專利名稱：抗hiv－1的單克隆抗體及由它制備的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及HIV-1感染的檢測、預(yù)防和治療以及AIDS治療。更具體地說，它涉及單克隆抗體、由這些抗體制備的藥物和疫苗以及在應(yīng)用這些抗體的基礎(chǔ)上形成的方法，用于分析和/或臨床應(yīng)用的藥物及疫苗。
背景技術(shù)：
在感染有I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的患者的血清中，在感染一段時(shí)間而沒有任何明顯的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的臨床表現(xiàn)時(shí)，其血清中可檢測到抗病毒的抗體。在主動(dòng)免疫應(yīng)答的這一階段，在循環(huán)中預(yù)計(jì)可出現(xiàn)大量抗原特異性B細(xì)胞。這些B細(xì)胞可用作融合伙伴來生產(chǎn)抗HIV-1的人單克隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體按已知的方法制備，例如按R.Kennet等在《單克隆抗體和功能細(xì)胞系；進(jìn)展及應(yīng)用》(Plenum Press(紐約)，1984)中所描述的。
本發(fā)明中應(yīng)用的其它材料和方法以已知的方法為依據(jù)，如病毒學(xué)雜志676642-6647，1993中所描述的。
本文所描述的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系CL1至CL6的存活樣品保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室設(shè)施(the Public Health Laboratory Service，PHLS)，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心，Porton Down，Salisbury SP4 OJG，英國。根據(jù)保藏號對它們進(jìn)行識別CL1-保藏號No.90091704(1990年9月17日保藏)；CL2-保藏號No.93091517(1993年9月15日保藏)；CL3-保藏號No.95032235(1995年3月22日保藏)；CL4-保藏號No.95032236(1995年3月22日保藏)；CL5-保藏號No.95032240(1995年3月22日保藏)；CL6-保藏號No.95032241(1995年3月22日保藏)。
此后，當(dāng)用縮寫形式時(shí)，這些細(xì)胞系產(chǎn)生的相應(yīng)單克隆抗體記作MAbCL1，MAb CL2至MAb CL6。
最近幾年人們廣泛應(yīng)用單克隆抗體，尤其是人的單克隆抗體以增加對抗體中和HIV-1的認(rèn)識，所述抗體是因HIV-1衍生的免疫原的免疫或患者的感染而產(chǎn)生的(病毒學(xué)雜志622107-2114，1988；免疫學(xué)76515-534，1992；病毒學(xué)雜志，676642-6647，1993；US 5087557)。HIV-1在免疫學(xué)的壓力下可迅速改變形狀，逃避患者免疫系統(tǒng)釋放的抗體或研究者開發(fā)利用的抗體的捕獲，對此人們付出了許多努力來克服它的這一有害性能。其結(jié)果是目前市場上還沒有用于主動(dòng)或被動(dòng)免疫的基于抗體的(或其它的)疫苗。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)HIV-1被膜糖蛋白gp160的小亞基gp41上的一個(gè)抗原決定簇(EP 570357A2)時(shí)就前進(jìn)了顯著的一步，該抗原決定簇與HIV-1分離物BH10的gp41位于662-667位的氨基酸序列“ELDKWA”一致。作者報(bào)道中和HIV-1的人單克隆抗體與該抗原決定簇特異性結(jié)合。該抗體被證明是對結(jié)合表位和其多樣性進(jìn)行生化分析的有力工具。gp41表位的高度保守狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)給找到適于更可靠地預(yù)防人類HIV-1感染和/或更有效地治療HIV-1感染的患者的疫苗組合物帶來了希望。
EP 570357A2中所報(bào)道的結(jié)果激勵(lì)著本發(fā)明的發(fā)明人增加他們研究的積極性，最終使他們得到本文公開的新的和創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)。
盡管在利用中和HIV-1的單克隆抗體這一領(lǐng)域中取得了有希望的結(jié)果，但是在這一途徑中至少存在一個(gè)主要的缺陷。該缺陷在于廣泛使用HIV-1分離物的實(shí)驗(yàn)室株，它已適應(yīng)了實(shí)驗(yàn)條件，毒性或多或少都有所減弱，因此如果它有任何代表意義的話也只很少地代表HIV-1初級分離物的特性和行為。因此，當(dāng)針對實(shí)驗(yàn)室HIV-1株產(chǎn)生的疫苗組合物用于對抗如感染者血液樣品中的HIV-1初級分離物時(shí)通常無效(J.Cohen，科學(xué)，262980-981，1993)。
第二個(gè)主要的缺陷過去是并且現(xiàn)在仍然是HIV-1病毒通過改變形態(tài)逃避抗體捕獲的能力，這經(jīng)常使研究者的異常努力幾乎無效。這種逃避突變的特征在于靶抗原決定簇中的一個(gè)僅有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸改變，這可能是自發(fā)或誘發(fā)突變的結(jié)果。
