專(zhuān)利名稱(chēng)：9，10-二氫化吖啶化合物發(fā)光的新方法和試劑盒的制作方法
交叉引用的相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是申請(qǐng)人的兩件共同待審申請(qǐng)08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，這兩件申請(qǐng)又是申請(qǐng)?zhí)枮?8/061，810(1993年5月17日)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。發(fā)明背景(1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光的9，10-二氫化吖啶化合物，更具體的說(shuō)，涉及N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸衍生物，它們可由9，10-二氫化吖啶通過(guò)與過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶反應(yīng)而發(fā)光(化學(xué)發(fā)光)。本發(fā)明涉及由化學(xué)方法發(fā)光(化學(xué)發(fā)光)的一種改進(jìn)的方法，該方法是通過(guò)一種過(guò)氧化物酶和一種氧化劑(如過(guò)氧化氫)對(duì)一組N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸衍生物的作用而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明也涉及用特定的增強(qiáng)劑物質(zhì)使得該方法產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光量增加的改進(jìn)方法。本發(fā)明也涉及用該方法測(cè)定過(guò)氧化氫或過(guò)氧化物酶。而且，本發(fā)明還涉及用該方法監(jiān)測(cè)和定量測(cè)定多種生物分子。例如，該方法通過(guò)免疫試驗(yàn)技術(shù)可用來(lái)測(cè)定半抗原、抗原、蛋白質(zhì)和抗體，以及通過(guò)核酸雜交試驗(yàn)可用來(lái)測(cè)定DNA或RNA。該方法另外還可用于檢測(cè)可產(chǎn)生過(guò)氧化氫的酶如氧化物酶。該方法特別可在用自動(dòng)化儀器完成的試驗(yàn)中檢測(cè)生物分子。
(2)相關(guān)技術(shù)的描述通過(guò)采用放射標(biāo)記的報(bào)道分子，過(guò)去已能夠以很高的靈敏度完成對(duì)生物分子的檢測(cè)和定量測(cè)定。最近已發(fā)展了無(wú)數(shù)非放射活性的方法以避免采用這些(放射性)物質(zhì)帶來(lái)的危害和不便。酶聯(lián)檢測(cè)技術(shù)提供了最好的靈敏度，這是因?yàn)榈孜锏拇呋D(zhuǎn)化產(chǎn)生了可檢測(cè)的變化，實(shí)際上放大了被測(cè)信號(hào)。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了一些可產(chǎn)生顏色、瑩光或化學(xué)發(fā)光的底物，后者可獲得最好的靈敏度。
而且，試驗(yàn)靈敏度的增加會(huì)擴(kuò)展以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的方法的應(yīng)用范圍，這是由于可以用更少量的分析物來(lái)進(jìn)行測(cè)定或者由于降低了完成試驗(yàn)所需的時(shí)間和/或反應(yīng)物的量。在化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)中提高測(cè)定速度和靈敏度的一種方法就是使得所發(fā)的光是短脈沖、高強(qiáng)度的光。
在酶聯(lián)檢測(cè)方法如免疫試驗(yàn)、寡核苷酸檢測(cè)和核酸雜交技術(shù)中，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是最廣泛使用的酶之一。本領(lǐng)域已知的HRP檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光試劑在分析中并未完全利用該酶的生物性能，這主要是由于靈敏度的限制。因此，需要更有效的化學(xué)發(fā)光底物以改善該報(bào)道酶的可用性。此外，產(chǎn)生高強(qiáng)度閃光與酶催放大步驟結(jié)合的能力(這是本領(lǐng)域未知的)，對(duì)檢測(cè)靈敏度和自動(dòng)測(cè)定也有有益的作用。a.9，10-二氫化吖啶的氧化在共同申請(qǐng)系列號(hào)08/061,810(1993年5月17日提出)，08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)中，公開(kāi)了用過(guò)氧化物酶使取代和未取代的N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸衍生物氧化而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。這些專(zhuān)利公開(kāi)的內(nèi)容在此作為參考文獻(xiàn)引用。在過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物存在下，可以在一步反應(yīng)中有效地氧化N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸衍生物而產(chǎn)生N-烷基吖啶酮和化學(xué)藍(lán)光。
在偶極非質(zhì)子溶劑強(qiáng)堿性條件下，10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯經(jīng)過(guò)自動(dòng)氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9(6)，201-8(1976)；F.McCapra，M.Roth，D.Hysert，K.A.Zaklika“化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光”，plenum press，New York，1973，pp.313-321；F.McCapra，“有機(jī)化學(xué)進(jìn)展”，8，231-277(1971)；F.McCapra，“純應(yīng)用化學(xué)”，24，611-629(1970)；U.S.Patent NO.5,283,334 and 5,284,951toMc Capra and 5,284,952 to Ramakrishnan)。產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的量是在10-5至0.1范圍內(nèi)，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯酚或醇離去基團(tuán)的Pka減小時(shí)，該發(fā)光量增加。在水溶液中產(chǎn)生的量明顯較低，這是由于中間體的競(jìng)爭(zhēng)性非發(fā)光分解反應(yīng)的存在。加入陽(yáng)離子表面活性劑CTAB由于阻止了不可見(jiàn)(光)反應(yīng)而使產(chǎn)生的可見(jiàn)光增加130倍。b.吖啶鎓酯的化學(xué)發(fā)光氧化在堿性溶液中采用H2O2對(duì)N-烷基吖啶鎓羧酸的脂族和芳族酯進(jìn)行化學(xué)發(fā)光氧化反應(yīng)是眾所周知的反應(yīng)。接近0.1的高化學(xué)發(fā)光量使具有可結(jié)合生物分子側(cè)活性基的衍生物得到了發(fā)展。利用吖啶鎓酯標(biāo)記的許多化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)和寡核苷酸探針已有報(bào)道。
吖啶鎓酯(AE′s)的采用，特別是當(dāng)在蛋白質(zhì)或寡核苷酸上標(biāo)記時(shí)，有兩個(gè)缺點(diǎn)。主要問(wèn)題是水解穩(wěn)定性。在室溫或略高于室溫條件下，通過(guò)酯基的水解，吖啶鎓酯共軛物發(fā)生穩(wěn)定的分解。根據(jù)離去基團(tuán)的取代情況，需要在-20℃下長(zhǎng)期保存。當(dāng)在這些條件下氧化時(shí)，N-烷基吖啶鎓羧酸的酰胺、硫代酯和磺酰胺也可發(fā)光(T.Kinkel，H.Lubbers，E.Schmidt，P.Molz，H.J.Skrzipczyk，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光雜志(J.Biolumin.Chemilumin.)，4，136-139，(1989)，G.Zomer，J.F.C.Stavenuiter，Anal.Chim.Acta，227，11-19(1989))。這些改性的離去基團(tuán)只能部分地改善保存穩(wěn)定性。
