr。具有滅活的N-糖基化位點的LbeIF4A多肽的變異體可用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的技術(shù)來生產(chǎn)，如寡核苷酸合成和連接或位點特異性誘變技術(shù)，這些都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為選擇，N-連接的糖基化位點可加到LbeIF4A多肽上。
本發(fā)明的多肽也包括由于一個或多個缺失，插入、取代或其它修飾具有不同于天然LbeIF4A蛋白質(zhì)的氨基酸序列的LbeIF4A多肽變異體。這類變異體應(yīng)與天然LbeIF4A基本上同源并應(yīng)保留在PBMC中刺激Th1免疫反應(yīng)的能力。本文所用的“基本上同源”指氨基酸序列可被在中等嚴(yán)格條件下能與天然存在的編碼LbeIF4A的DNA序列雜交的DNA序列編碼。合適的中等嚴(yán)格條件包括在5xSSC，0.5％SDS，1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗滌；在50℃-65℃，5xSSC下雜交過夜，接著在65℃洗滌2次20分鐘，每次用含0.1％SDS的2x，0.5x和0.2xSSC)。這種雜交DNA序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，與由于密碼簡并，編碼刺激多肽的核苷酸序列一樣，該刺激多肽由雜交DNA序列編碼。使用(例如)任何本文所述的方法，經(jīng)過分析突變的LbeIF4A多肽誘導(dǎo)Th1反應(yīng)的能力易于測定任何這類修飾對LbeIF4A多肽活性的影響。
一般來說，應(yīng)進(jìn)行保守性氨基酸取代，即取代氨基酸應(yīng)替換具有相似特性的氨基酸，以便肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)期多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本上不改變。一般來說，下面氨基酸基團(tuán)代表保守性改變(1)ala，pro，gly，glu，asp，g1n，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)Val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；(5)phe，tyr，trp，his?；蜃鳛檫x擇，本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體還可含有其它修飾，包括氨基酸的缺失或增加，這類修飾應(yīng)對多肽的刺激特性，二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)影響最小。一般來說，LbeIF4A片段可經(jīng)過缺失末端或內(nèi)部殘基或序列來構(gòu)建。對于合適修飾的其它指導(dǎo)可經(jīng)過比較LbeIF4A的序列與其它eIF4A家族成員的序列和結(jié)構(gòu)來獲得。例如，可缺失為生物學(xué)活性所不需要的LbeIF4A的末端或內(nèi)部殘基或序列?？扇笔Щ蛴闷渌被崽鎿Q半胱氨酸殘基以防止因復(fù)性形成錯誤的分子內(nèi)二硫橋鍵。誘變的其它方法涉及相鄰雙堿性氨基酸殘基的修飾以增強在存在KEX2蛋白酶活性的酵母系統(tǒng)中的表達(dá)。
一般可使用基因組成編碼蛋白質(zhì)的cDNA克隆獲得LbeIF4A全長蛋白質(zhì)。編碼全長LbeIF4A的基因組序列在SEQ ID NO1中表示，推斷的氨基酸序列在SEQ ID NO2中提供?？山?jīng)過篩選合適的Leishmania braziliensis表達(dá)文庫以獲得表達(dá)與患有粘膜利什曼病的患者血清反應(yīng)的抗原，然后分析該反應(yīng)性抗原在患者T細(xì)胞試驗中刺激增殖反應(yīng)和優(yōu)先產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子的能力來分離這類克隆。該文庫的制備和篩選一般可使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，如在Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manu-al，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold，Spring Harbor，N.Y.，1989中描述的方法，本文引用以供參考。簡單地說，可平板培養(yǎng)噬菌體表達(dá)文庫并轉(zhuǎn)移到濾膜上。然后將濾膜與血清和檢測試劑保溫。在本發(fā)明的說明書中，“檢測試劑”是能與抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合的任意化合物，它能以本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何方法檢測。典型的檢測試劑含有一種“結(jié)合劑”，如蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)G，IgG或植物凝血素，它與報道基團(tuán)偶聯(lián)。優(yōu)選的報道基團(tuán)包括酶，底物，輔助因子、抑制劑、染料，放射性核素，發(fā)光基團(tuán)，熒光基團(tuán)和生物素。更優(yōu)選的是，報道基團(tuán)是辣根過氧化物酶，它可以經(jīng)過與諸如四甲基聯(lián)苯胺或2，2′-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉磺酸的底物保溫來檢測。以本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離和純化含有表達(dá)與血清中抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列的噬菌斑。例如，可在Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中發(fā)現(xiàn)合適的方法。
一般可經(jīng)過用反應(yīng)性抗原處理患者PBMC并分析細(xì)胞的合適反應(yīng)進(jìn)行患者T細(xì)胞試驗。例如，可測定PBMC上清中分泌的細(xì)胞因子水平。優(yōu)選的是，測定的細(xì)胞因子是干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2；白細(xì)胞介素-12(p40亞基或生物學(xué)活性p70)，白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α。例如，使用以商業(yè)途徑得到的對目的細(xì)胞因子特異性的抗體以ELISA形式測定細(xì)胞因子，根據(jù)廠家說明書測定為陽性結(jié)果。例如，可從Chemicon，Temucula，CA和PharMingen，SanDiego，CA獲得合適的抗體。作為選擇，可測定處理的PBMC編碼一種或多種細(xì)胞因子干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12p40亞基，白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α的mRNA，或按本文所述測定PBMC的增殖反應(yīng)。
在PBMC中保留刺激Th1免疫反應(yīng)之能力的LbeIF4A變異體可經(jīng)過修飾在上述一個或多個方面的序列并測定所得多肽刺激Th1反應(yīng)的能力來鑒定。這類測定一般可經(jīng)過用修飾的多肽處理患者PBMC并測定反應(yīng)來進(jìn)行，如上所述。
上述序列修飾可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)或經(jīng)過修飾的多肽的自動合成來導(dǎo)入。例如，可經(jīng)過合成含突變序列的寡核苷酸，在側(cè)翼加上利于與天然序列片段連接的限制性位點在特定的位置導(dǎo)入突變。連接后，所得的重組序列編碼具有所述氨基酸插入、取代或缺失的類似物。
作為選擇，可使用位點特異性核苷酸誘變程序提供根據(jù)所需取代，缺失或插入改變特定密碼子的基因。上面闡述的進(jìn)行改變的方法例子由Walder et al.，Gene 42133，1986；Bauer et al.，Gene 3773，1985；Craik，BioTechniques，January 1985，12-19；Smith et al.，Genetic Engineering；Principles and Methods，Plenum Press，1981；和U.S.Patent Nos.4,518,584和4,737,462公開。
當(dāng)然，在為表達(dá)該LbeIF4A多肽而構(gòu)建的核苷酸序列中的突變必須保存編碼序列的閱讀框，優(yōu)選不產(chǎn)生能雜交產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)(如環(huán)或發(fā)夾)，對受體mRNA翻譯有不利影響的互補區(qū)域。盡管可預(yù)測突變位點，但預(yù)測突變本身的性質(zhì)是不必要的。例如，為了在給定位點選擇突變的最佳特征，可在靶密碼子處進(jìn)行隨機(jī)誘變并針對所需活性篩選表達(dá)的IbeIF4A蛋白質(zhì)突變體。
在編碼LbeIF4A蛋白質(zhì)的核苷酸序列中并不是有突變都在終產(chǎn)物中表達(dá)。例如，可進(jìn)行核苷酸取代以增強表達(dá)，主要是避免在轉(zhuǎn)錄的mRNA中的二級結(jié)構(gòu)環(huán)(例如，見歐洲專利申請75，444A)，或提供更易于被選定宿主翻譯的密碼子，如大腸桿菌表達(dá)的熟知的大腸桿菌優(yōu)選密碼子本發(fā)明的多肽(天然存在的和修飾的)優(yōu)選經(jīng)過重組DNA方法產(chǎn)生。該方法包括將編碼LbeIF4A多肽的DNA序列插入重組表達(dá)載體中并在啟動表達(dá)的條件下在重組微生物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)DNA序列。編碼由本發(fā)明提供的多肽的DNA序列可從cDNA片段和短寡核苷酸連接子或從一系列寡核苷酸裝配以提供能插入重組表達(dá)載體中的合成基團(tuán)并在重組轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)。
重組表達(dá)載體含有有效連接到來自哺乳動物，微生物，病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件上的編碼LbeIF4A多肽的DNA序列。這類調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子，任選控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列，編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列，如下面的詳細(xì)描述。另外可插入復(fù)制起點和利于轉(zhuǎn)化子識別的選擇性標(biāo)記。
當(dāng)它們在功能上互相相關(guān)時DNA區(qū)域有效連接。例如，信號肽(分泌先導(dǎo)序列)DNA與多肽DNA有效連接的條件是它作為參與多肽分泌的前體表達(dá)；啟動子與編碼序列有效連接的條件是它控制該序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點與編碼序列有效連接的條件是它被定位以便能翻譯。一般來說，有效連接指(在分泌先導(dǎo)序列的情況下)在閱讀框中連續(xù)。編碼在微生物中表達(dá)的LbeIF4A多肽的DNA序列優(yōu)選不含可能在成熟前終止DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的內(nèi)含子。
細(xì)胞使用的表達(dá)載體可包含可選擇的標(biāo)記和來自包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)遺傳元件的商業(yè)上可得到的質(zhì)粒的復(fù)制起點。例如，這種商業(yè)載體包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotee，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動子和所要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。典型地使用pBR322衍生物，一種來自大腸桿菌種類的質(zhì)粒(Bolivar et al.，Gene 295，1977)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡單手段。
