專利名稱：有治療作用的二環(huán)異硫脲衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的化合物及它們的制備方法，也涉及含有該化合物的組合物和它們作為神經(jīng)保護(hù)劑的用途。
以前已描述過(guò)硫脲和異硫脲衍生物的各種治療用途。WO94/12165(Wellcome)敘述了簡(jiǎn)單的異硫脲衍生物尤其在系統(tǒng)低血壓，膿毒性休克和炎癥中的治療用途；WO95/09619(Wellcome)(在申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)日之后發(fā)表)描述了取代的脲和異硫脲衍生物在大腦局部缺血治療中的用途；英國(guó)專利1178242(Wellcome)公布了二異硫脲有抗炎活性；EP411615(Warner Lambert)公布了硫脲衍生物對(duì)智力低下綜合征有治療用途；EP392802(Beecham)公布了硫脲衍生物用于治療支氣管，腦血管或神經(jīng)元疾病。
異硫脲衍生物在胍衍生物的制備中也是所熟知的化學(xué)中間體〔參見(jiàn)美國(guó)專利4,211,867(McNeil研究所)和《合成》(Synthesis)(1988)6.460-466(Rasmussen)，它公開(kāi)了4-二甲氨基苯基脲基硫代酸甲酯和美國(guó)專利5,223,498(Boots)〕。
作為結(jié)核菌抑制劑用的N-烷氧苯基N′-喹啉基-硫脲衍生物公開(kāi)于DE-B-1157626(Hoechst)。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO95/05363(Fisons)(在申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)日后發(fā)表)公開(kāi)了特別是表明對(duì)神經(jīng)變性疾病有治療作用的N-苯基脒衍生物。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一組新的有用的異硫脲衍生物。
按本發(fā)明，它提供了式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽，
其中D代表C1-6烷基T代表由-(CH2)m-NXY取代的C3-5飽和或不飽和的亞烷基鏈；由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH；或-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-；U代表NH，O或CH2；a和b，兩者可以是相同或不同，代表0-3的整數(shù)，其中給定的a+b在1-3內(nèi)；X和Y，兩者可以相同或不同，每一個(gè)代表氫、C1-6烷基，或-(CH2)nQ基團(tuán)，或者NXY一起代表哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基或四氫異喹啉基；Q代表苯基或由選自C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、三氟甲基、鹵素、硝基和氰基中的一個(gè)或更多取代基所取代的苯基；m和n獨(dú)立地代表0～5的一個(gè)整數(shù)；我們優(yōu)選T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-。我們更優(yōu)選T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-和U代表CH2。我們特別優(yōu)選T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b，U代表CH2并且a和b每一個(gè)代表1。
我們優(yōu)選D代表C1-3烷基，具體是甲基或乙基，特別是乙基。
T代表-U-CH2)a-N(X)-(CH2)b-時(shí)，我們優(yōu)選X代表氫，甲基或-CH2Q基。
T代表由-(CH2)m-NXY取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈或代表由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH-時(shí)，盡管X和Y都代表-CH2Q基不是優(yōu)選的我們優(yōu)選X和Y獨(dú)立地代表氫、甲基或-CH2Q基。我們具體優(yōu)選X和Y中之一代表氫或甲基而另一代表-CH2Q基。
我們優(yōu)選n代表1我們優(yōu)選Q代表苯基或由選自C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、鹵素、硝基和氰基取代基所取代的苯基。我們具體優(yōu)選Q代表苯基或由C1-6烷基或鹵素取代的苯基。
