專利名稱：分析或檢測多核苷酸的方法及其分析儀或裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用DNA進行診斷，檢測DNA的性質以及分析或檢測DNA的方法。
用DNA診斷疾病已日益普遍。在這種疾病診斷方法中，(1)制備具有與靶DNA互補序列的DNA探針并進行探針檢測，看這種DNA探針是否能與靶DNA雜交；(2)選出編碼靶DNA的某一序列區(qū)并用兩個DNA探針(引物)對其進行聚合酶鏈式反應擴增，閱讀所得的DNA片段或檢驗其長度，并根據(jù)獲得的DNA片段信息進行檢測；等等。將這樣得到的結果用于診斷等方面。這些方法適用于分析或檢測單一類型的DNA、至多是幾種類型的DNA，但不適合于大量DNA片段的DNA檢測或卡DNA的全面評估。
不過，DNA或基因組通過在體內相互作用而發(fā)揮其功能。所以非常需要從總體上鑒定染色體或其中所含的全部DNA。例如，在基因組計劃中引人關注的cDNA中，已經嘗試對互補于mRNA的cDNA的類型和數(shù)量進行檢測從而從整體上了解一種生物體，注意到DNA在生物體中發(fā)揮作用的機理，當DNA在生物體中發(fā)揮作用時，DNA信息首先被轉錄到mRNA上，基于這一信息合成蛋白質，以對生物體發(fā)揮作用。在這種嘗試中，從活樣品中取出cDNA，對各種cDNA進行測序以分析每種cDNA在一組織中出現(xiàn)的頻率(機體作圖)。
機體作圖包括下列步驟。首先，從mRNA制備cDNA(各種cDNA的混合物)，再進行克隆。把含有各種cDNA的大腸埃希氏桿菌(E.coli)在瓊脂糖平板上涂布并培養(yǎng)以獲取菌落，每一菌落含有所需cDNA中的一種。挑出所需cDNA并測序以鑒定cDNA的類型。按相似方式從每一菌落挑出所需cDNA并測序，這樣就經常出現(xiàn)相同的cDNA。當關注一種組織中存在的某一特定cDNA時，這一特定cDNA的數(shù)量越大，特定cDNA與在組織中強烈表達的基因的相關性就越高，所以該基因在菌落中出現(xiàn)的頻率也就越高。因而提出了一種測定cDNA出現(xiàn)頻率的方法，該方法包括在許多菌落中進行cDNA測序，觀察某一特定cDNA在各菌落中出現(xiàn)多少次(Katsuji，Murakawa等，Genomics，23，379-389(1994)) 。
另一方面，還提出了用于DNA診斷的另一種嘗試，它關注的是一個基因組(所有染色體中的DNA)或一條特定染色體的整體分布。一種稱之為基因掃描、也稱為Landmark基因組掃描(LGS方法)的指紋技術涉及下列步驟用象Not I等等這樣的8堿基切割限制性酶(每48～64kbs消化一次)選擇性消化DNA；把消化過的片段結合到放射性同位素標記或用熒光團標記的核苷酸上；用電泳法分離這些片段；然后，用4堿基切割限制性酶(每44～256堿基消化一次)；對聚丙烯酰胺板凝膠的上端的DNA片段進行雙向電泳。把這樣獲得的圖樣用作指紋，借此了解DNA的整體分布。一種嘗試包括圖樣的診斷用途，已知正常細胞中的DNA圖樣與患有癌癥等的異常細胞的DNA圖樣不同。
不過，迄今還沒有發(fā)現(xiàn)一種優(yōu)良技術，因為在前述方法中應該檢驗長DNA的哪一特定位點存在異常。
對疾病的早期檢測或了解細胞中DNA的功能而言，檢驗長、大DNA或弄清含不同cDNA的樣品的整體分布是很重要的。然而，如前所述，尚未開發(fā)出足以達到這一目的優(yōu)良技術。根據(jù)上文中闡述的技術，必須測定眾多克隆的堿基序列。所要求的人力和時間使這些技術不可能實際用于各種樣品。常規(guī)的DNA探查只足以在一個操作周期中檢驗至多幾種到幾十種DNA，但不適合于在一個操作周期中檢測幾百到上千種cDNA或DNA片段。此外，上述cDNA分析法不適合于存在異常的長DNA的檢測。
另一方面，基因掃描技術可以滿足前述要求，但也遇到一些問題，即在用限制性酶第二次消化過程中和雙向電泳中要消耗大量酶、作為第一次消化中出現(xiàn)的DNA片段長度的尺度的橫坐標和作為最終片段的長度的某種尺度的縱坐標并不總是定量，所以難以用這些數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫。
本發(fā)明的一個目的是克服上述問題、提供一種新的指紋技術即DNA分析法，該方法適用于各種樣品并且適合于測定大量cDNA或DNA片段和測定長DNA。
本發(fā)明的DNA分析或測定方法具有下列特征。首先，用限制性酶切割樣品中所含的DNA而產生具有樣品固有長度的DNA片段。將帶有已知序列的寡聚體連接到產生的DNA片段的3′末端上以形成一個引導區(qū)。制備一種能與這個引導區(qū)、識別序列和與識別序列相鄰的幾個堿基雜交的DNA探針。這一DNA探針由一套16個DNA探針組成，例如，其中3′末端的兩個堿基是基本上所有堿基的組合。使這16個DNA探針獨立地與樣品DNA雜交，進行互補鏈合成。所合成的鏈用熒光團等標記。引發(fā)互補鏈合成時，對互補鏈合成產物針對所用每一種DNA探針進行凝膠電泳，并測定每個片段的長度以獲得指紋。下文簡要描述本發(fā)明的組成。
A.根據(jù)本發(fā)明的分析或測定核苷酸的方法的第一方面包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)用標記的DNA探針(因互補鏈合成而摻入的標記的核苷酸也可用作標記的DNA鏈)的3′末端序列辨別得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并只有在末端序列配對時才通過互補鏈合成延伸標記的DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(3)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的DNA探針長度的步驟；其中對于該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列所測得的長度被用作指紋。
B.根據(jù)本發(fā)明的分析或測定核苷酸的方法的第二方面至少包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸，類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端連接的步驟；(3)用一套4個或16個標記的DNA探針進行互補鏈合成使所述標記的DNA探針延伸的步驟，標記的DNA探針具有互補于前述連接的寡核苷酸或互補于其3′末端的1個或2個堿基的一部分識別序列的任意序列并具有不同的末端序列；和(4)對通過互補鏈合成而延伸的鏈進行電泳以檢測DNA片段的步驟。
