專利名稱：一種有氨肽酶活性的酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表現出氨肽酶活性的酶，一種生產該酶的方法，含表現出氨肽酶活性的該酶的一種酶制劑，以及將該酶用于多種工業(yè)用途。
蛋白質水解產物被用于許多食品中。蛋白質水解產物傳統(tǒng)上是由酸水解所產生的，然而今天酶水解已被視為一種引人注意的替代方法。
蛋白質水解產物的主要問題之一是其嘗起來常常有苦味。當使用諸如大豆蛋白質或酪蛋白(它們都富含疏水L-氨基酸)作為蛋白質來源時，蛋白質水解產物就會具有苦味?？偟膩碚f，人們相信蛋白質是否具有苦味取決于L-氨基酸殘基的平均疏水性，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
大多數能表現出肽酶活性的酶都可實施對植物、酵母及/或動物蛋白質的酶水解，可引出用作食品添加物的具高營養(yǎng)值的蛋白質水解產物，如在湯類、醬油、肉汁、糊醬、豆腐、牛肉清湯、調味品、嬰兒食品、快餐、成品肉等產品中。
肽酶所有的肽酶或蛋白酶都是水解酶，它們作用于蛋白質或其部分水解產物而分解肽鍵。
歐洲專利427,385(日本研究與發(fā)展協會)披露了一種可編碼衍生自黃色霉菌(如米曲霉(Aspergillus oryzae))的堿性蛋白酶的染色體組基因。
日本專利0-2002374和0-2002375(Shokuhin)描述了衍生自米曲霉、可用于醫(yī)藥、食品和清潔劑之中的一種堿性蛋白酶。
SU-89177(Khark)討論了來自米曲霉的一種微生物蛋白酶，它也可用于食品、醫(yī)藥等。
日本專利5-4035283(Ajinomoto KK)披露了來自如米曲霉、可表現出內肽酶活性的多種酶制劑，它們可以將蛋白質幾乎完全水解。
WO 94/25580(Novo Nordisk A/S)描述了的一種水解植物或動物蛋白質的方法，是通過用衍生自米曲霉菌株的一種解蛋白酶制劑進行溫育而實施的。
氨肽酶肽酶(蛋白酶)的一個亞組叫做氨肽酶，根據國際生物化學和分子生物學聯合會(IUBMB)的推薦文件(1992)，被劃分在酶分類號碼E.C.3.4.11之下(氨肽酶)。
氨肽酶能夠從多肽中去除一個或多個氨基末端殘基。
日本專利7-5034631(Noda)披露了一種衍生自黃色霉菌(其中包括米曲霉)的亮氨酸氨肽酶。
日本專利7-4021798(Zaidan Hojin Noda Sangyo)描述了通過添加由培養(yǎng)多種霉菌(包括米曲霉菌株460和IAM 2616)而制備的亮氨酸氨肽酶II來生產味噌醬。
Van Heeke等人[生物化學和生物物理記述，(1992)，1131，337-340]描述了來自解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)的一種30kDa氨肽酶的克隆，該菌株保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏所，號碼ATCC No.15338。
米曲霉460被認為能生產多種亮氨酸氨肽酶。通過凝膠過濾，經計算可確定其中3種的分子量分別為26,500、56,000和61,000[Nakada等人，農業(yè)生物化學，(1972)，37(4)，757-765；Nakada等人，農業(yè)生物化學，(1972)，37(4)，767-774；Nakada等人，農業(yè)生物化學，(1972)，37(4)，775-782]。米曲霉460菌株保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏所，其為米曲霉(ATCC No.20386)。
蛋白質水解產物苦味的降低歐洲專利65,663和325,986(Miles公司)討論了利用含米曲霉衍生的蛋白酶的酶混合物對蛋白質進行酶水解。所得到的蛋白質水解產物味道溫和，無苦味。
日本專利4-7029577(Asahi電子-化學公司)探討了衍生自米曲霉的一種蛋白酶，其分解蛋白質時不產生任何苦成分。
現有技術披露了許多表現出肽酶、氨肽酶和其它酶活性的酶。所述的酶可衍生自多種微生物，包括真菌種類米曲霉。
一般來說，用于生產無苦味的蛋白質水解產物的產品包括肽酶和氨肽酶活性的混合物。
因此，極需要提供一種單成分酶(即基本上沒有任何副活性)，其只表現出用于減少食品中蛋白質水解產物的苦味的活性。


圖1顯示對來自米曲霉A01568 35 kDa氨肽酶生產用的轉化體上清液的SDS-PAGE分析結果。
本發(fā)明的目的是提供一種表現出活性的單成分酶，其尤其可用于制備改進性面包產品和生產食料中無苦味的蛋白質及/或蛋白質水解產物。
在分離可編碼表現出氨肽酶活性的DNA序列的方面，本發(fā)明人的成功是十分驚人的，其可優(yōu)先用于改進烘烤產品的味道、外皮色澤、面心結構和面團粘性。另外，所述新型酶可用于生產無苦味的蛋白質或蛋白質水解產物。
編碼所述氨肽酶的整體DNA序列使得制備單成分氨肽酶成為可能。
編碼本發(fā)明氨肽酶的整體DNA序列(如SEQ ID No.1所示)包含在一個質粒中，其被轉化到細菌菌株大腸桿菌DSM No.9965中。將在下面進行描述。
通過數據庫編排檢索，我們發(fā)現，如SEQ ID No.1所示的DNA序列是新的。我們發(fā)現，對于上述來自解蛋白弧菌(ATCC No.15338)的30kDa氨肽酶來說，相似性和同一性最高分別可達53％和2％。
本發(fā)明人對由分泌信號組成的氨肽酶前體形式和35 kDa氨肽酶進行了分析。經過計算，前體形式的分子量(Mw)達41kDa，估計等電點(pI)約為4.9。另外，氨肽酶的氨基酸組成估計如表1所示。表1非極性 No.百分比丙氨酸 37 9.79
纈氨酸 23 6.08亮氨酸 29 7.67異亮氨酸20 5.29脯氨酸 14 3.70甲硫氨酸3 0.79苯丙氨酸19 5.03色氨酸 2 0.53極性No.百分比甘氨酸 28 7.41絲氨酸 32 8.47蘇氨酸 25 6.61半胱氨酸4 1.06酪氨酸 13 3.44天冬酰胺11 2.91谷氨酰胺16 4.23酸性No.百分比天冬氨酸29 7.67谷氨酸 25 6.61堿性No.百分比賴氨酸 28 7.41精氨酸 9 2.38組氨酸 10 2.6535kDa酶的氨基酸序列的推論性完整前體形式 SEQ ID No.2所示。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種表現氨肽酶活性的酶，用SDS-PAGE法測得其表觀分子量(Mw)約為35kDa。
質譜法顯示，該重組氨肽酶的平均質量在33kDa-35kDa范圍內。測得該酶的等電點(pI)約為4.9。
等電點pI被定義為酶分子復合體(與金屬或其它離子選擇性相聯)為中性時即復合體上的靜電荷總量(凈電荷，NEC)等于0時的pH值。在這個量化過程中，必須考慮到靜電荷的正或負性。
在下列術語中，“35kDa氨肽酶”和“表現氨肽酶活性的酶”可交替用于本發(fā)明的單成分酶。
本發(fā)明表現氨肽酶活性的酶可衍生自多種微生物。本發(fā)明人已經從絲狀真菌米曲霉A01568中分離出了本發(fā)明的氨肽酶，其以米曲霉460(FERM-P No.1149，ATCC No.20386)被保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏所，進一步描述見美國專利No.3,914,436。
本發(fā)明的表現氨肽酶活性的酶至少包括分別如SEQ ID Nos.6，7，8，9和10所述的部分氨基酸序列之一。SEQ ID No.11是一種重疊和延伸N-末端序列的肽(5)。
第二方面，本發(fā)明涉及一種DNA構建體，其含有編碼所述氨肽酶的DNA序列，該DNA序列包括a)如SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶編碼部分，和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列，b)如a)定義所示DNA序列的類似物，其i)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列同源，或ii)與SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的相同寡核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽與由含如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的DNA序列所編碼的多肽同源，iv)編碼一種多肽，該多肽與由衍生自米曲霉A01568或得自大腸桿菌DSM 9965的SEQ ID No.1所示的DNA序列所編碼的純化氨肽酶所針對的抗體有免疫反應性，在本說明書中，如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的“類似物”意指編碼表現氨肽酶活性的酶的任何DNA序列，其至少具有屬性i)-iv)中的一種。
類似的DNA序列—可分離自能產生表現氨肽酶活性的酶的另一種或相關(如相同)的生物，這要根據SEQ ID Nos.3-5所示的任意DNA序列，例如可使用此處的方法；因此可以是含此處所示的DNA序列的DNA序列的等位或種類變異體，—依據如SEQ ID Nos.3-5所示的任何DNA序列進行構建，例如可通過引入核苷酸的置換，即不會發(fā)生該DNA序列所編碼氨肽酶的另外的氨基酸序列，但其需符合產生該酶的宿主生物的密碼子利用；或者可通過引入能發(fā)生不同氨基酸序列的核苷酸置換。然而，在后一情況中，氨基酸變化最好是微小性的，是對多肽折疊或活性無顯著影響的保守性氨基酸置換，是一般為1-30個氨基酸的小型缺失；小型氨基或羧基末端的延展，如氨基末端甲硫氨酸殘基，一個約達20-25個殘基的小型銜接性肽，可促進純化作用的小型延展，如聚組氨酸束，即抗原表位或連接區(qū)域。一般參見Ford等人，(1991)，蛋白質表達與純化2，95-107。保守性置換的實例限于堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小型氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)。
本領域技術人員顯然知道，這種置換可以在對分子功能十分關鍵的區(qū)域之外進行，而且仍舊導致一種活性酶。這些氨基酸對于由本發(fā)明DNA構建體所編碼的多肽活性是最基本的，因而最好不進行置換，它們可依據本技術領域熟知的程序進行鑒定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變[Cunningham和Wells，(1989)，科學244，1081-1085]。在后者中，在分子的每一個殘基處都引入了技術性突變，對所生成的突變分子進行生物活性檢測(即解氨肽特性)，以鑒定對于分子活性十分關鍵的氨基酸殘基。還可通過對晶體結構的分析來確定底物—酶相互作用的位點，例如可通過諸如核磁共振、結晶分析或光親和性標記等技術。例如可參見de Vos等人，(1992)，科學255，306-312；Smith等人，(1992)，分子生物學雜志，224，899-904；Wlodaver等人，(1992)，歐洲生物化學學會聯合會通訊，309，59-64。
可以理解，如SEQ ID Nos.3-5所示的DNA序列就是可用于分離編碼氨肽酶的整體DNA序列的序列，所述整體DNA序列例如是SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或轉化入保藏的菌種大腸桿菌DSM 9965中的DNA序列。術語“類似物”意指包括所述的完整DNA序列，其包含如SEQ ID Nos.3-5所示的一種或多種部分序列或其部分。氨基酸序列(從如SEQ ID No.1所示的DNA序列所推論)如SEQ ID No.2所示。