發(fā)明概述因此本發(fā)明公開了這樣一些抗體，它們能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，并且能用于生產(chǎn)給需要主動(dòng)和/或被動(dòng)免疫治療的病人應(yīng)用的疫苗。本發(fā)明還提供人類單克隆抗體，它們在功能上與上述由CL1至CL6中任何一種細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體相同。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供雜交瘤和/或CHO細(xì)胞系，它們產(chǎn)生本文公開和要求保護(hù)的任何一種抗體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體的混合物，以及體外和體內(nèi)應(yīng)用單個(gè)抗體或其混合物預(yù)防和/或治療HIV-1感染，和/或改進(jìn)的檢測HIV-1感染的方法。
細(xì)胞系CL1至CL4產(chǎn)生的單克隆抗體識別HIV被膜糖蛋白，尤其是gp160的特異性抗原決定簇。CL1至CL4抗體識別并結(jié)合gp41/gp160的一段氨基酸序列，該序列與HIV-1分離物BH10的gp41位于662至667(“ELDKWA”)位的表位一致(GenBank保藏號M15654；Swissprot數(shù)據(jù)庫登記號為ENV$HIV10)。CL2和CL3的單克隆抗體與兩個(gè)不同的抗原決定簇結(jié)合，更具體而言，是與gp120/gp160的片段結(jié)合，而該片段與分別位于HIV-1分離物BH10(GenBank保藏號M15654；Swissprot數(shù)據(jù)庫登記號為ENV$HIV10)的加工過的gp120的79至184和326至400的表位序列一致。
盡管由CL1至CL4產(chǎn)生的獨(dú)特型抗體是針對HIV-1病毒的體外和體內(nèi)捕獲和中和的，但由CL5和CL6所釋放的抗獨(dú)特型抗體卻起著相反的作用，即它們模擬病毒，更具體而言，它們模擬HIV-1病毒的相應(yīng)抗原決定簇。CL5和CL6的抗獨(dú)特型抗體具有這樣的性質(zhì)，即它們?nèi)绮《咀陨硪粯?，基本上在gp160的同一位置(抗原決定簇)與CL2的獨(dú)特型抗體結(jié)合。本發(fā)明一些實(shí)施方案的詳述當(dāng)為了發(fā)現(xiàn)新的抗HIV-1抗體而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在體外能有效中和HIV-1的人單克隆抗體包括多種初級HIV-1分離物，如HIV-1初級分離物92RW009，92RW021，92UG037，92TH014，92BR030，N70-2，DJ259(全部從用于HIV-1分離和表征的WHO網(wǎng)絡(luò)獲得)，或WYG，WRF，WRB，WSC，WHW(從奧地利病人中分離到的)。
奇怪的是，已證明這些抗體識別并與HIV-1糖蛋白gp160的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合。
此外，這些抗體所結(jié)合的靶體非常獨(dú)特。用不同公司、研究所提供的41種不同HIV-1結(jié)合抗體組成的混合物進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果顯示，混合物中沒有一種其它抗體與上面確定出的抗體相競爭，例如與來源于CL2細(xì)胞系的人單克隆抗體競爭結(jié)合gp120/gp160的目的抗原片段，該片段與HIV-1分離物BH10的gp120的79至184和326至400的氨基酸序列一致。
另外，對感染HIV-1的患者的血清和血漿所進(jìn)行的研究顯示在所測驗(yàn)樣品中不存在CL2型的抗體。這一發(fā)現(xiàn)又一次強(qiáng)調(diào)了這些中和HIV-1的人類單克隆抗體的獨(dú)特性，同時(shí)表明，以合適的形式應(yīng)用這些抗體對人類個(gè)體進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性治療，或許存在抵抗HIV-1感染的特別潛力。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括這樣的CL2型抗體，已發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)抗原決定簇以糖基化形式存在時(shí)，它才與上述gp120/gp160的抗原決定簇結(jié)合；當(dāng)該片段去糖基化時(shí)它們不與這些抗原性的糖肽片段結(jié)合，如通過肽-N-糖苷酶F(EC3.2.2.18；此后稱作“PN Gase F”)的作用去糖基化的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案還包括這樣的CL2型人類單克隆抗體，其特征還在于當(dāng)衣霉素不存在時(shí)，它能與SF9昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的gp120片段特異性結(jié)合，而當(dāng)衣霉素存在時(shí)，則不與表達(dá)的gp120片段結(jié)合。已知衣霉素對糖蛋白生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化作用有抑制活性。
本發(fā)明人在體外實(shí)驗(yàn)中能成功地證實(shí)，在前面所講的CL2型抗體中也存在這樣的樣品，它能抑制上述HIV-1初級分離物引起的人淋巴細(xì)胞感染。
本發(fā)明也涉及這樣的CL2型抗體，它具有上述特性的一種或多種并且還具有與雜交瘤細(xì)胞系CL5和CL6的抗獨(dú)特型單克隆抗體進(jìn)行特異反應(yīng)的特征，盡管它們能與CL5和CL6兩種抗獨(dú)特型抗體中的一個(gè)或另一個(gè)結(jié)合，但至少它們的一部分與由CL6產(chǎn)生的抗獨(dú)特型huMAb結(jié)合，并且其結(jié)合方式可特異性封阻抗體抑制HIV-1初級分離物感染人淋巴細(xì)胞的能力。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，CL2型抗體包含的抗體至少有上述的一種特征或性質(zhì)，此外已證明能夠與雜交瘤細(xì)胞系CL2產(chǎn)生的抗體競爭gp120/160的抗原決定簇。因此這類抗體至少在功能上與CL2釋放的抗體非常相近，并且可認(rèn)為與它功能上等價(jià)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是針對雜交瘤細(xì)胞系CL2所產(chǎn)生的最有益的人單克隆抗體，該抗體可用于例如HIV-1感染者的被動(dòng)免疫，但用作生化工具來制備預(yù)防和/或治療HIV-1感染的體內(nèi)應(yīng)用的疫苗或許更有益。