在上述方法A和B中，本發(fā)明的特征至少在于標記物是生物素、化學發(fā)光試劑或熒光團；通過檢測熒光團來檢測DNA探針或DNA片段；以及標記的DNA探針含有一套16個標記的DNA探針，其中至少兩個末端堿基由基本上所有堿基種類或其類似物構成。
C.根據(jù)本發(fā)明的分析或測定核苷酸的方法的第三個方面至少包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端連接的步驟；(3)使用在其3′末端具有由任意堿基種類組成的1～3個堿基的所有組合的每個標記的DNA探針進行互補鏈合成而使每個所述標記的DNA探針互補鏈延伸的步驟，標記的DNA探針是與以上步驟(2)中連接的寡核苷酸或與所述限制性酶所識別的一部分識別序列互補的；(4)將通過每個標記的DNA探針的互補鏈合成延伸的DNA鏈按照末端序列進行分類和分離的步驟；(5)將第二個寡聚體引入通過互補鏈合成在其3′末端延伸的DNA鏈中的步驟；(6)用引入了第二個寡聚體的DNA鏈作為模板進行步驟(3)和(4)的步驟；和(7)分級分離并根據(jù)長度，檢測通過互補鏈合成延伸的DNA鏈的步驟。
在上述方法C中，本發(fā)明的特征在于通過重復上述步驟(3)和(4)的，DNA片段或DNA片段的互補鏈相互間可以分級分離從而檢測DNA，因為標記的第二個DNA探針的每個末端堿基序列具有第二個寡聚體的互補鏈。通過重復前述步驟(3)和(4)，可以增加級分的數(shù)目，也就可以進行更為詳細的分析。而且，方法C適用于含有更多片段的樣品。
D.根據(jù)本發(fā)明的分析或測定核苷酸的方法的第四個方面至少包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端連接的步驟；(3)使用在其3′末端具有由任意堿基種類組成的1～3個堿基的所有組合的第一個標記的DNA探針進行互補鏈合成而使第一個標記的DNA探針的互補鏈延伸的步驟。標記的DNA探針是與以上步驟(2)中連接的寡核苷酸(或寡聚體)或與所述限制性酶所識別的一部分識別序列互補的；(4)將第一個標記的DNA探針的每個末端堿基通過互補鏈合成而延伸的DNA鏈之互補DNA鏈分類和分離的步驟；(5)用不同于以上步驟(3)中所用的第一個標記的DNA探針的第二個標記的DNA探針再次進行上述步驟(3)的步驟；和(6)分級分離并根據(jù)長度檢測經互補鏈合成延伸的DNA鏈的步驟，該DNA是由以上步驟(5)中得到的第二個標記的DNA探針生成的。
在上述方法A-D中，本發(fā)明的特征在于所述限制性酶是用于形成3′-突出端或平端型片段的限制性酶。方法A-D中，本發(fā)明的特征還在于其中所用限制性酶是用于產生5′-突出端的限制性酶，而且這些方法還包括，在以上步驟(1)之后，用DNA聚合酶填補用限制性酶消化的部分以形成雙鏈的步驟或者通過連接引入含有被消化部分的序列的寡聚體的步驟。
在方法A中，本發(fā)明的特征在于基于兩個堿基的差別分級分離的DNA片段的互補鏈至少用熒光團或化學發(fā)光試劑進行標記并用具有在其3′末端的任意兩個堿基所有可能組合的標記的DNA探針通過互補鏈合成而產生。
E.在方法A-D中，使用的標記的DNA探針是一套至少16個DNA探針，它們是N1，…Nn的所有組合形式(其中5≤n≤2(7)，X1，…，Xm(1≤m≤6)；Y1Y2是A，C，G和T任何一種；所述標記的DNA探針是用于互補鏈合成的引物并用下式表示
5′-N1…Nn，X1…XmY1Y2-3′其中N1…Nn具有基本上互補于與DNA片段連接的寡聚體的序列；X1…Xm基本上互補于用限制性酶消化的部分的一部分序列；Y1Y2由A，C，G和T中任意兩個的組合構成。
F.在方法A-D中，使用的標記的DNA探針是一套至少16個DNA探針，它們是N1，…，Nn的所有組合形式(其中5≤n≤2(7)，X1，Xm(1≤m≤6)；Y1Y2是A，C，G和T任何一種；Zi(1≤i≤3)是可與多種核苷酸雜交的核苷酸似物；所述標記的DNA探針是用于互補鏈合成的引物并用下式表示5′-N1…Nn，X1…XmZi…Y1Y2-3′其中N1…Nn具有基本上互補于與DNA片段連接的寡聚體的序列；X1…Xm基本上互補于用限制性酶消化的部分的一部分序列；Y1Y2由A，C，G和T中任意兩個的組合構成。
F中的DNA探針中，本發(fā)明的特征在于核苷酸N1，…，Nn任一個用生物素或熒光團進行標記。
G.在方法A-D中，用限制性酶消化的DNA是用下列步驟獲得的DNA(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；和(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA以給出有關mRNA的種類和量的信息的步驟。
H.本發(fā)明的另一方面涉及DNA分析儀或DNA測定義，它包括用限制性酶消化DNA的第一反應容器；進行第二個反應的多個第二反應容器，第二個反應包括在多個第二反應容器的每一個中混合在其3′末端附近具有不同堿基序列的多個標記的DNA探針的任一個，其中將消化產物分級分離并裝入第二反應容器中，用標記的DNA探針辨別通過以上消化作用得到的DNA片段在其3′末端附近的堿基序列的差異；只有在末端序列配對時才通過互補鏈合成延伸標記的DNA探針，將DNA片段分級分離成幾組；和用于測量屬于各組的DNA片段長度的電泳裝置或，用經互補鏈合成延伸的標記的DNA探針作為樣品并測量該樣品的長度；由此得到所測量的DNA片段在其3′末端附近的每個堿基序列樣品的長度作為指紋。
1.本發(fā)明的再一方面涉及DNA分析儀或DNA測定儀，它包括用限制性酶消化DNA并將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與以上消化中得到的DNA片段在其3′末端連接的第一反應容器；進行第二個反應的多個第二反應容器，第二個反應包括在多個第二反應容器的每一個中混合一套4或16個標記的DNA探針的任一個，其中將消化產物分級分離并裝入第二反應容器中。標記的DNA探針具有互補于以上連接的寡核苷酸(或寡聚體)或互補于在其3′末端的1個或2個堿基的識別序列一部分的任意序列；和用于用所延伸的DNA鏈作為樣品測量經互補鏈合成延伸的DNA鏈長度的電泳裝置；從而得到每個標記的DNA探針樣品的長度作為指紋。
在DNA分析儀或測定儀H和I中，本發(fā)明的特征在于長度標記物和樣品一起在所述電泳裝置的凝膠電泳泳道中進行電泳從而對經電泳分離的樣品片段進行分級分離和辨別，并用熒光團來標記樣品和長度標記物，從而根據(jù)熒光團標記物的熒光波長加以辨別。