通常用于重組微生物表達(dá)載體的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(chang et al.，Nature 275615，1978；和Goeddelet al.，Nature 281544，1979)，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel et al.，Nucl.Acids Res.84057，1980；和歐洲專利申請36，776)和tac啟動子(Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manu-al，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。特別有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)使用噬菌體1PL啟動子和cI857ts熱不穩(wěn)定性阻遏蛋白。能從美國典型培養(yǎng)物收集中心獲得的插入1PL啟動子衍生物的質(zhì)粒載體包括質(zhì)粒pHUB2(存在于大腸桿菌菌株JMB9(ATCC37092)中)和pPLc28(存在于大腸桿菌RR1(ATCC53082)中)。
在酵母載體中合適的啟動子序列包括用于金屬硫蛋白，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol，Chem.2552073，1980)或其它糖酵解酶(Hess et al.，I.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；和Hollandetal.，Biochem.174900，1978)，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄醣-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。用于酵母表達(dá)的合適的載體和啟動子在R.Hitzeman等的歐洲專利申請73，657中有進(jìn)一步的描述。
使用來自pBR322的在大腸桿菌中選擇和復(fù)制的DNA序列(Ampγ基因和復(fù)制起點)和包括葡萄糖-抑制的ADHZ啟動子和α-因子分泌先導(dǎo)序列的酵母DNA序列裝配優(yōu)選的酵母載體。AD-HZ啟動子已在Russell et al.，J.Biol.Chem.2582674，1982和Beieret al.，Nature 300724，1982中描述。指導(dǎo)異源性蛋白質(zhì)分泌的酵母α-因子先導(dǎo)序列可插到啟動子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因間。例如，見Kurian et al.，Cell 30933，1982；和Bitter et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 815330,1984。先導(dǎo)序列可在靠近其3′端修飾成含有一個或多個有用的限制性位點以利于先導(dǎo)序列與外源基因融合。用于轉(zhuǎn)化脊椎動物細(xì)胞的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可由病毒來源提供。例如，常用的啟動子和增強子來源于多瘤病毒，腺病毒2，猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒。來自SV40病毒基因組，如SV40起點，早期和晚期啟動子，增強子，剪接和多聚腺苷酸化位點的DNA序列可用于提供表達(dá)異源DNA序列所需的其它遺傳元件。早期和晚期啟動子特別有用，因為它們易于從病毒獲得，作為還含有SV40病毒復(fù)制起點(Fiers et al.，Nature 273113，1978)的片段。也可使用更小或更大的SV40片段，只要包括位于病毒復(fù)制起點從HindIII位點到BglII位點的大約250bp的序列。另外，可使用病毒基因組啟動子，控制和/或信號序列，只要該控制序列與選擇的宿主細(xì)胞相匹配。典型的載體可如Okayama and Berg.Mol.Cell.Biol.3280，1983所公開的方法。
可基本上按Cosman et al.，Mol.Immunol.23935，1986所述構(gòu)建在C127鼠類哺乳動物上皮細(xì)胞中穩(wěn)定高水平表達(dá)哺乳動物受體cDNA的有用的系統(tǒng)。用于表達(dá)LbeIF4A蛋白質(zhì)DNA的優(yōu)選的真核載體是pDC406(McMahan et al.，EMBOJ.102821，1991)，且包括來自SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的調(diào)節(jié)序列。其它優(yōu)選的載體包括pDC409和pDC410，它們來自pDC406。pDC410經(jīng)過用編碼SV40大型T抗原的序列取代EBV復(fù)制起點由pDC406產(chǎn)生。pDC409與pDC406的區(qū)別在于缺失了多克隆位點外側(cè)的BglII限制性位點，使在多克隆位點內(nèi)的BglII位點是唯一的。
允許諸如pDC406和pDC409的含有EBV復(fù)制起點的表達(dá)載體附加型復(fù)制的有用細(xì)系是CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-L/EBNA細(xì)胞系經(jīng)過用編碼Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)且在結(jié)構(gòu)上表達(dá)來自人CMV立即早期增強子/啟動子的EBNA-1的基因轉(zhuǎn)換CV-1細(xì)胞系產(chǎn)生。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是以使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明的LbeIF4A多肽之序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可表達(dá)所需的LbeIF4A多肽，但為克隆或擴(kuò)增LbeIF4ADNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不必表達(dá)LbeIF4A蛋白質(zhì)。根據(jù)選定的DNA，表達(dá)的LbeIF4A蛋白質(zhì)優(yōu)選分泌進(jìn)培養(yǎng)物上清，但也可貯存于細(xì)胞膜中。
表達(dá)重組蛋白質(zhì)的合適的宿主細(xì)胞包括在合適的啟動子控制下的原核生物，酵母或高等真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陰性生物，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細(xì)胞包括下面描述的昆蟲或哺乳動物來源的建立的細(xì)胞系。使用來自本文公開的DNA構(gòu)建體的RNA也可用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)LbeIF4A蛋白質(zhì)。描述了用于細(xì)胞，真菌，酵母和哺乳動物細(xì)胞宿主的合適的克隆和表達(dá)載體，例如，見Pouwels et al.，Cloning VectorsA Laboratory Man-ual，Elsevier，New York，1985。
原核表達(dá)宿主可用于表達(dá)不需廣泛蛋白水解和二硫鍵加工的LbeIF4A多肽。原核表達(dá)載體一般包括一個或多個表型可選擇的標(biāo)記(例如，編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需要之蛋白質(zhì)的基因)和一個被宿主識別以保證在宿主內(nèi)擴(kuò)增的復(fù)制起點。用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonelta typhimurium)和假單胞菌，鏈霉菌，葡萄球菌屬的不同種，盡管也可使用其它宿主。
重組LbeIF4A多肽也可在酵母宿主中表達(dá)，優(yōu)選從酵母菌種如釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)。也可使用其它屬，如畢赤酵母屬或克魯維酵母屬的酵母。酵母載體一般含有2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點或自主復(fù)制序列(AR)，啟動子，編碼LbeIF4A多肽的DNA，用于多腺苷化和轉(zhuǎn)錄終止的序列及一個選擇基因。優(yōu)選的是，酵母載體包括一個復(fù)制起點和允許酵母和大腸桿菌轉(zhuǎn)化的可選擇性標(biāo)記(例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母trp1基因，它為在色氨酸中缺乏生長能力的酵母突變株提供選擇標(biāo)記)和一個來自高水平表達(dá)的酵母基因以誘導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1損傷的存在為經(jīng)過在無色氨酸情況下生長檢測轉(zhuǎn)化提供了有效環(huán)境。
合適的宿母轉(zhuǎn)化方案是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。由Hindetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751927，1978描述的技術(shù)例子涉及在由0.67％酵母氮基質(zhì)，0.5％ 酪蛋白氨基酸，2％葡萄糖，10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶組成的選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化子。用包含ADH2啟動子的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株可在由1％酵母提取物，2％蛋白胨，含80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的1％葡萄糖組成的富集培養(yǎng)基中生長進(jìn)行表達(dá)。由于培養(yǎng)基葡萄糖耗盡發(fā)生ADH2啟動子的去阻遏。經(jīng)過濾收獲得粗制的酵母上清液并在進(jìn)一步純化前放置于4℃。
也可使用各種哺乳動物或昆蟲(例如，灰翅夜蛾屬或粉夜蛾屬)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白質(zhì)。用于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)的綜述(例如)可見Luckow and Summers，Bio/Technology 647，1988。合適的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子包括猴腎細(xì)胞cos-7細(xì)胞系(在Gluzman，Cell 23175，1981中描述)和能表達(dá)合適載體的其它細(xì)胞系，例如，包括CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)，L細(xì)胞，C127，3T3，中國倉鼠卵巢(CHO)，COS，NS-1，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體可包括不轉(zhuǎn)錄的元件，如復(fù)制起點，連接到所表達(dá)的基因上的合適的啟動子和增強子和其它5′或3側(cè)翼不轉(zhuǎn)錄序列，和5′或3′不翻譯序列，如必需的核糖體結(jié)合位點，多腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。
可經(jīng)過培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達(dá)本發(fā)明DNA的重組翻譯產(chǎn)物，然后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化來制備純化的LbeIF4A多肽。例如，可使用商業(yè)上可獲得的蛋白濃縮濾器，如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位首先濃縮來自將重組蛋白質(zhì)分泌進(jìn)培養(yǎng)基之系統(tǒng)的上清液。濃縮步驟后，可將濃縮物上樣到合適的純化基質(zhì)上。例如，合適的親和基質(zhì)可包括一種反結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(即根據(jù)結(jié)構(gòu)與LbeIF4A以特異性相互作用結(jié)合的蛋白質(zhì))或植物凝血素或結(jié)合到合適支持物上的抗體分子。作為選擇，可使用陰離子交換樹脂，例如，一種具有下垂的二乙氨乙基(DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)或底物?；|(zhì)可以是丙烯酰胺，瓊脂糖，葡聚糖，纖維素或常用于蛋白質(zhì)純化的其它類型。作為選擇，可使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種不溶性基質(zhì)，包含磺丙基或羧甲基。優(yōu)選磺丙基。凝膠過濾色譜也提供了一種純化LbeIF4A的方法。
