專利名稱：分離表型相關(guān)基因的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從有某種確定表型的人或高等動(dòng)植物的復(fù)雜基因組中分離該表型相關(guān)基因DNA片段的方法及其裝置。特別是涉及一種可直接準(zhǔn)確地分離出全基因組DNA鏈中任何部位、任何類型的表型相關(guān)基因DNA片段的方法及其裝置。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)中，從復(fù)雜基因組中分離表型相關(guān)基因片段則面臨兩個(gè)困難(1)表型相關(guān)基因片段包含多種類型，如遺傳系中血親同一型片段或等基因系(高等生物同一個(gè)體的體細(xì)胞系，植物的單克隆品系和動(dòng)植物培養(yǎng)細(xì)胞單克隆系)中突變片段；重排型突變(基因的缺失、插入、倒位等)、點(diǎn)突變(堿基置換和小的缺失、插入)或去甲基化突變片段；單基因型突變或多基因型突變片段。然而目前還沒有一種可分離出上述所有類型突變片段的方法。(2)人或高等動(dòng)植物的基因組龐大復(fù)雜，如人的基因組包含60億核苷酸對(duì)，它可被限制酶切成107種易于雜交識(shí)別的小片段。然而無論是雜交識(shí)別還是劑量比較都達(dá)不到10-7的分辨率(即分辨出兩個(gè)基因組間107分之一的差異)。任何分離基因方法首先必須把基因組的復(fù)雜度降至102以下，才能進(jìn)行分辨和分離?，F(xiàn)有技術(shù)或者以降低靈敏度(減少被檢基因組范圍)為代價(jià)降低復(fù)雜度，或者不能把復(fù)雜度降低到可分辨的程度，因而缺乏較高的靈敏度和分辨率。在現(xiàn)有技術(shù)中，依據(jù)分離的突變類型不同，分離基因方法可分為三類(1)功能克隆法提純某種已知功能蛋白質(zhì)，測(cè)其氨基酸順序，進(jìn)而推斷出其相關(guān)基因結(jié)構(gòu)。由于細(xì)胞中往往含有上萬種蛋白質(zhì)，大多數(shù)種含量極微，難以提純和分析，這類方法僅適用于極少數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)量高的基因的分離。(2)定位克隆法通過某種表型在遺傳家系中與一些位點(diǎn)標(biāo)記間連鎖分析把表型相關(guān)基因定位在染色體某區(qū)域中。這類方法僅適用于容易找到遺傳家系的植物基因或者人類單基因遺傳病相關(guān)基因的分離。(3)表型克隆法通過有相同表型的遺傳家系中不同個(gè)體基因組間雜交分離遺傳性血親同一片段(IBDF，idendical-by-desend-fragment)，或者通過有不同表型的同一個(gè)體細(xì)胞基因組間雜交或帶型比較分離重排型突變。近年來，大量的研究表明，人類大多數(shù)致命性疾病，例如惡性腫瘤、腦血管病、心臟病、II型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、老年癡呆癥等，甚至人類的衰老都是由多位點(diǎn)、體細(xì)胞性點(diǎn)突變所引起的。而現(xiàn)有技術(shù)均不適用分離這一類突變片段。本發(fā)明所確立的基本方法則可以用于分離這些人類致命基因(R.Nowak，Science，270(1995)，P368-371；P.Aldhous，Science，265(1994)，P2008-2010；J.J.Jonsson et al.，Proc.Natl. Acad. Sci.USA，92(1995)，P83-85)。在現(xiàn)有技術(shù)中依據(jù)減少基因組的復(fù)雜度方式不同，分離基因方法可分為二類(1)通過特異探針標(biāo)記(雜交)或特異引物PCR擴(kuò)增選擇性分離基因組中部分區(qū)域中基因。這類方法以減少被篩查基因組區(qū)域?yàn)榇鷥r(jià)來減少基因組復(fù)雜度，因而勢(shì)必降低其靈敏度(N.Lisitsyn，et al.，Science，259(1993)，P946-951；P.Liang，et al.，Nucl.Acid.Res.21(1993)，P3269-3275)。(2)在雜交前把基因組DNA片段單向電泳或帶型比較前把基因組雙向電泳，使DNA片段分散到103～104位點(diǎn)上，從而把每個(gè)位點(diǎn)上片段種類減少到104以下。