本發(fā)明一個(gè)值得注意的實(shí)施方案包括利用重組的CHO細(xì)胞來產(chǎn)生CL2型抗體。成功地鑒定出這些抗體識別和結(jié)合的抗原決定簇后，發(fā)明人又成功地把各個(gè)遺傳信息轉(zhuǎn)化給CHO細(xì)胞，形成穩(wěn)定的細(xì)胞系CL3，該細(xì)胞系能比雜交瘤細(xì)胞系CL2本身更有效地合成CL2型抗體。
另一實(shí)施方案中，公開的抗獨(dú)特型抗體能與CL2型的獨(dú)特型抗體特異性結(jié)合，并且/或者與至少其中一些相互作用，其作用方式能消除它們的抗HIV保護(hù)能力，即能夠阻礙它們抑制HIV-1初級分離物感染人類淋巴細(xì)胞。因此預(yù)計(jì)這種抗獨(dú)特型抗體在構(gòu)象上與HIV-1病毒相關(guān)，這樣它們可能含有與病毒糖蛋白(如gp160)相似或一致的抗原片段。
下面實(shí)施方案中的抗體似乎很引人注意，因?yàn)樗鼈兪强躬?dú)特型類型且將它們所具有的上述實(shí)施方案中抗獨(dú)特型抗體的特征與它們的性能聯(lián)系在一起，施用給哺乳動(dòng)物后，它們能誘導(dǎo)人或動(dòng)物個(gè)體產(chǎn)生和釋放抗HIV-1抗體。任選地，所誘導(dǎo)抗體具有這樣的性質(zhì)，即它們與前面任何一個(gè)相應(yīng)實(shí)施方案中的至少一種CL2型抗體競爭與gp120/160的特異性抗原決定簇的結(jié)合。這組抗獨(dú)特型抗體的特殊代表就是雜交瘤細(xì)胞系CL6產(chǎn)生的那種抗體。
前面實(shí)施方案中的抗獨(dú)特型抗體可對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或HIV-1受害者進(jìn)行主動(dòng)免疫，優(yōu)選對尚未感染者進(jìn)行主動(dòng)免疫，主動(dòng)免疫中所產(chǎn)生的抗體可用作疫苗的組分來進(jìn)行被動(dòng)免疫或用作研究對象來設(shè)計(jì)和/或合成或基因工程制備這類抗體，任選地，這些(獨(dú)特型)抗體功能上與CL2型抗體等價(jià)，即它們與CL2型抗體競爭性結(jié)合gp120/gp160的特異性抗原決定簇。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案，也是最令人興奮的一個(gè)實(shí)施方案中，人類單克隆抗體有很強(qiáng)的中和HIV-1的活性，并與gp160的小亞基(此后稱作gp41/gp160)結(jié)合，。臨床前研究證明，靜脈內(nèi)施用給人類HIV-1感染個(gè)體，可顯著降低其血清和/或血漿中循環(huán)HIV-1的水平(見實(shí)施例8和圖6)。
此外，這些抗體中至少有一部分可被進(jìn)一步表征為它們也與雜交瘤細(xì)胞系CL1產(chǎn)生的獨(dú)特型抗體競爭性結(jié)合gp41/gp160抗原決定簇，最后，由細(xì)胞系CL1自身所產(chǎn)生的抗體可作為能降低HIV-1水平的抗體中的重要一員。
與用CHO細(xì)胞系CL3產(chǎn)生CL2型抗體的情況相似，本發(fā)明人又成功地克隆了重組CHO細(xì)胞系CL4，它產(chǎn)生的抗體與CL1的抗體競爭性結(jié)合gp41/gp160抗原決定簇，由此可認(rèn)為多少與CL1抗體等價(jià)，這種重組CHO細(xì)胞系更易于生長，能更有效地用于相應(yīng)抗體的制備。
各種體外實(shí)驗(yàn)已證明，CL2型抗體及CL1型抗體能中和各種不同的包括一些逃逸突變株(escape mutant)在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室和初級HIV-1分離物，這通常是它們中的任何一種單獨(dú)應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的。這進(jìn)一步顯示，兩種抗體類型均可產(chǎn)生交叉反應(yīng)，即它們協(xié)同相互作用，使得它們中的每一種可捕獲另一種抗體的HIV-1逃逸突變株。因此，它們的混合物是抵抗HIV-1感染和AIDS的強(qiáng)大工具。提供包括至少一種CL1型抗體和至少一種CL2型抗體的混合物是本發(fā)明的目的之一。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生前面所講任何一種抗體的細(xì)胞系，尤其是如前所述由其保藏號識別的CL1-CL6。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了肽片段，它們包含至少一種gp41/gp160和gp120/gp160的抗原決定簇。希望這些肽片段具有這樣的性質(zhì)，即施用給哺乳動(dòng)物(如動(dòng)物或人類個(gè)體)之后，它們能對HIV-1感染誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，任選地產(chǎn)生和/或釋放中和HIV-1的抗體。
在另一實(shí)施方案中，為了增強(qiáng)這些肽片段對免疫系統(tǒng)的抗原遞呈作用，可把它們與合適的載體連接。這些載體可以在例如包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的有機(jī)聚合物，也可應(yīng)用任何其它適宜的和生理可接受性載體。為了增強(qiáng)對HIV-1病毒和/或感染細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，許多情況下把肽片段與修飾的，即減毒的和/或重組的病毒連接或許更有利，例如，與修飾的流感病毒或修飾的乙型肝炎病毒或與病毒的部分連接，如與病毒的糖蛋白，如流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原連接。