親和色譜是特別優(yōu)選的純化LbeIF4A多肽的方法，例如，以包含免疫球蛋白Fc區(qū)之融合蛋白表達(dá)的LbeIF4A多肽可使用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和色譜純化。而且，包含亮氨酸拉鏈區(qū)的LbeIF4A蛋白質(zhì)可在包含對亮氨酸拉鏈區(qū)特異性的抗體的樹脂上純化。經(jīng)過使用本領(lǐng)域熟知的方法抗LbeIF4A蛋白質(zhì)的單克隆抗體在親和色譜純化中也是有用的。
最后，使用疏水RP-HPLC培養(yǎng)基(例如，具有下垂的甲基或其它脂肪族基團(tuán)的硅膠)的一個或多個反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟可用于進(jìn)一步純化LbeIF4A蛋白質(zhì)組合物。以各種組合的一些或全部上述純化步驟也可用于提供同源重組蛋白質(zhì)。
在細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組LbeIF4A多肽優(yōu)選經(jīng)過開始從細(xì)胞沉淀中提取，接著經(jīng)過一步或多步濃縮，鹽拆，含水離子交換或大小排阻色譜步驟分離。高效液相色譜(HPLC)可用于最終純化步驟。用于重組LbeIF4A蛋白質(zhì)表達(dá)的微生物細(xì)胞可經(jīng)過任何常規(guī)方法，包括凍融循環(huán)，聲處理，機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解試劑來破碎。
以分泌的蛋白質(zhì)表達(dá)LbeIF4A多肽的酵母發(fā)酵極大地簡化了純化。由大批量發(fā)酵分泌的重組蛋白質(zhì)可用Urdal et al.，J.Chro-matog，296171，1984所公開的相似的方法純化。該參考文獻(xiàn)描述了在制備HPLC柱上純化重組人GM-CSF的2個連續(xù)的反相HPLC步驟。
在重組培養(yǎng)物中合成的LbeIF4A多肽的制品可含有非LbeIF4A細(xì)胞成份，包括蛋白質(zhì)，其量和特征取決于從培養(yǎng)物中回收LbeIF4A蛋白質(zhì)所用的純化步驟。這些成份一般來源于酵母，原核細(xì)胞或非人類真核細(xì)胞且優(yōu)選以無害污染量存在，其數(shù)量不超過重量的大約1％。這類制品典型地不含其它蛋白質(zhì)，而這類蛋白質(zhì)正常情況下與LbeIF4A蛋白質(zhì)相聯(lián)系，正如實際上在其來源種類中所發(fā)現(xiàn)的。
自動合成提供了制備具有少于大約100個氨基酸，典型的是少于大約50個氨基酸的本發(fā)明的多肽的可供選擇的方法。例如，可使用Merrifietd固相合成方法，其中氨基酸依次加到延長的氨基酸鏈上。見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自動合成的裝置可從諸如Applied Biosystems，Inc.of Foster City，CA的供應(yīng)商以商業(yè)形式買到。
除了上面多肽和DNA序列外，本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用上面所公開的多肽評價免疫反應(yīng)和刺激保護(hù)性免疫反應(yīng)和IL-12產(chǎn)生的方法。在本發(fā)明內(nèi)發(fā)現(xiàn)LbeIF4A含有T細(xì)胞抗原決定基(簇)，它刺激Leishmania感染的個體的PBMC增殖。LbeIF4A還刺激感染個體的PBMC產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子分布型。Th1反應(yīng)的特征在于產(chǎn)生細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，白細(xì)胞介素-12(IL-12)或干擾素-γ(IFN-γ)，以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。IL-12是包含p40和p35亞基的雜二聚體分子，它必須共同表達(dá)產(chǎn)生生物活性IL-12p70。p40亞基僅由產(chǎn)生IL-12的細(xì)胞產(chǎn)生并且在細(xì)菌和寄生蟲刺激后在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生；而p35亞基普遍存在且以結(jié)構(gòu)表達(dá)。因此，產(chǎn)生IL-12的細(xì)胞也具有大量超額(10-100倍)的無生物學(xué)活性的游離p40鏈。
LbeIF4A也刺激Leishmania感染的患者PBMC中諸如編碼IFN-γ，IL-1，IL-2，IL-12p40亞基和TNF-α的mRNA的Th1細(xì)胞因子分布型。表明Th2反應(yīng)的無可檢測到的IL-4或IL-10mRNA存在于這類刺激的PBMC中。事實上，LbeIF4A一般下調(diào)存在于一些利什曼患者“靜止”的PBMC中的IL-10mRNA的表達(dá)和患者及正常PBMC LPS誘導(dǎo)的IL-10產(chǎn)生。LbeIF4A的這些特性表明LbeIF4A在L·braziliensis感染后的保護(hù)性免疫反應(yīng)中起作用。
另外，LbeIF4A刺激未感染的對照個體PBMC中以及培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞，人髓樣白血病細(xì)胞系THP-1和小鼠中IL-12和IL-2的產(chǎn)生。LbeIF4A還與IFN-γ協(xié)同刺激THP-1細(xì)胞分泌IL-12，患者PBMC對IFN-γ產(chǎn)生的誘導(dǎo)因存在抗IL-12抗體而取消。刺激IL-12和IL-2產(chǎn)生的能力表明LbeIF4A具有誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力，本文所述的多肽在預(yù)防和治療諸如癌癥以及感染性疾病中具有廣泛的應(yīng)用性。
因此，在本發(fā)明的一個方面，公開了評價患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答總能力的方法。本文所用的術(shù)語“患者”指任何熱血動物，優(yōu)選人類?；颊呖赡芑加幸环N疾病，如利什曼病(或其它感染性疾病)或癌癥，或可以是正常的(即，無可檢測的疾病和感染)。一般來說，由于患者PBMC接觸LbeIF4A多肽誘導(dǎo)的增殖或Th1相關(guān)性反應(yīng)水平是患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)能力的指征。
簡單地說，評價患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力可經(jīng)過將可能感染或未感染的患者PBMC與本發(fā)明的多肽接觸，測量細(xì)胞合適的反應(yīng)來進(jìn)行。用于該目的的PBMC可經(jīng)過本領(lǐng)域已知的方法分離，包括用通過(例如)FicollTM(Winthrop Laboratories，New York)的密度離心。一般來說，是以評價大約104-106個細(xì)胞的多肽量范圍從大約1μg/到大約50μg/ml，優(yōu)選大約10μg/ml。多肽與PBMC溫育典型地在37℃進(jìn)行大約5天。與多肽一起溫育后，測定PBMC的合適的反應(yīng)。例如，測量的反應(yīng)可以是增殖反應(yīng)，它可用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法來評價，例如將細(xì)胞與放射標(biāo)記的腸腺嘧啶脈沖接觸并測量標(biāo)記進(jìn)入細(xì)胞DNA的摻入量。一般情況下，刺激指數(shù)(即用抗原刺激的細(xì)胞平均cpm除以無抗原的細(xì)胞平均cpm)大于或等于5的增殖反應(yīng)表明個體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力下降。作為選擇，測量的反應(yīng)可以是上述一種或多種特定細(xì)胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12p70，IL-12p40亞基，IL-1和TNF-α)的分泌，或編碼一種或多種特定細(xì)胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12p40亞基，IL-1和TNF-α)的mRNA的水平，正如用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(可能包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的擴(kuò)增)進(jìn)行的測定。這種細(xì)胞因子分泌或mRNA表達(dá)的高水平與產(chǎn)生免疫反應(yīng)的高能力相對應(yīng)。一般來說，如果在用LbeIF4A多肽處理的PBMC中不能檢測到(用本文公開的方法)IL-12或編碼IL-12的mRNA，患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力就低。
在另一方面，本發(fā)明提供了在PBMC和分離成份細(xì)胞(包括，但不限于巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞)中刺激免疫反應(yīng)的方法。為了刺激這類細(xì)胞，可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的任何各種技術(shù)(如Ficoll-hypaque密度離心)分離該細(xì)胞，并以足夠的量與LbeIF4A多肽接觸足夠的時間以產(chǎn)生免疫反應(yīng)，如上所述?？梢?但不必)從患有利什曼病或其它疾病的患者中分離根據(jù)本發(fā)明處理的細(xì)胞，并可再導(dǎo)入治療后的患者中。對于從Leishmania感染的個體獲得的細(xì)胞，可產(chǎn)生的免疫反應(yīng)包括優(yōu)選的Th1免疫反應(yīng)(包括IL-12產(chǎn)生的刺激)和IL-10表達(dá)的下調(diào)。對于未感染的個體的細(xì)胞，免疫反應(yīng)可能是IL-12的產(chǎn)生。
在有關(guān)方面，本發(fā)明提供了在患者(包括人類)中刺激或增強免疫反應(yīng)的方法。在一個實施方案中，LbeIF4A多肽可用作免疫調(diào)節(jié)劑以增強對不同抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。經(jīng)過將LbeIF4A多肽與不同的特異性抗原結(jié)合施用給患者，可增強患者對抗原的免疫反應(yīng)。在該方面，LbeIF4A多肽可在相同制品(例如疫苗)內(nèi)作為抗原施用，或可單獨施用。然而，一般來說，抗原和LbeIF4A多肽在同時和相同位點施用。以這種方式，LbeIF4A多肽可用作(例如)異源劑疫苗制品中的佐劑。用藥的合適的劑量和方法在下面詳細(xì)提供。
LbeIF4A多肽也可單獨或與其它Leishmania抗原一起施用給Leishmania感染的個體以刺激結(jié)合Leishmania寄生蟲的抗體的產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)在通常被認(rèn)為合理地預(yù)測人類和其它動物對Leishmania種類反應(yīng)的模型中用LbeIF4A免疫小鼠導(dǎo)致對L·braziliensis的保護(hù)性免疫反應(yīng)，證實了LbeIF4A作為疫苗的實用性。例如，本發(fā)明的多肽可施用給患有慢性皮膚利什曼病的患者以刺激有療效的免疫反應(yīng)。
在另一實施方案中，本文公開的多肽可施用給患者以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。對于Leishmania感染的個體，可產(chǎn)生的免疫反應(yīng)包括優(yōu)選的Th1免疫反應(yīng)(包括刺激IL-12的產(chǎn)生)和下調(diào)IL-10表達(dá)。對于未感染的個體，免疫反應(yīng)可能是IL-12和/或IL-2的產(chǎn)生，或γ-T細(xì)胞的刺激。用藥的合適劑量的方法如下所述。
本發(fā)明還有一個方面，可將一種或多種LbeIF4A多肽施用給患有與白細(xì)胞介素12刺激反應(yīng)性疾病的患者。這類疾病包括感染(例如，可以是細(xì)菌，病毒或原生動物感染)或諸如癌癥的疾病。一般來說，特定疾病與IL-12刺激的反應(yīng)性可經(jīng)過評價用LbeIF4A多肽治療對免疫臨床相關(guān)物的影響。例如，如果治療導(dǎo)致Th1反應(yīng)變高或Th2轉(zhuǎn)變成Th1并伴隨著治療的患者之臨床改善，則該疾病經(jīng)IL-12刺激后好轉(zhuǎn)。多肽的用藥可以按下面所述，或可根據(jù)適應(yīng)癥延長更長的時間。