吖啶鎓酯的第二個(gè)缺點(diǎn)是在9-位加合親核試劑(如水)有生成不發(fā)光的假堿中間體的趨勢(shì)，該假堿中間體在黑暗中以pH依賴(lài)的方式分解。在實(shí)踐中，首先必須降低吖啶鎓酯溶液的pH以使假堿的生成反應(yīng)反方向進(jìn)行，然后在H2O2存在下升高pH使其發(fā)光。
采用吖啶鎓酯作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的-個(gè)更主要的局限在于下述事實(shí)當(dāng)用作直接標(biāo)記時(shí)，至多只有約10個(gè)分子可結(jié)合到蛋白質(zhì)或寡核苷酸上。與有效產(chǎn)生光子的光量(≤10％)相對(duì)應(yīng)，吖啶鎓酯標(biāo)記的被分析物至多產(chǎn)生一個(gè)光子。與此相對(duì)照，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)的酶標(biāo)記的被分析物，利用酶的催化作用對(duì)每個(gè)被測(cè)分析物分子而言可能產(chǎn)生多達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)的光。
在免疫試驗(yàn)中增加與被分析物結(jié)合的吖啶鎓酯分子數(shù)量的一種嘗試就是建立抗體-脂質(zhì)體結(jié)合物，其中的脂質(zhì)體含有不定數(shù)量的AE′s(S.-J.Law，T.Miller，U.Piran，C.Klukas，S.Chang，J.Unger，J..Biolumin.Chemilumin.，4，88-98，(1989))。這種方法與采用直接標(biāo)記的AE′s相比只能使信號(hào)有中等程度增加。c.辣根過(guò)氧化物酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)氨基取代的環(huán)?；ｋ氯绨被蕉?肼和異氨基苯二酰-肼與H2O2和過(guò)氧化物酶酶催化劑(如辣根過(guò)氧化物酶，HRP)在堿性條件下反應(yīng)伴隨著發(fā)光。該反應(yīng)是測(cè)定H2O2和過(guò)氧化物酶分析方法的基礎(chǔ)。在采用HRP的強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)中已經(jīng)使用了氨基苯二酰-肼的類(lèi)似物(8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]噠嗪-1，4-(2H，3H)二酮)(M.Ii，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.Biophys.Res.comm，193(2)，540-5(1993))。被過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物氧化的另外的化學(xué)發(fā)光化合物是羥基取代的鄰苯二甲酰肼(Akhavan-Tafti，共同待審的US專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?65231，1992年10月23日提出)。申請(qǐng)人共同申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?8/061,810，08/205,093和08/228,290公開(kāi)了化學(xué)發(fā)光的N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸酯和碘酰亞胺，在測(cè)定過(guò)氧化物酶和在試驗(yàn)中它們與過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生光。
結(jié)合氨基苯二酰-肼的使用相對(duì)應(yīng)也采用了大量的增強(qiáng)劑以增加發(fā)光強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。這些增強(qiáng)劑包括苯并噻唑衍生物如-D熒光素、多種苯酚化合物如對(duì)-碘苯酚和對(duì)-苯基苯酚和芳胺(G.Thorpe，L.Kricka，inBioluminescence and Chemiluminescence，New Perspectives ，J.Scholmerich，etal，Eds.，pp.199-208(1987))。這里討論的苯酚化合物是指羥基芳族化合物，也包括諸如2-萘酚和6-溴-2-萘酚化合物，已知除前面提及取代的羥基苯基化合物之外它們可加強(qiáng)其它過(guò)氧化物酶的反應(yīng)。通過(guò)過(guò)氧化物酶對(duì)氨基-取代的環(huán)?；ｋ碌幕瘜W(xué)發(fā)光氧化反應(yīng)起到增強(qiáng)劑作用的其它化合物在下述文獻(xiàn)中公開(kāi)US專(zhuān)利號(hào)5,206,149，Oyama和5,171,688，Sugiyama，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O93/16195，登記日期1993年8月19日以及M.Ii.等人的文獻(xiàn)(見(jiàn)下文)。
目的因此本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的方法和具有較好性能的9，10-二氫化吖啶化合物，具體地說(shuō)是N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸芳基酯衍生物，所述方法和化合物是在過(guò)氧化物酶作用下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光用于生物物質(zhì)和化合物的測(cè)定。本發(fā)明的目的也是提供一種改進(jìn)的方法和試劑盒，利用N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸芳基衍生物在過(guò)氧化物酶作用下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用來(lái)測(cè)定試驗(yàn)溶液中的過(guò)氧化物酶和酶結(jié)合物。另外，本發(fā)明的目的也是提供一種改進(jìn)的方法和試劑盒，利用N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸芳基酯衍生物，通過(guò)過(guò)氧化物酶作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用于溶液中和表面上的核酸試驗(yàn)。另外，本發(fā)明的目的還提供-種改進(jìn)的方法和試劑盒，利用N-烷基-9，10二氫化吖啶羧酸芳基酯衍生物，通過(guò)過(guò)氧化物酶作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，在酶免疫試驗(yàn)中用來(lái)測(cè)定半抗原、蛋白質(zhì)和抗體。
附1是由含有本發(fā)明2′，3′，6′--三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9羧酸酯(5c)的試劑發(fā)光的圖示。用1μl含有1.4×10-16摩爾HRP的水溶液孵育40μl制劑。制劑的組成如下0.01Mtris緩沖液中的1.5μM 9，10-二氫化吖啶化合物5c，pH8.0，0.6mM脲過(guò)氧化物，0.1mM對(duì)苯基-苯酚，0.025％TWEEN20，1mMEDTA。100秒后，注射入100μl的0.1M氫氧化鈉。該圖表示在這些條件下突然地發(fā)出強(qiáng)光(以相對(duì)光單位，RLU)。
圖2表示采用本發(fā)明的試劑組合物測(cè)定HRP的線性度。在獨(dú)立試驗(yàn)中，在室溫將50μl含有9，10-二氫化吖啶5c的溶液與1.25μl等份含有所述量酶的HRP混合。100秒后，注射入100μl的0.1M氫氧化鈉。積分光強(qiáng)度2秒。術(shù)語(yǔ)S-B是指在用無(wú)HRP存在的背景化學(xué)發(fā)光(B)校準(zhǔn)后，在HRP存在下以RLU表示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(S)。
圖3表示含有9，10-二氫化吖啶5c(3ml)的實(shí)施例9試劑與1.1×10-13摩爾HRP反應(yīng)的一系列吸收?qǐng)D譜。加入酶后以30秒間隔在300-500nm范圍內(nèi)掃描吸收?qǐng)D譜。曲線的進(jìn)展表明吖啶鎓化合物4c生成，等吸光點(diǎn)約338nm(在該方向曲線最低至最高是在400nm)。15分鐘后未觀察到光譜進(jìn)一步的變化。