生產(chǎn)可靠的疫苗以抵抗HIV-1感染和/或在治療過程中治療已明顯感染HIV-1的患者，這也是本發(fā)明的一個(gè)重要目標(biāo)。在包括人類在內(nèi)的高等動(dòng)物的預(yù)防和治療中，可用至少由CL2和CL1的獨(dú)特型抗體中的一種形式的疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫。可提供有說服力的證據(jù)表明在臨床前的研究的治療過程中血清陽性患者的血漿和血清中HIV-1的水平降低(參見實(shí)施例8和圖6)。細(xì)胞系CL1獨(dú)特型抗體的預(yù)防能力也在給人留下深刻印象的SCID-小鼠試驗(yàn)及黑猩猩試驗(yàn)中被證實(shí)，用活的HIV-1病毒攻擊時(shí)，抗體處理過的小鼠和黑猩猩均沒有形成HIV-1感染，而沒有處理過的對照組中的動(dòng)物則感染HIV-1。
應(yīng)用至少一種前面所述的抗獨(dú)特型抗體來生產(chǎn)用于主動(dòng)免疫的疫苗可有助于成功地抵抗HIV-1感染。抗獨(dú)特型抗體以及由它而來的藥物和疫苗可初步用于HIV-1所危及人群的預(yù)防性治療，最好在與HIV-1病毒接觸前應(yīng)用。由于它們具有獨(dú)特的互補(bǔ)位特征，所以也可施用給已感染的患者以刺激其免疫系統(tǒng)釋放相應(yīng)的和更強(qiáng)勁的中和HIV-1的抗體。它們也可直接施用給人或至少與一種適宜的載體和/或本領(lǐng)域中通常應(yīng)用的添加劑聯(lián)合應(yīng)用，和/或與其他藥物一起應(yīng)用。但是抗獨(dú)特型抗體也可為例如載有它們相應(yīng)抗原決定簇(互補(bǔ)位)的融合蛋白的設(shè)計(jì)和構(gòu)建充當(dāng)“模型模板”。
許多情況下可優(yōu)選單個(gè)抗體或至少兩種不同的抗體組成的混合物與免疫血清和/或抗生素聯(lián)合應(yīng)用，以進(jìn)一步增加相應(yīng)制備的抗體疫苗的益處。
在其他情況中，至少用一種本文列舉的gp41/gp160和gp120/gp160的抗原性肽片段代替相應(yīng)疫苗和藥物中的抗獨(dú)特型抗體或許更有利。因此本發(fā)明也涉及到該肽片段以及它在制備藥物和/或疫苗中的應(yīng)用，而后者可對HIV-1危及者或感染者進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性處理。該片段任選地用作融合蛋白，其中它們與適宜的載體連接，載體可以是重組的或減毒的病毒或是病毒的一部分，如流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原，或者是其它的能有效地把抗原性部位遞呈給免疫系統(tǒng)的合適載體。但是該抗原片段也可直接在人類個(gè)體中用于預(yù)防和/或治療HIV-1感染，所述人類個(gè)體如屬于HIV-1高危人群之一者，包括從事HIV-1病毒研究的醫(yī)學(xué)和科學(xué)工作者和/或感染者。
這里所指的獨(dú)特型抗體還可用于檢測和/或確定HIV-1感染的細(xì)胞和/或HIV-1病毒，也可用作單個(gè)抗體或用作抗體雞尾酒。同樣，一種或多種抗獨(dú)特型抗體和/或上述的肽片段可成功地用于與病毒或HIV-1感染的細(xì)胞相結(jié)合的抗HIV-1抗體的檢測和/或確定。因此，本發(fā)明的獨(dú)特型和抗獨(dú)特型抗體均可被制備并用于為分析試驗(yàn)方法和/或可商業(yè)應(yīng)用的檢測試劑盒。
最后，本發(fā)明還有一部分是，為需要治療的HIV-1感染患者提供一種治療方法，并提供一種方法使人免受HIV-1感染。有明顯HIV-1感染的患者可用一種疫苗進(jìn)行治療，該疫苗包含至少一種CL2和CL1型獨(dú)特型抗體，優(yōu)選二者的混合物。但是，某些情況下為了誘導(dǎo)額外的(可能更強(qiáng)效的)抗體以中和病毒并降低感染患者血液中HIV-1水平，優(yōu)選施用至少一種抗獨(dú)特型抗體和/或抗原性肽片段。
在抗體和/或抗原性肽片段基礎(chǔ)上形成的疫苗還包括適宜的(即生理可接受的)載體以及本領(lǐng)域中通常應(yīng)用的添加物。施用給患者的劑量大約為1-10μg/kg體重，優(yōu)選每天靜脈內(nèi)注射1次。病情不嚴(yán)重或長期治療時(shí)劑量可降低到0.5-5μg/kg體重。根據(jù)感染的情況，治療可在一定的時(shí)間間隔內(nèi)重復(fù)進(jìn)行，例如每天兩到三次，或隔天或隔周。
本發(fā)明的疫苗可包括本文公開的任何一種獨(dú)特型或抗獨(dú)特型抗體或任何一種肽片段，它既可單獨(dú)又可與適宜的載體結(jié)合和/或與載體分子連接。在某些情況下，如HIV-1急性感染和/或已發(fā)展到相當(dāng)程度，這時(shí)可優(yōu)選應(yīng)用獨(dú)特型抗體的混合物，而在其它情況下應(yīng)用抗獨(dú)特型抗體的混合物和/或優(yōu)選應(yīng)用與載體連接的gp160肽片段將更有利。建議施用抗體或載體連接的gp160肽片段的劑量為0.5-10μg/kg體重，每天施用1-3次，可在一定的時(shí)間間隔內(nèi)重復(fù)施用，如以周、月或年的間隔，這取決于HIV-1感染的狀態(tài)或?qū)IV感染個(gè)體治療情況的估計(jì)。
附圖簡述

圖1表明了雜交瘤細(xì)胞系CL2釋放的人單克隆抗體與HIV-1gp160的糖蛋白亞基gp120的反應(yīng)性；圖2表明了CL2抗體與糖基化和去糖基化形式的HIV-1gp160的反應(yīng)性；圖3表明了衣霉素存在或不存在時(shí)CL2抗體與重組gp120的反應(yīng)性；圖4表明了p24抗原ELISA中，抗獨(dú)特型抗體對CL2細(xì)胞系HIV-1中和抗體的阻滯效應(yīng)；圖5按兩種不同抗獨(dú)特型抗體結(jié)合方式的特點(diǎn)，表明了在眾多不同的抗HIV抗體中，CL2細(xì)胞系抗體的獨(dú)特性；圖6表明人類患者體內(nèi)施用細(xì)胞系CL1的抗體后，對HIV-1的中和效應(yīng)。