按本發(fā)明，也提供了式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽的制備方法，該方法包括(a)通過(guò)其中X或X和Y之一或兩者都代表氫的相應(yīng)的式I化合物與式II化合物反應(yīng)制備其中X或X和Y至少一個(gè)代表C1-6烷基或-(CH2)nQ基的式I化合物R1-LII其中R1代表C1-6烷基或-(CH2)nQ基，并且L是離去基團(tuán)，或者，(b)通過(guò)其中T代表由-(CH2)m-L取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈或代表由-(CH2)m-L取代的-O-(CH2)2-NH-并且L代表離去基團(tuán)的相應(yīng)式I化合物與式III化合物反應(yīng)來(lái)制備T代表由-(CH2)m-NXY取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈或代表由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH-的式I化合物，XYNHIII其中X和Y如上定義，或者，(c)式IV化合物與式V化合物反應(yīng)
其中T如上定義D-LV其中D是如上定義的，并且L是離去基團(tuán)，并必要時(shí)或需要將反應(yīng)的最終化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌帉W(xué)上適用的鹽或反之亦然，如下所述在方法(a)和(b)中，反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，例如，于惰性溶劑中的兩種物質(zhì)在堿性條件下室溫反應(yīng)12小時(shí)。我們常常發(fā)現(xiàn)胺與其它化合物反應(yīng)前需要用NaH處理。適合的離去基團(tuán)L包括硫代烷基、磺酸、三氟甲磺酸、鹵化物、烷基和芳基醇，和甲基磺酰基；其它離去基團(tuán)在《高等有機(jī)化學(xué)》J.March(1985)第三版，McGraw-Hill于315頁(yè)(‘Advanced Organic Chemistry’，J.March(1985)3rd Edition，McGraw-Hill on page 315)中被列舉并且是本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的。我們優(yōu)選L代表鹵化物，尤其是溴化物。
方法(c)中相結(jié)合的兩個(gè)反應(yīng)物在惰性溶劑例如，丙酮中進(jìn)行反應(yīng)。合適的離去基團(tuán)L可代表包括硫代烷基、磺酸、三氟甲磺酸、鹵化物、烷基和芳基醇，和甲苯磺?；鶊F(tuán)；其它離去基團(tuán)在《高等有機(jī)化學(xué)》J.March(1985)第三版，McGraw-Hill于315頁(yè)(‘Advanced OrganicChemistry’，J.March(1985)3rd Edition，McGraw-Hill on page315)中被列舉并且是本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的。我們優(yōu)選使用碘化物，甲苯磺酸鹽或甲磺酸鹽衍生物。
式IV化合物按Rasmussen等在《合成》(Synthesis)(1988)456-459中的方法制備。式III化合物可通過(guò)式VI化合物與異硫氰酸苯甲酰酯反應(yīng)接著將生成的苯甲酰硫脲衍生物進(jìn)行水-堿裂解來(lái)制備，
其中T是如上所定義的。
式VI化合物可由相應(yīng)的式VII化合物的還原反應(yīng)制備，
其中T是如上定義的。
該還原反應(yīng)可以在多種條件下進(jìn)行，例如，在J.March《高等有機(jī)化學(xué)》(“Advanced Organic Chemistry”)第三版(1985)1103-1104頁(yè)中所描述的那些條件。它們中包括用Zn、Sn或Fe金屬，AlH3-AlCl3，硫化物其它物質(zhì)的催化氫化反應(yīng)。我們優(yōu)選通過(guò)1個(gè)大氣壓下的在鈀和碳催化劑存在下反應(yīng)一般為1-4小時(shí)，或直到反應(yīng)完成進(jìn)行的氫化反應(yīng)。
式VII化合物，其中T為上述定義的并且X或X和Y中至少一個(gè)代表C1-6烷基或-(CH2)nQ基團(tuán)，它可以通過(guò)X和/或Y代表氫的式VII化合物與式II化合物反應(yīng)制備。
該反應(yīng)可在方法(a)中所述的類似條件下進(jìn)行。
式VII化合物，其中T代表由-(CH2)m-NXY取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈或代表由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH-時(shí)，可通過(guò)其中T代表由-(CH2)m-L取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈或代表由-(CH2)m-L取代的-O-(CH2)2-NH-而L代表離去基團(tuán)的相應(yīng)化合物與式III化合物反應(yīng)制備。
