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新的普遍存在的鉀離子通道蛋白和其基因的制作方法

文檔序號:3549206閱讀:915來源:國知局
專利名稱:新的普遍存在的鉀離子通道蛋白和其基因的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及在人和鼠的各種組織中表達的新ATP敏感性鉀離子通道蛋白huKATP-1和ruKATP-1,和編碼它們的基因。所述蛋白和基因可用作鉀離子通道相關疾病如糖尿病、高血壓和內分泌不足的診斷和治療藥劑。
已知糖尿病的病因主要是胰腺β-細胞中胰島素分泌失調。因此闡明胰島素分泌的分子機制可望在弄清糖尿病的起因和開發(fā)治療糖尿病的治療藥方面起重要作用,但還不清楚這種分子機制的詳情。
現(xiàn)已清楚,存在于細胞膜上的ATP敏感性鉀離子通道(KATP通道),通過結合細胞中代謝狀態(tài)和膜電壓在細胞功能如分泌和肌肉收縮中起重要作用。
KATP通道首先于983年發(fā)現(xiàn)于心肌[Noma,A.,Nature 305147(1983)],而后證實其存在于各種組織中,如胰腺β-細胞[Cook,D.L.等,Nature 311271(1984),Misler,S.等,Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.837119(1986)]、垂體[Bernardi,H.等,Proc.Natl.Acad.U.S.A.,901340(1993)]、骨骼肌[Spruce,A.E.等,Nature,316736(1985)]和腦。
另外,已表明這種KATP通道存在分子不均一性[Ashcroft,F(xiàn).M.,Annu.Rev.Neurosci.1197(1988)]。
尤其在胰腺β-細胞中,由葡萄糖代謝產生的ATP通過關閉KATP通道造成去極化引起鈣離子從鈣通道流入,從而造成胰島素的分泌。顯然,KATP通道在調節(jié)胰島素分泌中起重要作用。
KATP通道屬于具有內向整流電生理性質的鉀離子通道家族。根據(jù)氨基酸序列一致性,具有內向整流電生理性質的鉀離子通道家族分為四個亞族,ROMK1,IRK1,GIRK1和cKATP-1。
但在胰腺β-細胞中還沒有闡明KATP通道的分子構架。另外,沒有公開過本發(fā)明的新ATP敏感性鉀離子通道(huKATP-1和ruKATP-1)的詳細蛋白結構和關于與其他蛋白形成復合物的資料,例如與磺酰脲結合蛋白。
為了分離、鑒定一種新的膜通道并進行功能分析,需要很復雜的技術,如分子生物學技術、細胞生物學技術和電生理技術。
正是如此,本發(fā)明者充分利用這些技術分離了編碼在哺乳動物不同組織中表達的新KATP通道(uKATP-1)的人和鼠基因組和cD-NA,還鑒定了這些通道蛋白的氨基酸序列(參見

圖1、2、3和4)。所鑒定uKATP-1通道蛋白在非洲蟾蜍卵母細胞和哺乳動物細胞系中表達。
電生理分析表明uKATP-1是一種顯示內向整流作用的ATP敏感性鉀離子通道。這種uKATP-1通道在包括人和鼠的哺乳動物組織中普遍表達,并參與基礎能量代謝中膜電壓的保持。
如上所述,本發(fā)明涉及在哺乳動物中普遍存在的ATP敏感性鉀離子通道(uKATP-1),還包括這種ATP敏感性鉀離子通道蛋白,編碼它們的已鑒定的DNA序列,其中含有這種序列的質粒,以及其中已轉入了這種質粒的重組細胞(轉化子)。另外,本發(fā)明包括分離的uKATP-1蛋白和重組蛋白,它們的相關物質如拮抗劑和激動劑,包括診斷劑和基因治療藥的藥物設計。
人源huKATP-1由324個氨基酸殘基組成(見圖4),分子量為47,965,而鼠源的uKATP-1由424個氨基酸殘基組成(見圖4),分子量為47,960。這兩個鉀離子通道顯示98%的氨基酸序列一致性,這種顯著的同源性使我們可以假定uKATP-1在哺乳動物細胞中起共同的、基礎結構和功能作用。首先,uKATP-1參與膜電壓和能量代謝,這提示它可用作在異常、極端代謝條件下(包括內分泌疾病,如糖尿病、饑餓和局部缺血)防止紊亂的物質。
例如,局部缺血開始過程中由uKATP-1開和關引起的鈣離子流入和流出與局部缺血紊亂密切相關。換句話說,打開和關閉uKATP-1的激動劑和拮抗劑可能構成抗局部缺血紊亂的抑制性藥物。