這類方法雖然沒有減少其靈敏度，但也沒有將基因組復(fù)雜度減少至102以下可分辨的程度(L.C.Au，et al.，86(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，P5507-5511；H.Yokota，et al.，219(1994)，Analy.Biochem.，P131-138；H.Nakashime.227(1995)，Analy.Biochem.，P319-327)。故而針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，研制一種可對(duì)全基因組中任何部位任何類型突變片段進(jìn)行直接分離的新型的分離表型相關(guān)基因的方法及其相關(guān)裝置。
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的是改進(jìn)現(xiàn)有表型克隆法存在的上述兩個(gè)缺陷，建立一種可直接準(zhǔn)確分離出全基因組任何部位任何類型的表型相關(guān)基因的方法。以雙向電泳取代現(xiàn)有的雜交前單向電泳法，以二次酶切(粗切酶和細(xì)切酶)凝膠過濾電泳取代現(xiàn)有的帶型比較前的普通雙向電泳。從而把基因組的復(fù)雜度降至102以下，達(dá)到了可直接分辨的程度。實(shí)現(xiàn)了對(duì)全基因組中突變片段的直接分離。以可檢出任何型式的突變片段的原位加減法取代現(xiàn)有的僅能分離重排型突變片段的減法雜交或帶型比較。實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組中任何型式的突變片段的分離。
一種分離表型相關(guān)基因的方法；包括下列步驟第一步，把樣本和對(duì)照本DNA片段分散到凝膠上，從而減少同一位點(diǎn)重疊在一起的DNA片段種數(shù)；第二步，通過堿液變性----中性液復(fù)性處理上述凝膠片，使其中含有的DNA片段在電泳原位相互雜交；第三步，將不雜交的重排型突變片段和去甲基化/甲基化突變片段及雜交形成錯(cuò)配處的點(diǎn)突變片段分離到另一膠膜上；第四步，通過對(duì)突變片段，即等基因系的表型相關(guān)基因片段原位PCR，或放射自顯影后在試管中PCR擴(kuò)增其為探針；通過對(duì)非突變片段，即遺傳系的表型相關(guān)基因片段放射自顯影后在試管中PCR擴(kuò)增其為探針。本發(fā)明所述的樣本和對(duì)照本DNA可以分別是同一生物個(gè)體不同表型細(xì)胞的DNA；也可以分別是不同生物個(gè)體細(xì)胞的DNA；或可以分別是不同表型、不同生物個(gè)體細(xì)胞的DNA；另外，樣本和對(duì)照本DNA可以是全部或部分細(xì)胞核DNA，也可以是從mRNA或hnRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、mtDNA等；其中可以是人或高等動(dòng)、植物及其它任何生物基因組的DNA或cDNA。本發(fā)明所述減少同一位點(diǎn)重疊DNA片段種數(shù)的步驟，可以是單向凝膠過濾電泳，也可以是雜交前雙向電泳或者帶型比較前用粗切酶和細(xì)切酶的雙向電泳；可以是樣本和對(duì)照本混合電泳，也可以是二者平行電泳。本發(fā)明所述的原位相互雜交步驟，可以是在均勻凝膠中進(jìn)行，也可以是在雜交膠膜上的空心泡內(nèi)液體中或稀的凝膠中進(jìn)行；可以通過堿液變性----中性液復(fù)性處理中進(jìn)行，也可以通過高溫變性----低溫復(fù)性處理中進(jìn)行。本發(fā)明所述的分離突變片段的步驟，可以是將非突變片段固定，然后通過電泳或吸印把游離的突變片段分離出來；也可以用化學(xué)物或酶把突變片段切短，再通過電泳把短的突變片段和長(zhǎng)的非突變片段分離開來；還可以通過原位樣本和對(duì)照本間螢光比較或是通過用修復(fù)酶mutHLS等標(biāo)記雜交雙鏈錯(cuò)配處以顯示分離之。本發(fā)明所述的擴(kuò)增基因片段的步驟，可以是原位PCR擴(kuò)增，也可以在放射自顯影原位顯示后取出，然后在試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，還可以將基因片段直接從凝膠片中洗脫到試管中擴(kuò)增。