圖4表示含有9，10-二氫化吖啶化合物2′，6′-二氟苯基10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯的3ml試劑與1.1×10-13摩爾HRP反應(yīng)的一系列吸收?qǐng)D譜。加入酶后以30秒間隔在300-500nm范圍內(nèi)掃描吸收?qǐng)D譜。曲線的進(jìn)展表明無(wú)等吸光點(diǎn)存在的更復(fù)雜的現(xiàn)象，標(biāo)志著吖啶鎓化合物2′，6′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯和10-甲基吖啶酮二者的生成(在該方向曲線最低至最高是在400nm)，這是通過(guò)與這兩種化合物的真樣進(jìn)行比較得到證實(shí)的。
優(yōu)選的實(shí)施方案本發(fā)明涉及產(chǎn)生一種化學(xué)發(fā)光的方法，該方法包括a)在中間體化合物能積累的時(shí)間、溫度和pH條件下，使過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶與9，10-二氫化吖啶反應(yīng)，其中9，10-二氫化吖啶具有下述的通式
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中的R1-R8各自獨(dú)立地選自可產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y是離去基團(tuán)；和b)將pH提高至足以使該中間體與過(guò)氧化物的反應(yīng)能突然發(fā)光的水平，其發(fā)光強(qiáng)度基本上大于該pH提高前產(chǎn)生的強(qiáng)度。
本發(fā)明也涉及該方法在檢測(cè)被分析物中的應(yīng)用，試驗(yàn)過(guò)程是通過(guò)一種化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其中的被分析物與(或可以)與過(guò)氧化物酶直接或間接地連接，并且其中的發(fā)光量是與被分析物的量相關(guān)的。
本發(fā)明也涉及該方法在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試驗(yàn)過(guò)程中用來(lái)檢測(cè)一種過(guò)氧化物酶，其中的發(fā)光量是與該酶的量相關(guān)的。該酶可連接到一種特定的結(jié)合對(duì)中的一個(gè)成員。這種連接可以是例如通過(guò)采用生物素標(biāo)記的被分析物和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶結(jié)合物。在實(shí)施本發(fā)明將過(guò)氧化物酶與特定結(jié)合對(duì)中一個(gè)成員結(jié)合的方法時(shí)，也可很容易地采用其它本領(lǐng)域公知的高親和性結(jié)合對(duì)，如熒光素和抗熒光素、洋地黃毒苷和抗洋地黃毒苷、或互補(bǔ)核酸序列。因此，本發(fā)明的方法可用于免疫試驗(yàn)技術(shù)中檢測(cè)半抗原、抗原、蛋白質(zhì)和抗體，以及核酸雜交試驗(yàn)中檢測(cè)DNA或RNA。
本發(fā)明也涉及該方法在測(cè)定過(guò)氧化氫中的應(yīng)用，所述的測(cè)定是通過(guò)與過(guò)氧化物酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行的，其中發(fā)光量是與存在的過(guò)氧化物的量相關(guān)的。氧化物酶也可采用本發(fā)明方法測(cè)定，對(duì)化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因?yàn)檠趸竿ㄟ^(guò)對(duì)氧的還原和對(duì)其初始底物的氧化可產(chǎn)生過(guò)氧化氫，所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫與本發(fā)明的9，10-二氫化吖啶化合物的反應(yīng)可以產(chǎn)生與過(guò)氧化物酶的量有關(guān)的光。
本發(fā)明也設(shè)計(jì)了一些試劑盒，用于檢測(cè)任何一種被分析物、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶結(jié)合物、過(guò)氧化物或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的測(cè)試過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑系統(tǒng)。用于實(shí)踐本發(fā)明任何一種實(shí)施方案中的試劑盒均包括一或多個(gè)容器a)上述的一種9，10-二氫化吖啶化合物；
b)使反應(yīng)溶液的pH增加的一種試劑；c)一種過(guò)氧化物，如果待測(cè)分析物不是過(guò)氧化物或可產(chǎn)生過(guò)氧化物的一種試劑；d)一種過(guò)氧化物酶，如果待測(cè)分析物不是過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化物酶與被分析物的結(jié)合物，或不是過(guò)氧化物酶與試劑(所述試劑與被分析物形成特定結(jié)合對(duì))的結(jié)合物。
另一方面本發(fā)明具體涉及下式所示的9，10-二氫化吖啶化合物
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中R1-R8各自獨(dú)立地選自可發(fā)光的基團(tuán)，這里R1-R8至少一個(gè)選自烷基，烷氧基和鹵素，并且其中Y表示可通過(guò)與過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶的反應(yīng)由9，10-二氫化吖啶發(fā)光的離去基團(tuán)。
優(yōu)選的一組化合物是
其中R是烷基、芳烷基或雜烷基，其中R2-R8各自獨(dú)立地選自可發(fā)光的基團(tuán)，其中OR9是C1-C20直鏈或支鏈烷氧基和其中Ar表示取代或未取代芳基或雜芳基。
另一組優(yōu)選的化合物是
其中可相同或不同的R2-R8中至少一個(gè)表示C1-C20直鏈或支鏈烷氧基，其中OR9、R和Ar的定義如上。
另一組優(yōu)選的化合物是
其中R選自烷基、芳烷基或雜烷基，其中R2-8各自獨(dú)立地選自可發(fā)光的基團(tuán)，其中R1選自鹵素和C1-C20直鏈或支鏈烷基，其中Ar表示取代或未取代芳基或雜芳基。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)采用的9，10-二氫化吖啶化合物包括那些有Ar基團(tuán)的化合物，Ar基團(tuán)由取代或未取代的芳基或雜芳基組成。芳基選自苯基、萘基、蒽基、菲基和芘基；雜芳基選自吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、喹啉基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、咪唑基等。可考慮作為取代基的基團(tuán)包括烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基烷基、鹵素、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、三氟甲基、氨基、氨基、三烷基銨基和硝基。
為了優(yōu)化具體應(yīng)用的9，10-二氫化吖啶化合物的性能，在不離開(kāi)本發(fā)明范圍的情況下對(duì)基團(tuán)R和Ar的具體組合進(jìn)行改進(jìn)是很容易進(jìn)行的。例如可以選擇易于合成的取代基或選擇可提供穩(wěn)定性好的化合物或具有特定反應(yīng)動(dòng)作力學(xué)的取代基。選擇的取代基也應(yīng)能提供穩(wěn)定性高或副反應(yīng)少或化學(xué)發(fā)光效率高的9，10-二氫化吖啶化合物。這些內(nèi)容可通過(guò)參考下文詳述的反應(yīng)過(guò)程和參考實(shí)施例來(lái)理解。