在上述方面，其中LbeIF4A多肽用于刺激或增強患者的免疫反應(yīng)，多肽優(yōu)選配成藥用組合物或疫苗。藥用組合物一般包含一種或多種LbeIF4A多肽與生理上可接受的載體，賦形劑或稀釋劑結(jié)合。這類載體在所用劑量和濃度下對接受者應(yīng)是無毒的。疫苗包含一種或多種LbeIF4A多肽和一種或多種適于適應(yīng)癥的其它抗原。還期望使用LbeIF4A蛋白質(zhì)與可溶性細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子結(jié)合。
用藥途徑和頻率及多肽劑量根據(jù)個體不同而變化并且可與通常用于其它感染之免疫或治療相似。一般來說，藥用組合物和疫苗可經(jīng)過注射(例如，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮下)，鼻內(nèi)(例如，經(jīng)過吸入)或口服用藥。
當(dāng)然，用藥的量和頻率取決于諸如所治療的適應(yīng)癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性，所需反應(yīng)，患者的狀態(tài)等等因素。典型地是，在2-6周期限內(nèi)施用1至4個劑量。優(yōu)選的是施用兩個劑量，第二次劑量比第一次晚2-4周。合適的劑量是在患者中刺激IL-12產(chǎn)生的LbeIF4A多肽量，使在從患者分離的PBMC上清中IL-12的量為每ml 10ng到10μg。一般來說，IL-12量的測定可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適的試驗，包括本文所述的試驗。存在于劑量中的LbeIF4A多肽的量典型地每kg宿主從大約1pg到大約100mg，典型地從大約10pg到大約1mg，優(yōu)選大約100pg到大約1μg。合適的劑量大小隨動物大小而變化，但典型地是對于10-60kg動物從大約0.01ml到大約5ml變化。特定適應(yīng)癥的具體合適劑量可易于測定。
盡管本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何合適的載體可用于本發(fā)明的藥用組合物，但載體類型根據(jù)用藥方式和是否需要緩釋用藥而變化。對于腸胃外用藥，如皮下注射，載體優(yōu)選包含水，鹽水，乙醇，脂肪，蠟或緩沖液。為了口服用藥，可使用任何上面的載體或固體載體，如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖和碳酸鎂。可被生物降解的微球體(例如polylactic galactide)也可用作本發(fā)明的藥用組合物的載體。例如，合適的可被生物降解的微球體在美國專利號4897268和5075109中公開。
藥用組合物和疫苗也可含有諸如緩沖液的稀釋劑，諸如抗壞血酸的抗氧化劑，低分子量(小于大約10個殘基)多肽，蛋白質(zhì)，氨基酸。包括葡萄糖，蔗糖或粗精的碳水化合物，諸如EDTA的螯合劑，谷胱甘肽和其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是合適的稀釋劑的例子。優(yōu)選的是，產(chǎn)品使用合適的賦形劑溶液(例如，蔗糖)作為稀釋劑配成凍干制品。
除了LbeIF4A多肽外，任何各種佐劑可用于本發(fā)明的疫苗或藥用組合物以非特異性地增強免疫反應(yīng)。大多數(shù)佐劑含有設(shè)計成保護(hù)抗原防止迅速分解代謝的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，免疫反應(yīng)的非特異性刺激劑，如脂A，百日咳博德特氏菌或結(jié)核分枝桿菌。這類佐劑在商業(yè)上可獲得，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Labo-ratonies，Detroit，MI)和Merck佐劑65(Merck和Company，Inc.，Rahway，NJ)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了測定給定抗原刺激保護(hù)性免疫反應(yīng)之能力的方法。LbeIF4A刺激白細(xì)胞介素-12產(chǎn)生的能力與感染的患者和從感染的患者分離的PBMC中的保護(hù)性Th1反應(yīng)的進(jìn)展相關(guān)。因此，測定選定抗原是否能刺激IL-12，IFN-γ和/或IL-2產(chǎn)生提供了用于疫苗形成的迅速的可重復(fù)的篩選方法。能誘發(fā)Th1反應(yīng)的抗原(正如使用上述在正常外周血單核細(xì)胞中刺激γT細(xì)胞，IL-12和/或IL-2產(chǎn)生所證實的)一般適用于制備疫苗。
LbeIF4A蛋白質(zhì)衍生物也可用作免疫測定中的免疫原，試劑或作為親和純化程序中的結(jié)合劑。用于測定或純化目的的LbeIF4A多肽可結(jié)合到固態(tài)支持物上?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種技術(shù)將多肽結(jié)合到支持物上，這些技術(shù)在專利和科技文獻(xiàn)中有廣泛的描述。在本發(fā)明這一方面的說明書中，術(shù)語“結(jié)合”指非共價締合(如吸附)和共價連接(可以是抗原和功能基團(tuán)在支持物上直接連接或可以是以交聯(lián)劑方式連接)。優(yōu)選經(jīng)吸附結(jié)合到微滴定板上或結(jié)合到膜上。在這類情況下，吸附可以經(jīng)過將多肽(在合適的緩沖液中)與固態(tài)支持物接觸適量時間來實現(xiàn)。接觸時間隨溫度而變化，但典型地是在大約1小時和1天之間。一般來說，將塑料微滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔與范圍為大約10ng到大約1μg，優(yōu)選大約250ng的多肽量接觸足以結(jié)合足夠量的抗原。
可使用各種技術(shù)將多肽共價結(jié)合到固態(tài)支持物上。例如，可使用交聯(lián)劑實現(xiàn)結(jié)合，如m-順丁烯二酰亞胺苯甲酰琥珀酰亞胺酯和N-羥基珀酰亞胺，它們在半胱氨酸和賴氨酸殘基處共價結(jié)合到多肽上。LbeIF4A多肽也可通過反應(yīng)性側(cè)基共價結(jié)合到各種不溶性底物(如溴化氰激活的，雙環(huán)氧乙烷激活的，羰基二咪唑激活的或甲苯磺酸基激活的瓊脂結(jié)構(gòu))上或經(jīng)吸附結(jié)合到聚烯烴表面(有或沒有戊二醛交聯(lián))。
一旦結(jié)合到底物上，LbeIF4A多肽可用于結(jié)合LbeIF4A蛋白質(zhì)之抗體的試驗。合適的試驗包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。這類試驗的進(jìn)行可首先將固定在固態(tài)支持物(通常是微滴定板孔)上的多肽抗原與含抗體的樣品接觸以便樣品內(nèi)抗多肽的抗體能結(jié)合到固定的多肽上。然后從固定的多肽上去掉未結(jié)合的樣品并加入能結(jié)合固相抗體-多肽復(fù)合物的檢測試劑。然后使用適合于特定檢測試劑的方法測定仍結(jié)合于固態(tài)支持物上的檢測試劑的量。
固相多肽還可用于純化結(jié)合LbeIF4A多肽的抗體。這類抗體可用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任意各種技術(shù)來制備。例如，見Harlow和Land，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring，Har-bor Laboratory，1988。在一個這類技術(shù)中，包含多肽的免疫原開始注射進(jìn)任何各種各樣的哺乳動物(例如小鼠，大鼠，兔，綿羊和山羊)中。在這一步驟中，本發(fā)明的多肽可不經(jīng)修飾用作免疫原。作為選擇，特別是對于相當(dāng)短的多肽，如果多肽與諸如牛血清白蛋白或鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白的載體連接可誘發(fā)高水平的免疫反應(yīng)。免疫原注射進(jìn)動物宿主，優(yōu)選根據(jù)預(yù)定的程度摻入一次或多次加強免疫，動物定期抽血。然后從該抗血清純化出對多肽特異性的多克隆抗體，例如，經(jīng)過使用與合適的固態(tài)支持物偶聯(lián)的多肽進(jìn)行親和層析。
可制備對目的多肽特異性的單克隆抗體，例如，使用Kohlwrand Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519，1976的技術(shù)及其改進(jìn)方法。簡單地說，這些方法涉及制備能產(chǎn)生具有所需特異性(即，與目的多肽的反應(yīng)性)之抗體的無限增殖細(xì)胞系。這類細(xì)胞系可從例如上述免疫的動物獲得的脾細(xì)胞產(chǎn)生。然后經(jīng)過例如與骨髓瘤細(xì)胞融合伙伴優(yōu)選的是與免疫動物協(xié)同作用者融合使脾細(xì)胞無限增殖。可使用各種融合技術(shù)。例如，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可與非離子去污劑合并幾分鐘，然后以低密度涂布在選擇性培養(yǎng)基上使雜交細(xì)胞而不是骨髓瘤細(xì)胞生長。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)選擇。經(jīng)過足夠的一段時間后，通常是大約1到2周后，獲得雜交體集落。選擇單個集落并試驗對多肽的結(jié)合能力。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可從生長的雜交瘤集落上清中分離。另外，可使用各種技術(shù)提高產(chǎn)率，例如，將雜交瘤細(xì)胞系注射進(jìn)合適的脊椎動物宿主(如小鼠)的腹腔。然后可從腹水液或血液收獲單克隆抗體?？山?jīng)過常規(guī)技術(shù)，如色譜，凝膠過濾，沉淀和提取從抗體中去掉污染物。本發(fā)明的多肽可用于純化方法中，例如親和層析步驟中。
可使用結(jié)合本發(fā)明多肽的單一特異性抗體(例如)檢測生物學(xué)樣品中Leishmania感染，其中使用任一種免疫測定法，它可以是直接的或競爭性的。簡單地說，在一種直接測定方法中，可將單一特異性抗體固定在固態(tài)支持物(如上所述)上并與待測樣品接觸。去掉來結(jié)合的樣品后，可加入用報道基團(tuán)標(biāo)記的第二單一特異性抗體并用于檢測結(jié)合的抗原，在一個競爭試驗例子中，樣品可與用合適的報道基團(tuán)標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體結(jié)合。然后，樣品和抗體混合物可與固定在合適固態(tài)支持物上的多肽抗原結(jié)合。使未結(jié)合樣品中抗原的抗體與固定化抗原結(jié)合，去掉剩余的樣品和抗體。結(jié)合到固態(tài)支持物上的抗體水平與樣品中抗原水平反相關(guān)。因此，結(jié)合到固態(tài)支持物上的抗體水平較低表明在樣品中存在Leishmania。使用單一特異性抗體檢測樣品中Leishmania的其它方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，上面方法僅作為舉例目的提供。
下面的實施例以舉例的方式而不是限制的方式提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到可對實施例體現(xiàn)的本發(fā)明進(jìn)行變化，特別是在本文引證的各種參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)下可達(dá)到這一目的。
實施例實施例1編碼LbeIF4A的DNA的制備本實施例描述了編碼L·braziliensis核糖體抗原LbeIF4A的DNA序列的分子克隆。
用L·braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)的剪切的DNA在噬菌體λZAPII(Stratagene，La Jolla，CA)中構(gòu)建基因組表達(dá)文庫。用來自L·braziliensis感染的具有粘膜利什曼病的個體的大腸桿菌預(yù)吸附的患者血清篩選表達(dá)文庫。純化含免疫反應(yīng)性重組抗原的噬菌體，使用廠家的方案剪切pBSK(一)噬菌粒。用核酸外切酶III進(jìn)行嵌套缺失產(chǎn)生用于單鏈模板制備和測序的重疊缺失。按廠家(Stratagene，La Jolla，CA)建議用VCSM13輔助噬菌體感染后分離單鏈模板并用雙脫氧鏈終止法或使用Applied Biosystems AutomatedSequencer Model373A經(jīng)Taq染料終止子系統(tǒng)測序。
然后在患者T細(xì)胞試驗中分析免疫反應(yīng)性重組抗原刺激增殖反應(yīng)(如下面實施例5所述)和主要Th1細(xì)胞因子分布型(如下面實施例7所述)的能力。
在上面試驗中鑒定重組克隆，經(jīng)過將其推測的氨基酸序列與其它蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列比較后鑒定為真核生物起始因子4A(eIF4A)的Leishmania braziliensis同源物。分離的克隆(pLeIF.1)缺乏全長蛋白質(zhì)序列的前48個氨基酸殘基(144個核苷酸)。pLeIF.l)插入片段隨后用于分離全長基因組序列。