上述i)中所述的同源性可通過兩個序列間同一性程度(標志第一個序列由第二個序列衍生)來確定?？赏ㄟ^技術領域所熟知的計算機程序來適宜地確定該同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wuns ch，C.D.(1970)，分子生物學雜志，48，443-453]。使用GAP在下列條件下進行DNA序列的比較GAP創(chuàng)造罰值為5.0，GAP延展罰值為0.3，與如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質粒的DNA序列的編碼區(qū)域相比，DNA序列的編碼區(qū)域所表現出的同一性程度最好至少為70％，優(yōu)選至少為80％，尤其至少為90％。
上述ii)中所述的雜交意指，在某些特殊條件下類似的DNA序列與編碼氨肽酶的DNA序列的相同探針進行雜交，詳細描述見以下“材料與方法”章節(jié)。
一般而言，類似的DNA序列與DNA序列是高度同源的，例如同如SEQ IDNo.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質粒、編碼本發(fā)明中氨肽酶的DNA序列至少有60％的同源性，如與所述DNA序列比較至少為65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或甚至至少95％的同源性。
上述iii)中所述的同源性可通過兩個序列間同一性程度(標志第一個序列由第二個序列衍生)來確定?？赏ㄟ^技術領域所熟知的計算機程序來適宜地確定該同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物學雜志，48，443-453]。使用GAP在下列條件下進行DNA序列的比較GAP創(chuàng)造罰值為5.0，GAP延展罰值為0.3，與如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質粒的DNA序列的編碼區(qū)域相比，DNA序列的編碼區(qū)域所表現出的同一性程度最好至少為70％，優(yōu)選至少為80％，尤其至少為90％。
與上述特性iv)相聯系的術語“衍生自”不僅指由菌種A01568所產生的氨肽酶，而且指由分離自菌種A01568的DNA序列所編碼并在用該DNA序列轉化的宿主生物中產生的氨肽酶。可通過如以下“材料與方法”章節(jié)中所述的方法來確定免疫反應性。
本發(fā)明的進一個方面涉及攜帶本發(fā)明DNA構建體的表達載體，含該DNA構建體或表達載體的細胞，和表現氨肽酶活性的酶的生產方法，該方法包括在允許該酶生成的條件下培養(yǎng)所述細胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。
本發(fā)明還有一個目的是提供富含本發(fā)明35kDa氨肽酶的酶制劑。
另外，本發(fā)明提供了一種改進面包或面團的組合物，它含有本發(fā)明表現氨肽酶活性的酶。該組合物可以和其它酶組合，例如與解淀粉酶和常規(guī)性面包改進劑組合。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明35kDa氨肽酶的烘烤產品和冷凍面團的制備方法。
最后，本發(fā)明涉及對本發(fā)明35kDa氨肽酶的利用。本發(fā)明的酶或含這種酶的本發(fā)明組合物可用于改進烘烤產品的味道、外皮色澤和面心結構，以及改進冷凍面團的粘性。本發(fā)明的氨肽酶還可優(yōu)先用于生產無苦味的蛋白質和蛋白質水解產物，還可用于很多用途，包括含多種物質的蛋白質的降解或修飾；對接觸透鏡的清洗、制備食物和動物飼料等。
可通過通常方法來分離本發(fā)明中編碼表現氨肽酶活性的酶的DNA序列，包括—在適宜的載體中從米曲霉中克隆出DNA文庫，—用所述載體轉化適宜的酵母宿主細胞，—在適宜的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以表達由文庫中克隆所編碼的令人感興趣的任何酶，—通過測定該克隆所產生的酶的任何氨肽酶活性來篩選陽性克隆，—從該克隆中分離編碼酶的DNA。
通常方法進一步參見WO 93/11249，其內容附此作為參考。對篩選方法的更詳細描述見以下實施例3。
微生物來源例如，通過篩選供體生物的cDNA文庫和選擇表達適當酶活性(即由酶水解亮氨酸-7酰胺基-4-甲基香豆素的能力所定義的氨肽酶活性)的克隆，來分離出編碼本發(fā)明中氨肽酶的DNA序列。而后可通過標準程序從克隆中分離適當的DNA序列，例如在實施例1中所述。
供體生物可以是米曲霉(ATCC No.20386)的真菌，如美國專利No.3,914,436所述。
把編碼本發(fā)明中氨肽酶的完整全長DNA序列轉化入大腸桿菌菌株中，其包括在表達質粒pYES 2.0(Invitrogen)中。該菌種由本發(fā)明人根據有關“用于專利程序用途的國際微生物保藏認可的布達佩斯條約”保藏于theDeutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Branschweig，德國(DSM)。
保藏日期11.05.95保藏者文獻NN49001DSM名稱大腸桿菌DSM No.9965作為布達佩斯條約下的國際保藏機構，Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH根據上述條約的條例和規(guī)章來實施永久性的保藏，特別參見條例9。在本專利申請尚未授權期間，被美國專利及商標局的專員授權的人員，可以得到兩種保藏菌種，按照37 C.F.R.Par.1.14和35U.S.C.Par.122。另外，根據EPC的條例28，上述保藏菌種滿足了歐洲有關微生物專利申請的要求。
上述保藏菌種代表了所分離菌種基本純化的培養(yǎng)物。在某些國家中，按該外國專利法可得到保藏物，所述國家中本申請的對應申請或其派生申請已提交。不過，應該理解，得到所保藏的菌種并不是對實施本標題發(fā)明的許可，政府行為所授權的專利權并沒有廢止。
可通過標準方法從上述保藏菌種中分離出表現氨肽酶活性的酶的編碼DNA序列。
我們預期，編碼同源酶的DNA序列(即類似的DNA序列)可得自其它微生物。例如，可通過類似篩選另一種微生物的cDNA文庫來衍生出該DNA序列，特別是真菌，如曲霉屬的菌種，尤其是刺孢曲霉(A.aculeatus)或黑曲霉，木霉屬的菌種，尤其是T.reesei、綠色木霉(T.viride)、T.longibrachiatum或康寧木霉(T.koningii)，或鐮孢屬的菌種，尤其是尖鐮孢(F.oxysporum)，或腐殖霉屬的菌種。
另外，依據人們熟知的程序，通過根據此處披露的DNA序列所制備的合成性寡核苷酸探針，可以從適宜來源(例如上述任何生物)的DNA中方便地分離出編碼表現本發(fā)明氨肽酶活性的酶的DNA序列。比如，依據如SEQ IDNos.3-5所示的任何寡核苷酸序列或如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其任何適宜的亞序列，可制備出適宜的寡核苷酸針。
隨后可將該DNA序列插入重組表達載體中。其可以是能方便進行重組DNA程序處理的任何載體，而載體的選擇常常取決于其所要引入的宿主細胞。于是，該載體可以是自主復制載體，即作為染色體外實體而存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制(如質粒)。另外，該載體可以是這樣的載體，當引入宿主細胞中時，其可整合入宿主細胞基因組中并同其整合入的染色體一起進行復制。
在載體中，編碼氨肽酶的DNA序列可操作性連接到適宜的啟動子和終止子序列上。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中表現出轉錄活性的任意DNA序列，可以衍生自編碼蛋白質(對宿主細胞既可是同源的也可是異源的)的基因。用于將編碼氨肽酶的DNA序列、啟動子和終止子分別連接起來及將其插入適宜載體中的程序是本領域技術人員所熟知的[例如可參見Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，紐約]。
用編碼本發(fā)明中酶的DNA序列進行轉化的宿主細胞優(yōu)選為真核細胞，特別是真菌細胞，如酵母或絲狀真菌細胞。該細胞尤其可以是曲霉屬的菌種，最好為米曲霉或黑曲霉?？梢酝ㄟ^涉及原生質體形成及其轉化、隨后通過熟悉的方式進行細胞壁再生，這樣來進行真菌細胞的轉化。使用曲霉屬作為宿主微生物如歐洲專利238 023所述(Novo Nordisk A/S)，其內容附錄于此作參考。該宿主細胞也可以是酵母細胞，如酵母菌屬的菌種，特別是釀酒酵母、克魯弗酵母(S.kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)；裂殖酵母屬的菌種，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；漢遜酵母屬的菌種；畢赤酵母屬的菌種；Yarrowia的菌種，如Y.lipolytica；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌種，如乳酸克魯維酵母(K.lactis)。
生產本發(fā)明酶的方法本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的酶的生產方法，其中將用酶的DNA編碼序列所轉化的適宜的宿主細胞在準許酶生成的條件下進行培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)物中回收所生成的酶。
用于培養(yǎng)轉化過的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是任意適于所述宿主細胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的氨肽酶可方便地分泌入培養(yǎng)基中，并通過熟知的程序進行回收，其中包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，通過鹽法(如硫酸銨)、隨后通過色譜程序(如離子交換色譜、親合色譜等)沉淀出培養(yǎng)基中的蛋白質類成分。
酶制劑本發(fā)明還有一個方面涉及可用于降低食料中蛋白質及/或蛋白質水解產物苦味的酶制劑。
富集本發(fā)明酶的酶制劑例如可以是含有多種酶活性的酶制劑，例如含多種生成蛋白質水解產物之酶的酶制劑。富集的制劑可以是Flavourzyme(購自Novo Nordisk A/S)。Flavourzyme是一種衍生自米曲霉中的蛋白酶/肽酶復合體，開發(fā)來進行蛋白質的水解。
根據該酶制劑待應用的用途，本發(fā)明的氨肽酶可結合下述其它酶類。
在本說明書中，術語“富集”意指該酶制劑的氨肽酶活性已經增長了，例如富集因子至少為1.1，優(yōu)選在1.1及10之間，更優(yōu)選在2及8之間，特別是4及6之間，原因在于添加了通過上述方法所制備的本發(fā)明的酶。
另外，用表現出氨肽酶活性的酶所富集的酶制劑是這樣的制劑，其包括作為主要酶成分的本發(fā)明的酶，如單成分酶制劑。
可依據本技術領域熟知的方法來制備該酶制劑，形式可以是液體或是干制劑。例如，酶制劑的形式可以是顆?；蛭㈩w粒狀的?？梢罁炯夹g領域熟知的方法來穩(wěn)定包含在該制劑中的酶。
本發(fā)明的另一個方面涉及含有本發(fā)明氨肽酶的改進面包或面團的組合物。所述組合物可進一步含有選自解淀粉酶在內的酶類，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶和1，6-支鏈淀粉酶。
這類酶可購于Novo Nordisk A/S，如得自黑曲霉菌種的AMGTM(淀粉葡糖苷酶)，得自米曲霉菌種的FungamylTM(真菌淀粉酶)，得自嗜熱脂肪芽孢桿菌的NovamylTM(生麥淀粉酶)。
本發(fā)明的組合物還可含有一種或多種附加酶。這類酶的實例包括纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶(用于戊聚糖的部分水解，這能增加面團的延展性)、脂肪酶(用于改變面團或面團構成中存在的脂質以軟化面團)、過氧化物酶(用于改善面團的稠度)、氧化酶(如葡糖氧化酶)、漆酶、木聚糖酶、蛋白酶(用于面筋弱化，特別是當使用硬度小麥面粉時)。