本發(fā)明涉及改進(jìn)的9，10-二氫化吖啶化合物，當(dāng)其與過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物反應(yīng)時(shí)被轉(zhuǎn)化為中間體化合物，該中間體化合物在高pH條件下進(jìn)行快速化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。雖然沒(méi)有找到任何具體的理論解釋?zhuān)鲜龅闹虚g體似乎可以鑒別為它是相應(yīng)的其中中心環(huán)是芳香環(huán)的吖啶鎓化合物。以這種方式進(jìn)行的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所發(fā)的光是具有高峰值強(qiáng)度的短暫的突然發(fā)光。與之相反的是，在08/061,810申請(qǐng)中公開(kāi)的發(fā)光方法是采取在幾分鐘內(nèi)逐漸增加達(dá)到穩(wěn)定的水平的方式。9，10-二氫化吖啶化合物與過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物的反應(yīng)通常是在含水緩沖液中在與酶活性匹配的pH條件下進(jìn)行的，pH優(yōu)選在約6至約8.5之間。在幾秒至幾分鐘的一段初期孵育后將溶液的pH升高到約11。酶催反應(yīng)形成的中間體在高pH條件下通過(guò)與過(guò)氧化物的反應(yīng)突然產(chǎn)生光。反應(yīng)流程1
通過(guò)適當(dāng)選擇9，10-二氫化吖啶化合物和通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)條件使得吖啶鎓化合物積累，可降低酶催化氧化相中吖啶鎓化合物的化學(xué)發(fā)光分解反應(yīng)的速率。例如將1-位具有除氫外取代基的9，10-二氫化吖啶氧化，可得到具有較好穩(wěn)定性的吖啶鎓化合物。隨后調(diào)高反應(yīng)溶液堿性，大大加速了吖啶鎓與過(guò)氧化物反應(yīng)，以消除離去基團(tuán)和二氧化碳，并且發(fā)出由N-取代吖啶酮的激發(fā)態(tài)產(chǎn)生的光。
本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)提供了檢測(cè)過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化物的意想不到靈敏的方法。由信/噪比定義的分析靈敏度受到其對(duì)不同途徑產(chǎn)生光的鑒別能力的限制，即能否將由酶催化產(chǎn)生的中間體發(fā)生堿-誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的光與其它所有的發(fā)光方法產(chǎn)生的光區(qū)分開(kāi)來(lái)。非常意想不到的是，以下三種潛在的副反應(yīng)發(fā)生的程度并未影響所需信號(hào)的測(cè)定。首先，在本方法中通過(guò)對(duì)9，10-二氫化吖啶的酶催氧化產(chǎn)生的吖啶鎓酯中間體，在中性和中等堿性pH條件下發(fā)出相對(duì)低水平的光。本領(lǐng)域已知的吖啶鎓酯、硫代酯和碘酰胺與過(guò)氧化氫快反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈化學(xué)發(fā)光，這一事實(shí)是令人驚異的。
其次，如以下McCapra所述，N-烷基-9，10-二氫化吖啶羧酸酯本身與分子氧在pH≥11時(shí)發(fā)生了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(自動(dòng)氧化)。預(yù)計(jì)當(dāng)pH升高時(shí)，酶孵育后存在的任何未反應(yīng)的9，10-二氫化吖啶會(huì)產(chǎn)生大量的背景發(fā)光。令人驚異的是，相對(duì)于酶催產(chǎn)生的吖啶鎓化合物所發(fā)出的光而言，本發(fā)明的9，10-二氫化吖啶在第二步中所使用的高pH條件下并不產(chǎn)生大量的光。
第三，吖啶鎓化合物可能產(chǎn)生不發(fā)光的副反應(yīng)。本領(lǐng)域公知的一些反應(yīng)是通過(guò)與非-發(fā)光通道競(jìng)爭(zhēng)消耗吖啶鎓化合物而降低了本來(lái)能產(chǎn)生的發(fā)光量。水解結(jié)果使得離去基團(tuán)Y脫去，并形成非-發(fā)光的羧酸酯(鹽)離子。親核試劑加到9-位上產(chǎn)生了稱(chēng)之為假堿的中間體。溶液的pH降低至約1-3時(shí)該反應(yīng)是可逆的，但這將會(huì)使反應(yīng)不必要地復(fù)雜化。水解起始的9，10-二氫化吖啶也會(huì)限制可能產(chǎn)生的光量。
本發(fā)明的反應(yīng)是在可以與固體載體表面接觸的溶液如含水緩沖液中進(jìn)行的。固體載體如涂布了酶的珠、管、膜或微孔平板。合適的緩沖液包括能夠保持pH在約6-約8.5范圍內(nèi)的任何常用的緩沖液，例如磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、三(羥甲基氨基)甲烷、甘氨酸、tricine、2-氨基-2甲基-1丙醇、二乙醇胺緩沖液等等。在這個(gè)方面實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的方法是由具體應(yīng)用的要求所決定的。
將某些增強(qiáng)劑化合物單獨(dú)或表面活性劑聯(lián)合加入反應(yīng)混合物中，可以提高酶的活性。因?yàn)槊复弋a(chǎn)生的中間體在pH升高時(shí)隨后發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生的中間體增多轉(zhuǎn)化為發(fā)光增多。這些增強(qiáng)劑包括如下文獻(xiàn)中所述的已知可加強(qiáng)其它過(guò)氧化物反應(yīng)的苯酚化合物和芳香胺G.Thorpe，Lkricka，inBioluminescence and Chemiluminescence，New Perspectives，J.Scholmerich，etal，Eds.，pp.199-208(1987)，M.Ii，H.Yoshida，YAramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.Biophys.Res.Comm.，193(2)，540-5(1993)，和U.S.專(zhuān)利號(hào)5,171,668和5,206,149。上述文獻(xiàn)作為參考文獻(xiàn)引入本文。在PCTWO93/16195(1993年8月19日)中公開(kāi)的和作為參考文獻(xiàn)引入本文的取代和未取代的芳基硼酸化合物和它們的酯和酸酐衍生物，也在本發(fā)明使用的增強(qiáng)劑的范圍之內(nèi)。優(yōu)選的增強(qiáng)劑包括但不限于對(duì)苯基苯酚，對(duì)碘苯酚，對(duì)溴苯酚，對(duì)羥基肉桂酸，2-萘酚和6-溴-2-萘酚。
某些添加劑在沒(méi)有過(guò)氧化物酶存在下可抑制過(guò)氧化氫和芳基9，10-二氫化吖啶衍生物反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。這樣的添加劑可被進(jìn)一步采用來(lái)改善本發(fā)明的應(yīng)用。也已發(fā)現(xiàn)某些表面活性劑如陰離子、陽(yáng)離子和非離子表面活性劑可以通過(guò)提供較強(qiáng)信號(hào)來(lái)提高本發(fā)明測(cè)定過(guò)氧化物酶試驗(yàn)的靈敏度。
本發(fā)明組合物各種組分的優(yōu)選的量如表I所示；表I9，10-二氫化吖啶 InM-1mM苯酚增強(qiáng)劑1μM-10mM表面活性劑0.005-5％過(guò)氧化物 0.01-10mM螯合劑0.01-5mM本發(fā)明涉及含有緩沖液的溶液，包括1)苯酚增強(qiáng)劑或苯酚增強(qiáng)劑的鹽，2)過(guò)氧化物，該過(guò)氧化物沒(méi)有限制，可以是過(guò)氧化氫、過(guò)氧化脲或過(guò)硼酸鹽，3)本發(fā)明的9，10-二氫化吖啶化合物，4)多齒陽(yáng)離子絡(luò)合劑如EDTA，EGTA和它們的鹽，和5)表面活性劑如陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，或優(yōu)選的非離子表面活性劑如聚氧乙烯化的烷基苯酚、聚氧乙烯化的醇、聚氧乙烯化的醚、聚氧乙烯化的山梨糖醇酯等。
在實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，將pH在約5-約9范圍內(nèi)的水緩沖溶液(其中含有最終濃度大約是0.01M-1×10-6M的苯酚化合物如對(duì)苯基苯酚或?qū)Φ獗椒?、最終濃度大約是5％-0.005％(v/v)的非離子表面活性劑、過(guò)氧化物源如過(guò)氧化氫或優(yōu)選的過(guò)硼酸鹽或過(guò)氧化脲和最終濃度大約是1×10-3M-1×10-5M陽(yáng)離子絡(luò)合劑如EDTA)與其中含有本發(fā)明9，10-二氫化吖啶化合物最終濃度達(dá)到約0.001M-約1×10-9M的第二溶液混合，得到檢測(cè)試劑溶液。使所得的溶液與溶液中的或吸附于固體載體上的過(guò)氧化物酶接觸。檢測(cè)反應(yīng)可以在一定的溫度范圍內(nèi)至少包括10-40℃內(nèi)進(jìn)行。孵育期后，通過(guò)加入堿也可以另外加過(guò)氧化物使溶液的pH至少升高到約10。結(jié)果是發(fā)光很快達(dá)到最高水平然后衰減。優(yōu)選快速加入堿使得光以幾秒鐘的時(shí)間間隔發(fā)出。孵育的時(shí)間和溫度以及反應(yīng)pH的調(diào)整本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員對(duì)此是很清楚的，這些均在本發(fā)明的主題之內(nèi)。