SEQID NO1顯示了全長LbeIF4A多肽的全部核苷酸序列。開放閱讀框(核苷酸115至1323)編碼403個氨基酸，預(yù)測分子量為45.3KD的蛋白質(zhì)。比較LbeIF4A預(yù)測的蛋白質(zhì)序列與煙草(TeIF4A)，小鼠(MeIF4A)和酵母(YeIF4A)的同源蛋白質(zhì)表明具有廣泛的序列同源性，變化最大的是前20-30個氨基酸。LbeIF4A，TeIF4A，MeIF4A和YeIF4A的長度(403，413，407，和395個氨基酸)，分子量(45.3，46.8，46.4，和44.7KDa)和等電點(5.9，5.4，5.5，和4.9)分別相似。LbeIF4A顯示出與TeIF4A的總同源性為75.5％(57％相同，18.5％保守取代)，與MeIF4A為68.6％(50％相同，18.6％保守取代)，與YeIF4A為67.2％(47.6％相同，19.6％保守取代)。
實施例2LbeIF4A基因的表征本實施例描述了Leishmania種類LbeIF4A DNA的Southen印跡分析。使用了Leishmania braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)，L.guyanensis(MHOM/BR/75/M4147)，L.amazonensis(IFLA/BR/67/pH8)，L.chagasi(MHOM/BR/82/BA-2，C1和MHOM/BR/84/Jonas)，L.donovani(MHOM/Et/67/HU3)，L.infantum(IPT-1)，L.major(LTMp-2)，L.tropica(1063c)，Trypanosoma cruzi(MHOM/CH/00/TulahuenC2)和T.brucei(TREU 667)且在以前進(jìn)行了描述(見Burns et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90775-779，1993)。前鞭毛蟲和上鞭毛蟲在無菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別從Syrian倉鼠脾和BALB/C ByJ小鼠瓜墊獲得I.chagasi和L.amazonensis無鞭毛蟲并按Burns et al.，J.Immunol.146742-748，1991所述純化。
按Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989所述制備基因組DNA，用在LbeIF4A內(nèi)(Pst I和Not I)和外側(cè)(BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，PruII和SstI)剪切的酶消化，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離并印跡到Nytran膜上。包含LbeIF4A編碼區(qū)～0.94kb片段(核苷酸143至1083)的限制性片段經(jīng)隨機(jī)活化方法(見Feinbergand Vogelstein，And，Biochem，137266-268，1984)進(jìn)行放射性標(biāo)記且印跡在65℃雜交過夜。用含0.1％SDS的2x，0.5x和0.2xSSC在65℃洗滌印跡2次20分鐘。L.braziliensis基因組DNA含IbeIF4A的至少2個拷貝，這可由在BamHI和PouII泳道上存在2條雜交帶來說明(圖1)。
同一圖還說明了在L·braziliensis和其它Leishmania種類的eIF4A同源物間的種間保守性。在用顯示相同雜交方式的L·dono-vani復(fù)合物(L.chagasi，L.donovani，和L.infantum)膜試驗的所有其它Leishmania種類中檢測到2個主要的PstI雜交片段。在嚴(yán)格雜交條件下LbeIF4A還與更遠(yuǎn)源的寄生蟲T.cruzi而不是T.brucei發(fā)生交叉雜交。這些資料表明Leishmania eIF4A同源物具有廣泛的種間保守性。
實施例3LbeIF4A的制備本實施例說明了～45KDa LbeIF4A抗原基因產(chǎn)物的表達(dá)和純化。從500ml IPTG-誘導(dǎo)的培養(yǎng)物純化基因組克隆pLeIF.1的45KDa的重組抗原(即，缺乏N-端48個殘基的抗原)。分離包含體并依次在含2，4和8M尿素的10mlTNE(50mM Tris，pH8.0，100mM Nacl和10mM EDTA)中洗滌。合并含溶解重組抗原的部分(通常是4和8M尿素的上清液)，用Tris緩沖的鹽水(TBS)透析并經(jīng)過用30％硫酸銨沉淀來濃縮。經(jīng)過制備性SDS-PAGE電泳，接著切下并電洗脫重組抗原實現(xiàn)純化至均一性。在用Immunex Corp，Seattle，WA進(jìn)行的Limulus阿米巴細(xì)胞試驗中本試驗所用的全部抗原具有不足10pg/ml的內(nèi)毒素。
重組抗原用于免疫兔以生產(chǎn)多克隆抗血清。用100μg在不完全弗氏佐劑(IFA，GIBCO，Grand Island，NY)中的純化LbeIF4A與100μg胞壁酰二肽(佐劑肽，Calbiochem-Norabiochem Corp，LaJoua，CA)經(jīng)皮下免疫，四周后單獨用在IFA中的100μg重組抗原進(jìn)行加強免疫來免疫成年兔(NeW Zealand white；R＆R Rabbitry，Stanwood，WA)。三周后，用在鹽水中的25μgLbeIF4A靜脈內(nèi)加強注射兔，一周后收集血清。
用多克隆兔抗血清作探針對在早、中或晚對數(shù)期或在22-35℃培養(yǎng)物的溫度變動后收獲的L·braziliensis前鞭毛蟲溶胞產(chǎn)物依次進(jìn)行免疫印跡(圖2)。圖2A組顯示了分子量標(biāo)記(泳道m(xù))，未誘導(dǎo)的(泳道1)和誘導(dǎo)的(泳道2)培養(yǎng)物大腸桿菌溶胞產(chǎn)物和純化的重組抗原(泳道3)的免疫印跡分析。圖2B組顯示了L·braziliensis前鞭毛蟲溶胞產(chǎn)物(泳道1)，L.chagasi前鞭毛蟲溶胞產(chǎn)物(泳道2)和L.amazonensis前鞭毛蟲(泳道3)或無鞭毛蟲(泳道4)溶胞產(chǎn)物的免疫印跡分析。
經(jīng)過在無甘油和β-疏基乙醇的SDS樣品緩沖液中對沉淀進(jìn)行凍/融裂解制備寄生蟲和哺乳動物細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。在微量離心機(jī)中以10krpm離心從上清中分離不溶性物質(zhì)。使用Pierce BCA蛋白質(zhì)試驗試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。在12.5％SDS-PAGE上分離5至10μg寄生蟲或細(xì)胞提取物或0.5至1.0μg重組抗原并經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。接前面所述(Skeiky et al.，J.Exp.Med.176201-211，1992)使用[125I]-蛋白質(zhì)A，接著經(jīng)放射自顯影測定抗血清的反應(yīng)性。
兔抗血清檢測到一個～45KD大小的主要蛋白質(zhì)種類。對于所有分析的溶胞產(chǎn)物，45KDeIF4A同源物的相對強度相似，因此表明在寄生蟲早到中期對數(shù)生長期期間或模擬細(xì)胞內(nèi)無鞭毛蟲階段的溫度轉(zhuǎn)變后在結(jié)構(gòu)上表達(dá)該抗原。這不象其產(chǎn)物在22-35℃的溫度轉(zhuǎn)變后上調(diào)的Leishmania熱體克蛋白質(zhì)家族的成員。免疫前的兔血清不與寄生蟲溶胞產(chǎn)物反應(yīng)。
實施例4結(jié)合LbeIF4A的單克隆抗體的制備本實施例描述了抗LbeIF4A單克隆抗體的制備?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)，如在美國專利號4,411,993中公開的技術(shù)將純化的重組LbeIF4A或高水平表達(dá)LbeIF4A的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于生產(chǎn)抗LbeIF4A的單克隆抗體。這類抗體可用于干擾PBMC的LbeIF4A激活作為LbeIF4A的診斷或研究試驗或在LbeIF4A親和純化中的成份。
為了免疫嚙齒類，LbeIF4A免疫原在佐劑(如完全或不完全弗氏佐劑，明礬，或其它佐劑，如Ribi佐劑R700(Ribi，Hamilton，MT)中乳化并以從10-100μg范圍的量皮下注射進(jìn)選定的嚙齒類，例如，BALB/C小鼠或Lewis大鼠。10天到3周后，用另外的免疫原加強免疫的動物并隨后以一周，二周或每三周的免疫程序定期加強。經(jīng)眼眶后抽血或尾端切除定期取血清樣品用于經(jīng)點印跡試驗(抗體夾心)或ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)測試。其它試驗方法也是合適的，如Th1反應(yīng)誘發(fā)的抑制。
經(jīng)過檢測合適的抗體滴度后，對陰性動物靜脈注射鹽水中的抗原。3至4天后處死動物，收獲脾細(xì)胞并與鼠骨髓瘤細(xì)胞系(例如，NS1或優(yōu)選Ag8.653[ATCC CRL 1580])融合。以該方法產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系平板接種在含選擇性培養(yǎng)基(如含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基或HAT)的多個微滴定板上以抑制非融合細(xì)胞，骨髓瘤-骨髓瘤雜交體，脾細(xì)胞-脾細(xì)胞雜交體的增殖。
由此產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系可經(jīng)ELISA篩選與LbeIF4A的反應(yīng)性，例如，用在Engvall et al.，Immunochem，8871(1971)和美國專利號4703004中公開的技術(shù)的修改方法進(jìn)行。優(yōu)選的篩選技術(shù)是Beckmanet al.，J.Immunol.1444212(199)描述的抗體俘獲技術(shù)。例如，經(jīng)過有限稀釋或在軟瓊脂上克隆來克隆雜交瘤細(xì)胞系以產(chǎn)生單克隆細(xì)胞系。然后將陽性克隆注射進(jìn)同源嚙齒類的腹膜腔以產(chǎn)生含高濃度(＞1mg/ml)抗-LbeIF4A單克隆抗體的腹水?？山?jīng)過硫酸銨沉淀接著進(jìn)行凝膠排阻色譜純化所得的單克隆抗體。作為選擇，也可使用基于將抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G上的親和色譜，及基于結(jié)合到LbeIF4A上的親和色譜。
實施例5PBMC增殖的LbeIF4A刺激本實施例描述了純化的重組LbeIF4A刺激Lbraziliensis感染的個體的PBMC增殖的能力。從生活于Lbraziliensis傳播的地區(qū)(該地區(qū)的流行病學(xué)，臨床和免疫學(xué)研究已進(jìn)行了超過十年)的個體獲得外周血。經(jīng)過與至少下列之一相聯(lián)系的臨床發(fā)現(xiàn)進(jìn)行患者的診斷從損傷處分離寄生蟲，與Leishmania溶胞產(chǎn)物的陽性皮膚試驗或陽性血清學(xué)試驗。
收集外周血并經(jīng)過通過FicollTM(Winthrop Laboratories，NewYork)的密度離心分離PBMC。為進(jìn)行體外增殖試驗，在含有或不含10μg/m1所示抗原或5μg/mlPHA(Sigma Immunochemicals.St.Louis，MO)的96孔平底平板中在完全培養(yǎng)基(RPMI1640，加有慶大霉素，2-ME，L-谷氨酰胺，和10％篩選的合并A+人血清；Trimar，Hollywood，CA)中培養(yǎng)2-4×105細(xì)胞/孔5天。然后，在培養(yǎng)的最后18小時用1μci[3H]胸腺嘧啶脈沖細(xì)胞。
數(shù)據(jù)以三份培養(yǎng)物的平均cpm代表且刺激指數(shù)(SI)定義為含抗原的培養(yǎng)物平均cpm/無抗原的培養(yǎng)物平均cpm。如表I和圖3所示，大多數(shù)(＞70％)粘膜和發(fā)作的或治愈的皮膚患者PBMC以異源增殖方式與刺激指數(shù)范圍分別為12到233和2到64的LbeIF4A反應(yīng)。