本發(fā)明所述的避免對(duì)照片段間不雜交的措施，可以將樣本和對(duì)照本片段混合電泳或平行電泳以避免二者間錯(cuò)位，也可以將DNA切成小片段以有利于其運(yùn)動(dòng)、雜交，還可以通過凝膠過濾電泳提高DNA片段的濃度或是在雜交膠膜空心泡液相中雜交。本發(fā)明所述的避免非對(duì)照片段間錯(cuò)交，可以將DNA切成小片段減少散在性重復(fù)片段的錯(cuò)交，也可以是雙向電泳，凝膠過濾電泳或是自交結(jié)果對(duì)照減少家族基因和等位基因間錯(cuò)交，或以嚴(yán)格條件進(jìn)行雜交以避免DNA單鏈的自交。本發(fā)明所述一種分離表型相關(guān)基因的裝置，其包括由用于DNA片段雙向電泳和第三向電轉(zhuǎn)移的三維電泳儀(SD)和DNA片段原位雜交的雜交膠膜(Hm)所組成；在三維電泳儀(SD)內(nèi)具有中央平臺(tái)，在中央平臺(tái)的左、右、前、后相對(duì)設(shè)置電泳液槽(N1，P1，N2，P2)，其中N1，N2為負(fù)極電液槽，P1，P2為正極電液槽；在平臺(tái)的下方設(shè)有不銹鋼網(wǎng)，在不銹鋼網(wǎng)的下面設(shè)有負(fù)極電泳液槽(N3)，在不銹鋼網(wǎng)上面放置用于DNA片段雙向電泳的凝膠片，在凝膠片上面放置有雜交膠膜(Hm)，用做正極的不銹鋼網(wǎng)(P3)設(shè)置在雜交膠膜(Hm)的上面。本發(fā)明所述雜交膠膜(Hm)包括一正方形尼龍膜(Nm)或硝酸纖維素膜，其膜孔徑為0.1μm，在尼龍膜(Nm)上附有1～2mm薄層聚丙烯酰胺空心凝膠，其濃度為0.8％，空心泡(Cell)孔徑10μm--100μm，在泡內(nèi)含液體或低濃度Hydrolink膠或瓊脂糖。
本發(fā)明所述的分離表型相關(guān)基因的方法包括(1)、二次酶切雙向電泳以不同表型同一個(gè)體細(xì)胞基因組DNA(cDNA庫、mt DNA庫)，或者以同一表型不同個(gè)體細(xì)胞基因組DNA為樣本和對(duì)照本。將二者用相同粗切酶(識(shí)別6～8個(gè)核苷酸對(duì)序列的限制酶)充分分解為平均10kb以上長(zhǎng)片段，并分別標(biāo)記放射性同位素和生物素，混合電泳至凝膠條中，再用細(xì)切酶(識(shí)別4個(gè)核苷酸對(duì)的酶)把凝膠條中DNA片段進(jìn)一步分解為平均幾百bp片段，橫向(與第一次電泳方向垂直)電泳到凝膠片中，使基因組中107種片段分散到105個(gè)(200×500)位點(diǎn)上。每個(gè)位點(diǎn)上平均含有102種DNA片段。(2)、限制片段原位加減法同一生物個(gè)體中所有細(xì)胞都從一個(gè)受精卵細(xì)胞增殖而來，因此它們有相同的基因組和限制圖。任何一種樣本中限制片段與其在對(duì)照本中對(duì)照片段(同染色體上同位點(diǎn)片段)具有相等長(zhǎng)度和相同堿基順序，會(huì)被上述電泳移動(dòng)到相同位置。任何形式的突變將改變二者等位狀態(tài)(2.1)、重排性突變會(huì)使突變片段與其對(duì)照片段間發(fā)生移位，因此可通過不移位的非突變片段間減法雜交分離出這類突變片段。具體地，將經(jīng)雙向電泳的凝膠中DNA片段用堿液變性處理后，將它們縱向(與原膠面垂直)電泳到含有生物素親合素(Avidin)凝膠附著的尼龍膜上，溫育固定標(biāo)有生物素的對(duì)照本片段，再以中性液處理使不移位樣本片段雜交到已固定的對(duì)照本對(duì)照片段上，最后把未雜交的樣本突變片段轉(zhuǎn)到另一個(gè)附有凝膠的尼龍膜上。(2.2)、點(diǎn)突變會(huì)使突變片段與其對(duì)照片段間發(fā)生堿基順序差異，因此可通過有差異的突變片段間加法雜交分離這類突變片段。具體地，把減法中已被分離出重排性突變片段的凝膠片用化學(xué)物，比如鋨酸、鹽酸羥胺和六氫吡啶或T4內(nèi)切酶VII，S1核酸酶等處理以切割突變片段的雜交雙鏈錯(cuò)配處，然后把切斷而游離下來的突變片段轉(zhuǎn)到另一附有凝膠的尼龍膜上。(3)、突變片段原位顯示和擴(kuò)增對(duì)上述含有突變片的凝膠片進(jìn)行X光片放射自顯影，依據(jù)顯示的位置取出突變片段，加上寡聚核苷酸接頭，再進(jìn)一步通過PCR擴(kuò)增為探針，再用于表型相關(guān)基因的表達(dá)序列和全序列測(cè)定。另外，還有不必對(duì)樣本加以放射性標(biāo)記的方法在含有突變片段的膠片上，通過原位PCR把突變片段擴(kuò)增為探針?