芳基9，10-二氫化吖啶衍生物和含有它們的本發(fā)明組合物的顯著優(yōu)點(diǎn)包括它們能測(cè)定累積的化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物中短時(shí)間發(fā)出的所有的光。對(duì)幾秒內(nèi)發(fā)光總量的測(cè)定相當(dāng)于將強(qiáng)度時(shí)間曲線的積分，該曲線是由申請(qǐng)人以前公開(kāi)的可產(chǎn)生持續(xù)發(fā)光的9，10-二氫化吖啶衍生物的反應(yīng)得到的。壓縮發(fā)光時(shí)間的結(jié)果就是，很少量的過(guò)氧化物酶活性產(chǎn)生了(強(qiáng)度)大的容易測(cè)定的閃光。如果控制背景化學(xué)發(fā)光的話(huà)，可以改善測(cè)定的靈敏度。采用這類(lèi)光進(jìn)行檢測(cè)的試驗(yàn)很容易適合現(xiàn)在的大體積商用免疫試驗(yàn)儀器。這些和其它的優(yōu)點(diǎn)通過(guò)實(shí)施例可以很明顯看到。
實(shí)施例合成9，10-二氫化吖啶衍生物根據(jù)反應(yīng)流程2所示的某一個(gè)方法，從相應(yīng)的吖啶-9-羧酸制備9，10-二氫化吖啶羧酸衍生物5a-h。在下面所示的結(jié)構(gòu)中，取代基A和B的確定和位置如表中所述。所有的其它的取代基是H。
化合物 AB X Ar5a 1-OCH3H O 2′，3′，6′-三氟苯基5b 1-OCH3H S 4′-氟苯基5c 1-OCH36-OCH3O 2′，3′，6′-三氟苯基5d 1-OCH38-OCH3O 2′，3′，6′-三氟苯基
5e 3-OCH36-OCH3O 2′，3′，6′-三氟苯基5f 3-OCH3HO 2′，3′，6′-三氟苯基5g 1-CH3HO 2′，3′，6′-三氟苯基5h 1-Cl HO 2′，3′，6′-三氟苯基反應(yīng)流程2.制備9，10-二氫化吖啶化合物
相應(yīng)的吖啶-9-羧酸化合物1a-h通過(guò)文獻(xiàn)所述的方法制備(G.Zomer，J.Stavenuiter，R.Van Den Berg，E.Jansen，In Luminescence Techniques inChemical and Biochemical Analvsis(化學(xué)和生物化學(xué)分析中的發(fā)光技術(shù))，W.Baeyens，D.De Keukeleire，K.Korkidis，eds.，Dekker，New York，505-521，(1991)；R.Stolle，J.Prakt.Chem.，105，137，(1992))。實(shí)施例1.合成化合物5a.2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)使市場(chǎng)獲得的3-甲氧基聯(lián)苯基胺(Aldrich)與草酰氯縮合得到3-甲氧基和1-甲氧基吖啶羧酸(1a和1f)的混合物，轉(zhuǎn)化為酯(3a，f)后通過(guò)硅膠柱色譜分離，用20％乙酸乙酯/己烷洗脫。(b)將化合物1a和1f(1.5g)的混合物懸浮于10mlSOCl2中并回流反應(yīng)混合物3小時(shí)，減壓除去溶劑得到黃色固體。在氬氣氣氛下將其溶于二氯甲烷(CH2Cl2)和吡啶(0.7ml)中，滴加入苯酚0.0878g)的二氯甲烷溶液。在室溫?cái)嚢枞芤哼^(guò)夜，然后用更多的二氯甲烷(100ml)稀釋并用水(3×50ml)洗滌。用硫酸鈉干燥有機(jī)層并濃縮得到異構(gòu)體酯的混合物。通過(guò)硅膠色譜分離產(chǎn)物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基吖啶-9-羧酸酯(3a)，以25％乙酸乙酯/己烷洗脫1HNMR(CDCl3)δ4.180(s)，7.08-8.43(m)。(c)在氬氣氣氛加熱下將酯3a(0.223g)溶于70ml乙醇中，冷卻到室溫后將燒瓶避光放置，加入0.313g氯化銨(10當(dāng)量)，接著加入0.382g(10當(dāng)量)鋅粉。90分鐘后，濾除固體，用二氯甲烷洗滌并蒸發(fā)合并的溶劑。將所得的固體溶于二氯甲烷并過(guò)濾得到淺黃色物質(zhì)，通過(guò)TLC確定其為2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯，TLC也表明該物質(zhì)是純的并具有與原料酯不同的Rf值。(d)在避光氬氣氣氛下約8ml二氯甲烷中，用三氟甲磺酸甲酯(7ml)將還原的產(chǎn)物甲基化。4天后，可揮發(fā)物蒸發(fā)了，通過(guò)硅膠色譜純化產(chǎn)物，以50％乙酸乙酯/己烷洗脫得到化合物5a，為白色固體。實(shí)施例2.合成化合物5b.4′-氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸酯(a)如實(shí)施例1所述將10.3g3-甲氧基和1-甲氧基吖啶羧酸(1a和1f)的混合物轉(zhuǎn)化成異構(gòu)體酰氯，在氬氣氣氛中將產(chǎn)物溶于約200ml二氯甲烷中，加入吡啶(4.2ml，1.3當(dāng)量)并攪拌溶液15分鐘。加入4-氟苯硫酚(5.4ml，1.2當(dāng)量)并攪拌溫?zé)岬娜芤哼^(guò)夜。加入另外的二氯甲烷(100ml)并用水和飽和氯化鈉提取溶液。用硫酸鈉干燥有機(jī)層并濃縮得到棕色固體。通過(guò)硅膠色譜分離產(chǎn)物4′-氟苯基1-甲氧基吖啶-9-硫代羧酸酯(3b)，采用極性梯度在20％乙酸乙酯/己烷至純乙酸乙酯范圍內(nèi)的溶劑洗脫1H NMR(CDCl3)δ4.162(s)，7.18-7.24(m)，7.55-7.65(m)，7.82-7.88(m)，8.07-8.10(d)，8.35-8.38(d)。
(b)加熱下將硫酯3b溶于300ml乙醇中。冷卻到室溫后將燒瓶避光保存。加入1.75g氯化銨10當(dāng)量)接著加入2.14g(10當(dāng)量)鋅粉。15分鐘后濾除固體，用二氯甲烷洗滌并蒸發(fā)合并的溶劑。將所得的固體物質(zhì)溶于二氯甲烷中并過(guò)濾得到淺棕色物質(zhì)，通過(guò)1NMR確定為4-氟苯基1-甲氧基-9，10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸酯(6b)，它不需進(jìn)一步純化即可用來(lái)制備化合物5b。1H NMR(CDCl3)δ 3.928(s)，5.165(s)，6.56-6.59(d)，6.89-7.03(m)，7.16-7.34(m)。
(c)在氬氣氣氛中避光條件下，采用三氟甲磺酸甲酯(12ml)的5ml二氯甲烷溶液將還原產(chǎn)物甲基化。72小時(shí)后，蒸除可揮發(fā)物并通過(guò)硅膠色譜純化產(chǎn)物，采用10-20％乙酸乙酯/己烷洗脫得到0.75g白色固體1H NMR(CDCl3)δ3.712(s)，3.916(s)，4.892(s)，6.656-6.685(d)，6.97-7.06(m)，7.12-7.27(m)，7.31-7.37(m)。實(shí)施例3.合成化合物5c.2′，3′，6′-三氟苯基1，6-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)將羧酸(1c，1d和1e)的混合物(1.4g，4.9mmol)懸浮于過(guò)量的亞硫酰氯(15ml)中并回流反應(yīng)混合物4小時(shí)。減壓除去溶劑并將酰氯產(chǎn)物與2，3，6-三氟苯酚(0.74g，5mmol)和二氯甲烷混合。在氬氣氣氛中滴加入吡啶(1ml，13mmol)。在室溫?cái)嚢枞芤哼^(guò)夜并減壓除去可揮發(fā)物。通過(guò)硅膠柱色譜法純化粗產(chǎn)物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脫，得到產(chǎn)物純2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-吖啶-9-羧酸酯(3c)1H NMR(CDCl3)δ 4.03(s，3H)，4.04(S，3H)，6.85-6.88(d，1H)，7.02-7.24(m，2H)，7.32-7.36(dd，1H)，7.48-7.49(d，1H)，7.70-7.83(m，2H)，8.08-8.11(d，1H)。