為了能夠更充分地理解本發(fā)明，下面給出了實(shí)施例。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅以說明為目的，而不應(yīng)解釋為在任何一方面對本發(fā)明進(jìn)行限制實(shí)施例1(圖1)GST/HIV-gp120融合蛋白與細(xì)胞系CL2的抗體的反應(yīng)性由CL2制備的人單克隆抗體(此后稱作MAb CL2)對HIV-1被膜糖蛋白gp120的結(jié)合特點(diǎn)將重疊的gp120片段融合到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。用表達(dá)不同GST-gp120片段的重組桿狀病毒克隆感染SF9細(xì)胞，首先用SF9的細(xì)胞溶解產(chǎn)物檢測它們產(chǎn)生GST的水平。然后分析GST-gp120融合蛋白的溶解產(chǎn)物，以確定MAb CL2的結(jié)合親合性。圖中給出的Ab CL2的OD值與不同的rgp120片段相對應(yīng)。預(yù)先用2μg/ml的谷胱甘肽鋪微滴度板，然后加細(xì)胞溶解物培養(yǎng)1小時(shí)，之后與1μg/ml MAb CL2培養(yǎng)1小時(shí)，用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗人IgG檢測，這樣可顯示出與等量GST融合蛋白相對應(yīng)的細(xì)胞溶解物的光密度。
如圖1所示，GST融合蛋白包含的片段1與HIV-1的BH10分離物的gp120的氨基酸1-95相對應(yīng)，片段2與gp120的氨基酸79-184相對應(yīng)，片段3與氨基酸170-279，片段4與氨基酸264-354，片段5與氨基酸326-400，片段6與氨基酸384-481相對應(yīng)。實(shí)施例2(圖2)與去糖基化的gp160HIV MN結(jié)合的抗體N-去糖基化蛋白質(zhì)樣品(500ng重組gp160HIV MN)在變性緩沖液(0.5％SDS，1％β-巰基乙醇)中煮沸10分鐘，然后添加1/10體積的每種10×酶反應(yīng)緩沖液和10％NP-40。反應(yīng)混合物與2000U的PNGaseF(Boehringer Mannheim)在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。在10-20％Tris/Glycin膠中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)印跡后，相同的膜與5μg/ml MAb CL2(A組)和5μg/ml MAb CL1(B組)培養(yǎng)作對照。圖2中泳道1-3顯示泳道1未處理的gp160HIV MN；泳道2gp160HIV MN，沒有酶的情況下經(jīng)PNGaseF處理；泳道3PNGase處理過的gp160HIV MN；分子量標(biāo)記以kDa為單位。
圖2中可以看到，經(jīng)PNGaseF的去糖基化作用后MAb CL2不與gp160結(jié)合(A組，泳道3)，而MAb CL1與經(jīng)PNGaseF處理過的gp160結(jié)合(B組，泳道3)。實(shí)施例3(圖3)衣霉素(TM)存在或不存在時(shí)重組GST/HIVgp120融合蛋白與MAb CL2和抗GST抗血清的反應(yīng)性用野生型桿狀病毒或表達(dá)GST-gp120的重組桿狀病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞，感染5小時(shí)后加入終濃度為5μg/ml的衣霉素。48小時(shí)后收集細(xì)胞并溶解之，用ELISA檢測抗GST反應(yīng)性和MAb CL2反應(yīng)性。把桿狀病毒感染細(xì)胞的溶解物(從1×107細(xì)胞/ml中獲得)轉(zhuǎn)移到預(yù)先鋪有2μg/ml谷胱甘肽的微滴定板中，培養(yǎng)1.5小時(shí)。分別用GST-抗血清(稀釋度1∶2000)或MAb 2G12(1.5μg/ml)和辣根過氧化物酶結(jié)合的抗鼠/抗人IgG檢測GST融合蛋白或gp120。在492nm處測吸收值如圖3中所能看到的，當(dāng)衣霉素存在時(shí)， MAb CL2不與gp120融合蛋白結(jié)合，而抗GST卻可以結(jié)合，盡管其水平較低。實(shí)施例4MAb CL2中和HIV-1初級分離物的能力按Purtscher等(1994)所描述的用PBMC進(jìn)行中和測定，方法是與系列抗體稀釋液一起在37℃預(yù)培養(yǎng)病毒1小時(shí)，隨后感染從HIV陰性供者血沉棕黃層細(xì)胞制備的經(jīng)PHA刺激的新鮮PBMC。7-12天后估測中和能力，方法是比較抗體存在或不存在時(shí)由細(xì)胞產(chǎn)生的p24抗原的數(shù)量。
表1用PBMC進(jìn)行中和測定時(shí)MAb CL2中和能力的總結(jié)初級分離物亞型分化單位中和能力92RW009A+++92RW021A+++92UG037A+++92TH014B+++92BR030B+++N70-2 B +DJ259 C +WYG 未知 +++WRF 未知 +++
WRB未知+++WSC未知 +WHM未知 +注+++濃度＜1μg/ml時(shí)的90％中和++濃度為1-50μg/ml時(shí)的90％中和+濃度＜50μg/ml時(shí)的50％中和實(shí)施例5(圖4)合胞體抑制試驗(yàn)/抗獨(dú)特型阻滯進(jìn)行抗獨(dú)特型(A2)阻滯試驗(yàn)以表明抗獨(dú)特型抗體A2是否通過與MAb CL2的中和互補(bǔ)位結(jié)合而阻滯其中和能力?？躬?dú)特型抗體不存在時(shí)MAb CL1和CL2的合胞體抑制濃度(EC50)分別為2.0和8.8μg/ml(應(yīng)用了HIV-1分離物RF)?？躬?dú)特型抗體加入到MAb CL2中表明，抗體M1A3和M4C12并不改變中和能力，但是當(dāng)M1G1(＝CL6產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體)與MAb CL2共同培養(yǎng)時(shí)，可觀察到明顯的損傷(表2)。MAb CL1直接針對gp41的合胞體抑制能力并不被所測驗(yàn)的抗獨(dú)特型抗體影響。抗獨(dú)特型抗體以100μg/ml的濃度單獨(dú)應(yīng)用以及作為非中和對照應(yīng)用MAb 3D6時(shí)沒有觀測到合胞體抑制。