其它酶組分優(yōu)選為微生物來源的，可通過上述使用的常規(guī)技術得到。
本發(fā)明中所使用的酶類可以是適宜的任何形式，例如干粉或顆粒形式(特別是無塵顆粒)、液體形式(特別是穩(wěn)定性液體)或被護性酶形式。可如US 4,106,991和US 4,661,452(均為Novo Industri A/S)所披露的來生成顆粒，用本技術領域所熟知的方法來有選擇地進行涂敷。例如，可依據既成方法，通過加入營養(yǎng)上可接受的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定酶制劑，如糖、糖醇或另外的多羥基化合物、乳酸或另外的有機酸?？梢罁W洲專利238,216所披露的方法來制備被護性酶。
一般來說，為了在預混物或面粉中進行添加，酶最好是干產品的形式，如無塵顆粒，而為了與液體一同添加，最好是液態(tài)形式的。
除此之外或作為其它酶組分的替代品，改善面團及/或面包的組合物可含有常規(guī)使用的烘烤劑，例如一種或多種下列組成奶粉(提供外皮色澤)、面筋(以改善弱度面粉中的氣體滯留)、乳化劑(以改善面團的延展性并在某種程度上改善做出的面包的稠度)、顆粒性脂肪(用于面團的軟化和面包的稠度)、氧化劑(添加以加強面筋的結構；如抗壞血酸、溴酸鉀、碘化鉀或過硫酸銨)、氨基酸(如半胱氨酸)、糖、鹽類(如氯化鈉、乙酸鈣、硫酸鈉或硫酸鈣，用來使面團更加堅固)、面粉或定粉。還可以依據本發(fā)明的方法將這些組分直接加入到面團之中。
適當的乳化劑實例有甘油一酯或甘油二酯、甘油一酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油一酯的乳酸酯、甘油一酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸鹽、磷脂和卵磷脂。
本發(fā)明的面包和/或面團改善組合物通常含在面團中，其含量0.01-5％，尤其是0.1-3％。
依據本發(fā)明的方法，其中將本發(fā)明具有氨肽酶活性的酶與上述其它酶類有選擇地組合起來，可用于面團和/或烘烤產品的制備，可將酶類原樣加入面團制備于其中的混合物或待制備面團用的任何組分(如面粉)中。另外，可將酶類作為上述面團和/或面包改善組合物的組分進行添加，既可以加入面粉中也可加入其它面團組分之中，或直接加入到制備面團用的混合物中。
在本發(fā)明方法中所使用的酶劑量應適用于所述面團的特性和組成以及所用酶類的特性。一般來說，酶制劑的添加量為每kg面粉中0.01-1000mg酶蛋白質，優(yōu)選為每kg面粉中0.1-100mg酶蛋白質，更優(yōu)選為每kg面粉中0.1-10mg酶蛋白質。
至于酶的活性，具有氨肽酶活性的已知單成分酶有選擇地同其它酶相組合使用，用于對面粉或烘烤產品的外皮色澤進行有益的改善，其適當的劑量取決于所涉及的酶和酶底物。最佳劑量依面粉或酵母類型和烘烤過程的不同而有所變化。有經驗的人士可根據本技術領域的方法來確定適宜的酶單位劑量。
然而，依據本發(fā)明，本發(fā)明表現出氨肽酶活性的酶的添加劑量為每kg面粉30-1000 LAPU，優(yōu)選為50-500 LAPU，尤其為80-300 LAPU，如約為100 LAPU。LAPU定義如下。
解淀粉酶的添加量一般為每kg面粉1-50 FAU。一個FAU(真菌α-淀粉酶單位)是指每小時分解5.26g淀粉所用的酶量(Merk，Amylumsolubile Erg.B.6，BAch 9947275)，使用的是Novo Nordisk標準方法來測定α-淀粉酶的活性。對Novo Nordisk分析方法(AF216)的詳細描述可索取得到。
生麥淀粉酶一般添加量為每kg面粉1-1000 MANU(生麥淀粉酶Novo單位)。一個MANU被定義為標準條件下，每分鐘水解i微摩爾麥芽三糖所用的酶量。該分析方法(AF 203)可索取得到。
當依據本發(fā)明的方法添加一種或多種附加的酶活性時，這些活性可以分別加入或者同具有外肽酶活性的燒烤組分酶一起加入，可選擇性作為本發(fā)明面包和/或面團改善組合物的組成。其它酶活性可以是上述任意的酶，可依據既成的烘烤做法來確定添加劑量。
如上所述，表現出氨肽酶活性的酶與上述其它酶選擇性組合使用，可添加至任何面團組分的混合物中，加入面團，或加入面團中所包括的任何組分中，換句話說，酶可以在面團制備的任意步驟加入，在適宜之處可分一步、兩步或多步進行添加。
對于擬議中的面團和/或烘烤產品來說，可通過任何適當的方法來實施對面團和/或烘烤物的處理，一般包括以下步驟揉捏面團，對面團進行一次或多次試驗處理，在適宜的條件下烘烤產品，即適宜的溫度和足夠的烘烤時間。例如，可通過常規(guī)的直接面團過程、酸面團過程、面團過夜方法、低溫和長期發(fā)酵方法、面團冷凍方法、Chorleywood面包過程或發(fā)面及面團過程來制備面團。
通過本發(fā)明方法所制備的面團和/或烘烤產品一般使用的是小麥粉或面粉，可有選擇地同其它類型的粉組合使用，如玉米粉、黑麥粉、燕麥粉、大豆粉、高粱粉或土豆粉。
在本說明書中，術語“烘烤產品”意指任何制備于面粉的產品，既可以是柔軟的也可以是松脆特性的。由本發(fā)明優(yōu)先制作的烘烤產品的實例可以是白色、淡色或深色類型的，包括面包(尤其是白色、全粉或黑麥面包)、典型形式為條形或卷形、法國小圓形面包、皮塔面包、油炸三明治、蛋糕、薄煎餅、餅干、松脆面包等等。
本發(fā)明的面團可以是上述任意類型的，可以是新鮮或冷凍的。
冷凍面團的制備如K.Kulp和K.Lorenz所述，見“冷凍和冷藏面團及稀面糊”。當使用本發(fā)明中的氨肽酶用于冷凍面包時，其味道、外皮色澤和松軟性都得到了改善。
如上所述，顯然，本發(fā)明中的面團一般是發(fā)酵的面團或要進行發(fā)酵處理的面團。可以以多種方式使面團發(fā)酵，例如加入小蘇打等或曲子(發(fā)酵的面團)，但優(yōu)選是通過加入適當的酵母培養(yǎng)物來發(fā)酵面團，如釀酒酵母培養(yǎng)物(即面包師傅所使用的酵母)。可以使用任何商用性釀酒酵母菌種。
如上所述，本發(fā)明還涉及一種預混物，形式例如可為面粉組合物，用于面團和/或由面團制備的烘烤產品，該預混物含有本發(fā)明表現氨肽酶活性的酶以及上述其它選擇性酶。可通過將相關的酶或含有酶的本發(fā)明面包和/或面團改進用組合物同適宜的載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)進行摻混來制備出預混物。該預混物可含有其它面團和/或面包改進用添加劑，如任意的添加劑，包括上述的酶。
對本發(fā)明35 kDa氨肽酶的利用利用本發(fā)明的酶來制備烘烤產品本發(fā)明中的酶或酶制劑可用于烘烤業(yè)，例如用來減弱面粉的面筋成分以獲得所謂硬麥面粉的軟化。
不過，我們驚奇地發(fā)現，本發(fā)明中的氨肽酶并不能降解面筋的網絡，而這是在將蛋白酶用于制備烘烤產品時所觀察到現象。于是，面團的特性和面心結構并沒有受到影響。
另外，當制備烘烤產品時在面團或面團成分中加入本發(fā)明的35 kDa氨肽酶，烘烤產品的味道、外皮色澤和/或面心結構和/或外皮色澤將得到顯著改善，如實施例13所示。
再者，本發(fā)明中的酶可改善面團的粘性。
添加本發(fā)明中的酶可使得烘烤產品具有酵母類型的味道，提供一種“新烘烤性”面包的香味。這使得本發(fā)明著重研究了發(fā)面團系統(tǒng)，其中添加酶可以減少發(fā)面團發(fā)酵的時間而無酵母味道降低的副作用，在速制面團法(大多數歐洲用的過程)中酶可以提供酵母味道，而一般以該過程制備的產品會缺少這種味道。
在不局限于任何理論的情況下，我們堅信，當具有外肽酶活性的單成分酶與解淀粉酶組合使用時，就可以進一步改善烘烤產品的味道和/或外皮色澤，尤其是與能夠從面粉或面團其它組成中釋放還原糖分子的解淀粉酶組合使用時。還原糖在面團中的數量增長可以增強烘烤過程中發(fā)生的Maillard反應，因此可進一步改善烘烤產品的味道和外皮色澤。
利用本發(fā)明的酶來降低苦味本發(fā)明的酶或酶制劑可用于降低食料中蛋白質和/或蛋白質水解產物的苦味。
依據本發(fā)明還可以推測在從蛋白質和/或蛋白質水解產物中產生出游離氨基酸。在這方面，谷氨酸可以提高食品的味道。
所述蛋白質或蛋白質水解產物可以是動物或植物來源的。
在本發(fā)明的實施方案中，所水解的蛋白質是酪蛋白或大豆蛋白。
蛋白質可用來生成如奶酪的食料和含可可的食料。
盡管用本發(fā)明的酶所富集的氨肽酶和酶制劑可與特別優(yōu)先用于生成無苦味的蛋白質或蛋白質水解產物，本發(fā)明的氨肽酶還可以用于多種的工業(yè)用途，包括降解或修飾含蛋白質的多種物質(如細胞壁)。諸如伸展蛋白的某些蛋白質是植物細胞壁的組成成分。因而氨肽酶可以促進植物細胞壁的降解或修飾。
可依據本技術領域熟知的方法來確定本發(fā)明的酶制劑劑量和使用該制劑的其它條件。
從植物中提取油依據本發(fā)明的酶制劑可以用來從植物源(如橄欖和油菜)中提取油，或者從不同的水果(如蘋果、梨和柑橘)中榨取汁液。它還可以用于酒行業(yè)來防止混濁的形成，特別是在白酒行業(yè)。再者，它還可用來修飾和降解蛋白質，例如用來降低蛋白質引起或部分引起的粘度，或者用來促進涉及蛋白質的發(fā)酵過程，或者用來改善蛋白質和其它營養(yǎng)物的可消化性。
在制備食品和飼料中的應用氨肽酶制劑還可以用于食品和飼料業(yè)中以改善蛋白質的可消化性。例如，可在動物飼料中加入該酶或酶制劑，或者用來處理動物飼料，尤其是小豬或家禽的飼料。
另外，本發(fā)明的酶或酶制劑可用于從諸如植物蛋白質(如大豆、豌豆、羽扇豆或油菜籽蛋白質)、乳(如酪蛋白)、肉類蛋白質或魚類蛋白質中制造蛋白質水解產物。氨肽酶可以用于蛋白質水解產物以改善溶解能力、稠度或發(fā)酵能力，用來降低抗原性或用于其它用途來制造食品、飼料或醫(yī)藥產品。氨肽酶可以單獨使用或司其它氨肽酶或其它酶類(如外肽酶)一起使用。將本發(fā)明的氨肽酶同富含外肽酶的酶一起使用可改善蛋白質水解產物的味道。
再者，該酶或酶制劑可用于魚或肉類的加工中，例如可用來改變組織結構和/或粘性。
在釀造過程中應用該酶制劑還可以用來促進發(fā)酵過程，譬如對大麥、麥芽和其它原材料的酵母發(fā)酵過程以制造諸如啤酒的產品。
用來制造原生質體該酶制劑可用來從真菌中制造原生質體。
用來生產肽該酶制劑可用來從蛋白質中生產肽，其優(yōu)勢在于它使用了基本不含其它解蛋白活性的克隆化酶。
用來降解蛋白質另外，該氨肽酶制劑可用來降解蛋白質以促進不同產品的純化或濃集，例如用來純化或濃集樹膠(如瓜耳膠、黃原膠)，用來進行絲的脫膠，或者改善絨毛的質量。
用來清洗接觸透鏡該酶或酶制劑還可用來清洗接觸透鏡。
本發(fā)明將在如下的實施例中進行詳細的描述，這些實施例絕不是限制本發(fā)明所要求的范圍。
方法和材料材料供體生物米曲霉A01568(如美國專利No.3,914,436所述)宿主生物大腸桿菌MC1061[Meissner等人，(1987)，美國自然科學學術匯編，84，4171-4176cDNA文庫菌種]
釀酒酵母W3124[van den Hazel等人，(1992)，歐洲生物化學雜志，207，277-283]活性篩選菌種粟酒裂殖酵母Broker等人，(1989)，歐洲生物化學學會聯合會通訊，248，105-110其它生物米曲霉A1560[Christensen等人，(1988)，生物/技術6，1419-1422]。
質粒pYES 2.0轉化載體(Invitrogen)pHD414曲霉表達載體是質粒p775的衍生物(如歐洲專利238,023所述)。pHD414的構建進一步描述于WO 93/11249中。pHD414含有黑曲霉葡糖淀粉酶終止子和米曲霉TAKA淀粉酶啟動子。
pHD423是帶有新的多接頭的pHD414的微生物(如WO 94/20611所述)。
pUC18表達載體[Sambrook等人，(1989)，分子克隆實驗室手冊，第2版；冷泉港實驗室，冷泉港，紐約]。
pC1EXP3含有編碼本發(fā)明35kDa氨肽酶的1.4kb cDNA插入子的質粒(見實施例3和SEQ ID No.1)。
pC1EXP4含有cDNA序列的質粒，其比pC1EXP3 1.4kb cDNA插入子短120bp(見實施例10和SEQ ID No.12)。