(b)在氬氣氣氛，采用三氟甲烷-磺酸甲酯(1ml，8.8mmol)，通過(guò)在10ml二氯甲烷中攪拌酯(3c)過(guò)夜將其甲基化。減壓除去可揮發(fā)物并用乙酸乙酯洗滌殘留物。N-甲基吖啶鎓酯(4c)可直接用于下一個(gè)步驟。(c)9，10-二氫化吖啶(5c)的還原是通過(guò)4c(45mg)和1g氯化銨的25ml乙醇溶液與1g鋅粉的反應(yīng)進(jìn)行的。立刻將得到的黃色溶液脫色并另外攪拌30分鐘。加入乙酸乙酯(50ml)并過(guò)濾混合物。蒸除溶劑并通過(guò)硅膠色譜純化殘留物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脫得到純的5c1H NMR(CDCl3)δ3.39(s)，3.84(s，1H)，3.90(s，3H)，5.90(s，1H)，6.50-7.43(m，8H)。實(shí)施例4.合成化合物5d.2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基-9，1 0-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)通過(guò)色譜法從實(shí)施例3所述的試驗(yàn)產(chǎn)物中分離酯3d。1H NMR(CDCl3)δ4.17(s)，7.10-7.30(m)，7.58-7.61(d)，8.16-8.19(d)。(b)向溫?zé)岬孽?0.02g)和氯化銨2g)的乙醇(25ml)溶液中加入鋅粉(2g)，立刻使得溶液脫色。在室溫?cái)嚢杳撋娜芤?0分鐘。向溶液中加入乙酸乙酯(200m1)，然后過(guò)濾，減壓除去濾液中的溶劑。通過(guò)硅膠色譜純化得到的粗產(chǎn)物(10％乙酸乙酯/己烷)，得到純產(chǎn)物(6d)。1H NMR(丙酮-d6)δ，5.66(s)，6.87-6.89(d)，7.12-7.40(m)，7.43-7.46(d)，7.58(s)。(c)在氬氣氣氛中避光條件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液將還原產(chǎn)物甲基化。72小時(shí)后，蒸除可揮發(fā)物并通過(guò)硅膠色譜純化產(chǎn)物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脫得到白色固體。1H NMR(CDCl3)δ3.47(s)，3.91(S)，5.03(s)，6.74-6.77(d)，7.80-7.00(m)，7.21-7.23(d)。實(shí)施例5.合成化合物5e.2′，3′，6′-三氟苯基3，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)通過(guò)色譜法從實(shí)施例3所述的試驗(yàn)產(chǎn)物中分離酯3e。1H NMR(CDCl3)δ4.03(s，6H)，7.11-7.24(m，2H)，7.29-7.33(dd，2H)，7.47-7.48(d，2H)，8.08-8.11(d，2H)。(b)在氬氣氣氛中，采用三氟甲磺酸甲酯(1.3ml，5當(dāng)量)，通過(guò)在30ml二氯甲烷中攪拌酯(3e)過(guò)夜將其甲基化。減壓除去可除揮發(fā)物并用乙酸乙酯洗滌殘留物。N-甲基吖啶鎓酯(4e)可直接用于下一個(gè)步驟。1H NMR(DMSO-d6)δ4.25(s，6H)，4.73(s，3H)，7.60-8.23(m，8H)。(c)9，10-二氫吖啶(5e)的還原是通過(guò)4e(650mg)和650mg氯化銨的100ml乙醇溶液與650mg鋅粉的反應(yīng)進(jìn)行的。立刻將得到的黃色溶液脫色并另外攪拌30分鐘。加入乙酸乙酯(150ml)并過(guò)濾混合物。蒸除溶劑并通過(guò)硅膠色譜純化殘留物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脫得到純的5e1H NMR(丙酮-d6)δ3.48(s，3H)，3.88(s，6H)，5.41(s，1H)，6.62-7.39(m，8H)。實(shí)施例6.合成化合物5f.2′，3′，6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)通過(guò)硅膠色譜法從實(shí)施例1反應(yīng)中分離合2′，3′，6′-三氟苯基3-甲氧基吖啶-9-羧酸酯(3f)，以25％乙酸乙酯/己烷洗脫1H NMR(CDCl3)δ4.043(s，3H)，7.08-8.25(m，9H)。(b)在氬氣氣氛中將化合物3f(0.24g)溶于二氯甲烷(3ml)中并加入三氟甲磺酸甲酯(0.1ml，1.4當(dāng)量)。在室溫?cái)嚢杷玫娜芤哼^(guò)夜得到稠的黃色沉淀，過(guò)濾沉淀，用乙醚洗滌并干燥得到純4f，為黃色晶體1H NMR(DMSO-d6)δ4.288(s，3H)，4.837(s，3H)，7.64-8.89(m，9H)。(d)將化合物4f(35mg)懸浮于無(wú)水乙醇(15ml)中并回流溶液10分鐘得到澄清的溶液。向溶液中分批加入過(guò)量的氯化銨(4g)，接著加入鋅粉(4g)，立刻使得溶液脫色。回流所得的無(wú)色溶液30分鐘，冷卻，過(guò)濾并用乙醇(3×20ml)洗滌沉淀。濃縮溶液得到灰白色固體，將其再次溶于二氯甲烷中并用水(3×50ml)洗滌。蒸除二氯甲烷后得到粗產(chǎn)物，通過(guò)硅膠色譜純化(乙酸乙酯/己烷洗脫)得到純產(chǎn)物，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ3.422(s，3H)，3.847(s，3H)，5.25(S，1H)，6.54-7.39(m，9H)。實(shí)施例7.合成化合物5g.2′，3′，6′-三氟苯基1，10-二甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)將1-甲基吖啶-9-羧酸和3-甲基吖啶-9-羧酸(4.0g，15.6mmol)的混合物懸浮于過(guò)量亞硫酰氯(50ml)中并回流反應(yīng)混合物1.5小時(shí)。減壓除去溶劑。并向上述殘留物中加入2，3，6-三氟苯酚(2.77g，18.7mmol)。在氬氣氣氛中將該混合物溶于二氯甲烷中并滴加吡啶(4ml，49.5mmol)。在室溫?cái)嚢枞芤簲?shù)日然后減壓除去溶劑和過(guò)量的吡啶。通過(guò)硅膠柱色譜法純化粗產(chǎn)物(5％乙酸乙酯/己烷洗脫)得到異構(gòu)體3-氯-和1-申基-9，10-二氫化吖啶酯(3g)。1H NMR(CDCl3)δ7.04-7.25(m，2H)，7.70-7.77(m，3H)，7.87-7.92(t，1H)，8.24-8.31(m，3H)。(b)向酯3g(0.2g)和氯化銨(2g)的乙醇(200ml)溶液加入鋅粉(2g)，立刻使得溶液脫色。在室溫?cái)嚢杳撋娜芤?0分鐘。向溶液中加入乙酸乙酯(200ml)，然后過(guò)濾，減壓除去濾液中的溶劑。通過(guò)硅膠色譜(40％乙酸乙酯/己烷)純化得到的粗產(chǎn)物，得到2，3，6-三氟苯基1-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(6g)。(c)在氬氣氣氛中避光條件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液將還原產(chǎn)物(0.18g)甲基化。72小時(shí)后，蒸除可揮發(fā)物并通過(guò)硅膠色譜純化產(chǎn)物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脫得到白色固體(5g)。實(shí)施例8.合成化合物5h.2′，3′，6′-三氟苯基1-氯-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)將1-氯吖啶-9-羧酸和3-氯吖啶-9-羧酸(4.0g，15.5mmol)的混合懸浮于過(guò)量亞硫酰氯(50ml)中并回流反應(yīng)混合物1.5小時(shí)。減壓除去溶劑。并向上述殘留物中加入2，3，6-三氟苯酚(2.77g，18.7mmol)混合。將該混合物溶于二氯甲烷并在氬氣氣氛中滴加吡啶(4ml，49.5mmol)。在室溫?cái)嚢枞芤簲?shù)日然后減壓除去溶劑和過(guò)量的吡啶。通過(guò)硅膠色譜法純化粗產(chǎn)物(5％乙酸乙酯/己烷洗脫)，得到異構(gòu)體3-氯-和l-氯-吖啶酯(3h)。1HNMR(CDCl3)δ7.04-7.25(m，2H)，7.70-7.77(m，3H)，7.87-7.92(t，1H)，8.24-8.31(m，3H)。(b)向溫?zé)岬孽?h(0.2g，0.52mmol)和氯化銨(2g)的乙醇(200ml)溶液中加入鋅粉(2g)，立刻使得溶液脫色。在室溫?cái)嚢杳撋娜芤?0分鐘。向溶液中加入乙酸乙酯(200ml)，然后過(guò)濾，減壓除去濾液中的溶劑。通過(guò)硅膠色譜化得到的粗產(chǎn)物(40％乙酸乙酯/己烷)，得到2，3，6-三氟苯基1-氯-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(6h)。