J.本發(fā)明的又一方面涉及DNA分析儀或核苷酸測定儀，其中，提供了多個反應容器和在控制溫度的條件下進行化學反應的一個化學反應容器，并將至少一套16個標記的DNA探針分別裝入多個反應容器中，并使分別裝入多個反應容器中的每個DNA片段與標記的DNA探針同時反應。
盡管樣品中存在著許多待分析的DNA片段，但在大多數(shù)情況中，每個DNA片段具有的序列不同于鄰近于識別序列的序列。因此，根據(jù)鄰近于識別序列的序列的差異將DNA片段初步分級分離成幾組。重復進行這種分組操作，直到每組中DNA片段的數(shù)量降低到不會對用凝膠電泳分級分離DNA片段造成不便的水平時為止。最后，借助每個DNA片段的長度通過凝膠電泳檢測每組中的DNA片段。
用具有兩個末端堿基所有組合的一套16個DNA探針通過互補鏈合成對樣品中用限制性酶消化DNA而得到的DNA片段進行分級分離和分類。當兩個末端堿基完全與靶DNA雜交時進行互補鏈合成，否則不能進行。通過互補鏈合成而延伸的DNA鏈其長度基本上與原DNA鏈(用限劑性酶消化而得到的DNA片段)相同。當這樣設計時，即當標記物被接納到由互補鏈合成所延伸的DNA鏈中而使標記的DNA鏈能與由互補鏈合成而延伸的其它DNA鏈明顯區(qū)分開時，對末端的兩個堿基進行辨別以確定原DNA鏈的長度。
在單一分級分離不足以辨別在樣品中用限制性酶消化DNA而得到的DNA片段的情況中，把生物素標記到DNA探針上并僅僅探查出延伸的鏈。再一次把分級分離用于探查出的DNA片段(由互補鏈合成而延伸的DNA鏈)。在這種情形中，所用的DNA探針是連接到互補鏈3′末端(相應于原DNA的5′末端)上的一種DNA探針，所以可以進行不同于第一個操作的分類。
也就是說，根據(jù)本發(fā)明，有關用限制性酶消化樣品中DNA而得到的許多DNA片段的長度的信息并不用作指紋。而是借助末端堿基序列對用限制性酶消化而得到的DNA片段進行分級分離并分成幾組。對每組中存在的DNA片段，用凝膠電泳測定片段長度并將片段長度用作指紋。所以本發(fā)明的優(yōu)點在于片段長度不會相互重疊但能達到高分辨力。
本發(fā)明適合于多種樣品而無需消耗大量人力和時間，并可以提供適于測定許多DNA或DNA片段或者分析或測定長DNA的指紋圖譜法，以及其中所用到的分析儀或裝置。
根據(jù)本發(fā)明，不再需要克隆和培養(yǎng)步驟，即這些步驟在現(xiàn)有技術中為基因表達分析而進行的mRNA顯性是必需的而且所需時間長，這樣就可以在更短的時間內進行顯性，所需時間少于現(xiàn)有技術的十分之一。此外，所獲得的數(shù)據(jù)可以換算成數(shù)字數(shù)據(jù)，數(shù)字數(shù)據(jù)是計算中優(yōu)選的數(shù)據(jù)庫。
下面將參照

圖1描述本發(fā)明。用限制性酶HhaI消化樣品1，并把聚腺苷酸加到每個DNA片段的3′末端堿基序列4，制備一套16個具有RXY結構(其中X和Y代表A，C，G或T)的熒光團標記的DNA探針6。把含有由所有片段組成的樣品DNA的溶液分成16個級分15，把不同的DNA探針6加到各級分中以進行互補鏈合成。DNA探針與DNA片段雜交，但如11所示只有在3′末端完全雜交的DNA探針(*R-AA)才通過互補鏈合成而得以延伸。用熒光凝膠電泳裝置鑒別出具有延伸的DNA序列相同長度即延伸的互補鏈長度的互補鏈13。在凝膠電泳圖譜中，片段長度不會相互重疊，但能獲得長度的高分辨力。所以，本方法和分析儀或裝置適合于多種樣品。
圖1是解釋本發(fā)明實施例1中操作程序的圖示。
圖2A是由混合的DNA片段測定的電泳圖譜，混合的DNA片段是通過把本發(fā)明實施例中的操作程序用于樣品-DNA而獲得的。
圖2B是由按照末端堿基序列分類的DNA片段測定的電泳圖譜，分類的DNA片段是用一套16個DNA探針通過把本發(fā)明實施例1中的操作程序用于樣品-DNA而獲得的。
圖3A表示PUC19的電泳圖譜，它是本發(fā)明實施例2得到的。
圖3B表示PUC118的電泳圖譜，它是本發(fā)明實施例2得到的。
圖4是解釋本發(fā)明實施例2中的操作程序的圖示。
本發(fā)明適合于象DNA或RNA這樣的多核苷酸樣品。通過指紋分析或采用指紋法的測定技術進行多核苷酸樣品的分析或測定。本發(fā)明還涉及在DNA分析或DNA測定中應用的DNA分析儀或DNA測定儀。
下面將參照附圖詳細描述本發(fā)明的實施方案。實施例1該實施例主要用于解釋本發(fā)明的基本原理。對于DNA診斷，通常使用的技術是用限制酶消化DNA，通過凝膠電泳分級分離所產生的DNA片段并根據(jù)所獲得的電泳圖譜進行診斷。但是，隨著由限制酶產生的DNA片段的種類增加，這些DNA片段不易被彼此區(qū)分，造成診斷困難。這些片段的特征在于其堿基長度和序列。雖然每一片段都有其固有序列，但均由數(shù)個堿基組成的各個末端序列通常也各不相同。例如， 4-堿基切割限制酶的消化位點通常出現(xiàn)在平均每隔256bp處。因此，當用4-堿基切割限制酶消化一約50kb的雙鏈DNA時，產生約200個雙鏈DNA片段(約400個單鏈DNA片段)。首先用與識別序列相鄰的兩堿基3′-末端序列分級分離這些DNA片段，兩堿基序列的組合數(shù)變?yōu)?×4＝16種組合。屬于每一組的單鏈DNA片段的平均數(shù)約為25個片段。具有從數(shù)個堿基到1kb的各種長度的約25個DNA易于分級分離。當完整的DNA很長或當所要處理的樣品含有許多DNA片段時，利用較長的堿基序列對DNA片段進行分組。例如，當利用末端四堿基序列來分組時，DNA片段被分級分離為256組。當按長度對每組的DNA片段進行分級分離時，具有從幾個堿基到1000個堿基在內的至少100種DNA片段可被區(qū)分，因此總共20,000個以上的DNA片段可被分級分離。由此獲得的數(shù)據(jù)可用作指紋圖譜。下面參照圖1詳細解釋具體的步驟。
使用λDNA作為樣品1，并使用HhaI作為限制酶、HhaI是一種消化雙鏈DNA的限制酶，它將雙鏈DNA5′-N…NGCGCN…N-3′3′-N…NCGCGN…N-5′消化成5′-N…NGCGCN…N-3′3′-N…NCGCGN…N-5′其中N代表A、T、G和C中任何一種。每一DNA片段3的3′末端堿基序列4為GCG。在圖1中，與每一DNA片段3的3′—末端堿基序列4相鄰的兩個堿基10通常用NN表示，其中N為A、C、G和T中的任何一種。通過連接將一寡聚物加到該DNA片段的3′末端?；蛘?，利用末端脫氧核苷酸轉移酶將poly A(它可為A、C、G或T)加到該DNA片段的3′末端。當加入polyA時，3′末端應為3′-突出末端或平末端。參照圖1解釋了加入poly A5的實施方案。當將poly A5加到每一DNA片段的3′末端時，3′末端的序列由下式表示