p3SR2冠構曲霉amdS+基因攜帶質粒[Christensen等人，(1988)，生物/技術，6，1419-1422]。
pP1酵母表達載體，其為含有ADH啟動子和URA 3(選擇性標記物)的大腸桿菌/粟酒裂殖酵母穿梭載體[Broker等人，(1989)，歐洲生物化學學會聯合會通訊，248，105-110]。
引物通用pUC引物[Sambrook等人，(1989)，如上]在PCR反應中所使用引物的推斷序列s25’-GAR ACI GTI CAR AAY CTI AT-3’s35’GAY AAR AAR AAY TTY GAW ACI GT-3’as15’TCI ACR TTR TCI GTI ATI ATY TCI AT-3’(s＝意義，as＝反義)A＝腺嘌呤G＝鳥嘌呤C＝胞嘧啶T＝胸腺嘧啶I＝脫氧肌苷Y＝C或TR＝A或GW＝A或T正向和反向pYES引物(Invitrogen)酶賴氨酸特異性蛋白酶Novozym234(Novo Nordisk A/S)Alcalase(Novo Nordisk A/S)Neutrase (Novo Nordisk A/S)35kDa氨肽酶的肽(見SEQ ID No.6-11)N-末端對真實和重組氨肽酶N-末端的直接序列測定表明，兩種酶具有相同的N-末端氨基酸序列，這表明對重組酶進行了與真實酶相同的解蛋白處理。Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa-Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-s2 ------>Lys-Ser-Leu-Asp-Lys-Lys-Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-s3------>(Xaa是糖基化的Asn殘基)通過用賴氨酰特異性蛋白酶進行裂解，從衍生自氨肽酶S-羧甲化樣品的肽中得到了下列肽序列。肽1Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa-Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-Lys肽2Gly-Val-Thr-Val-Glu-Pro-Phe-Lys肽3Val-Ile-Val-Asp-Ala-Tyr-Cys-Thr-Ile-Pro-Thr-Val-Asp-Ser-Lys肽4Gly-Thr-Thr-Asp-Ala-Gly-Lys-Pro-Glu-Ser-Ile-Glu-Ile-Ile-Thr-<-------as1Asp-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Leu-Thr-Lys肽5Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-Phe-Ser-Glu-Phe-His-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Lys(重疊和擴展N-末端序列)培養(yǎng)基和其它材料STC1.2 M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2BSA(Sigma，H25型)亮氨酸-7酰胺-4-甲基香豆素(Sigma)PEG 4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英國)SequenaseKit(美國生物化學公司)Hybond-N尼龍膜(Amersham，美國)Q-瓊脂糖(Pharmacia Tm)Superdex 200 TmAmicon膜VG Analytical Tofspecα-氰基-4-羥基肉桂酸(Aldrich，Steinheim，德國)YPD10g酵母膏，20g胨，加水至810ml。高壓滅菌，加入90ml20％的葡萄糖(無菌過濾)。
10x基礎鹽66.8g酵母氮堿。100g琥珀酸，60g NaOH，加水到1000ml，無菌過濾。
SC-URA90ml 10x基礎鹽，22.5ml的20％酪蛋白氨基酸，9ml 1％的色氨酸，加水至806ml，高壓滅菌，加入3.6ml 5％的蘇氨酸和90ml20％的葡萄糖或20％的半乳糖。
SC-H培養(yǎng)液7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿。11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l無維生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每100ml培養(yǎng)液中加入10ml 30％的半乳糖液，5ml 30％的葡萄糖液和0.4ml 5％的蘇氨酸液。
SC-H瓊脂7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿，11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l的無維生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸和20g/l瓊脂(Bacto)。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每450ml瓊脂中加入55ml 22％的半乳糖液，1.8ml 5％的蘇氨酸液。
YNB-1瓊脂3.3g/l的KH2PO4，16.7g/l的瓊脂，pH調至7。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每450ml瓊脂中加入25ml 13.6％的無氨基酸的酵母氮堿，25ml 40％的葡萄糖液，1.5ml 1％的L-亮氨酸液和1.5ml 1％的組氨酸液。
YNB-1培養(yǎng)液組成同YNB-1瓊脂一樣，但無瓊脂。
基本平皿[Cove生物化學及生物物理記述113(1996)51-56]含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺(作為氮源)和20mM的CsCl。
乳清蛋白質水解產物用Alcalase和Neutrase水解乳清，再用水稀釋，直到蛋白質的含量為整體溶液的8％(w/w)。
方法RNA分離通過用硫氰酸胍提取隨后通過5.7M CsCl墊[Chirgwin等人，(1979)，生物化學，18，5294-5299]進行超離心，從冷凍、粉狀的米曲霉A01568菌絲體中制備出整體RNA。通過寡(dT)-纖維素親和色譜方法來實施聚(A)+RNA[Aviv，H，和Leder P，(1972)，美國自然科學學術匯編，69，1408-1412]。
cDNA的合成從5μg米曲霉聚(A)RNA中合成雙鏈cDNA，如Kofod等人所述，生物化學雜志，(1994)，269，29182-29189，不同點在于在第一次鏈合成中加入25ng的隨機六核苷酸引物(Pharmacia，瑞典)。
cDNA文庫的構建進行cDNA文庫的構建，如Kofod等人所述，生物化學雜志，(1994)，269，29182-29189。
釀酒酵母的轉化為了確保所有的細菌克隆都能在酵母中得到檢測，將比源庫池中的細菌克隆數量高出5倍的酵母轉化體數目作為一種限制。
將來自各個庫池的1μl等分試樣的純化質粒DNA(100ng/μl)電穿孔(200Ω，1.5kV，24μF)至40μl的感受態(tài)釀酒酵母細胞中(在500ml YPD中OD600＝1.5，在冷蒸餾水中沖洗2次，在1M的冷山梨醇中沖洗1次，在0.5ml 1M的山梨醇中重懸浮，Becker和Guarante，1991)。添加1ml 1M的冷山梨醇之后，將80μl等分試樣涂敷在SC+葡萄糖-尿嘧啶的平皿上而達到250-400c.f.u./平皿，在30℃下溫育3-5天。
粟酒裂殖酵母的轉化對粟酒裂殖酵母進行轉化，如Broker(1987)所述，生物技術，5，51-517。
從米曲霉中提純35kDa氨肽酶將1g米曲霉A01568發(fā)酵上清液的冷凍、干燥粉末溶解于100ml的Tris-乙酸緩沖液中(25mM，pH8)。離子強度為2mSi。將懸浮液通過45μ微孔過濾器進行過濾。過濾后的溶液上200ml的陰離子交換色譜柱(填充有Q-瓊脂糖)，其用Tris-乙酸緩沖液進行過平衡。從流出液中收集堿性蛋白酶—即主要的內蛋白酶(等電點為8)。用Tris-乙酸緩沖液來沖洗色譜柱，直到流出液中再無紫外線吸附物質出現。
用線性鹽梯度來洗脫所束縛的蛋白質，即在Tris-乙酸緩沖液(pH為8)中使用0-0.5M的NaCl，10柱體積，流速為4ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性(見下)的級分，用Tris-乙酸緩沖液進行透析(25mM，pH為6)。
將透析后含有活性的庫池pH值調至6，離子強度至2mSi，上50ml的高性能Q-瓊脂糖柱(用25mM的Tris-乙酸緩沖液平衡，pH為8)進行陰離子交換色譜分析。沖洗該柱直到流出液中的紫外線吸附物質在280nm處低于0.05。用20柱體積的線性鹽梯度(從0-0.5M NaCl)來洗脫所束縛的活性，流速為2ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性的級分，用50mM-乙酸鈉緩沖液(pH為6)，超過濾進行濃縮。
將含有氨肽酶活性的2ml濃縮庫池上Superdex 200Tm柱，該柱用含0.1M的NaCl的50mM乙酸鈉緩沖液平衡(pH為6)。進行凝膠過濾，流速為0.5ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性的樣品，利用Amicon膜進行超過濾濃縮，截斷值為10kDa。
測定米曲霉氨肽酶的N-末端和內部肽的氨基酸序列用賴氨酰-特異性蛋白酶來消化純化的天然氨肽酶的S-羧甲基化樣品，通過反相高壓液體色譜法(HPLC)來分離所得到的肽，并如Matsudaria所示進行序列測定，見“用于微序列測定的蛋白質和肽提純的實用指南”，3-88，學術出版公司，圣迭哥，加利福尼亞，根據生產商說明書參見應用生物系統(tǒng)公司的473A序列測定儀(應用生物系統(tǒng)公司)。
用于氨基酸序列測定的試劑和溶劑均來自應用生物系統(tǒng)公司(Foster城，加利福尼亞)。
PCR引物的設計PCR引物的設計如Kofod等人所述，生物化學雜志，(1994)，269，29182-29189。
使用PCR進行的氨肽酶cDNA探針的產生
利用每份500pmol所設計的引物，配合500pmol pYES 2.0多接頭引物(正向和反向)、DNA熱循環(huán)器(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，對來自cDNA文庫池的1μg雙鏈質粒DNA進行PCR擴增。
實施30輪PCR反應，每輪在94℃下變性反應1分鐘，在55℃下退火2分鐘，在72℃下延伸3分鐘。
雙脫氧鏈終止法該方法實施如Sanger等人所述，(1977)，美國自然科學學術匯編，74，5463-5467，使用SequenaseKit和通用pUC引物。
利用Southern印跡分析來鑒定陽性cDNA克隆通過Southern印跡雜交來鑒定陽性克隆，使用的是0.5kb無規(guī)引物32P標記性PCR產物或作為探針的35 kDa氨肽酶。雜交實施的條件為2×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％(w/v)SDS， 100μg/ml變性鮭精DNA，時間48小時，溫度65℃，隨后嚴格沖洗，2×SSC(2×15分鐘)，2×SSC，0.5％SDS(30分鐘)，0.2×SSC，0.5％SDS(30分鐘)，最好2×SSC(15分鐘)，溫度65℃[Sambrook等人，(1989)，如上述]。
電泳在0.7％瓊脂糖凝膠(來自SeaKem，FMC)上進行電泳。
毛細管印跡法毛細管印跡法如Sambrook等人所述(1989，如上)，使用10×SSC轉移緩沖液。
對雜交克隆進行嚴格沖洗在2×SSC中實施2×15分鐘的沖洗，在0.1×SSC、0.5％SDS中實施2×30分鐘的沖洗，在2×SSC中實施15分鐘的沖洗，溫度65℃。