從huKATP-1和ruKATP-1與其他鉀離子通道氨基酸序列的比較研究中,證實了本發(fā)明的uKATP-1屬于新的一族內向整流鉀離子通道,uKATP-1蛋白的中心區(qū)顯示與其他內向整流鉀離子通道的同源性較高。親水性圖譜表明存在兩個疏水區(qū)和一個孔區(qū),兩個疏水區(qū)由兩個內向整流鉀離子通道的特征性跨膜區(qū)組成[Nicholas,C.G.,Trends Pharmacol.Sci.,14320(1993),Jan,L.Y.and Jen,Y.N.,Nature,371119(1994)]。
據(jù)報道[Inagaki,N.等,J.B.C.,2705691(1995)],ruKATP-1的第二個細胞內區(qū)中有兩個潛在的cAMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(Thr-234和Ser-385)和7個潛在蛋白激酶C依賴性磷酸化位點(Ser-224,Thr-345,Ser-354,Ser-379,Ser-385,Ser-391和Ser-397),而在第一和第二細胞內區(qū)中分別存在一個(Thr-63)和4個潛在酪蛋白激酶II依賴性磷酸化位點(Thr-234,Ser-281,Thr-329和Ser-354),但在分子內區(qū)中不存在N連接的糖基化位點。在huKATP-1中也有同樣的發(fā)現(xiàn)[Inagaki,N.,等,in press(1995)]。
本發(fā)明者鑒定了huKATP-1和ruKATP-1的核苷酸序列和整個氨基酸序列,這樣利用已知遺傳工程技術在細菌或動物細胞中表達編碼huKATP-1和ruKATP-1和其突變體的DNA,可以大量合成huKATP-1和ruKATP-1蛋白本身和其突變體。另外huKATP-1和其片段可用于huKATP-1 DNA缺乏的雜交診斷,huKATP-1的突變體可用于細胞中糖代謝的研究,尤其是胰島素依賴性和非依賴性糖尿病的研究。
在cDNA文庫和基因組文庫基礎上鑒定了本發(fā)明新huKATP-1和ruKATP-1的DNA。編碼huKATP-1的DNA長度為約9.7kb,由三個外顯子組成,存在于染色體12p11·23上。利用uKATP-1和其片段的cDNA探測基因組DNA文庫可獲得染色體DNA。用已知技術易于在分離的uKATP-1 DNA上進行核苷酸缺失、插入或取代來制備其突變體。
利用已知技術易于將編碼其他蛋白或合成多肽的核苷酸序列連接到uKATP-1或其變體的5′和3′末端,從而制備融合蛋白或其衍生物。
例如,以前體蛋白形式制備融合蛋白并在體內或體外進行裂解,從而發(fā)揮功能;這種融合蛋白除其適宜功能外提供組織靶向和膜導向。此時,該融合蛋白含有糖鏈結合氨基酸,可被修飾成具有組織導向或通過加入新糖鏈而被激活的生理活性的衍生物。
為了產生uKATP-1、其變體或它們的衍生物,將相應的編碼DNA引入可繁殖質粒中,再培養(yǎng)用這種質粒轉化的宿主細胞。宿主細胞包括細菌、酵母和動物細胞。
原核細胞如細菌適用于脫氧核糖核苷酸的克隆。例如,來自大腸桿菌的pBR322質粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因,可提供鑒別轉化細胞的實用工具。另外,微生物質粒含有可用于表達其自身蛋白的啟動子。除原核細胞外,真核細胞如酵母也可行,質粒YRp7在糖酵母(Saccharomyces)種的酵母中表達尤其有用[Stin-chomb等,Nature,28239(1979)]。
動物細胞也可用作宿主,尤其脊椎動物細胞的培養(yǎng)易于操作并構成一種常規(guī)方法[Krause和Paterson,Tissue Culture,AcademicPress(1973)]。可提及的細胞系有AtT-20、Hela細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COMSM6、COS-7等。多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猴病毒40的啟動子用于控制表達質粒在這種細胞系中的功能,其中pCMV是在動物細胞表達系統(tǒng)中有廣泛應用的一種質粒[Thomsen等,PNAS,81659(1984)]。