GCGAAAA…A-3′當加入polyA時識別序列GCG的存在是鑒別末端位點的關鍵。這是因為polyA的長度不能被控制。因此，制備了一套具有SEQ No.1所示結構的16種DNA探針65′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCXY-3′其中x和y均代表A、C、G或T(16種DNA探針是所有可能的x和y組合)。在圖1中，這些DNA探針由RXY表示，其中x和y均代表A、C、G或T，且R代表TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGC。符號*代表熒光團標記。當CGC序列缺失時，XY部分就不能發(fā)揮其區(qū)分DNA片段中的TG、TC、TT、TA等的作用(因為XY是與poly T相連的)。DNA探針的CGC5′端的序列與通過用限制酶HhaI消化所獲得的所有DNA片段互補，并可與所有這些片段雜交。下面解釋其中XY(即與3′末端堿基序列4相鄰的兩個堿基10)為AA的一個實施方案。在這一例子中，XY部分僅與具有互補鏈序列TT的片段雜交，形成雙鏈11，當XY部分10不具有與該片段互補的序列時，則XY部分不與任何片段雜交，如12所示。并不能僅僅通過雜交的穩(wěn)定性來確定XY部分是否完全雜交，這是因為幾乎所有該DNA探針的位點均可與任何片段雜交，而僅僅依靠末端兩個堿基序列上的差異并不足以用于鑒定。
但是，通過利用DNA聚合酶進行互補鏈的合成，就可以鑒別出末端兩堿基是否完全雜交。將一含有樣品DNA的溶液分成16等分(15)，該樣品DNA由通過用限制酶HhaI消化所獲得的所有DNA片段組成。將不同的每種DNA探針6加到每一等分中以進行互補鏈的合成。DNA探針與DNA片段雜交，但是只有3′末端完全雜交的DNA探針(*R-AA)(如11所示)未通過互補鏈的延伸而被延長，從而獲得與DNA片段具有相同長度的互補鏈13，當DNA探針被熒光團標記時，利用熒光凝膠電泳裝置即可鑒別出被延長的互補鏈的長度。
圖2A和2B顯示了利用-DNA所獲得的部分結果。當試圖同時測定通過用限制酶HhaI消化所獲得的所有DNA片段的長度時，許多峰相互重疊(如圖2A的電泳圖譜21所示)，使得其鑒別不可能。但是，如圖2B所示，在利用一套16種DNA探針23(在圖2B中僅顯示了該DNA探針*RXY的XY部分)根據(jù)末端堿基序列分組的DNA片段的電泳圖譜22中，對應于各個片段的峰彼此分開。從而可測定出分組的DNA片段中每一DNA片段的長度。根據(jù)所要分析的完整DNA的種類，圖2B所示的每一DNA片段的電泳圖譜都是固定的。如果完整DNA的結構不同，將出現(xiàn)另一種電泳圖譜。因此，可利用這些電泳圖譜作為指紋圖譜，后者反過來可用于DNA的診斷等。在圖2A和2B中，橫座標表示堿基長度(24)。實施例2圖3A和3B顯示了應用本發(fā)明方法鑒定不同DNA所獲得的結果。操作步驟與實施例1類似。即使用的樣品是基堿基序列具有某些差別的兩種PUC，即PUC19和PUC118。PUC19和PUC18是分別由2686個和3162個堿基組成的DNA，其中約有2630個堿基構成完全相同的共同序列。用限制酶HhaI消化層，通過連接反應將具有已知序列的寡聚物加到消化片段的末端。隨后按與實施例1類似的方式，利用一套16種引物(DNA探針)按消化片段的末端堿基序列對DNA片段進行分組，并獲得每一組的電泳圖譜。
圖3A中所示的電泳圖譜31得自PUC19。圖3B中所示的電泳圖譜32得自PUC118。圖3A和3B中的橫座標代表堿基長度24。作為在PUC19的電泳圖譜中缺失而僅在PUC118的電泳圖譜中檢測到DNA片段檢測到的是約75個堿基的片段(CT、GT引物)和約450個堿基的片段(CC、GT引物)，作為僅在PUC19中測得的片段則是約130個堿基的片段(CT、GT引物)。
如上所述，通過應用本發(fā)明的方法可以簡單方式將彼此稍有差異的各種DNA區(qū)分開。當然，本發(fā)明也可應用于基因組DNA。當用限制酶HhaI消化DNA時，平均每隔250個堿基發(fā)現(xiàn)一個消化位點，因為HhaI是一種4-堿基切割限制酶。在基因組的情況下，每1M堿基平均產生約100個雙鏈DNA片段。當利用8-堿基切割限制酶如NotI等檢測約100M堿基的一基因組時，產生幾乎同樣數(shù)量級的DNA片段，因此該方法同樣適用于基因組。
通過凝膠電泳極難對如此大量的DNA片段(按單鏈計算為2000-3000個片段)進行分級分離，并發(fā)現(xiàn)其電泳圖譜上的細微差別。因此，按照被限制酶消化的每一DNA片段的3′-末端序列將DNA片段分為16組，從而使第一組中平均含有約150個DNA片段。由于這一數(shù)目小于實施例1中所示的數(shù)目，從而可按類似于實施例1的方式分析DNA片段。
3′-末端的兩堿基是否與DNA探針的靶DNA(DNA片段)完全互補對互補鏈的合成影響甚大。利用這一現(xiàn)象將所形成的DNA片段分為16組。DNA片段以下式表示5′-C′1…C′iXn…X1Ci…C1-3′其中Xn…X1為每一片段本身的序列；Ci…C1和C′1…C′i代表識別序列或其一部分，且為已知。18聚寡聚物A′1…A′18，A18…A1分別在該DNA片段的5′和3′末端與其連接。結果每一DN片段均具有了如下結構5′-A′1…A′18C′1…C′iXn…X1Ci…C1A18…A1-3′A18…A1和A1′…A18′為具有已知序列的寡聚物。在每一DNA片段中，CiC1A18…A1的序列已知且與該已知序列相鄰的3′末端Xn…X1中的幾個堿基被用于DNA片段的分組。
制備與該DNA片段雜交的DNA探針。該DNA探針是與DNA片段的A1…A18C1…Ci互補且與特定序列x1x2完全雜交的序列。由于x1x2存在16種可能的組合，因此共制備16種探針。DNA探針以下式表示5′-A′1…A′18C′1…C′iY1Y2-3′
可在Ci′和Y1之間插入-DNA類似物如肌苷或用其取代Ci′，并也可使用由此產生的探針。用生物素(B)標記該DNA探針；根據(jù)需要，可對該標記的探針進行設計，以便通過其上固定有鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定板或通過磁性珠等對其進行分離。在上述解釋中，C1′…，Ci；C1′，…，Ci′；Xi，…，xn；Y1，Y2；A1，…，A18；A1′，…，A18′代表A、C、G和T中任何一種；且序列C1…Ci和序列C1′…Ci′；序列A1…A18和序列A1′…A18′；序列x1x2和Y1Y2形成互補鏈(如后面圖4所示)。