米曲霉的轉化米曲霉的轉化如Christensen等人所述，(1988)，生物技術6，1419-1422。
曲霉屬的氨肽酶表達盒構建使用標準程序從陽性大腸桿菌克隆中分離出質粒DNA，并通過限制性內切酶進行分析。利用適宜的限制性內切酶來剪切cDNA插入子，并連接到曲霉屬表達載體上。
米曲霉或黑曲霉的轉化(通用程序)將100ml YPD(Sherman等人，酵母遺傳學方法，冷泉港實驗室，1981)用米曲霉或黑曲霉的孢子接種，在37℃下震蕩溫育約2天。通過miracloth過濾來收獲菌絲體，用200ml 0.6M的MgSO4沖洗。將菌絲體懸浮在15ml1.2M的MgSO4·10mM NaH2PO4，pH＝5.8。將懸浮液在冰上冷卻，加入含120mg Novozym234的緩沖液1ml。5分鐘后，加入12mg/ml的BSA 1ml，在37℃下輕微攪拌，持續(xù)溫育1.5-2.5小時，直到在顯微鏡下檢測樣品可看到大量的原生質體。
將懸浮液通過miracloth進行過濾，把濾液轉移至無菌試管中，用5ml0.6M的山梨醇、100mM Tris-HCl、pH＝7.0重疊。在100g下離心15分鐘，從MgSO4墊的頂端收集原生質體。在原生質體懸浮液中加入2體積的STC，在1000g下將混合物離心5分鐘。將原生質體丸粒重懸浮在3ml的STC中并再次制成丸粒。重復這一過程。
最后將原生質體重懸浮在0.2-1ml的STC中。
將100μl的原生質體懸浮液和5-25μg的適宜DNA在10μl的STC中進行混合。將原生質體和p3SR2(一種攜帶冠構曲霉amdS基因的質粒)。把混合液在室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％的PEG 4000，10mM的CaCl2和10mM的Tris-HCl，pH7.5，仔細混合(兩次)，最后加入0.85ml的相同溶液并仔細混合。將混合液在室溫下放置25分鐘，在2500g下旋轉15分鐘，并在2ml 1.2M的山梨醇中重懸浮丸粒。再經過一次沉淀之后，將原生質體涂抹到適當的平皿上。把原生質體涂抹到基本平皿上以抑制背景的生長。在37℃下溫育4-7天之后挑選出孢子，涂抹為單菌落。重復該過程，在兩次重分離之后，將單菌落的孢子儲存為所定義的轉化體。
米曲霉轉化體的提純通過分生孢子在AmdS’-平皿(+0.01％Triton X-100)上并于30℃下在YPM中生長3天來提純米曲霉菌落。
對氨肽酶陽性米曲霉轉化體的鑒定在瓊脂平皿(重疊有60μg/ml的亮氨酸-7酰胺-4甲基香豆素)上對得自米曲霉轉化體的上清液進行氨肽酶的檢測。通過在30℃下溫育5分鐘-2小時后在紫外線熒光下分析平皿來鑒定陽性轉化體。
SDS-PAGE分析對來自米曲霉氨肽酶生產用轉化體的上清液進行SDS-PAGE分析。將該轉化體在5ml的YPM中生長3天。將10μl的上清液上12％的SDS聚丙烯酰胺凝膠，而后用考馬斯亮藍進行染色。
質譜分析在VG Analytical TofSpec中使用基質輔助性激光解吸電離飛行時間質譜法進行質譜分析。對質譜分析來說，將2μl的樣品同2μl飽和基質液
和2μl點在靶平皿上的混合物相混合。在引入質譜分析儀之前，蒸發(fā)去除溶劑。在閾值激光強度下通過4ns激光脈沖(337nm)來解吸和電離樣品，通過25kV的加速電壓而加速加入無場飛行試管中。通過設置在1850V下的微槽平皿對離子進行檢測。用已知質量的蛋白質從外部對光譜進行校準。
免疫交叉反應性通過使用純化氨肽酶來制備用于測定免疫交叉反應性的抗體。特別是通過使兔子(或其它嚙齒動物)免疫來培養(yǎng)出抗本發(fā)明氨肽酶的抗血清，依據的程序見N.Axelsen等人，定量免疫電泳手冊，Blackwell科學出版社，1973，第23章；或見A.Johnstone和R.Thorpe，實用免疫化學，Blackwell科學出版社，1982(尤其是27-31頁)。從該抗血清中可得到純化的免疫球蛋白，例如可通過鹽沉淀法[(NH4)2SO4]，而后進行滲析和離子交換色譜分析，如在DEAE-Sephadex上?？蛇M行蛋白質的免疫化學分析，既可通過Outcherlony雙擴散分析[O.Ouchterlony，見實驗免疫學手冊(D.M.Weir編輯)，Blackwell科學出版社，1967，655-706頁]，通過交叉免疫電泳法(N.Axelsen等人，如上，第3和第4章)，也可以通過火箭免疫電泳法(N.Axelsen等人，第2章)。
Southern印跡分析根據Yelton等人(1984)從米曲霉中分離出基因組DNA(美國自然科學學術匯編，81，1470-1474頁)，用BamHI、BglII、EcoRI和HindIII(10μg/樣品)進行完全消化，在0.7％的瓊脂糖凝膠上分級，利用10×SSC作為轉移緩沖液將其變性并印跡在尼龍濾膜(Hybond-N)上，見Southern，E.M.(1975)，分子生物學雜志，503-517頁。通過隨機引物法對氨肽酶cDNA進行32P標記(＞1×109cpm/μg)，并用作Southern分析中的探針。雜交和沖洗條件如RNA凝膠印跡分析中所述。將濾膜在-80℃下放射性自顯影12小時。
RNA凝膠印跡分析將來自米曲霉的聚(A)+RNA(1μg)上電泳(1.2％瓊脂糖-2.2M甲醛凝膠)，見Thomas，P.S.(1983)，酶學方法，100，255-2663頁，然后印跡在具10×SSC(作為轉移緩沖液)的尼龍膜(Nybond-N)中。通過隨機引物法對氨肽酶cDNA進行32P標記(＞1×109cpm/μg)，然后在65℃下在膜上雜交18-20小時，溶液為5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％SDS(w/v)和100μg/ml的變性鮭精DNA。沖洗濾膜，溶液為65℃下的5×SSC(2×15分鐘)，2×SSC，0.5％SDS(1×30分鐘)，0.2×SSC，0.5％SDS(1×30分鐘)及5×SSC(2×15分鐘)。將濾膜在-80℃下放射性自顯影12小時。
測定氨肽酶的活性(LAPU)將一個LAPU定義為每分鐘水解1μmol L-亮氨酸-p-硝基酰苯胺所用的酶量，方法如AF 298/1-GB所述(從Novo Nodisk A/S可索取得到)。
根據TMBS分析來確定％DH可通過水解作用達到的程度來測定蛋白質水解的程度。在本發(fā)明的說明書中，水解作用的程度(DH)可據如下公式所定義hDH＝------------------×100％htotalh是所水解的肽鍵的數目，htotal是蛋白質中肽鍵的總數。htotal取決于原材料的類型，而h可表示為meqv亮氨酸NH2的函數，例如可通過TNBS分析來量度。
％DH的確定如EF-9415317所述(可從Novo Nordisk A/S索取得到)。
對面團和面包的檢測依據本發(fā)明，可通過以下方法在面團和面包中檢測添加具有氨肽酶活性的單成分酶后的效果面包的制作程序1.面團的調制(螺旋調制器)700 RPM下3分鐘1400 RPM下5分鐘調制時間事先由有經驗的面包師根據所用面粉進行確定并調整，以便能在本檢測條件下達到最佳的面團稠度。
2.第一次實驗30℃-80％RH，15分鐘3.標度和定型；4.在周圍環(huán)境下擱置5分鐘；5.最終實驗32℃-80％RH，面包卷45分鐘，面包55分鐘；6.烘烤225℃，面包卷22分鐘，枕形面包30分鐘。
對面團和烘烤產品的評估如下對面團和烘烤產品進行評估枕形面包的比容使用傳統(tǒng)油菜籽方法來衡量4個枕形面包體積的平均值。按每g面包的體積ml來計算比容。將對照組(無酶)的比容定義為100。如下計算出相對比容指數4個枕形面包的比容比容指數＝--------------------------------------------*1004個對照枕形面包的比容可依據以下尺度從視覺上來評估面團粘性和面心結構面團粘性近乎液體1過于粘著2粘著3可接受 3.5正常4干燥5面心結構很差1
差 2非均勻 3均勻/良好 4優(yōu)秀5震動測試第二次實驗之后，將盛有面團的一個平鍋從20cm高度處扔下。將面團進行烘烤，確定所制作面包的體積。
酵母味道對照組 3略有改善 3.5改善 4面心色澤可從視覺上來確定面心色澤實施例實施例1 cDNA文庫的構建從米曲霉A01568中提取全部RNA。利用寡(dT)-纖維素親和色譜來分離聚(A)+RNA，并合成雙鏈cDNA(ds cDNA)。
將來自米曲霉A01568的cDNA文庫(由3.5×106個克隆組成)構建入酵母表達載體pYES 2.0中。
實施例2 cDNA克隆的擴增和特性分析如“材料和方法”章節(jié)中所述，從米曲霉A01568中提純氨肽酶。
用賴氨酰-特異性蛋白酶對S-羧甲基化純蛋白質進行消化，得到氨肽酶的1個長NH2-末端序列和4個內序列(包括肽1-5)。
根據這些序列合成出3個引物(分別是as1、s2和s3)。如“材料和方法”章節(jié)中所述，將雙鏈cDNA(ds cDNA)用作PCR擴增試驗中的模板。
對所生成PCR產物的分析揭示出帶有一引物對(引物s3和引物as1)的0.5kb片段。
將PCR片段亞克隆到Sma I酶切的脫磷酸化pUC18載體中，利用如“材料和方法”章節(jié)中所述的雙脫氧鏈終止方法從兩端來進行序列測定。
除了引物所編碼的殘基之外，由得自純化氨肽酶的肽2序列(與所推論的氨基酸序列線匹配)可以確定所需的cDNA種類已經被PCR特異性地擴增了。
實施例3對編碼來自米曲霉的氨肽酶的克隆之cDNA文庫的篩選通過上述菌落雜交篩選出來自米曲霉A01568的cDNA文庫的約10,000個菌落。其產生出帶有插入子(范圍650bp-1.5kb)的陽性克隆。
按上述“材料和方法”章節(jié)中所述，用Southern印跡分析法分析這些陽性克隆。
將來自氨肽酶cDNA克隆的純化質粒DNA(約1μg)用HindIII和XbaI進行完全消化，以從pYES載體中釋放出cDNA插入子。將樣品進行電泳分析，通過毛細管印跡方法將其轉移至Hybond-N尼龍膜。嚴格沖洗濾膜，可得到帶有插入子(范圍900bp-1700bp)的陽性克隆。
通過對帶有正向和反向pYES引物的cDNAs末端進行序列測定，可分析強烈雜交的克隆。
對序列數據的分析表明，其中一些克隆是截斷的cDNAs，而另外一些似乎是完整的克隆。所得到的完整克隆之一(pC1EXP3，如表1所述)的核苷酸序列和推論性氨基酸序列含有1.4kb的cDNA插入子。
實施例4 氨肽酶在米曲霉中的表達為了能在米曲霉中大量生成氨肽酶，將來自pC1EXP3克隆的cDNA插入子亞克隆到pHD423中，并同AmdS+質粒共轉化到米曲霉中，如上所述。
通過Hind III和Not I消化，從pYES2.0中分離出來自pC1EXP3的1.4kb的cDNA插入子，連接到Not I/Hind III裂解的pHD423載體上，然后轉化入大腸桿菌。
將所生成的轉化體提純兩次(如上)并如上述進行氨肽酶活性的檢測。轉化體pA3EXP3/1表現出可檢測到的氨肽酶活性。
實施例5 氨肽酶生成用轉化體(pA3EXP3/1)的表達水平利用非轉化性米曲霉A01560菌種作為負對照及米曲霉A01568菌種作為正對照，通過DSD-PAGE來半定量測定來自轉化體(pA3EXP3/1)的分泌性氨肽酶的數量和純度(表達水平)，參見表1。
在pA3EXP3/1中可以看到一個36-37kDa的多肽，但在負對照中沒有。重組氨肽酶的大小比天然氨肽酶(約35kDa的雙條帶)高出約2kDa，可能是由于附加的糖基化或其它類型的轉譯后修飾作用。
實施例6質譜法顯示，由于所測定的質量超過了由cDNA序列計算出的多肽質量32.4kDa，重組氨肽酶被糖基化了。
重組氨肽酶的平均質量為34.1kDa，其質量范圍為33kDa-35kDa。
通過SDS-PAGE(如“材料和方法”中所述)所測定的表觀分子量(Mw)約為35kDa。
實施例7 35kDa氨肽酶生成用轉化體的發(fā)酵米曲霉轉化體pA3EXP3/1在含有150ml DAP 2C(pH＝5.9)的1升搖瓶中生長3天，溫度30℃。
通過SDS-PAGE分析所估測的分泌性氨肽酶數量約為0.5g/l上清液。
實施例8 35kDa氨肽酶克隆在粟酒裂殖酵母中的表達通過電穿孔法將完整的35 kDa氨肽酶cDNA克隆pC1EXP3重轉化到粟酒裂殖酵母中。通過Spel和NotI消化從pYES 2.0載體中釋放出1.4kb的cDNA插入子，并亞克隆至Spel/NotI剪切性酵母表達載體pP1(一種含有ADH啟動子的大腸桿菌/粟酒裂殖酵母穿梭載體)上，而后檢測氨肽酶的活性。