表I與寄生蟲溶胞產(chǎn)物和LbeIF4A抗原反應(yīng)的Lbraziliensis感染的個體之PBMC的體外增殖[3H]摻入(平均cpm(SD)×103)患者培養(yǎng)基溶胞產(chǎn)物 LbeIF4A粘膜 S·I.S.I.JV0.15(0.0)41.30(1.3)294 11.90(4.8) 81SZ0.45(0.1)140.60(7.6) 308 105.90(5.6) 233AB0.42(0.3)44.20(0.5)104 5.00(1.3)12NO0.38(0.1)52.70(3.3)138 12.80(1.6) 33TE0.18(0.0)27.40(1.5)150 8.80(0.3)48MB0.18(0.0)300.10(9.4) 163441.50(4.5) 226OM0.28(0.0)35.40(3.2)124 6.90(2.5)24皮膚AS0.22(0.0)19.14(1.3) 87 14.30(2.3)64JP0.25(0.0)55.63(8.6) 218 4.40(0.3)17VS0.17(0.0)0.26(0.0)1.5 0.3(0.0) 2RJ0.10(0.0)0.32(0.2)3.0 1.5(0.6) 15JA0.16(0.0)0.77(0.1)4.7 2.5(0.2) 16AD4.20(1.0)4.01(1.0)2.0 14.1(2.2)3.5HN0.36(0.0)4.73(1.7)13 4.69(1.7) 13彌散性皮膚VAL0.22(0.0)0.51(0.3)2.0 2.12(0.2) 9.0自身愈合皮膚GS0.21(0.0)19.70(4 4) 94 41.50(2.8)198MS0.09(0.0)0.60(0.1)6.5 5.10(2.1)57AH0.11(0.0)59.60(7.1) 519 9.60(4.7)83DJ0.12(0.0)0.20(0.1)1.6 19.00(6.7) 151HS0.12(0.0)27.10(2.0) 225 12.40(2.7) 103MCT 0.38(0.0)130.30(14) 340 6.20(1.5)16正常LV0.14(0.0)0.19(0.0)1.4 0.71(0.1)4.0VV0.18(0.0)0.31(0.1)1.7 0.28(0.1)1.5N30.14(0.0)0.36(0.1)2.6 0.27(0.1)1.9N40.59(0.1)2.00(0.3)3.80.56(0.0)1.0一般來說，對粘膜個體的PBMC與刺激指數(shù)更高。一些粘膜患者PBMC與刺激指數(shù)可比得上用寄生蟲溶胞產(chǎn)物所觀察到的指數(shù)的LbeIF4A反應(yīng)。令人感興趣的是，在一些具有皮膚利什曼病的患者中，對LbeIF4A的增殖反應(yīng)比由寄生蟲溶胞產(chǎn)物誘導(dǎo)的反應(yīng)更高。與粘膜和皮膚患者相反，具有自身愈合皮膚利什曼病的所有6個個體的PBMC與具有比得上粘膜個體的刺激指數(shù)(16-198)的IbeIF4A反應(yīng)而增殖。兩個自身愈合個體(MS和DJ)的PBMC的反應(yīng)明顯比用寄生蟲溶胞產(chǎn)物獲得的更高。正常未感染個體的細(xì)胞勉強受LbeIF4A刺激。
實施例6PBMC中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的LbeIF4A刺激本實施例提供了對證實為Lbraziliensis感染的患者PBMC中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)方式的分析。為進(jìn)行細(xì)胞因子mRNA分析，0.5至1ml PBMC以1-2×106細(xì)胞/ml在具有或不具有10μg/ml·缺少SEQ ID NO2N端48個殘基的LLeIF4A抗原(如實施例3所述)的條件下培養(yǎng)48和72小時。收獲上清和細(xì)胞并經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析細(xì)胞因子mRNA。為進(jìn)行細(xì)胞因子mRNA PCR分析，使用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法從PBMC中分離總RNA，如Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162156-159，1987所述。使用poly(dT)(Pharmacia)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda ResearchIaboratories，Gaithersburg，MD)在20μl終體積中合成互補DNA(cDNA)。用水將cDNA樣品加到200μl。
對β-肌動蛋白規(guī)度化后，使用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Ce-tus，Norwalk，CT)用各0.2μm的5’和3’外部引物在50μl反應(yīng)體積中經(jīng)PCR擴(kuò)增12至20μl稀稀的cDNA。使用的條件是94℃變性(β-肌動蛋白，IL-2和IL-4 1分鐘；IFN-γ45秒，IL-10 30秒)，55℃退火(β-肌動蛋白，IL-2和IL-41分鐘；IL-10 30秒)或?qū)FN-γ60℃下45秒，在72℃延長。經(jīng)過起始進(jìn)行cDNA的系列稀釋并改變用于PCR的循環(huán)數(shù)證實了PCR條件在半定量范圍內(nèi)。在所有隨后的實驗中，對β-肌動蛋白，IL-2，IL-4和IFN-γ的擴(kuò)增反應(yīng)使用30個循環(huán)，對于IL-10PCR使用25個循環(huán)。
使用的引物對和PCR條件來自公開的資料；β-肌動蛋白，IL-2，IL-4和IFN-γ(Ehlwrs et al.，J.Exp.Med.17323-36，1991)及IL-10(Viera et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.881172-1176，1991)。5’和3’寡核苷酸引物的核苷酸序列分別如下(1)β-肌動蛋白，TGACGGGGTCACC-CACACTGTGCCCATCTA和CTAGAAGCATTGCG-GTGGACGATGGAGGG；(2)IL-2，ATGTACAGGATG-CAACTCCTGTCTT和GTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC；(3)IL-4，ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT和CGAA-CACTTTGAATATTTCTCTCTCAT；(4)IFN-γ，ATGAAATATA-CAAGTTATATCTTGGCTTT和GATGCTCTTCGAC-CTCGAAACAGCAT；(5)IL-10，TCT-CAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA和ATGCCCCAAGCTGA-GAACCAAGACCCA.
使用含有人序列IL-2，IFN-γ和IL-4(Lewis et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.859743-9747，1988)及β-肌動蛋白的分別用HindIII/EcoRI，EcoRI，SacI/HindII，和EcoRI消化的質(zhì)粒(no.65128；American Type Culture Collection，Rockville，MD)獲得探針。使用設(shè)計成擴(kuò)增包含人IL-10整個編碼區(qū)的535個堿基對片段的寡核苷酸引物從正常供體分裂素刺激的PBMC經(jīng)PCR克隆人IL-10 cDNA(Lewis et al.，Proc. Natl.Acad. Sci.U.S.A.859743-9747，1988)。cDNA亞克隆進(jìn)pBluescript并用BamHI/EcoRI消化。在1％瓊脂糖凝膠上分離后，切下插入的DNA片段，電洗脫并純化。經(jīng)隨機(jī)活化方法制備放射性標(biāo)記的32P-探針。
經(jīng)過在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并用合適的32P-標(biāo)記的DNA插入片段探測分析PCR產(chǎn)物。雜交在55℃過夜。雜交后的洗滌在55℃用含0.2％/SDS的2×和1×SSC各洗滌2次20分鐘。
這些分析的結(jié)果在圖4A和4B中提供。用培養(yǎng)前的細(xì)胞(脈道0)，無抗原培養(yǎng)后的細(xì)胞(泳道-)或存在10μg/ml L·braziliensis溶胞產(chǎn)物(泳道Lb)或存在10μg/ml LbeIF4A(泳道IF)的培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行PCR細(xì)胞因子分析。圖4A顯示了分析的6個粘膜患者PBMC中的3個(JV，SZ和TE)和一個L.amazonensis感染證實為彌散性皮膚利什曼疾病(DCL)的患者(VA)細(xì)胞因子mRNA PCR結(jié)果。在6個粘膜患者的3個中(TE，圖4A；NO和EO，未顯示)；未在體外培養(yǎng)的PBMC具有可檢測的IFN-γ和IL-4及IL-2mRNA水平(患者TE和EO)。在任何粘膜患者的“靜止”PBMC中未檢測到IL-10mRNA。然而，在缺乏抗原刺激的條件下體外培養(yǎng)后，大多數(shù)分析的粘膜PBMC上調(diào)IL-10mRNA的合成。另外，在患者TE，NO和EO的“靜止”PBMC中檢測的細(xì)胞因子mRNA水平減小到背景水平。
寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激Th1細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2 mRNA及Th2細(xì)胞因子IL-4 mRNA的表達(dá)(在6個患者的三個中)。在與寄生蟲溶腸產(chǎn)物培養(yǎng)后在一個患者PBMC(S2)中檢測到IL-10mRNA增加。LbeIF4A抗原和寄生蟲溶胞產(chǎn)物均誘導(dǎo)所有粘膜患者PBMC產(chǎn)生IFN-γ和IL-2的mRNA，且LbeIF4A誘導(dǎo)唯一的Th1細(xì)胞因子分布型。事實上，LbeIF4A下調(diào)在抗原刺激前大多數(shù)粘膜患者培養(yǎng)的PBMC中檢測到的IL-10 mRNA的合成。令人感興趣的是，在使用粘膜患者PBMC的情況下；LbeIF4A也下調(diào)DCL患者VA中IL-10 mRNA的合成。
一般來說，在溴化乙錠染色的凝膠中IFN-γ和IL-2mRNA水平從抗原刺激前不可檢測量增加到抗原刺激后的易于觀察的水平。然而，細(xì)胞因子IL-4和IL-10mRNA僅在放射活性探測分辨的PCR產(chǎn)物后檢測。
對來自皮膚患者的PBMC進(jìn)行相似的PCR分析(圖4B)。來自分析的4個患者的3個(VS，JP和CA(未顯示))的靜止PBMC顯示出檢測到高水平的Th1(IFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4和IL-10)細(xì)胞因子的mRNA。在第4個(AS)皮膚患者的靜止PBMC中檢測到IFN-γ和IL-2而不是IL-10和IL-4的mRNA.因此，與粘膜患者相反，皮膚利什曼疾患者靜止PBMC中除了IL-4，IL-2和IFN-γ外，還有IL-10 mRNA。令人感興趣的是，盡管在缺乏抗原時體外培養(yǎng)PBMC后IL-2和IFN-γ的mRNA減少到幾乎不能檢測的水平，但I(xiàn)L-10 mRNA保持不受影響或增加。因此，在皮膚患者中，IL-10 mRNA靜止水平是穩(wěn)定的或其PBMC在缺乏抗原刺激的條件下繼續(xù)合成IL-10mRNA。皮膚利什曼病患者的這類反應(yīng)的觀察可用于區(qū)分易形成慢性皮膚利什曼病的個體與經(jīng)歷自身愈合損傷的個體。
試驗的所有皮膚患者經(jīng)過上調(diào)IL-2和IFN-γmRNA的合成與LbeIF4A抗原及寄生蟲溶胞產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。四個患者中有2個(VS和AS)用寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激后IL-4 mRNA水平也增加。在具有可檢測的IL-10mRNA“靜止”水平的3個患者(VS，JP和CA)中，LbeIF4A及寄生蟲溶胞產(chǎn)物下調(diào)IL-10mRNA的表達(dá)。
具有自身愈合CL的患者PBMC細(xì)胞因子mRNA分布型與ML患者相似，其中(a)一個具有可檢測的IL-10mRNA水平的個體例外，分析的4個患者中3個休息PBMC具有可檢測的IL-2，IFN-γ和IL-4水平，但很少或沒有IL-10mRNA；(b)無抗原培養(yǎng)PBMC后IL-10mRNA上調(diào)，而IL-2，IFN-γ和IL-4減少到背景水平；(c)利什曼蟲溶胞產(chǎn)物刺激混合的Th1/Th2細(xì)胞因子分布型的表達(dá)，而LbeIF4A僅誘導(dǎo)Th1-型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)增加且在大多數(shù)自身愈合個體培養(yǎng)的PBMC中下調(diào)IL-10mRNA的表達(dá)(未顯示)。