下面參照圖4進一步詳細描述本發(fā)明。DNA樣品38(具有已知序列的18聚寡聚物A′1…A′18和A18…A1分別連到每一DNA片段的5′和3′末端；它是通過用HindIII消化DNA而獲得的，并將由此獲得的DNA片段分組)被分成16份。將每一份單獨加到容器中。向每一份中加入一生物素化的DNA探針39(其中B代表生物素)5′-B-A′1…A′18C′1…C′iY1Y2-3′進一步向其中加入DNA聚合酶和用于鏈合成的底物(dNTP；脫氧核苷酸三磷酸)，完成互補鏈延伸反應。
可作為DNA聚合酶使用的有熱穩(wěn)定性Taq或熱穩(wěn)定性測序酶。在熱循環(huán)條件下進行反應，合成與DNA探針末端序列完全互補的DNA片段互補鏈?；パa鏈合成后，加入其表面具有鏈霉抗生物素蛋白(Av)的磁性珠，以將生物素標記的合成DNA鏈40捕獲至該珠上。也可用其上固定有鏈霉抗生物素蛋白的塑料珠或濾膜代替磁性珠。除去所捕獲的除DNA鏈外的未反應物質。如上所述，對于具有下列特定末端序列的每一DNA片段均制備了16個組(43)X2X1Ci…C1A18…A1在本實例中，是利用每一DNA片段的互補鏈進行分組。通過升高含有DNA片段的溶液的溫度，雜交的完整DNA片段被釋放并被除去。如圖4，回收電段的互補鏈(DNA鏈)46組在5′末端具有共同的探針序列(在互補鏈合成后DNA探針序列位于合成鏈的5′末端)，并根據(jù)與探針序列相鄰的兩堿基的不同被分成16組。每一組平均含有150個DNA鏈。
根據(jù)3′末端序列的差異進一步對每組DNA片段進行鑒定和分類(3’末端序列對應于在互補鏈合成中作為模板的完整DNA片段的5′末端序列)。捕獲在珠上的DNA鏈46含有通過連接反應而連接上的寡聚物序列A1…A18，DNA探針可與其雜交。一組16個熒光團標記的探針44具有與前面所述相同的序列5′-*A′1…A′18C′1…C′iY3Y4-3′其中*為熒光團標記，Y3和Y4代表A、C、G和T中的任何一種。將捕獲在珠上的DNA片段分成16組。
如上述實施方案所述，向每一組中加入一DNA探針以完成互補鏈的合成(延伸反應)。共在16×16＝256組中進行反應，并測定延伸產物45的電泳圖譜。可改變每一探針的所述熒光團標記，用具有不同顏色的熒光團標記的探針可同時反應，并可用多色檢測型DNA分析儀檢測延伸產物45。當使用具有四種不同顏色的熒光團時，對每一DNA組足以完成四次反應，即總共為4×16＝64次。另外，64條泳道對于電泳是足夠的。在這一實施方案中，與兩末端相連的寡聚物被看作是相同的，但也可在兩末端使用不同的限制酶，從而可在兩末端連上不同的序列。
通過對其基因組織有不同的大腸桿菌JM109和C600的電泳圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)它們絕大部分相同，僅部分存在差別，就象圖3A和3B所示的pUC19和pUC118的例子一樣。當未分組進行電泳時則不能發(fā)現(xiàn)該差異。
如上所述，當一大DNA被限制酶消化后，根據(jù)兩末端附近的序列對所得的DNA片段進行分組并進行電泳以獲得長度分離圖形，由此可以獲得每一基因組所固有的電泳圖譜。該圖形能有效地鑒定基因組之間的差異。尤其是，根據(jù)末端堿基種類所進行的分組也可有效地用于構建數(shù)據(jù)庫。在僅由二維電泳構成的圖形數(shù)據(jù)中，通過類似信息提供的DNA長度是不確定的，因而難以構建數(shù)據(jù)庫。但是，通過將按照末端堿基種類進行的分組與數(shù)字信息結合，即使通過類似信息進行的長度分離不是很精確，也可精確地區(qū)分DNA。
在上面的解釋中，通過升高含有DNA片段的溶液的溫度可以分離和除去雜交的完整DNA片段。也可以在分級分離后再使用與通過互補鏈合成延長的DNA探針雜交的完整DNA片段。在這種情況下，首先是將溶液加熱至80-85℃，以釋放并除去與未通過互補鏈合成延長的探針雜交的DNA片段，然后將溶液加熱至95-100℃，以釋放和回收與通過互補鏈合成延長的探針雜交的DNA片段。實施例3本實施例的目的在于獲得與顯示基因表達分析所需mRNA有關的信息。據(jù)說人類的基因數(shù)為50,000-100,000種。因此，相應地存在50,000-100,000種mRNA(信使RNA)。在這些mRNA中，推測約有3,000種mRNA是正常工作的。因此，了解這些mRNA如何在各種組織中發(fā)揮作用是十分重要的。為了測定mRNA的功能，現(xiàn)有技術包括收集mRNA，克隆mRNA，分析每一克隆中mRNA的序列并檢測顯示mRNA的頻率。但是，該方法需要大量的勞動。因此有必要開發(fā)用于這一分析的簡便操作方法。與mRNA互補的cDNA的分析已取得進展，由此也可能制備出能夠與每一cDNA特異性雜交的DNA探針并利用該DNA探針進行檢測。但是，實際上可應用的探針僅限于約數(shù)十種到100種探針。當要檢測不能被探針檢測的cDNA時，利用該有限的探針則不實用。因此有必要開發(fā)一套可檢測任何cDNA的系統(tǒng)。鑒于這種情況，在本實施方案中是利用本發(fā)明來顯示mRNA。
從組織中制備出mRNA文庫(cDNA文庫)(J.DNA Sequencingand Mapping，2,137-144(1991))。按照Nature，357,519-520(1992)所述技術，利用生物素化的polyT制備cDNA，并制備mRNA-cDNA雜交體和雙鏈DNA。用限制酶Sau 3AI消化雙鏈DNA，并將具有已知序列的寡聚物連接到消化位點，也可使用HhaI(GCG↓c)或NlaIII(CATG↓)作為限制酶。