；蛘咄ㄟ^電洗器將膠片中突變片段轉(zhuǎn)入試管，再通過PCR擴(kuò)增為探針。(4)、降低假陽性率和假陰性率對(duì)照片段間不雜交或雜交效率低，非對(duì)照片段間錯(cuò)交都會(huì)造成一些假陽性和假陰性。把樣本和對(duì)照本片段混合在一起電泳可避免對(duì)照片段間錯(cuò)位而不雜交。采用空心膠做雜交膜可避免在凝膠中雜交的低效率。把限制片段切成幾百bp小片段，既有利于提高雜交效率，又可把單拷貝序列和散在性重復(fù)序列(IRS，interspersed repeat sequence)切開，而避免非對(duì)照片段的IRS間錯(cuò)交。雙向電泳可避免大部份非對(duì)照片段的家族基因或等位基因序列間錯(cuò)交。余下的錯(cuò)交結(jié)果可通過樣本和對(duì)照本雜交分離的片段與二者自交分離的片段的對(duì)比或進(jìn)行減法雜交以去除。采用一對(duì)限制酶可把基因組80％部份切成0.1kb至2kb適宜長(zhǎng)度而被篩查，采用三對(duì)不同限制酶即可篩查基因組99.2％部份。綜上所述使用本發(fā)明的方法和裝置，無需昂貴設(shè)備和特殊探針，甚至無需放射性標(biāo)記，具有成本低、實(shí)驗(yàn)周期短等特點(diǎn)，即可從人和高等動(dòng)植物復(fù)雜基因組中分離出任何部位、任何型式的表型相關(guān)基因片段。特別是為分離至關(guān)重要的人類致命基因提供了一個(gè)簡(jiǎn)便快捷的新手段。
本發(fā)明共有三張附圖，其中附

圖1是分離表型相關(guān)基因的方法流程圖。
附圖2是三維電泳儀的結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖3是雜交膠膜的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中RF--限制片段 Ao--電泳凝膠片 TE--二次酶切雙向電泳SH--減法雜交 AH1--加法雜交1AH2--加法雜交2Aa--放射自顯影 PCR--鏈?zhǔn)矫复俜磻?yīng) Tube--試管N1--負(fù)極電液槽1 N2--負(fù)極電液槽2 N3--負(fù)極電泳液槽3P1--正極電液槽1 P2--正極電液槽2 P3--正極不銹鋼網(wǎng)3Nm--尼龍膜 Hm--雜交膠膜 Cell--空心泡Gel--凝膠 A1，A2，B1，B2--雜交膠膜本發(fā)明的具體實(shí)施例如附圖所示實(shí)施例1用雜交減法分離等基因系重排型突變片段把樣本和對(duì)照本的DNA片段(RF)分別標(biāo)記放射性同位素和生物素。將二者以1∶100比例混合在A0膠中雙向電泳(TE)，堿液處理后將全部DNA片段轉(zhuǎn)入含生物素親合素的雜交膠膜A1中，溫育固定標(biāo)有生物素的對(duì)照本片段。然后中性液處理使非突變片段雜交到對(duì)照本片段上。把未雜交的突變片段轉(zhuǎn)移到另一雜交膜B1中(SH)。對(duì)B1膠膜進(jìn)行X光片放射自顯影(Aa)顯示突變片段位置，取出它再進(jìn)一步擴(kuò)增為探針。這種方法適用分離小于100bp的突變片段。實(shí)施例2用比較減法分離等基因系重排突變片段用同種限制酶把樣本和對(duì)照本的等量DNA切成平均100kb長(zhǎng)片段，經(jīng)平行脈沖電場(chǎng)電泳到膠條中，再用細(xì)切酶將它們切成平均10kb片段，并把二者分別在3′末端標(biāo)記不同顏色的螢光素。將二者在A0膠中作橫向電泳，然后把A0膠置于螢光自動(dòng)掃描儀下檢出色差異常位點(diǎn)。即為突變片段位點(diǎn)。取出其中DNA片段通過單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)電泳分離出突變片段，再進(jìn)一步擴(kuò)增為探針。這種方法適用于分離大于100bp的突變片段。實(shí)施例3用雜交減法分離等基因系去甲基化突變片段該方法與實(shí)施例1相似，不同之處是前者采用不切割會(huì)發(fā)生去甲基化突變的CpG序列的限制酶進(jìn)行二次酶切，后者采用切割去甲基化的CpG而不切割甲基化的CpG序列的酶，而使樣本突變片段比對(duì)照片段少了一個(gè)切點(diǎn)，二者間發(fā)生了位移則可用雜交減法進(jìn)行分離。