實施例7LbeIF4A刺激PBMC中細(xì)胞因子的分泌本實施例提供了用缺少SEQ ID.NO2N端48個殘基的LbeIF4A抗原(在實施例3中描述)或寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激后Lbraziliensis感染的個體PBMC分泌的細(xì)胞因子上清水平。測定PBMC上清等份試樣的IFN-γ，TNF-α，IL-4和IL-10。使用小鼠抗人IFN-γmAb(Chemicon，Temucula，CA)和多克隆兔抗人IFN-γ血清經(jīng)雙夾心ELISA定量IFN-γ。使用人rIFN-γ(Gen-netechInc.，San Francisco.CA)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用小鼠抗人IL-4 mAb(m1)和多克隆兔抗人IL-4血清(P3)經(jīng)雙夾心ELISA定量上清中的IL-4。人IL-4(Immunex Corp.，Seattle，WA)用于產(chǎn)生范圍從50pg/ml到1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用大鼠抗人IL-10mAb(Pbar Mingen，San Diego，CA，Cat.#18551D)“捕獲”分泌的IL-10且生物素標(biāo)記的大鼠抗人IL-10 mAb(PharMingen SanDiego，CA，Cat.#18562D)用于檢測與鏈霉抗生物素蛋白連接的辣根過氧化物酶結(jié)合的IL-10并以ABTS作底物來測量IL-10。使用人rIL-10(由DNA X Research Institute，Palo Alto.CA惠贈)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，范圍從30pg到2ng/ml。
用10μg/ml LbeIF4A抗原或10μg/ml寄生蟲溶胞產(chǎn)物(圖5和6)刺激后所有3個患者組(即，粘膜，皮膚和自身愈合皮膚的細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α(圖5和6)。同樣地，LbeIF4A刺激Ltropica感染的患者(沙漠風(fēng)暴患者)增殖和分泌IFN-γ(未顯示)。在患者PBMC上清中檢測到的IFN-γ和TNF-α水平明顯高于未感染的對照。在缺乏抗原刺激時，只有粘膜患者PBMC(6個中的5個)產(chǎn)生可檢測的上清TNF-α水平(60到190pg/ml)。在分析的任何上清中幾乎檢測不到或完全檢測不到IL-4或IL-10(未顯示)，表明其水平低于所用的ELISA試驗檢測極限。經(jīng)過比較，利什曼蟲溶胞產(chǎn)物也刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α，且在某些患者中，也檢測到IL-10(未顯示)。綜合起來，這些結(jié)果表明LbeIF4A刺激Lbraziliensis感染的個體PBMC中占優(yōu)勢的Th1細(xì)胞因子分布型，而寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激混合的Th1/Th2細(xì)胞因子分布型。
抗原刺激后粘膜和自身愈合個體的患者PBMC上清中檢測到的TNF-α水平比皮膚患者更高(圖6)。5個粘膜患者中4個(JV，S2，AB和MB)的PBMC TNF-α上清水平(0.80至2.20ng/ml)比用寄生蟲溶胞產(chǎn)物刺激后未感染的對照PBMC培養(yǎng)物中檢測到的更高。同樣地，LbeIF4A刺激相同的PBMC產(chǎn)生范圍從0.66到3.14ng/ml的TNF-α上清水平。與未感染的對照相比，分析的6個自身愈合個體中3個(GS，HS和MCT)的PBMC與寄生蟲溶胞產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生更高水平的TNF-α，分析的6個自身愈合個體中6個全部(GS，MS，AH，DJ，HS和MCT)與LbeIF4A反應(yīng)產(chǎn)生更高的TNF-α水平。皮膚利什曼疾患者PBMC與寄生蟲溶胞產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生的TNF-α水平比得上未感染的對照。然而，LbeIF4A刺激這些患者中的3個(RJ，AD和JS)的PBMC產(chǎn)生TNF-α。這些患者可能在形成急性皮膚利什曼病的過程中。
實施例8LbeIF4A刺激IL-12產(chǎn)生本實施例表明LbeIF4A刺激L.braziliensis感染后個體的PBMC，培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞，正常供體血液貼壁PBMC和人骨髓樣白血病細(xì)胞系THP-1分泌IL-12。IL-12顯示出在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫形成，Th1反應(yīng)的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或寄生蟲感染的IFN-γ產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵性的免疫調(diào)節(jié)作用。使用的LbeIF4A多肽是缺少SEQ ID NO2N端48個殘基的LbeIF4A抗原(如實施例3所述)。
使用mAb對c11.79/c8.6經(jīng)RIA(檢測極限為10pg/m1)在無細(xì)胞的上清液中測量IL-12p40，如D’Andreaetal.，J。Exp.Med.1791387-1398，1992所述。生物活性IL-12p70雜二聚體(檢測極限為1pg/ml)按Kubin et al.，Blood 831847-1855，1994所述測量。
圖7A顯示了10μg/ml LbeIF4A(LeIF)刺激粘膜患者PBMC在培養(yǎng)上清中分泌的IL-12p40數(shù)量明顯高于用10μg/ml寄生蟲溶胞產(chǎn)物作抗原(Lb)觀察到的IL-12p40水平。還顯示了缺乏溶胞產(chǎn)物或抗原分泌的IL-12p40量(Med)。同一圖還顯示了用LbeIF4A(LeIF+IL-10)或溶胞產(chǎn)物(Lb+IL-10)刺激后10μg/mlIL-10下調(diào)患者PBMC產(chǎn)生IL-12p40。
當(dāng)用LbeIF4A(LeIF，圖7B)培養(yǎng)時未感染的個體PBMC還產(chǎn)生IL-12p40，盡管檢測不到p40與寄生蟲溶胞產(chǎn)物(Lb)反應(yīng)。這可能表明IFN-γ在患者的PBMC觀察到的溶胞產(chǎn)物誘導(dǎo)的p40中起作用，在抗原刺激后患者的PBMC比正常PBMC多5-100倍的IFN-γ(見圖5)。
為了測定在抗原刺激的PBMC培養(yǎng)物中觀察到的IL-12p40是否反應(yīng)生物活性細(xì)胞因子，還在這些培養(yǎng)物中測定了IL-12p70(圖7C和7D)。一般來說，p70產(chǎn)生類似于p40的產(chǎn)生，表明在患者和正常PBMC中與LbeIF4A反應(yīng)均產(chǎn)生生物活性IL-12。
LbeIF4A還刺激培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞(圖9A)和貼壁PBMC(圖9B)中的IL-12產(chǎn)生。從正常供體血液經(jīng)Ficoll-hypague梯度離心分離的PBMC制備貼壁細(xì)胞。2×106PBMC在500μlRPMI，2％人AB血清中培養(yǎng)2小時。經(jīng)過用PBS洗滌平板3次純化貼壁細(xì)胞。然后加入具有各刺激物(IFN-1000V/ml，LbeIF4A(Lf)10μg/ml)的試驗培養(yǎng)基(RPMI，2％人AB血清)500μl。18小時后取上清液。
經(jīng)過用5日齡的PHA母細(xì)胞進(jìn)行捕獲生物測定測量貼壁PBMC產(chǎn)生的IL-12。簡單地說，將IL-12捕獲抗體C11.5.14(WistarInstitute惠贈)覆蓋在96孔平板上。將誘導(dǎo)實驗的上清與重組IL-12(作為標(biāo)準(zhǔn)品)保溫4小時。經(jīng)過幾步洗滌步驟后，加入5日齡PHA母細(xì)胞，這些母細(xì)胞的增殖用于測定貼壁細(xì)胞上清中的IL-12濃度。
經(jīng)過在試驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞(2×106PBMC)5天產(chǎn)生巨噬細(xì)胞。然后在PBS中洗滌巨噬細(xì)胞，加入500μlRPMI，2％人AB血清和1000V/ml IFN-γ。用LbeIF4A(10μg/ml)刺激巨噬細(xì)胞或單獨在培養(yǎng)基(M)中培養(yǎng)。在一組中，用LbeIF4A在500μl RPMI，2％人AB血清，無IFN-γ中培養(yǎng)LbeIF4A對照巨噬細(xì)胞。18小時后取上清并用于誘導(dǎo)IL-12依賴性增殖。簡單地說，用巨噬細(xì)胞上清培養(yǎng)5日齡母細(xì)胞2天。在最后18小時，加入3H胸腺嘧啶。按所指明的加入中和抗-IL-12多克隆山羊血清(5μg/ml)。
另外，LbeIF4A刺激人髓樣白血病細(xì)胞系THP-1中IL12的產(chǎn)生(圖10)。在含5％胎牛血清的無內(nèi)毒素RPMI培養(yǎng)基中以106細(xì)胞/ml將細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時。10μg/ml LbeIF4A與IFN-γ協(xié)同刺激THP-1細(xì)胞分泌IL-12。這些結(jié)果表明LbeIF4A作為疫苗的實用性。
實施例9IL-12和1L-10對LbeIF4A誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的影響本實施例檢查了IL-12，IL-10和IFN-γ間相互作用與缺少SEQ ID NO2 N端48個殘基的LbeIF4A多肽(如實施例3所述)的反應(yīng)。如圖8A所示，在缺少(LeIF)或存在10ng/ml抗-IL-12(LeIF+抗-IL-12)或IL-10(LeIF+IL-10)的條件下用10μg/mlLbeIF4A刺激粘膜利什曼患者的PBMC，測定培養(yǎng)的上清液的IFN-γ分泌?？?IL-12mAb和IL-10取消了LbeIF4A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌的生產(chǎn)。然而，用利什曼蟲溶胞產(chǎn)物刺激后抗-IL-12mAb僅部分減少IFN-γ的生產(chǎn)(圖8B)。這些結(jié)果表明IFN-γ生產(chǎn)是IL-12依整型，并受IL-10的抑制，而IL-12的生產(chǎn)受IFN-γ依賴型和非依賴兩種途徑的調(diào)節(jié)。
實施例10小鼠中LbeIF4A刺激的Th1分布型本實施例證實了缺少SEQ ID NO2N端48個殘基的LbeIF4A多肽(如實施例3所述)刺激BALB/c小鼠中占優(yōu)勢的Th1細(xì)胞因子分布型。使用quilA或CFA作佐劑用LbeIF4A或8E(L·braziliensis線粒體hsp70的C端部分，它刺激患者PBMC產(chǎn)生高水平的IL-10)致敏動物。致敏10天后，用重組抗原再次體外刺激淋巴結(jié)(LN)細(xì)胞并分析上清培養(yǎng)物中分泌的細(xì)胞因子。結(jié)果(圖11)表明使用兩種類型的佐劑用LbeIF4A攻擊后用LbeIF4A致敏的小鼠LN細(xì)胞增殖并分泌幾乎唯一的Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)。與此相反，與用8E攻擊發(fā)生的特異性反應(yīng)是用8E致敏的小鼠LN細(xì)胞產(chǎn)生Th0反應(yīng)(以CFA作佐劑)或Th1/Th2型細(xì)胞因子(以quil A作佐劑)強烈偏向Th2細(xì)胞因子，IL-4和IL-10。同樣地，用寄生蟲溶胞產(chǎn)物致敏的小鼠產(chǎn)生混合的細(xì)胞因子分布型，該結(jié)果可能與寄生蟲溶胞產(chǎn)物單獨用作侯選疫苗相抵觸(圖11)。
這些結(jié)果表明，LbeIF4A可用作佐劑。由于LbeIF4A誘導(dǎo)有力的Th1反應(yīng)，包括與實驗利什曼病保護(hù)最明確相關(guān)的2個細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12，我們研究了該抗原保護(hù)小鼠抵抗利什曼病的能力。用不含佐劑的LbeIF4A免疫BALB/c小鼠一次，7天后接著用L.major皮下感染。與對照組相比，LbeIF4A提供顯著的保護(hù)抵抗L.major感染(圖12)。因此，來自L·braziliensis的異源性抗原可提供一些保護(hù)抵抗L.major感染，表明在這兩類寄生蟲中至少有一些保護(hù)性抗原決定簇保守。
從上面的描述可預(yù)料到，盡管為了說明目的本文描述了本發(fā)明的具體實施方案，但在偏離本發(fā)明精神和范圍的條件下可做出各種修改。
序列描述(1)一般資料(i)申請人Corixa，Corporation(ii)發(fā)明題目用于刺激和增強保護(hù)性免疫反應(yīng)和IL-2生產(chǎn)的化合物和方法(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人SEED and BERRY(B)街道6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue(C)城市Seattle(D)州華盛頓(E)國家美國(F)郵編98104-7092(V)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(Vi)最近申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日1995年4月24日(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名Kadlecek，Ann T.