1H MR(CDCl3)δ5.72(s)，6.29(s)，6.68-6.70(d)，6.77-6.79(d)，6.79-6.88(m)，6.96-7.03(m)，7.12-7.17(t)，7.21-7.27(d)，7.54-7.76(d)。(c)在氬氣氣氛中避光條件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液將還原產(chǎn)物(0.18g，0.46mmol)甲基化。72小時(shí)后，蒸除可揮發(fā)物并通過(guò)硅膠色譜純化產(chǎn)物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脫得到白色固體(5h)1HNMR(CDCl3)δ3.441(s，3H)，5.754(s，1H)，6.81-7.09(m，6H)，7.22-7.38(m，2H)，7.52-7.55(dd，1H)?；瘜W(xué)發(fā)光的測(cè)定在下述實(shí)施例中的試驗(yàn)是采用裝有用于使光衰減的中性密度濾器的Turner Designs TD-20e(Sunnyvale，CA)光度計(jì)或采用LabsystemsLumimoskan(Helsinki，F(xiàn)inland)光度計(jì)完成的。數(shù)據(jù)的收集、分析和顯示是通過(guò)軟件控制的。實(shí)施例9如下所述制備檢測(cè)試劑以40∶1的比例將試劑A(其組成為0.6mM過(guò)氧化脲，0.1mM對(duì)苯基苯酚，0.025％TWEEN20，溶于0.01M tris緩沖液中的1mMEDTA，pH8.0)和試劑B(其組成為溶于1∶1(v/v)p-二惡烷/乙醇或11(v/v)丙二醇/乙醇中的9，10-二氫化吖啶5c(0.86mg/ml)。向40μl所得的溶液中加入1μlHRP((1.4×10-16摩爾))并孵育溶液5分鐘。通過(guò)注射入100μ10.1M氫氧化鈉溶液產(chǎn)生閃光。不加酶重復(fù)這個(gè)試驗(yàn)得到空白對(duì)照。

圖1表示產(chǎn)生的發(fā)光。實(shí)施例10
采用檢測(cè)試劑(它是通過(guò)將試劑A和試劑B以1200∶1的比例混合制備的)和100秒孵育時(shí)間重復(fù)實(shí)施例9所述的試驗(yàn)。由于降低了空白光強(qiáng)度，因而獲得較好的信/噪比。實(shí)施例11可確定采用實(shí)施例10檢測(cè)試劑進(jìn)行HRP測(cè)定的靈敏度和線性度。在3孔平板的各個(gè)孔中，在室溫下將體積為50μl的檢測(cè)試劑與1μl等分的HRP溶液(其中含有1.4×10-15摩爾1.4×10-19摩爾酶)混合。100秒后，加入100μl 0.1M氫氧化鈉。積分光(強(qiáng)度)2秒。圖2表示采用含有9，10-二氫化吖啶5d的本發(fā)明試劑測(cè)量HRP量的線性范圍。實(shí)施例12根據(jù)實(shí)施例9組合物的檢測(cè)試劑(9，10-二氫化吖啶5b代替)用于檢測(cè)HRP。根據(jù)實(shí)施例10的具體方法，除了測(cè)定溶液是用酶孵育5分鐘。信/噪比是2時(shí)，HRP的最低檢測(cè)量是1.4amol(1.4×10-18摩爾)。實(shí)施例13根據(jù)實(shí)施例9組合物的檢測(cè)試劑(含有的制劑以9，10-二氫化吖啶5d的稍微不純的制劑替換)用于測(cè)試HRP。根據(jù)實(shí)施例10的具體方法，采用試劑孵育1.4×10-16摩爾HRP和采用氫氧化鈉閃光產(chǎn)生比空白大105倍的信號(hào)。采用1.4×10-17摩爾HRP并孵育10分鐘可以產(chǎn)生比空白大69倍的信號(hào)。在試驗(yàn)條件下單獨(dú)測(cè)定主要的雜質(zhì)，N-去甲基類(lèi)似物(6d)，并未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生明顯的光量。實(shí)施例14其中以9，10-二氫化吖啶5h粗制劑代替的檢測(cè)試劑用于測(cè)試HRP。根據(jù)實(shí)施例10的具體方法，采用試劑孵育1.4×10-16摩爾HRP3分鐘和用氫氧化鈉處理產(chǎn)生比空白大72倍的信號(hào)。在試驗(yàn)條件下單獨(dú)測(cè)定主要的雜質(zhì)，N-去甲基類(lèi)似物(6h)，并未發(fā)現(xiàn)發(fā)光。實(shí)施例15.增強(qiáng)劑的作用根據(jù)實(shí)施例9組合物的檢測(cè)試劑溶液可通過(guò)對(duì)多種苯酚增強(qiáng)劑進(jìn)行取代，與HRP反應(yīng)和隨后調(diào)至強(qiáng)堿性制備。采用合并有對(duì)碘苯酚、對(duì)溴苯酚、對(duì)羥基肉桂酸、2-萘酚、6-溴-2-萘酚和4-碘苯基硼酸的試劑，獲得相對(duì)于試劑背景而言可利用的光強(qiáng)度水平。實(shí)施例16.過(guò)氧化物在作用根據(jù)實(shí)施例9組合物的檢測(cè)試劑溶液可通過(guò)對(duì)多種苯酚增強(qiáng)劑進(jìn)行取代，與HRP反應(yīng)和隨后調(diào)至強(qiáng)堿性制備。采用合并有過(guò)氧化氫、過(guò)硼酸鈉和過(guò)氧化脲的試劑，可以獲得相對(duì)于試劑背景而言可利用的光強(qiáng)度水平。實(shí)施例17將含有9，10-二氫化吖啶5c(3ml)的實(shí)施例9試劑的溶液，置于VarianCary 3E(Palo Alto，CA)UV-Vis分光光度計(jì)的石英比色杯中。加入HRP(1.4×10-15摩爾)并在300-500nm范圍內(nèi)以30秒的間隔對(duì)吸收光譜掃描。圖3表示吖啶鎓化合物4c的形成(在該方向曲線最低至最高是在400nm)。15分鐘后未觀察到光譜進(jìn)一步的變化。加入0.1M氫氧化鈉溶液導(dǎo)致突然發(fā)出藍(lán)光。所得溶液的吸收光譜與1，6-二甲氧基-10-甲基吖啶酮的吸收匹配。實(shí)施例18為了證明1-位有取代基的9，10-二氫化吖啶具備更優(yōu)異的性能，采用1-位未被取代的9，10-二氫化吖啶化合物重復(fù)實(shí)施例17的試驗(yàn)。使與實(shí)施例9所用類(lèi)似、但含有9，10-二氫化吖啶2′，6′-二氟苯基10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯的試劑溶液(3ml)與HRP(1.4×10-15摩爾)反應(yīng)并在300-500nm范圍內(nèi)以30秒的間隔吸收光譜掃描。圖4表明了吖啶鎓化合物2′，4′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯和10-甲基吖啶酮二者的生成(在該方向曲線最低至最高是在400nm)，這是通過(guò)與這兩種化合物的真樣進(jìn)行比較得到證實(shí)的。此外將吖啶鎓化合物2′，4′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯加到未加HRP的同樣的試劑制劑中，在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生向同樣吖啶酮的可測(cè)轉(zhuǎn)化。
應(yīng)當(dāng)理解，上文的敘述只是說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明只由權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法，該方法包括a)在中間體化合物能積累的時(shí)間、溫度和第一個(gè)pH水平的條件下，使過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶與9，10-二氫化吖啶反應(yīng)；和b)將pH提高至足以使該中間體與過(guò)氧化物的反應(yīng)能突然發(fā)光的第二個(gè)pH水平，其發(fā)光強(qiáng)度基本上大于該pH提高前產(chǎn)生的強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9，10-二氫化吖啶具有下述的通式
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中的R1-R8各自獨(dú)立地選自可產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y是離去基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R1是選自烷基，烷氧基和鹵素的基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中9，10-二氫化吖啶環(huán)上至少兩個(gè)取代基選自烷基和烷氧基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的9，10-二氫化吖啶如下式所示