表2 M1G1、M1A3或M4C12存在時(shí)，MAb CL2和MAb CL1的EC50

把抗獨(dú)特型抗體在培養(yǎng)液中稀釋為200μg/ml，把Mab CL2和CL1(作為對照抗體)稀釋為10μg/ml。MAb CL2和CL1的起始濃度為100μg/ml，制備50μl的2倍稀釋度的系列稀釋液，每樣4份。每孔加入50μl的抗獨(dú)特型抗體(200μg/ml)，在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。把HIV-1分離物RF稀釋到大約102-103TCID50/ml作為病毒的接種物，每孔加入50μl的病毒懸液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，每孔加入50μl的AA-2細(xì)胞懸液(106細(xì)胞/ml；參見CHAFFEE等，1988，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，168605-621)，然后37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞5天，隨后顯微鏡下估算合胞體的形成。每孔中至少出現(xiàn)一個(gè)合胞體時(shí)沒作HIV-1感染的指示，用Reed和Muench(1938)的方法計(jì)算50％有效濃度(EC50)。
然后合并一次稀釋的所有孔，以p24抗原ELISA的方式對p24進(jìn)行定量測定。所得p24的值對應(yīng)MAb濃度作圖。其結(jié)果在圖4中可見到，圖4表明了在包含MAb CL2(圖A)和MAb CL1(圖B)及不同數(shù)量的抗獨(dú)特型抗體的培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的抗原p24。實(shí)施例6(圖6)抗獨(dú)特型抗體與不同的抗gp160抗體的反應(yīng)性一組人類抗gp160抗體和HIV-1陽性個(gè)體的合并血清(HIVIG)在M1G1(＝MAb CL6)和M1A3(＝MAb CL5)存在時(shí)，在鋪有g(shù)p160的微滴度板上培養(yǎng)，以提高抗獨(dú)特型抗體的反應(yīng)性。圖5中，圖A和B表明M1G1和M1A3特異性結(jié)合MAb CL2。兩種抗獨(dú)特型抗體都僅與MAb CL2反應(yīng)而不與其它被測驗(yàn)的人類抗體反應(yīng)(MAb CL1和5F3和HIVIG是人類抗HIV-1抗體的代表性實(shí)施例)。
圖5，圖A和圖B用2μg/ml的gp160(Immuno AG，Vienna)覆蓋96孔板。人類單克隆抗體樣品的起始稀釋在濃度大約為200ng/ml時(shí)開始，HIVIG預(yù)先以1∶100稀釋。對人類抗體的8個(gè)稀釋液進(jìn)行2n稀釋。M1G1和M1A3的濃度為1μg/ml。人和鼠的抗體稀釋液被轉(zhuǎn)移到測試板中并同時(shí)培養(yǎng)1小時(shí)。然后把過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠IgG加到板中，培養(yǎng)1小時(shí)后每孔加入染液；以620nm為參照，在492nm處讀吸收值。實(shí)施例7用HIV-1分子克隆C182進(jìn)行的免疫篩選試驗(yàn)表3


ND，未做1)對MAb CL2的中和抗性；混合物和MAb CL1仍然中和，2)對MAb CL1的中和抗性；混合物和MAb CL2仍然中和。實(shí)施例8(圖6)用3劑MAb CL1治療前后，在HIV-1感染個(gè)體血清樣品培養(yǎng)物中p24的產(chǎn)生過程血清與PHA刺激的、從健康、HIV陰性供者而來的PBMC共同培養(yǎng)，培養(yǎng)上清液每周以1∶2更換2次。每周在培養(yǎng)物中添加新鮮的PHA刺激的PBMC。對培養(yǎng)物檢測5周。
圖6表明施用MAb CL1之前(三角形)患者血清樣品培養(yǎng)物中合胞體形成增加，如在p24產(chǎn)物零水平的直線所顯示的，施用MAb CL1后能有力中和患者HIV-1的感染。實(shí)施例9黑猩猩實(shí)驗(yàn)中HIV-1感染的體內(nèi)預(yù)防與Merck研究中心(West Point，Pennsylvania 19486，美國)協(xié)作，選擇了四只黑猩猩來測驗(yàn)體內(nèi)中和作用。
體內(nèi)試驗(yàn)之前，先從每只黑猩猩分離出CD4+初級T細(xì)胞(PBMC’S)來測驗(yàn)對HIV初級分離物B類體外感染的受納性。所有的體外試驗(yàn)中應(yīng)用M.Purtscher等的常規(guī)方法，這在《Aids研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒》Vol.10，Nr.12，1994，Mary Ann Liebert，Inc，Publ.中有所描述。所有四只黑猩猩的CD4 PBMC均容納病毒體外繁殖。這表明體內(nèi)也應(yīng)該能成功地感染。
給兩只黑猩猩輸注單克隆抗體CL1(PHLS保藏號90091704)。將靜脈內(nèi)輸注用的抗體施用給動(dòng)物，其300ml溶液中含有大約1mg/ml，穩(wěn)定在1％的人血清白蛋白中，pH值為7。另外二只動(dòng)物僅用人血清白蛋白處理。
HIV-1初級分離物處理1天后，四只黑猩猩均接受攻擊，靜脈內(nèi)注射3倍黑猩猩感染劑量的病毒。常規(guī)地對四只動(dòng)物HIV-1的感染情況監(jiān)測4個(gè)月。
結(jié)果經(jīng)抗體CL1處理的兩只黑猩猩沒有表現(xiàn)出HIV-1感染的癥狀；它們免受感染。兩只對照動(dòng)物即僅用人血清白蛋白處理過的動(dòng)物均為HIV-1陽性。實(shí)施例10SCID小鼠試驗(yàn)中HIV-1感染的體內(nèi)預(yù)防另一個(gè)證明MAb CL1體內(nèi)中和作用的實(shí)驗(yàn)與Transgene(Strasbourg，法國)合作進(jìn)行。