結果表明，粟酒裂殖酵母轉化體具有很強的氨肽酶活性，這說明粟酒裂殖酵母能夠從米曲霉A01568中合成及分泌具功能活性的35kDa氨肽酶。實施例9氨肽酶基因的組織和表達通過Southern印跡雜交(如“材料和方法”章節(jié)所述)來確定米曲霉A01568基因組中氨肽酶基因的拷貝數。用BamHI、BalII、EcoRI或HindIII來完全消化從米曲霉中分離的完整DNA，并與氨肽酶cDNA進行雜交。氨肽酶探針只能在每一情況中檢測出單個強雜交片段(BamHI消化除外)，由于BamHI位點在核苷酸640處，因此可給出2個雜交片段。這意味著氨肽酶基因在米曲霉A01568基因組中是以單拷貝存在的。
實施例10為了研究35kDa氨肽酶基因的表達，對提取自米曲霉A01568菌絲體的聚(A)+RNA進行Northern印跡分析。用氨肽酶cDNA來探測RNA印跡揭示了mRNA的兩個種類，約1.45和1.55千堿基。這兩個mRNAs似乎并不代表兩個不同基因的轉錄物，因為當嚴格沖洗濾膜時會觀察到相同模式的雜交。兩個mRNAs大小的差異可能是由于3′-非翻譯區(qū)的不同長度，因為存在有兩個聚腺苷酸化位點，而依據分離自米曲霉cDNA文庫的兩個cDNA種類，一個對應著克隆pC1EXP3，而另一個則對應著pC1EXP4(其短120bp)。兩個mRNAs都能編碼同樣的氨肽酶。
實施例11 去除乳清蛋白質水解產物的苦味檢測米曲霉轉化體pA3EXP3/1的發(fā)酵培養(yǎng)液去除含8％(w/w)蛋白酶水解乳清蛋白質的溶液苦味的能力。
發(fā)酵培養(yǎng)液的氨肽酶活性為5.58LAPU/g。
在含100g 8％的蛋白質水解產物的燒瓶中檢測底物蛋白質溶液。加入表現出氨肽酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)液，直到根據5000 LAPU/g的產品(等于12.5LAPU/g蛋白質)進行計算，酶和底物(E/S)之間的關系為0.25％，而后在50℃下重新水解6小時，pH7.0。
(利用標準方法)分別在1分鐘和6小時之后來測定pH和滲析作用。使用TNSB方法(如上述)來測定％DH，使用標準方法來測定％FAA(％自由氨基酸)。
*通過氨肽酶對底物的水解所引起的DH增加。盲試DH為28％對去掉苦味的水解產物(含13％FFA)樣品分析其亮氨酸含量。我們發(fā)現亮氨酸組成約為2.7％，而盲試的亮氨酸為約0.3％。
實施例12 品嘗測試利用苦指數(BI)為0(不苦)和10(盲試)之間，通過5個人的品嘗小組來評估去苦味蛋白質水解產物的口味。
對屬于轉化體的苦味3.5％蛋白質水解產物(盲試)的樣品和相似樣品的苦味進行評估。
我們發(fā)現屬于轉化體的蛋白質水解產物樣品的苦指數(BI)范圍約為6.2。
這個結果表明，35kDa氨肽酶去除了蛋白質水解產物樣品的苦味。
實施例13 面包味道、面團粘性和面心結構將使用每kg面粉0-300 LAPU所制作的面包的味道、面團粘性和面心結構同使用商用產品Flavourzyme制作的面包進行比較。制作面包并如上述“材料和方法”章節(jié)中所述進行評估。
我們發(fā)現下列結果(兩重復的平均量)
從上表可以看出，當每kg面粉加入量為30-300 LAPU時，本發(fā)明的35 kDa氨肽酶以“新烘烤性”面包的形式顯著地改善了味道。本發(fā)明的氨肽酶對面心結構并無影響。與商用性蛋白酶/肽酶復合物Flavourzyme相比，面團的粘性得到了改善。
本領域技術人員從上述說明中顯然可以看出，在實施本發(fā)明而不背離其精神或其范圍的前提下可以進行許多變化和改進。因此，本發(fā)明的范圍要依據下列權利要求所定義的內容。
序列表(1)一般情況(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話+45 4444 8888(H)電傳+45 4449 3256(ii)發(fā)明標題一種有氨肽酶活性的酶(iii)序列數目12(iv)計算機可讀形式(A)媒介形式軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30B(EPO)(2)SEQ ID No.1(i)序列性質(A)長度1409個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(B)菌種米曲霉A01568(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置52..1183(xi)序列描述SEQ ID No.1CGAGCATTCC GTTCGTATCG ACTTGGTGGT ACACCTTTC GTTCTCTCAA G ATG CGT57Met Arg1TTC CTC CCC TGC ATC GCG ACT TTG GCA GCC ACG GCC TCT GCC CTT GCT105Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala Leu Ala5 10 15ATT GGA GAC CAT GTA CGC TCG GAC GAT CAG TAT GTC CTA GAA CTC GCC153Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu Leu Ala20 25 30CCG GGA CAA ACG AAA GTT GTG ACG GAA GCA GAG AAA TGG GCT CTG AGA201Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala Leu Arg35 40 45 50GCT GAG GGC AAG CGT TTC TTC GAT ATA ACC GAA CGG GCC AGT AGC CTG249Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser Ser Leu55 60 65GAA CTC GCA TCG AAC AAG AAA CAA AAG CTC GGG GTT ACC TAC CCC GAT297Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Leu Ala Val Thr Tyr Pro Asp70 75 80TCC GTG CAA CAC AAC GAG ACC GTG CAA AAT CTG ATC AAG TCG CTC GAC345Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser Leu Asp85 90 95AAA AAG AAC TTC GAA ACC CTT CTC CAG CCG TTC TCG GAG TTC CAC AAT393Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe His Asn100 105 110CGC TAT TAC AAG AGC GAC AAT GGC AAG AAA TCA TCC GAG TGG CTG CAA441Arg Tyr Tyr Lys Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp Leu Gln115 120 125 130GGC AAG ATT CAG GAA ATC ATC TCC GCC AGT GGA GCA AAG GGA GTC ACT489Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly Val Thr135 140 145GTG GAG CCT TTC AAA CAC TCC TTC CCG CAG TCG AGT CTG ATT GCG AAA537Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile Ala Lys150 155 160ATC CCC GGC AAG AGT GAC AAG ACC ATC GTG CTT GGA GCG CAT CAG GAC585Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His Gln Asp165 170 175TCC ATC AAC CTT GAT TCA CCC TCA GAG GGC CGT GCA CCG GGA GCT GAT633Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly Ala Asp180 185 190GAC GAT GGA TCC GGC GTT GTT ACC ATT CTC GAA GCC TTC CGC GTT CTC681Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg Val Leu195 200 205 210CTG ACG GAC GAG AAG GTC GCA GCC GGT GAG GCT CCG AAC ACC GTT TGA 729Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr Val Glu252 220 225TTC CAC TTC TAT GCC GGA GAG GGT GGT GGT CTG CTG GGA AGT CAG GAC 777Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser Gln Asp230 235 240ATC TTC GAG CAG TAC TCG CAG AAA AGC CGA GAC GTG AAA GCC ATG CTT 825Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala Met Leu245 250 255CAA CAG GAT ATG ACG GGT TAT ACT AAA GGC ACA ACC GAT GCT GGA AAG 873Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys260 265 270CCG GAG TCG ATC GGT ATC ATC ACT GAC AAT GTC GAT GAG AAC CTG ACC 921Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asp Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr275 280 285 290AAG TTC CTG AAG GTC ATT GTC GAT GCT TAT TGC ACT ATC CCG ACC GTC 969Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val295 300 305GAT TCG AAA TGC GGA TAC GGA TGC TCT GAC CAT GCT TCT GCC ACG AAG 1017Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Ala Thr Lys310 315 320TAT GGT TAT CCC GCC GCA TTC GGA TTC GAG TCA GCC TTT GGC GAC GAC 1065Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly Asp Asp325 330 335AGC CCT TAC ATT CAC TCG GCT GAT GAT ACG ATT GAG ACC GTC AAC TTT 1113Ser Pro Tyr Ile His Ser Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val Asn