通過這些步驟制成了在其5′末端帶有生物素化的polyT序列且在其3′末端帶有識別序列和已知寡聚物的DNA片段。向該DNA片段中加入其上固定有鏈霉抗生物素蛋白的磁性珠，形成生物素鏈霉抗生物素蛋白復合物。該復合物捕獲上述DNA片段及其互補鏈。將其上固定了DNA片段的珠粒加到容器中，并向其中加入緩沖溶液。加熱所產生的混合物以釋放互補DNA片段，并使用該互補DNA片段作為樣品。隨后按實施2方法處理該樣品，使DNA片段根據(jù)與其polyA相鄰的3′末端序列進行分級分離。在本例中，與實施例2所不同的是共有12種與polyT相鄰的選擇序列。分級分離生物素化的DNA探針后，利用16種熒光團標記的探針合成互補鏈。通過凝膠電泳測定所產生的DNA的長度，獲得指紋圖譜。實施例4為了實施實施例1-3所述方法，所使用的DNA分析儀包括用于16種或256種DNA探針同時進行反應以獲得互補鏈延伸產物的反應器，一個用于將每一探針自動加到每一反應器的自動移液管，以及一個用于電泳的裝置。優(yōu)選在65℃以上的溫度進行互補鏈延伸反應，因為無論該反應進行與否它都明顯受末端堿基序列的配對或誤配的影響。通過將DNA探針末端堿基的每一堿基同時進行延長產物的電泳，或在通過對DNA探針的末端堿基的每一堿基同時進行長度(對照)標記物的電泳，對互補鏈延伸反應的產物的相對長度進行比較也是必要的。為此，尤其優(yōu)選這樣一種測定片段長度的裝置，它將對照標記物與互補鏈延伸反應的每種產物一起電泳，并且利用了通過電泳分級分離的互補鏈延伸反應產物片段與標記物的相對位置關系。在這種情況下，通過鑒別DNA片段的長度易于完成操作，其中利用的是具有不同長度的多個標記物，根據(jù)其排列方式即都確定DNA片段屬于哪一組。如果最高達1kb的DNA片段被每隔5個堿基上出現(xiàn)的標記物分級分離成200組，則該DNA片段甚至將分級分離成256×200-50,000組。這一組數(shù)足以用于mRNA的診斷等或用于指紋圖譜分析。
在10-500堿基的長度范圍內電泳中的測量精確度是很高的。當對每2個堿基進行DNA片段分級分離時所獲得的分級分離數(shù)據(jù)將更詳細。在該測定中，需要用其發(fā)射波長與標記靶DNA片段的熒光團的發(fā)射波長完全不同的熒光團來標記該標記物，以便該標記物與靶DNA片段易于鑒別，熒光團在較長波長方向上具有一平的發(fā)射區(qū)。因此，重要的是通過為標記靶DNA片段的標記物選擇合適種類的熒光團使得標記物不干擾所需的DNA片段測量并在較長的波長區(qū)產生熒光信號。根據(jù)序列長度的不同DNA片段可具有不同的結構，而且即使它們具有相同的堿基長度，它們在凝膠電泳中的流動性也可能不同。但是，即使在這種情況下，只要知道DNA片段在哪一級分出現(xiàn)，就可以利用標記物作為檢測標準對DNA片段進行分級分離、也就是說，即使DNA片段具有相同長度，它們也會由于序列上的差異而以不同的級分被分級分離，但分級分離的良好再現(xiàn)性消除了分析上的任何困難。
序列表SEQ ID No1長度24個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓樸結構線性分子類型合成DNA，熒光團標記序列描述X，Y任意選自A、C、G或T。
權利要求
1.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)用DNA探針辨別得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并通過互補鏈合成延伸DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(3)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的DNA探針長度的步驟；其中對于該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列所測得的長度被用作指紋。
2.根據(jù)權利要求1的分析或測定核苷酸的方法，其中由DNA探針所合成的互補鏈被標記。
3.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端引入的步驟；(3)使用一套4個或6個在3′末端具有1個或2個堿基任意序列的標記的DNA探針和與以上連接的引入的寡核苷酸或與限制性酶的一部分識別序列互補的鏈進行互補鏈合成而使所述標記的DNA探針延伸的步驟；和(4)對通過互補鏈合成所延伸的鏈進行電泳以檢測DNA片段的步驟。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的分析或測定核苷酸的方法，其中標記是選自生物素和化學發(fā)光試劑的任一種。
5.根據(jù)權利要求1～3任一項的分析或測定核苷酸的方法，其中標記是熒光團并且通過檢測熒光團來檢測DNA探針或DNA片段。
6.根據(jù)權利要求1～3任一項的分析或測定核苷酸的方法，其中標記的DNA探針含有一套16個標記的DNA探針，其中末端的兩個堿基由基本上所有堿基種類或其類似物構成。
7.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端引入的步驟；(3)使用在其3′末端具有由任意堿基種類組成的1～3個堿基的所有組合的標記的DNA探針或使用標記的核苷酸磷酸鹽進行互補鏈合成而使每個所述標記的DNA探針互補鏈延伸的步驟，標記的DNA探針是與以上步驟(2)中連接的寡核苷酸(或寡聚體)或與所述限制性酶所識別的一部分識別序列互補的；(4)將通過每個DNA探針的互補鏈合成延伸的DNA鏈分類和分離的步驟；(5)將寡聚體引入通過互補鏈合成在其3′末端延伸的DNA鏈中的步驟；(6)用引入了寡聚體的DNA鏈作為模板進行步驟(3)和(4)的步驟；和(7)根據(jù)長度，分級分離并檢測通過互補鏈合成延伸的DNA鏈的步驟。
8.根據(jù)權利要求7的分析或測定核苷酸的方法，其中重復步驟(3)和(4)以分級分離DNA片段或每個具有第二個寡聚體的互補鏈的標記的DNA探針的DNA片段互補鏈，借此檢測DNA。
9.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端引入的步驟；(3)使用在其3′末端具有由任意堿基種類組成的1～3個堿基的所有組合的標記的DNA探針進行互補鏈合成而使標記的DNA探針的互補鏈延伸的步驟，標記的DNA探針是與以上步驟(2)中連接的寡核苷酸(或寡聚體)或與所述限制性酶所識別的一部分識別序列互補的；(4)將每個標記的DNA探針通過互補鏈合成而延伸的DNA鏈之互補DNA鏈分類和分離的步驟；(5)用不同于以上步驟(3)中所用的標記的DNA探針再次進行上述步驟(3)的步驟；和(6)依據(jù)長度，分級分離并檢測經互補鏈合成延伸的在以上步驟(5)中生成的DNA鏈。
10.根據(jù)權利要求1，3，7和9任一項的分析成測定核苷酸的方法，其中所述限制性酶是用于形成3′-突出端的限制性酶。
11.根據(jù)權利要求1，3，7和9任一項的分析或測定核苷酸的方法，其中所述限制性酶是用于形成平端型片段的限制性酶。