把編碼MAb CL1輕鏈和重鏈的基因提供給Transgene，利用基因工程的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對小鼠成纖維細(xì)胞(3T3)進(jìn)行基因操作。產(chǎn)生MAbCL1的轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞在體外在GOREDEX纖維上增殖，形成細(xì)胞團(tuán)。然后把細(xì)胞團(tuán)皮下供給SCID小鼠，這樣在這些小鼠中可形成細(xì)胞器，它能以一定的方式把MAb CL1釋放到血流中。
用人類的白細(xì)胞系統(tǒng)經(jīng)常規(guī)方法對SCID小鼠進(jìn)行重構(gòu)，這樣可建立適于HIV-1感染的動(dòng)物模型。
MAb CL1抗體水平高于抗體2毫克的那些SCID小鼠對HIV-1IIIB的攻擊有保護(hù)作用，而每ml血清中抗體水平較低的那些小鼠則表現(xiàn)出感染的顯著延遲，經(jīng)處理的及其它相似方式作用的血清中沒有MAbCL1的SCID小鼠全部感染。
權(quán)利要求
1.中和HIV-1的人類單克隆抗體，其特征在于它與HIV-1的兩個(gè)不同的抗原決定簇結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體，其特征在于抗原決定簇是gp160的片段，并與HIV-1分離物BH10的加工過的gp120氨基酸序列79至184和326至400一致(按照Swissprot數(shù)據(jù)庫登記號ENV$HIV10編號)。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于它不與所述抗原決定簇的經(jīng)PN Gase F處理過的(去糖基化)形式結(jié)合。
4.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于當(dāng)衣霉素不存在時(shí)，它與SF9昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的gp120片段進(jìn)行特異性結(jié)合，而當(dāng)衣霉素存在時(shí)不結(jié)合。
5.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它能夠在體外抑制HIV-1初級分離物感染人類淋巴細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的抗體，其特征在于它抑制HIV-1初級分離物感染人類淋巴細(xì)胞的能力能被細(xì)胞系CL6產(chǎn)生的單克隆抗體特異性阻滯，而CL6保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為95032241。
7.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它與細(xì)胞系CL5(保藏號95032240)和CL6(保藏號95032241；保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國)中的至少一種所產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結(jié)合。
8.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它與雜交瘤細(xì)胞系CL2產(chǎn)生的抗體競爭與所述抗原決定簇的結(jié)合，CL2保藏于PHLS PortonDown，Salisbury，英國，保藏號為93091517。
9.權(quán)利要求1至7中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它是由雜交瘤細(xì)胞系CL2產(chǎn)生的，CL2保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為93091517。
10.權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它是由重組的CHO細(xì)胞系CL3產(chǎn)生的，CL3保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為95032235。
11.一種單克隆抗體，其特征在于它與權(quán)利要求6或7的抗體特異性結(jié)合，并且/或者阻遏權(quán)利要求6的抗體抑制HIV-1初級分離物對人淋巴細(xì)胞的感染。
12.權(quán)利要求11的抗體，其特征在于當(dāng)施用給動(dòng)物或人類個(gè)體之后，它能誘導(dǎo)中和HIV-1的抗體，而該抗體任選地與權(quán)利要求1至10中任一權(quán)項(xiàng)的抗體競爭與HIV-1的抗原決定簇的結(jié)合。
13.權(quán)利要求11或12的抗體，其特征在于它由雜交瘤細(xì)胞系CL6產(chǎn)生，CL6保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為95032241。
14.權(quán)利要求11的抗體，其特征在于它由雜交瘤細(xì)胞系CL5產(chǎn)生，CL5保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為95032240
15.用權(quán)利要求11至14中任一權(quán)項(xiàng)的抗體對動(dòng)物或人類個(gè)體進(jìn)行主動(dòng)免疫時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種抗體，它任選地與權(quán)利要求1至10中任一權(quán)項(xiàng)的中和HIV-1的抗體競爭與HIV-1的抗原決定簇的結(jié)合。
16.一種與HIV-1的gp41/gp160結(jié)合的中和HIV-1的人類單克隆抗體，其特征在于當(dāng)靜脈內(nèi)施用給感染了人類HIV-1的個(gè)體后，它能顯著降低該個(gè)體的血清和/或血漿中循環(huán)HIV-1的水平。