本發(fā)明huKATP-1和muKATP-1的DNA序列從起始密碼子“ATG”開始。當重組細胞用于合成這種蛋白時,需要向目的DNA上加入ATG,從而使得易于操作。因此當在用大腸桿菌轉化的原核細胞中表達時,一般合成氨基酸序列從Met開始的蛋白。根據(jù)應用目的,可從生成的蛋白中消除N-末端的Met。
與此相似,當在重組動物細胞中合成uKATP-1時,可生物合成或在N-末端含Met的蛋白或N-末端消除了Met的蛋白,兩種蛋白對具體的應用目的都是有用的。
可將uKATP-1和其片段給予動物進行免疫,以產生抗體。通過動物免疫還可從分泌目的抗體的細胞產生單克隆抗體。
現(xiàn)在已容易大量制備uKATP-1,從而可以更好地在分子水平了解uKATP-1。因此,應用uKATP-1和其突變體或類似物可能開發(fā)出主要用于通道蛋白相關疾病的診斷或治療試劑。
尤其,該蛋白可用于研究適于診斷學和治療學的物質,或對uKATP-1起激動或拮抗作用的物質。例如用動物細胞檢測的步驟為將uKATP-1的cDNA注入細胞中進行表達,然后加入磺酰脲以研究它們的相互作用[Kayano.T.等,J.Biol.Chem.,26513276(1990),實例4]。
其次,已獲得了關于uKATP-1 DNA序列的相關信息,從而有助于制備脫氧核糖核苷酸的部分序列。這種較短的DNA序列能夠與所選基因雜交,可用作核酸探針,這種探針對在不同組織中檢測cD-NA很有效。
利用uKATP-1制得的探針可用于從各種生物和其組織獲得能夠雜交的核酸。所得核酸可與uKATP-1的類型相同或為其異型,包括編碼新蛋白的核酸。
所制探針可用于鉀離子通道相關疾病的基因診斷;可對與這種探針雜交的病人核苷酸進行研究以檢測疾病基因。
在此以前,鉀離子通道阻斷劑和開放劑已用作抗糖尿病和高血壓的治療劑。uKATP-1和其突變體、衍生物和它們的單克隆抗體,當被加工成藥物制劑時,可給予病人,以通過中和由臨床服用過量的這種抑斷劑或開放劑引起的副作用而減輕病癥。當顯示uKATP-1自身功能不足時,可服用這種藥劑以補償這種uKATP-1的功能缺陷。
本發(fā)明包括可用于必需治療方法中的基因治療藥物的制備??蓪KATP-1或其突變體和它們的衍生物的核苷酸序列引入質粒或干細胞中,然后將其給予病人,以提供用作基因治療藥物的可能性。
以下參照附圖描述實施例以更詳細地說明本發(fā)明。
附圖中圖1顯示圖2和3中所示堿基序列相應的氨基酸序列。
圖2顯示如實施例5中所得人源uKATP-1的堿基序列。
圖3顯示圖5和6相應的氨基酸序列。
圖4顯示鼠源ruKATP-1的堿基序列。
圖5A顯示利用非洲蟾蜍卵母細胞對ruKATP-1進行電生理分析的結果。注入ruKATP-1 cDNA的卵母細胞在45mM[K+]濃縮細胞外液的條件下顯示內向整流作用,但該整流作用在向細胞外液中加入300μM Ba2+時被阻斷。注射水作為對照,僅觀察到極小的內向電流。
圖5B是鉀離子濃度依賴性電流對電壓的作圖,從此證實uKATP-1明顯為內向整流鉀離子通道。
圖5C是注入ruKATP-1的cRNA的卵母細胞中可逆性電壓對細胞外K+濃度的對數(shù)作圖,顯示可逆性電壓對細胞外K+濃度的依賴性。
圖6是對其中表達uKATP-1的HEM239轉化細胞的單通道分析,其中A代表單通道電流的記錄,B是電流-電壓關系,說明存在顯示內向整流的K+電流。
實施例1克隆新內向整流鉀離子通道(ruKATP-1)的cDNA按聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增了GIRK的cDNA片段,GIRK是一種鼠G蛋白調節(jié)的內向整流鉀離子通道。用32P-標記的鼠GIRK cDNA片段作為探針,對從鼠朗氏細胞島在λgt22載體中構建的cDNA文庫進行篩選。將分離的ruKATP-1cDNA切成適當?shù)腄NA片段,然后亞克隆至M13mp18或mp19中,按鏈終止法進行堿基測序(見圖5和6)。實施例2在爪蟾卵母細胞中表達及電生理分析含全長ruKATP-1cDNA的質粒pGEM11Z用限制酶Not 1處理線性化后,用RNA聚合酶體外合成cRNA。將20ng量的cRNA注入爪蟾卵母細胞中,然后在2或3天后進行電生理分析(見圖7)。如圖7A和7B中所示,觀察到了顯示弱內向整流的K+電流。在細胞外液中加入Ba2+抑制該K+電流。實施例3對表達ruKATP-1的HEK239細胞的單通道分析在補有10%馬血清的最小基本Eegle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK239細胞。利用Lipofectamine將攜帶全長ruKATP-1編碼cDNA的表達質粒(pCMV6b)轉染到HEK239細胞中,以制備轉化的HEK239細胞。對如此產生的轉化細胞進行單通道分析,結果示于圖8A和8B中。