(B)登記號p-39，244(C)參考/文摘號210121.404PC
(ix)電訊資料(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(C)電傳3723836 SEEDANDBERRY(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度1618堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置115..1326(xi)序列描述SEQ ID NO1CCACTCTCTC GGTCGTCTGT CTCCCACGCG CGCACGCAGT TGATTTCCGC CTTCTTAAAC 60GCTCTCTTTT TTTTTATTTT TCACCTGACC AACCGCACCA CGTCGGCCTC CATC ATG117Met1TCG CAG CAA GAC CGA GTT GCC CCA CAG GAC CAG GAC TCG TTC CTC GAC165Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu Asp5 10 15GAC CAG CCC GGC GTC CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAT GAC ATG CCG TTG213Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro Leu20 25 30CAC CAG AAC CTT CTG CGC GGC ATC TAC TCG TAC GGC TTC GAG AAA CCG 261His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys Pro35 40 45TCC AGC ATC CAG CAG CGC GCC ATC GCC CCC TTC ACG CGC GGC GGC GAC 309Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly Asp50 55 60 65ATC ATC GCG CAG GCG CAG TCC GGT ACC GGC AAG ACG GGC GCC TTC TCC 357Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe Ser70 75 80ATC GGC CTG CTG CAG CGC CTG GAC TTC CGC CAC AAC CTG ATC CAG GGC 405Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln Gly85 90 95CTC GTG CTC TCC CCG ACC CGC GAG CTG GCC CTG CAG ACG GCG GAG GTG 453Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu Val100 105 110ATC AGC CGC ATC GGC GAG TTC CTG TCG AAC AGC GCG AAG TTC TGT GAG 501Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys Glu115 120 125ACC TTT GTG GGT GGC ACG CGC GTG CAG GAT GAC CTG CGC AAG CTG CAG 549Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu Gln130 135 140 145GCT GGC GTC GTC GTC GCC GTG GGG ACG CCG GGC CGC GTG TCC GAC GTG 597Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp Val150 155 160ATC AAG CGC GGC GCG CTG CGC ACC GAG TCC CTG CGC GTG CTG GTG CTC 645Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val Leu165 170 175GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAT CAG ATT TAC693Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile Tyr180 185 190GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC TCC741Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe Ser195 200 205GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTG CTG GAG CTG ACA AAG AAG TTC ATG CGC789Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met Arg210 215 220 225GAC CCC GTA CGC ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG GGC837Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu Gly230 235 240ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAG GAG GAG CAC AAG CTG GAC ACG885Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp Thr245 250 255CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC TTC933Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile Phe260 265 270GCC AAC ACC CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAT CAG981Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn Gln275 280 285AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC GAC1029Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser Asp290 295 300 305CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG CTC1077Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu310 315 320GTA ACG ACC GAC CTC GTG GCC CGC GGC ATC GAC GTG CAC CAC GTG AAC 1125Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val Asn325 330 335ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCG ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG CAC 1173Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu His340 345 350CGC ATT GGC CGC GGC GGC CGC TAC GGC GTA AAG GGT GTT GCC ATC AAC 1221Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile Asn355 360 365TTC GTG ACG GAG AAA GAC GTG GAG CTG CTG CAC GAG ATC GAG GGG CAC 1269Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly His370 375 380 385TAC CAC ACG CAG ATC GAT GAG CTC CCG GTG GAC TTT GCC GCC TAC CTC 1317Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr Leu390 395 400GGC GAG TGA GCGGGCCCCT GCCCCCCTTC CCTGCCCCCC TCTCGCGACG 1366Gly Glu *AGAGAACGCA CATCGTAACA CAGCCACGCG AACGATAGTA AGGGCGTGCG GCGGCGTTCC 1426CCTCCTCCTG CCAGCGGCCC CCCTCCGCAG CGCTTCTCTT TTGAGAGGGG GGCAGGGGGA 1486GGCGCTGCGC CTGGCTGGAT GTGTGCTTGA GCTTGCATTC CGTCAAGCAA GTGCTTTGTT 1546TTAATTATGC GCGCCGTTTT GTTGCTCGTC CCTTTCGTTG GTGTTTTTTC GGCCGAAACG 1606GCGTTTAAAG CA1618(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度403個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45Pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385390 395 400Leu Gly Glu
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA分子，包含選自下列的DNA序列(a)SEQ ID NO1核苷酸115地1323；(b)在中等嚴(yán)格的條件下與SEQ ID NO1核苷酸115至1323的互補核苷酸序列雜交的DNA序列，其中，該DNA序列編碼在來自Leishmania感染的個體外周血單核細(xì)胞中刺激Th1免疫反應(yīng)的多肽；(c)編碼由上述任一DNA序列編碼之多肽的DNA。
2.一種重組表達(dá)載體，包含權(quán)利要求1的DNA分子。
3.一種用權(quán)利要求2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
4.一種制備在Leishmania感染的個體外周血單核細(xì)胞中刺激Th1免疫反應(yīng)之多肽的方法，包含在啟動該DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞并回收該多肽。
5.一種多肽，包含由權(quán)利要求1的DNA序列編碼的氨基酸序列
6.一種多肽，包含SEQ ID NO2的氨基酸49-403，或其區(qū)別僅在于保守取代和/或修飾的變異體。
7.一種評價患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)之能力的方法，包含(a)將從患者獲得的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求5或6的多肽接觸，其中生物學(xué)樣品包含選自外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞；樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或其組合的細(xì)胞；(b)測量細(xì)胞的反應(yīng)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的反應(yīng)是增殖反應(yīng)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中的反應(yīng)是選自干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12p70，白細(xì)胞介素-12p40亞基，白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的細(xì)胞因子的分泌。
10.權(quán)利要求7的方法，其中的反應(yīng)是編碼選自干擾素γ，白細(xì)胞介素-1，白細(xì)胞介素-12p40亞基，白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的細(xì)胞因子之mRNA的表達(dá)。
11.一種在患者中增強對抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽和一種抗原。
12.一種在患者中刺激結(jié)合Leishmania寄生蟲之抗體的產(chǎn)生的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽。
13.一種在患者中刺激Th1免疫反應(yīng)的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽。
14.一種在生物學(xué)樣品中刺激Th1反應(yīng)的方法，包含將Leish-mania感染的個體的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求5或6的多肽接觸，其中生物學(xué)樣品包含選自外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其組合的細(xì)胞。
15.一種在患者中下調(diào)白細(xì)胞介素10表達(dá)的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽。
16.一種在生物學(xué)樣品中下調(diào)白細(xì)胞介素-10表達(dá)的方法，包含將得自Leishmania感染的個體的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求5或6的多肽接觸，其中生物學(xué)樣品包含選自外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其組合的細(xì)胞。
17.一種測定抗原制備疫苗組合物之適宜性的方法，包含測定該抗原是否能刺激得自未感染Leishmania的個體的生物學(xué)樣品產(chǎn)生白細(xì)胞介素-12，其中，生物學(xué)樣品包含選自外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其組合的細(xì)胞。
18.一種單克隆抗體，與權(quán)利要求5或6的多肽特異性地結(jié)合。
19.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求5或6的多肽和一種生理上可接受的載體。
20.一種用于刺激對抗原的保護(hù)性免疫反應(yīng)的疫苗，包含權(quán)利要求5或6的多肽和一種抗原。
21.一種刺激患者中IL-12生產(chǎn)的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽。
22.一種刺激生物學(xué)樣品中IL-12產(chǎn)生的方法，包含將生物學(xué)樣品與權(quán)利要求5或6的多肽接觸，其中生物學(xué)樣品包含選自外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹枝狀細(xì)胞和其組合的細(xì)胞。
23.一種治療患有與IL-12刺激反應(yīng)的疾病的患者的方法，包含給患者施用權(quán)利要求5或6的多肽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的疾病是感染性疾病。
25.權(quán)利要求23的方法，其中的疾病是癌癥。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于增強患者細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答之藥物中的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于刺激結(jié)合Leishma-nia寄生蟲患者抗體產(chǎn)生之藥物中的應(yīng)用。
28.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于刺激患者Th1免疫反應(yīng)之藥物中的應(yīng)用。
29.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于下調(diào)患者白細(xì)胞介素-10表達(dá)之藥物中的應(yīng)用。
30.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于刺激患者白細(xì)胞介素-12之藥物中的應(yīng)用。
31.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多肽在生產(chǎn)用于治療患有與白細(xì)胞介素-12刺激反應(yīng)的疾病的患者之藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
公開了用于刺激和增強免疫反應(yīng)及用于評價患者免疫反應(yīng)的化合物和方法。公開的化合物包括至少含有Leishmania braziliensis同源的真核起始因子4A的生物活性部分的多肽或其衍生物。這類化合物對于刺激在患者及分離的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物中的Th1免疫反應(yīng)和IL-12產(chǎn)生有用。本發(fā)明的多肽還對于評價和治療可能患有利什曼病或其它疾病的患者有用。
文檔編號C07K14/435GK1149887SQ95193405
公開日1997年5月14日 申請日期1995年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月22日
發(fā)明者S·G·里德 申請人:科里克薩有限公司