17.權(quán)利要求16的抗體，其特征在于它與雜交瘤細(xì)胞系CL1產(chǎn)生的抗體競爭與HIV-1的gp41/gp160的特異性結(jié)合，CL1保藏于PHLSPorton Down，Salisbury，英國，保藏號為90091704。
18.權(quán)利要求16的抗體，其特征在于它由雜交瘤細(xì)胞系CL1產(chǎn)生，CL1保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為90091704。
19.權(quán)利要求16的抗體，其特征在于它與重組的CHO細(xì)胞系CL4產(chǎn)生的抗體競爭，CL4保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英國，保藏號為95032236。
20.權(quán)利要求16至19中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，其特征在于它能在體內(nèi)防止受HIV-1攻擊的個(gè)體被HIV-1感染，如在SCID小鼠和黑猩猩的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭兴C實(shí)的。
21.一種中和HIV-1的人類單克隆抗體的混合物，其特征在于它至少包含權(quán)利要求1至10的一種抗體并且至少包含權(quán)利要求15至20中的一種抗體。
22.權(quán)利要求21的混合物，其特征在于它可在體外防止HIV-1突變株的逃逸，所述逃逸通常是由單獨(dú)應(yīng)用混合物的任何一種所述抗體引起的。
23.一種產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系，其特征在于它能產(chǎn)生權(quán)利要求1至20中任一權(quán)項(xiàng)的單克隆抗體。
24.權(quán)利要求23的細(xì)胞系，其特征在于它選自細(xì)胞系CL1(保藏號為90091704)，CL2(保藏號為93091517)，CL3(保藏號為95032235)，CL4(保藏號為95032236)，CL5(保藏號為95032240)，CL6(保藏號為95032241)，以及雜交瘤的后代，所述細(xì)胞系均保藏于PHLS PortonDown，Salisbury，英國。
25.一種肽片段，它至少包含權(quán)利要求1或2的一種抗原決定簇
26.權(quán)利要求25的肽片段，其特征在于當(dāng)施用給動(dòng)物或人類個(gè)體之后，它能誘導(dǎo)針對HIV-1的免疫應(yīng)答，任選地誘導(dǎo)中和HIV-1的抗體的釋放。
27.權(quán)利要求25或26的肽片段，其特征在于它與適宜的載體連接以形成融合蛋白。
28.權(quán)利要求27的肽片段，其特征在于載體是病毒或病毒的一部分，任選地是流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原。
29.一種預(yù)防和/或治療HIV-1感染的疫苗，其特征在于它包含至少一種權(quán)利要求1至20中任一權(quán)項(xiàng)的抗體，和/或至少一種權(quán)利要求25至28中任一權(quán)項(xiàng)的肽片段，并且任選地包含至少一種適宜的載體和/或其它的添加物。
30.權(quán)利要求29的疫苗，其特征在于它包含有效劑量的抗體和/或肽片段，優(yōu)選地適宜施用劑量為0.5至10μg/kg體重。
31.至少一種權(quán)利要求1至20中任一權(quán)項(xiàng)的單克隆抗體在制備用于體內(nèi)預(yù)防和/或治療HIV-1感染的疫苗中的應(yīng)用。
32.權(quán)利要求31的應(yīng)用，其中至少一種抗體在混合物中與常規(guī)的免疫血清和/或抗生素一起應(yīng)用。
33.權(quán)利要求31或32的應(yīng)用，其中應(yīng)用了至少兩種不同的抗體。
34.至少一種權(quán)利要求1至10和15至20中任一權(quán)項(xiàng)的抗體在檢測和/或確定人血液和/或血清樣品中HIV-1感染和/或感染的細(xì)胞中的應(yīng)用。
35.至少一種權(quán)利要求11至14中任一權(quán)項(xiàng)的抗體和/或至少一種權(quán)利要求25至28中任一權(quán)項(xiàng)的抗原性肽片段在檢測和/或確定抗HIV-1抗體中的應(yīng)用。
36.至少一種權(quán)利要求25至28中任一權(quán)項(xiàng)的肽片段在制備抗HIV感染的用于人類主動(dòng)免疫的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于制備疫苗的抗體,所述疫苗用于對需要治療的人進(jìn)行主動(dòng)和/或被動(dòng)免疫。本發(fā)明也提供人類單克隆抗體,它們與CL1至CL6細(xì)胞系保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC),PHLS,Porton Down,Salisbury,英國)產(chǎn)生的上述抗體是功能等價(jià)物。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供產(chǎn)生本文公開和要求保護(hù)的任意一種抗體的雜交瘤和或CHO細(xì)胞系。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明抗體的混合物,以及用單獨(dú)的抗體或其混合物進(jìn)行HIV－1感染的體外或體內(nèi)檢測、預(yù)防和/或治療。
文檔編號C07K16/08GK1186500SQ95197896
公開日1998年7月1日 申請日期1995年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月19日
發(fā)明者H·卡特英格, A·布克阿謝爾, W·埃爾內(nèi)斯特, C·鮑爾昂, M·珀特謝爾, A·特里科拉, R·普雷德爾, C·謝馬特茨, A·克利馬, F·施泰因德爾, T·穆斯特爾 申請人:波利門科學(xué)生物免疫研究有限公司