如圖8A和8B中所示,流經(jīng)通道的外向電流被細胞內Mg2+抑制,揭示uKATP-1是一種內向整流K+通道;uKATP-1顯示單通道電導為約70pS。圖7表明在內-外模型中觀察到的ATP對uKATP-1通道活性的影響。當向細胞膜內加入1μM ATP時通道打開,但加入1mM ATP時完全關閉。結果表明uKATP-1是一種ATP調節(jié)的KATP通道。實施例4RNA印跡分析從各種組織和細胞系提取的20μg RNA和從垂體及胸腺提取的10μg RNA,分別用甲醛變性并在1%瓊脂糖凝膠上電泳,然后轉移到尼龍膜上。用32P-標記的ruKATP-1 cDNA作為探針進行雜交,在幾乎所有組織中觀察到了uKATP-1 mRNA的表達。實施例5人源uKATP-1的cDNA和基因的克隆為了分離編碼人源uKATP-1的cDNA,用32P-標記的鼠源ruKATP-1 cDNA作為探針,對人肺cDNA文庫進行篩選。將形成的克隆亞克隆到M13mp18,M13mp19和pGM3Z中,然后用鏈終止法進行堿基測序。
權利要求
1.一種普遍存在的人源ATP敏感性鉀離子通道蛋白,它具有圖1所示的氨基酸序列。
2.具有編碼權利要求1的氨基酸序列的堿基序列的脫氧核糖核苷酸。
3.權利要求2的脫氧核糖核苷酸,其堿基序列由圖2中所示圖式代表。
4.一種含有權利要求1的氨基酸序列的蛋白,其部分氨基酸殘基被部分取代、插入或缺失,而不引起其生物活性的損失。
5.編碼權利要求4的含所述氨基酸序列之蛋白的脫氧核糖核苷酸。
6.權利要求2或3的編碼顯示ATP敏感性鉀離子通道蛋白生物活性的蛋白的脫氧核糖核苷酸,該脫氧核糖核苷酸含有編碼其他蛋白或多肽的、在5′或3′末端與其堿基序列連接的堿基序列。
7.與人和鼠源普遍存在的ATP敏感性鉀離子通道屬同一族的源自其他動物的ATP敏感性鉀離子通道蛋白,和編碼它的脫氧核糖核苷酸。
8.含各自被置于其啟動子下游的權利要求2、3、5或6的脫氧核糖核苷酸的表達質粒。
9.已用權利要求8的質粒進行了轉化的生物細胞。
10.與權利要求1或4的普遍存在的ATP敏感性鉀離子通道蛋白相作用的抗體。
11.權利要求10的抗體,它是單克隆抗體。
12.一種分析并檢測能與權利要求1或4的普遍存在的ATP敏感性鉀離子通道蛋白或其突變蛋白相作用的物質的方法。
13.權利要求12的方法,其中相互作用是通過在體外與一種物質直接連接來進行的。
14.權利要求13的方法,其中相互作用是通過激動或拮抗作用來進行的。
15.具有不同長度的探針,其通過合成權利要求2、3或5的脫氧核糖核苷酸的部分序列而制備。
16.具有不同長度的探針,其通過合成權利要求7的脫氧核糖核苷酸的部分序列而制備。
17.來自人組織和細胞的基因組文庫和cDNA文庫中的脫氧核糖核苷酸序列,其與權利要求15的探針相作用。
18.一種利用權利要求15或16的探針分析和檢測所得脫氧核糖核苷酸序列的方法。
19.來自人和其他動物組織和細胞的基因組文庫和cDNA文庫的脫氧核糖核苷酸序列,其與權利要求16的探針相作用。
20.一種鉀離子通道相關疾病的治療劑,其含有權利要求1的蛋白作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明提供普遍存在于動物活體中的新型ATP敏感性鉀離子通道蛋白,和其基因。
文檔編號C07K16/00GK1157826SQ9610586
公開日1997年8月27日 申請日期1996年5月16日 優(yōu)先權日1995年9月18日
發(fā)明者清野進, 稻垣暢也 申請人:清野進, 日本化學研究股份有限公司
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