Phe340 345 350GAC CAT GTG CTG CAA CAC GGC AAA CTG ACT CTT GGA TTT GCA TAT GAG 1161Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Thr Leu Gly Phe Ala Try Glu355 360 365 370CTT GCC TTC GCA GAT TGG CTG T AAGGCTTATG ACGACGGTTG TATGAGCGAG 1213Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu375AGATCCAGTC CAACAGTGTG TATAATATGT GGGCCCGTGT TCAAATAGCA CTTTGATTTA1273GCCAGTGAGT AGCTTTGGTG GCGAAAATGG AGGCCGAATT CTAGGCAACA TCGAACTGGA1333GGCTGTCAGG GGCGCATCAC AAGAAGTTTT GAGCTACATA AGCGAGATAA AAGTCAGAAA1393AAAAAAAAAA AAAAAA1409(2)SEQ ID No.2的情況(i)序列性質(A)長度377個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID No.2Met Arg Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala1 5 10 15Leu Ala Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu20 25 30Leu Ala Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala35 40 45Leu Arg Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser50 55 60Ser Leu Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Leu Ala Val Thr Tyr65 70 75 80Pro Asp Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser85 90 95Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe100 105 110His Asn Arg Tyr Tyr Lys Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp115 120 125Leu Gln Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly130 125 140Val Thr Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile145 150 155 160Ala Lys Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His165 170 175Gln Asp Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly180 185 190Ala Asp Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg195 200 205Val Leu Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr210 215 220Val Glu Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser225 230 235 240Gln Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala245 250 255Mer Leu Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala260 265 270Gly Lys Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asp Asn Val Asp Glu Asn275 280 285Leu Thr Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro290 295 300Thr Val Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Ala305 310 315 320Thr Lys Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly325 330 335Asp Asp Ser Pro Tyr Ile His Ser Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val340 345 350Asn Phe Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Thr Leu Gly Phe Ala355 360 365Tyr Glu Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu370 375(2)SEQ ID No.3的情況(i)序列性質(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID No.3TCTACRTTRT CTGTTATTAT YTCTACT 26(2)SEQ ID No.4的情況(i)序列性質(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID No.4GARACTGTTC ARAAYCTTACT 20(2)SEQ ID No.5的情況(i)序列性質(A)長度23個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ lD No.5GAYAARAARA AYTTYGAWAC IGT 23(2)SEQ ID No.6的情況(i)序列性質(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID No.6Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.7的情況(i)序列性質(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ l D No.7Gly Val Thr Val Glu Pro Phe Lys1 5(2)SEQ ID No.8的情況(i)序列性質(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID No.8Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val Asp Ser Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.9的情況(i)序列性質(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID No.9Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ile Glu Ile Ile Thr Asp1 5 10 15Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr Lys20(2)SEQ ID No.10的情況(i)序列性質(A)長度29個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID No.10Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Teu Ile Lys1 5 10 15Ser Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro20 25(2)SEQ ID No.11的情況(i)序列性質(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID No.11Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe His Asn Arg Tyr Tyr Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.12的情況(i)序列性質(A)長度1272個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(B)菌種米曲霉A01568(xi)序列描述SEQ ID No.12CTCGAGCATT CCGTTCGTAT CGACTTGGTG GTACACGCTT TCGTTCTCTC AAGATGCGTT 60TCCTCCCCTG CATCGCGACT TTGGCAGCCA CGGCCTCTGC CCTTCCTATT GGAGACCATG120TACGCTCGGA CGATCAGTAT GTCCTAGAAC TCGCCCCGGG ACAAACGAAA GTTGTGACGG180AAGCAGAGAA ATGGGCTCTG AGAGCTGAGG GCAAGCGTTT CTTCGATATA ACCCAACGGG240CCAGTAGCCT GGAACTCGCA TGGAACAAGA AACAAAAGCT CGCGGTTACC TACCCCGATT300CCGTGCAACA CAACGAGACC GTGCAAAATC TGATCAAGTC GCTGGACAAA AAGAACTTCG360AAACCGTTCT CCAGCCGTTC TCGGAGTTCC ACAAGCGCTA TTACAAGAGC GACAATGGCA420AGAAATCATC CGAGTGGCTG CAAGGCAAGA TTCAGGAAAT CATCTCCGCC AGTGGAGCAA480AGGGAGTCAC TGTGGAGCCT TTCAAACACT CCTTCCCGCA GTCGAGTCTG ATTGCGAAAA540TCCCCGGCAA GAGTGACAAG ACCATCGTGC TTGGAGCGCA TCAGGACTCC ATCAACCTTG600ATTCACCCTC AGAGGGCCGT GCACCGGGAG CTGATGACGA TGGATCCGGC GTTGTTACCA660TTCTCGAAGC CTTCCGCGTT CTCCTGACGG ACGAGAAGGT CGCAGCCGGT GAGGCTCGGA720ACACCGTTGA GTTCCACTTC TATGCCGGAG AGGAGGGTGG TCTGCTGGGA AGTCAGGACA780TCTTCGAGCA GTACTCGCAG AAAAGCCGAG ACGTGAAAGC CATGCTTCAA CAGGATATGA840CGGGTTATAC TAAAGGCACA ACCGAGGCTG GAAAGCCGGA GTCGATCGGT ATCATCACTG900ACAATGTCGA TGAGAACCTG ACCAAGTTCC TGAAGGTCAT TGTCGATGCT TATTGCACTA960TCCCGACCGT CGATTCGAAA TGCGGATACG GATGCTCTGA CCATGCTTCT GCCACGAAGT1020ATGGTTATCC CGCCGCATTC GCATTCGAGT CAGCCTTTGG CGACGACAGC CCTTACATTC1080ACTCGGCTGA TGATACGATT GAGACCGTCA ACTTTGACCA TGTGCTGCAA CACGGCAAAC1140TGACTCTTGG ATTTGCATAT GAGCTTGCCT TCGCAGATTC GCTGTAAGGC TTATGACGAC1200GGTTGTATGA GCGAGAGATC CAGTCCAACA GTGTGTATAA TATGTGGGCC CGTGTTCAAA1260TAGCACTTAA AA1272INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCTRule 13bis)