12.根據(jù)權利要求1，3，7和9任一項的分析或測定核苷酸的方法，其中所述限制性酶是用于產生5′-突出端的限制性酶，該方法還包括，在以上步驟(1)之后，用DNA聚合酶重締合用限制性酶消化的部分以形成雙鏈的步驟。
13.根據(jù)權利要求1的分析或測定核苷酸的方法，其中基于兩個堿基的差別分級分離的DNA片段的互補鏈用熒光團或化學發(fā)光試劑進行標記并使用在其3′末端具有任意兩個堿基所有可能組合的標記的DNA探針通過互補鏈合成而產生。
14.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)根據(jù)每個DNA片段3′末端附近兩個堿基的差異將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(2)按照長度，用電泳法分級分離每組中所含的DNA片段或DNA片段的互補鏈；其中經電泳獲得的電泳圖譜被用于分析或測定。
15.根據(jù)權利要求14的分析或測定核苷酸的方法，其中基于兩個堿基的差異分級分離的DNA片段的互補鏈用熒光團或化學發(fā)光試劑進行標記并使用在其3′末端具有任意兩個堿基所有可能組合的標記的DNA探針通過互補鏈合成而產生。
16.一種分析或測定DNA的方法，該方法包括(1)消化DNA的步驟；(2)用DNA探針辨別得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并通過互補鏈合成延伸DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(3)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的標記的DNA探針長度的步驟；其中對于該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列所測得的長度進行測量。
17.一套16個DNA探針，它們是用于根據(jù)權利要求1，3，7，9，14和16任一項的分析或測定核苷酸的方法中的DNA探針，可以是N1，…Nn的所有組合形式(其中5≤n≤2(7)，X1，…，Xm(1≤m≤6)；Y1Y2是A，C，G和T任何一種；所述標記的DNA探針是用于互補鏈合成的引物并用下式表示5′-N1…Nn，X1…XmY1Y2-3′其中N1…Nn具有基本上互補于與DNA片段連接的寡聚體的序列；X1…Xm基本上互補于用限制性酶消化的部分的一部分序列；Y1Y2由A，C，G和T中任意兩個的組合構成。
18.一套16個DNA探針，它們是用于根據(jù)權利要求1，3，7，9，14和16任一項的分析或測定核苷酸的方法中的DNA探針，可以是N1，…，Nn的所有組合形式(其中5≤n≤2(7)，X1，…Xm(1≤m≤6)；Y1Y2是A，C，G和T任何一種；Zi(1≤i≤3)是可與多個核苷酸雜交的核苷酸類似物；所述標記的DNA探針是用于互補鏈合成的引物并用下式表示5′-N1…Nn，X1…XmZi…Y1Y2-3′其中N1…Nn具有基本上互補于與DNA片段連接的寡聚體的序列；X1…Xm基本上互補于用限制性酶消化的部分的一部分序列；Y1Y2由A，C，G和T中任意兩個的組合構成。
19.根據(jù)權利要求17或18的一套DNA探針，其中核苷酸N1，…，Nn任一個用生物素或熒光團進行標記。
20.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)用限制性酶消化DNA的步驟；(4)用標記的DNA探針辨別得自以上步驟(3)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并通過互補鏈合成延伸標記的DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(5)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的標記的DNA探針長度的步驟；其中對于該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列所測得的長度被用作指紋以給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
21.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)用限制性酶消化雙鏈DNA的步驟；(4)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(3)的DNA片段在其3′末端連接的步驟；(5)用一套4個或16個標記的DNA探針進行互補鏈合成使所述標記的DNA探針延伸的步驟，標記的DNA探針具有互補于在以上步驟(4)中連接的寡核苷酸或互補于其3′末端的1個或2個堿基的一部分識別序列的任意序列；和(6)對通過互補鏈合成而延伸的鏈進行電泳以檢測DNA片段的步驟；從而給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
22.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)用限制性酶消化雙鏈DNA的步驟；(4)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(3)的DNA片段在其3′末端引入的步驟；(5)用一套4個或16個標記的DNA探針進行互補鏈合成使所述標記的DNA探針延伸的步驟，標記的DNA探針具有互補于在以上步驟(4)中連接的寡核苷酸或互補于其3′末端的1個或2個堿基的一部分識別序列的任意序列；(6)捕獲經每個DNA探針的互補鏈合成延伸的DNA鏈的步驟；(7)將寡聚體引入通過互補鏈合成在其3′末端延伸的DNA鏈中的步驟；(8)用引入了寡聚體的DNA鏈作為模板進行步驟(5)和(6)步驟；和(9)根據(jù)長度，分級分離并檢測通過互補鏈合成延伸的DNA鏈的步驟；從而給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
23.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)用限制性酶消化雙鏈DNA的步驟；(4)將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與得自以上步驟(3)的DNA片段在其3′末端連接的步驟；(5)用一套4個或16個標記的DNA探針進行互補鏈合成使所述標記的DNA探針延伸的步驟，標記的DNA探針具有互補于在以上步驟(4)中連接的寡核苷酸(或寡聚體)或互補于其3′末端的1個或2個堿基的一部分識別序列的任意序列；(6)將每個標記的DNA探針通過互補鏈合成而延伸的DNA鏈之互補鏈分類和分離的步驟；(7)用不同于以上步驟(5)中所用的標記DNA探針的標記的DNA探針再次進行上述步驟(5)的步驟；和(8)依據(jù)長度，分級分離和檢測經互補鏈合成延伸的在以上步驟(7)中生成的DNA鏈；從而給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