實(shí)施例4用加法分離等基因系點(diǎn)突變片段把等量的樣本和對(duì)照本DNA片段(RF)混合在A0膠中進(jìn)行雙向電泳(TE)，將DNA轉(zhuǎn)入雜交膠膜A2后，堿變性--中性重復(fù)性處理，使二者原位雜交。然后用化學(xué)物，比如鹽酸羥胺、鋨酸和六氫吡啶或用酶，比如T4內(nèi)切酶VII，S1核酸酶等處理DNA片段，在雜交雙鏈錯(cuò)配處切下突變片段，然后將被切短的突變片段轉(zhuǎn)入另一膠膜B2(AH1)。未被切斷的非突變片段電泳速度慢而留在膠A2中。將B2膠中突變片段進(jìn)一步擴(kuò)增為探針。實(shí)施例5用加減法分離遺傳系血親同一型片段把等量的樣本和對(duì)照本DNA片段(RF)分別在3′末端標(biāo)記放射性同位素和生物素。將二者混合在A0膠中單向電泳，堿液變性后將DNA轉(zhuǎn)入另一含有生物素親合素的膠膜A1上，溫育固定對(duì)照本片段，再用中性液復(fù)性處理，使非重排型樣本片段雜交、固定于A1膜上，把重排型突變片段轉(zhuǎn)入B1膜上(SH)，然后用化學(xué)物或酶把A1膠膜中點(diǎn)突變片段切斷，把游離的點(diǎn)突變片段轉(zhuǎn)入膠膜B2(AH2)，最后對(duì)除去重排型和點(diǎn)突變型片段的膠膜A2進(jìn)行X光片放射自顯影(Aa)，顯示位置即為血親同一片段位置，取出后進(jìn)一步擴(kuò)增為探針。實(shí)施例6用加法分離等基因系重排型突變片段把樣本和對(duì)照本DNA片段(RF)分別用去甲基化酶和甲基化酶處理，將二者以1∶100比例混合在A0膠中雙向電泳和原位雜交。然后用不切割甲基化序列的限制酶把去甲基化的樣本自交雙鏈(即為重排突變片段)切斷，最后將這些切短的突變片段轉(zhuǎn)入膠膜B2上(AH1)。甲基化的對(duì)照本片段和半甲基化的雜交片段都未被切短，它們?cè)陔娪緯r(shí)落在后面留在膠膜A2中。然后將膠膜B2中突變片段進(jìn)一步擴(kuò)增為探針。
權(quán)利要求
1.一種分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于包括下列步驟第一步，把樣本和對(duì)照本DNA片段分散到凝膠上，從而減少同一位點(diǎn)重疊在一起的DNA片段種數(shù)；第二步，通過堿液變性----中性液復(fù)性處理上述凝膠片，使其中含有的DNA片段在電泳原位相互雜交；第三步，將不雜交的重排型突變片段和去甲基化/甲基化突變片段及雜交形成錯(cuò)配處的點(diǎn)突變片段分離到另一膠膜上；第四步，通過對(duì)突變片段，即等基因系的表型相關(guān)基因片段原位PCR，或放射自顯影后在試管中PCR擴(kuò)增其為探針；通過對(duì)非突變片段，即遺傳系的表型相關(guān)基因片段放射自顯影后在試管中PCR擴(kuò)增其為探針，在上述四步中，通過把樣本和對(duì)照本片段混合電泳以使對(duì)照片段間同位而充分雜交，通過雙向凝膠過濾電泳以使非對(duì)照片段間錯(cuò)位而不雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的樣本和對(duì)照本DNA可以分別是同一生物個(gè)體不同表型細(xì)胞的DNA；也可以分別是不同生物個(gè)體細(xì)胞的DNA；或可以分別是不同表型、不同生物個(gè)體細(xì)胞的DNA；另外，樣本和對(duì)照本DNA可以是全部或部分細(xì)胞核DNA，也可以是從mRNA或hnRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、mtDNA等；其中可以是人或高等動(dòng)、植物及其它任何生物基因組的DNA或cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述減少同一位點(diǎn)重疊DNA片段種數(shù)的步驟，可以是單向凝膠過濾電泳，也可以是雜交前雙向電泳或者帶型比較前用粗切酶和細(xì)切酶的雙向電泳；可以是樣本和對(duì)照本混合電泳，也可以是二者平行電泳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的原位相互雜交步驟，可以是在均勻凝膠中進(jìn)行，也可以是在雜交膠膜中的空心泡內(nèi)液體中或稀的凝膠中進(jìn)行；可以通過堿液變性----中性液復(fù)性處理中進(jìn)行，也可以通過高溫變性----低溫復(fù)性處理中進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的分離突變片段的步驟，可以是將非突變片段固定，然后通過電泳或吸印把游離的突變片段分離出來；也可以用化學(xué)物或酶把突變片段切短，再通過電泳把短的突變片段和長(zhǎng)的非突變片段分離開來；還可以通過原位樣本和對(duì)照本間螢光比較或是通過用修復(fù)酶mut HLS等標(biāo)記雜交雙鏈錯(cuò)配處以顯示分離之。