權利要求
1.一種來自真菌微生物、表現氨肽酶活性的酶，該酶通過SDS-PAGE所測定的表觀分子量(Mw)為35kDa。
2.依據權利要求1的酶，估計其等電點(pI)范圍約為4.9。
3.依據權利要求1至2的酶，其中估計前體形式酶的分子量約為41kDa。
4.依據權利要求3的酶，其中前體形式酶包括一個分泌信號。
5.依據權利要求1-4中任何一項的酶，衍生自絲狀真菌或酵母。
6.依據權利要求5的酶，衍生自絲狀真菌，如曲霉屬，特別是米曲霉，尤其是米曲霉A01568，或木霉屬、青霉屬、鐮孢霉屬或腐殖霉屬。
7.依據權利要求1-6中任意一項的酶，該酶包括或歸入如SEQ ID No.6所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，如SEQ ID No.7所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.8所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.9所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.10所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物和/或如SEQ ID No.11所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物。
8.依據權利要求1-7中任意一項的酶，該酶包括或歸入如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或所述序列的類似物。
9.依據權利要求1-8中任意一項的酶，該酶與衍生自米曲霉A01568、如SEQ ID No.2所示的純化氨肽酶所針對的抗體有免疫反應性。
10.依據權利要求1-9中任意一項的酶，該酶含有范圍在35-45％的非極性氨基酸，優(yōu)選為37-41％，和/或范圍為30-40％的極性氨基酸，優(yōu)選為33-37％，和/或范圍在10-20％的酸性氨基酸，優(yōu)選為12-16％。
11.依據權利要求1-10中任意一項的酶，該酶含有范圍在7-17％的酸性氨基酸，優(yōu)選為10-14％。
12.含有編碼表現氨肽酶活性的酶的DNA序列的DNA構建體，該DNA序列包括a)如SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶編碼部分，和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列，b)如a)定義所示DNA序列的類似物，其i)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列同源，ii)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的相同寡核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽與由含如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的DNA序列所編碼的多肽同源，iv)編碼一種多肽，該多肽與衍生自米曲霉A01568和/或得自大腸桿菌DSM 9965的SEQ ID No.1所示的DNA序列所編碼的純化氨肽酶所針對的抗體有免疫反應性。
13.依據權利要求12的DNA構建體，含有如SEQ ID No.3所示的部分DNA序列，和/或如SEQ ID No.4所示的部分DNA序列，和/或如SEQ ID No.5所示的部分DNA序列。
14.依據權利要求12-13中任意一項的DNA構建體，其中DNA序列得自真菌微生物，如絲狀真菌或酵母。
15.依據權利要求14的DNA構建體，其中DNA序列得自曲霉屬菌株，如米曲霉，特別是來自保藏的米曲霉ATCC 20386，或木霉屬、青霉屬、鐮孢霉屬、腐殖霉屬或大腸桿菌DMS 9965。
16.依據權利要求30的DNA構建體，其中DNA序列分離自或依據米曲霉A01568的核酸文庫。
17.含有依據權利要求12-16中任意一項的DNA構建體的重組表達載體。
18.含有依據權利要求12-16的DNA構建體或依據權利要求17的重組表達載體的細胞。
19.依據權利要求18的細胞，其為真核細胞，特別是真菌細胞，如酵母細胞或絲狀真菌細胞。
20.依據權利要求19的細胞，其中細胞為曲霉屬的菌株，特別為米曲霉或黑曲霉菌株；酵母菌屬的菌株，特別是釀酒酵母、克魯弗酵母或葡萄汁酵母；裂殖酵母屬的菌株，如粟酒裂殖酵母；漢遜酵母屬的菌株；畢赤酵母屬的菌株；Yarrowia的菌株，如Yarrowia.lipolytica；或克魯維酵母屬的菌株，如乳酸克魯維酵母。
21.依據權利要求20的細胞，其中細胞屬于曲霉屬的菌株，特別是米曲霉或黑曲霉的菌株。
22.生產表現氨肽酶活性的酶的方法，該方法包括，在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)依據權利要求18-21中任何一項的細胞，培養(yǎng)條件使依據權利要求12-16中任意一項的DNA構建體或依據權利要求17的表達載體得以表達，并從培養(yǎng)物中回收酶。
23.用于降低食料中蛋白質或蛋白質水解產物苦味的一種酶制劑，該制劑用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶進行富集。
24.依據權利要求23的酶制劑，該制劑富集因子為1.1-10之間，優(yōu)選2-8之間，特別在4-6之間。
25.依據權利要求23和24的酶制劑，其另外含有至少一種其它酶活性，包括纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶、木聚糖酶、肽酶和內蛋白酶。
26.含有依據權利要求1-11中的任意一項的表現氨肽酶活性的酶的改進面包或面團的組合物。
27.依據權利要求26的改進面包或面團的組合物，其進一步含有解淀粉酶，選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶、1，6-支鏈淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。
28.依據權利要求26和27的改進面包或面團的組合物，其進一步含有另外的酶，如纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶和木聚糖酶。
29.依據權利要求26-28中任意一項的改進面包或面團的組合物，其進一步含有另外的面包或面團改進劑。
30.從面粉面團制備烘烤產品的方法，該方法包括，在面團制作過程中在面團或面團組分中添加依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶，并在適宜的條件下將所制作的面團進行烘烤。
31.依據權利要求30的從面粉面團制備烘烤產品的方法，該方法包括，在面團制作過程中在面團或面團組分中進一步添加解淀粉酶并在適宜的條件下將所制作的面團進行烘烤。
32.依據權利要求3 1的方法，其中解淀粉酶選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶、1，6-支鏈淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。
33.依據權利要求11-18中任意一項的方法，其中將其它酶如纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶加入到面團或面團組分中。
34.依據權利要求30-34中任意一項的方法，其中加入依據權利要求1-11中任意一項的酶，數量為每kg面粉30-1000 LAPU，優(yōu)選為50-500 LAPU，特別是80-300 LAPU，如約100 LAPU。
35.依據權利要求30-34中任意一項的方法，其中加入如權利要求26-29中任意一項所定義的改進面包或面團的組合物形式的酶。
36.制作冷凍面團的方法，該方法包括，在面團制作過程中在面團或面團組分中添加依據權利要求1-11中任一項的表現氨肽酶活性的酶并在適宜的條件下將所制作的面團進行冷凍。
37.依據權利要求36的方法，其中將解淀粉酶同依據權利要求1-11任一項的表現氨肽酶活性的酶一起加入。
38.依據權利要求36和37任意一項的方法，其中加入如權利要求26-29中任意一項所定義的改進面包或面團的組合物形式的酶。
39.通過如權利要求30-38中任意一項的方法制作的烘烤產品或面團。
40.含有依據權利要求1-11任一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求26-29中任一項的改進面包或面團的組合物的面團用預混物。
41.利用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求26-29中任意一項的組合物來改善烘烤產品的味道。
42.利用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求26-29中任意一項的組合物來改善烘烤產品的面團粘性。
43.利用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求26-29中任意一項的組合物來改善烘烤產品的面心結構。
44.利用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求26-29中任意一項的組合物來改善烘烤產品的外皮色澤。
45.將依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求23-25中任意一項的酶制劑用于食料的蛋白質或蛋白質水解產物。
46.依據權利要求45的應用，用于去除食料中蛋白質或蛋白質水解產物的苦味。
47.依據權利要求45和46的應用，其中待水解的蛋白質或蛋白質水解產物為動物來源的，如酪蛋白或乳清蛋白。
48.依據權利要求47的應用，其中食料為奶酪。
49.依據權利要求45和46的應用，其中待水解的蛋白質或蛋白質水解產物為植物來源的，如大豆蛋白。
50.依據權利要求49的應用，其中食料包括可可。
51.利用依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求23-25中任意一項的酶制劑清洗接觸透鏡。
52.將依據權利要求1-11中任意一項的表現氨肽酶活性的酶或如權利要求23-25中任意一項的酶制劑用于釀造。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表現氨肽酶活性、衍生自真菌微生物的35kDa的酶,一種含編碼該酶的DNA序列的DNA構建體,一種含該DNA構建體的重組表達載體以及一種含該DNA序列的細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供表現氨肽酶活性的該酶的生產方法,以及含該酶的酶制劑,含本發(fā)明氨肽酶的改善面包和面團的組合物。最后,本發(fā)明還涉及對表現氨肽酶活性的該酶、或其酶制劑及其組合物的利用。
文檔編號C07H21/04GK1178551SQ96192610
公開日1998年4月8日 申請日期1996年3月15日 優(yōu)先權日1995年3月16日
發(fā)明者S·卡比內, J·Q·司, T·斯彼德勒, C·達穆比瑪恩, T·哈勒吉爾, P·R·奧斯特加德 申請人:諾沃挪第克公司