24.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)根據(jù)每個DNA片段3′末端附近兩個堿基的差異將得自雙鏈DNA的DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(4)按照長度，用電泳法分級分離每組中所含的DNA片段或DNA片段的互補鏈；從而給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
25.一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)從組織樣品收集mRNA以制備mRNA-cDNA互補對的步驟；(2)從mRNA-cDNA互補對制備雙鏈DNA的步驟；(3)用限制性酶消化雙鏈DNA的步驟；(4)用標記的DNA探針辨別得自以上步驟(3)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并通過互補鏈合成延伸DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(5)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的標記的DNA探針長度的步驟；其中根據(jù)所測得的該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列的長度，分析或測定所述DNA以給出有關所述mRNA的種類和量的信息。
26.一種核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，包括用限制性酶消化DNA的第一反應容器；進行第二個反應的多個第二反應容器，第二個反應包括在多個第二反應容器的每一個中混合在其3′末端附近具有不同堿基序列的多個標記的DNA探針的任一個，其中將消化產物分級分離并裝入第二反應容器中；用標記的DNA探針辨別通過以上消化作用得到的DNA片段在其3′末端附近的堿基序列的差異；只有在末端序列配對時才通過互補鏈合成延伸標記的DNA探針，將DNA片段分級分離成幾組；和用于測量屬于各組的DNA片段長度的電泳裝置或，用經互補鏈合成延伸的標記的DNA探針作為樣品并測量該樣品的長度；由此得到所測量的DNA片段在其3′末端附近的每個堿基序列樣品的長度作為指紋。
27.一種核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，包括用限制性酶消化DNA并將脫氧核苷酸或含有脫氧核苷酸類似物的寡聚體與以上消化中得到的DNA片段在其3′末端引入的第一反應容器；進行第二個反應的多個第二反應容器，第二個反應包括在多個第二反應容器的每一個中混合一套4或16個標記的DNA探針的任一個，其中將消化產物分級分離并裝入第二反應容器中，標記的DNA探針具有互補于以上連接的寡核苷酸(或寡聚體)或互補于在其3′末端的1個或2個堿基的識別序列一部分的任意序列；和用于用所延伸的DNA鏈作為樣品測量經互補鏈合成延伸的DNA鏈長度的電泳裝置；從而得到每個標記的DNA探針樣品的長度作為指紋。
28.根據(jù)權利要求26或27的核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，其中一種長度(參比)標記物與所述樣品一起在所述電泳裝置的泳道上進行電泳并將電泳后的樣品片段分級分離和分類。
29.根據(jù)權利要求26或27的核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，其中所說的樣品和所說的參比標記物分別用熒光團進行標記，用熒光團的熒光波長區(qū)分所說的樣品和所說的參比標記物，所說的參比標記物與所說的樣品一起在所述電泳裝置的泳道上進行電泳并將電泳后的樣品片段分級分離和分類。
30.根據(jù)權利要求26的核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，其中將多個標記的DNA探針分別裝入多個所述第二反應容器中以同時進行第二個反應。
31.根據(jù)權利要求27的核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，其中至少將16個一套的標記的DNA探針分別裝入多個所述第二反應容器中以同時進行第二個反應。
32.一種核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，包括用于分離含有多個DNA片段以及參比標記物的樣品的裝置，其中將所述樣品分級分離并依據(jù)DNA片段的長度分類。
33.根據(jù)權利要求32的核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，其中所說的分離裝置是電泳裝置，所說的樣品和所說的參比標記物分別用熒光團進行標記，并用熒光團的熒光波長區(qū)分所說的樣品和所說的參比標記物。
34.一種核苷酸分析儀或核苷酸測定儀，包括多個反應容器和在控制溫度的條件下進行化學反應的一個化學反應容器，其中將至少一套16個標記的DNA探針分別裝入多個反應容器中，并使分別裝入多個反應容器中的每個DNA片段與標記的DNA探針同時反應。
全文摘要
一種分析或測定核苷酸的方法，該方法包括(1)用限制性酶消化DNA的步驟；(2)用DNA探針辨別得自以上步驟(1)的DNA片段在其3′末端附近的序列的差異并通過互補鏈合成延伸DNA探針而將DNA片段分級分離成幾組的步驟；和(3)測量屬于所述組的DNA片段長度或通過所述互補鏈延伸反應延伸的DNA探針長度的步驟；其中對于該DNA片段3′末端附近的每個堿基序列所測得的長度被用作指紋。
文檔編號C07H21/04GK1162743SQ9612178
公開日1997年10月22日 申請日期1996年11月29日 優(yōu)先權日1995年11月30日
發(fā)明者神原秀記, 岡野和宣, 植松千宗 申請人:株式會社日立制作所