其中R選自烷基，雜烷基和芳烷基，其中Y是離去基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中基團(tuán)Y是至少一個(gè)氟原子取代的苯氧基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9，10-二氫化吖啶是2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
8.在用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的測(cè)試方法中檢測(cè)被分析物是否存在或其存在量的方法，該方法包括a)在中間體化合物能積累的時(shí)間、溫度和第一個(gè)pH水平的條件下，使過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶與9，10-二氫化吖啶反應(yīng)；和b)將pH提高至足以使該中間體與過(guò)氧化物的反應(yīng)能突然發(fā)光的第二個(gè)pH水平，其發(fā)光強(qiáng)度基本上大于該pH提高前產(chǎn)生的強(qiáng)度。c)建立發(fā)光量與被分析物的存在和數(shù)量的關(guān)系。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的9，10-二氫化吖啶如下式所示
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中的R1-R8各自獨(dú)立地選自可產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y是離去基團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的被分析物是過(guò)氧化物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的被分析物是過(guò)氧化物酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中過(guò)氧化物酶與選自半抗原、抗原、抗體和寡核苷酸的特定結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員相連接。
13.在用產(chǎn)生中間體化合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的測(cè)試方法中檢測(cè)被分析物是否存在或存在量的試劑盒，該試劑盒包括在幾個(gè)獨(dú)立容器中裝載a)一種9，10-二氫化吖啶化合物；b)一種過(guò)氧化物的水溶液，其pH在能形成中間體化合物的第一個(gè)水平上；c)單獨(dú)存在或與結(jié)合被分析物的化合物相連的一種過(guò)氧化物酶；和d)可使溶液的pH提高到第二個(gè)水平的一種試劑，其中檢測(cè)光的試驗(yàn)是將該9，10-二氫化吖啶化合物與該過(guò)氧化物以及該過(guò)氧化物酶反應(yīng)生成一種中間體化合物，隨后用該試劑將溶液的pH提高至第二個(gè)水平。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中9，10-二氫化吖啶化合物如下式所示
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中的R1-R8各自獨(dú)立地選自可產(chǎn)生光的基團(tuán)，和其中Y是離去基團(tuán)。
15.在用產(chǎn)生中間體化合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的測(cè)試方法中檢測(cè)被分析物是否存在或其存在量的一種試劑盒，該試劑盒包括在幾個(gè)容器中裝載a)在過(guò)氧化物酶存在下發(fā)光的一種試劑組合物，該組合物包括下式中間體化合物9，10-二氫化吖啶在第一個(gè)pH水平的水溶液
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中的R1-R8各自獨(dú)立地選自可產(chǎn)生光的基團(tuán)，和其中Y表示可通過(guò)該9，10-二氫化吖啶與一種過(guò)氧化物和一種過(guò)氧化物酶反應(yīng)發(fā)光的一種離去基團(tuán)；可使9，10-二氫化吖啶發(fā)光增加的一種苯酚化合物；參與該9，10-二氫化吖啶與該過(guò)氧化物酶反應(yīng)的一種過(guò)氧化物；在該過(guò)氧化物酶加到該組合物之前防止該過(guò)氧化物反應(yīng)的一種螯合劑；和使化學(xué)發(fā)光改進(jìn)的足夠數(shù)量的一種表面活性劑；b)單獨(dú)存在或與結(jié)合被分析物的化合物相連的一種過(guò)氧化物酶；和c)可使溶液的pH提高到第二個(gè)水平的一種試劑，其中檢測(cè)光的試驗(yàn)是將該9，10-二氫化吖啶化合物與該過(guò)氧化物以及該過(guò)氧化物酶反應(yīng)生成一種中間體化合物，隨后用該試劑將溶液的pH提高至第二個(gè)水平。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的試劑盒，其中R1是選自選自烷基，烷氧基和鹵素。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，其中9，10-二氫化吖啶環(huán)上至少兩個(gè)取代基選自烷基和烷氧基。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15的試劑盒，其中基團(tuán)Y是至少被一個(gè)氟原子取代的苯氧基。
19.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15的試劑盒，其中9，10-二氫化吖啶如下式所示
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中Y是離去基團(tuán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15的試劑盒，其中9，10-二氫化吖啶是2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
21.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
22.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
23.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
24.化合物4′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸酯。
25.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。
26.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。
27.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。
28.化合物4-氟苯基1-甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-硫代羧酸酯。
全文摘要
本文公開(kāi)了采用兩步化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光測(cè)試方法、組合物、試劑盒和化學(xué)發(fā)光的9，10-二氫化吖啶化合物。該反應(yīng)包括9，10-二氫化吖啶化合物，優(yōu)選N-烷基-9，10-二氫化吖啶-9-羧酸，在使得中間體化合物能積累的時(shí)間、溫度和pH條件下，與過(guò)氧化物、過(guò)氧化物酶和增強(qiáng)劑進(jìn)行反應(yīng)，隨后通過(guò)提高pH誘發(fā)突然發(fā)光。結(jié)果是通過(guò)這一反應(yīng)產(chǎn)生極高強(qiáng)度的光。在免疫測(cè)試、DNA探針測(cè)試或其它凡是水解酶與受體分子結(jié)合的測(cè)試中，該過(guò)氧化物酶是單獨(dú)存在或與一種特定結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員相連的。由于孵育和發(fā)光步驟的分離，因而這一方法特別適用于自動(dòng)測(cè)試。
文檔編號(hào)C07D219/04GK1161083SQ95195266
公開(kāi)日1997年10月1日 申請(qǐng)日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日
發(fā)明者哈希姆·阿克哈文-塔夫蒂, 扎拉·阿格哈瓦尼, 倫納卡·德席爾瓦 申請(qǐng)人:魯米根公司