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的擴(kuò)增基因片段的步驟，可以是原位PCR擴(kuò)增，也可以在放射自顯影原位顯示后取出，然后在試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，還可以將基因片段直接從凝膠片中洗脫到試管中擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的避免對(duì)照片段間不雜交的措施，可以將樣本和對(duì)照本片段混合電泳或平行電泳以避免二者間錯(cuò)位，也可以將DNA切成小片段以有利于其運(yùn)動(dòng)、雜交，還可以通過凝膠過濾電泳以提高DNA片段的濃度或是在雜交膠膜空心泡液相中雜交。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離表型相關(guān)基因的方法；其特征在于所述的避免非對(duì)照片段間錯(cuò)交，可以將DNA切成小片段減少散在性重復(fù)片段的錯(cuò)交，也可以是雙向電泳，凝膠過濾電泳或以自交結(jié)果對(duì)照來減少家族基因和等位基因間錯(cuò)交，或在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交以避免DNA單鏈的自交。
9.一種分離表型相關(guān)基因的裝置；其特征在于由用于DNA片段雙向電泳和第三向電轉(zhuǎn)移的三維電泳儀(SD)和DNA片段原位雜交的雜交膠膜(Hm)所組成；在三維電泳儀(SD)內(nèi)具有中央平臺(tái)，在中央平臺(tái)的左、右、前、后相對(duì)設(shè)置電泳液槽(N1，P1，N2，P2)，其中N1，N2為負(fù)極電液槽，P1，P2為正極電液槽；在平臺(tái)的下方設(shè)有不銹鋼網(wǎng)，在不銹鋼網(wǎng)的下面設(shè)有負(fù)極電泳液槽(N3)，在不銹鋼網(wǎng)上面放置用于DNA片段雙向電泳的凝膠片，在凝膠片上面放置有雜交膠膜(Hm)，用做正極的不銹鋼網(wǎng)(P3)設(shè)置在雜交膠膜(Hm)的上面。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離表型相關(guān)基因的裝置；其特征在于雜交膠膜(Hm)包括一正方形尼龍膜(Nm)或硝酸纖維素膜，其膜孔徑為0.1μm以下，在尼龍膜(Nm)上附有1～2mm薄層聚丙烯酰胺空心凝膠，其濃度為0.8％以上，空心泡(Cell)孔徑10μm--100μm，在泡內(nèi)含液體或低濃度Hydrolink膠或瓊脂糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直接準(zhǔn)確分離有確定表型的復(fù)雜基因組DNA中任何部位任何類型的該表型相關(guān)基因的方法及其裝置。其包括通過樣本和對(duì)照本基因組DNA的二次酶切和混合雙向電泳把雜交雙方復(fù)雜度降至十萬分之一，然后通過原位減法雜交分離重排型或去甲基化型突變片段，通過原位加法雜交分離點(diǎn)突變片段。本發(fā)明適用于人類任何生理或病理表型相關(guān)基因，特別是大多數(shù)常見致命疾病相關(guān)基因和多種經(jīng)濟(jì)作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆表型相關(guān)基因的分離。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1152613SQ9611958
公開日1997年6月25日 申請(qǐng)日期1996年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月25日
發(fā)明者卞小莊 申請(qǐng)人:卞小莊, 萬輝