該反應(yīng)可在上述方法(b)的類似反應(yīng)條件下進(jìn)行。
X代表氫的式VII化合物或是已知的或者可通過(guò)已知方法制備。例如，它們可通過(guò)非硝化的衍生物的硝化反應(yīng)制備。有關(guān)未硝化的芳香化合物或者單獨(dú)與硝酸或者與硝酸的水、醋酸、醋酸酐或硫酸溶液的硝化反應(yīng)很方便地發(fā)生。更詳細(xì)的反應(yīng)和更有選擇的試劑在J.March《高等有機(jī)化學(xué)》第三版(1985)468-470頁(yè)被列出。
式II、III和V化合物或者是已知的或者通過(guò)本身已知的常規(guī)方法制備。
可制備式I化合物本身，或制成其上述的酸加成鹽的形式。另外，它們也可制成非藥學(xué)上適用的加成鹽，例如草酸鹽，并且其任何產(chǎn)物經(jīng)便利的方法可以接著被轉(zhuǎn)變成藥學(xué)上適用的鹽。
式I化合物的鹽可通過(guò)游離酸、堿或其鹽與等當(dāng)量或多當(dāng)量的適當(dāng)?shù)膲A或酸反應(yīng)形成。反應(yīng)可在所生成的鹽不溶的溶劑或介質(zhì)中進(jìn)行或在鹽可溶的溶劑中進(jìn)行，例如水、二氧六環(huán)、乙醇、四氫呋喃或乙醚，或可在通過(guò)真空或冷凍干燥除去的混合溶劑中進(jìn)行。該反應(yīng)可以是復(fù)分解反應(yīng)過(guò)程或可在離子交換樹(shù)脂中進(jìn)行。
必要時(shí)，胺基或其它活潑基可使用由Greene和Wuts所著的《有機(jī)合成的保護(hù)基》(“Protecting groups in Organic Synthesis”)第二版(1991)中所述標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中的保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)?？商峒暗陌繁Ｗo(hù)基團(tuán)尤其包括C2-7烷氧羰基，例如叔丁基氧羰基，C8-13苯烷基氧羰基，例如芐基氧羰基。然而，通過(guò)室溫下在適合的溶劑(例如，二氯甲烷，甲醇)中使用三氟醋酸酐反應(yīng)進(jìn)行胺基的保護(hù)是優(yōu)選的。在水中水解可去保護(hù)。
本發(fā)明化合物和中間體可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從它們的反應(yīng)混合物中分離。
術(shù)語(yǔ)“C1-6烷基”包括含有1-6個(gè)碳原子的直鏈，支鏈的，飽和的，不飽和的脂肪的和環(huán)狀的烷基?！癈1-3烷基”可被相似地說(shuō)明。
式I化合物可存在對(duì)映異構(gòu)體。各種光學(xué)異構(gòu)體使用常規(guī)的技術(shù)，例如，分步結(jié)晶，或高效液相色譜，經(jīng)拆分化合物混旋體來(lái)分離。另外，每一個(gè)對(duì)映異構(gòu)體可通過(guò)反應(yīng)條件下將不發(fā)生消旋化的旋光活性的起始原料的反應(yīng)來(lái)制備。
中間體化合物也存在對(duì)映異構(gòu)體的形式，并且可使用純化的對(duì)映體，非對(duì)映異構(gòu)體，消旋體或混合物。
通式I化合物在動(dòng)物中具有藥理活性的用途。尤其，它們具有用于氮氧化物合酶抑制的活性，并預(yù)料將用于治療或預(yù)防人類的氮氧化物合成或超合成構(gòu)成促進(jìn)作用的疾病或癥狀，例如，缺氧，如在心博停止情況下的缺氧，中風(fēng)和新生兒的缺氧，神經(jīng)變性癥，包括神經(jīng)變性和/或神經(jīng)壞死癥如局部缺血，缺氧，低血糖，癲癇，和外傷(如脊柱索和頭損傷)，高壓氧驚厥和毒性，癡呆例如，早期老年性癡呆，Alzheimer氏疾病和與艾滋病有關(guān)的癡呆，小舞蹈病，震顫麻庳癥，杭廷頓舞蹈癥，肌萎縮性側(cè)索硬化，Korsakoff精神病，與腦血管疾病有關(guān)的癡愚，睡眠障礙，精神分裂癥，焦慮癥，抑郁癥，季節(jié)性影響的病癥，時(shí)差反應(yīng)，與經(jīng)前期綜合征(PMS)有關(guān)的抑郁癥或其它綜合癥，焦慮和膿毒性休克。式I化合物預(yù)計(jì)在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)對(duì)鴉片制劑和二氮雜類藥耐受性，治療藥物成癮性，降低疼痛和治療偏頭痛和其它血管性頭痛方面顯示活性。本發(fā)明化合物也顯示出有用的免疫抑制活性，用于治療或預(yù)防炎癥，治療胃腸能動(dòng)性病癥，和應(yīng)用于引產(chǎn)術(shù)。本化合物也可用于治療表達(dá)為氮氧化物合酶的癌。
預(yù)期式I化合物將主要用于神經(jīng)變性癥或偏頭痛的治療或預(yù)防，或用于對(duì)鴉片制劑和二氮雜類藥物耐受性的防治或逆轉(zhuǎn)，或用于藥物的成癮性的治療，并且特別用于神經(jīng)變性病癥的治療或預(yù)防。我們特別感興趣的癥狀選自缺氧，局部缺血，中風(fēng)和肌萎縮性側(cè)索硬化。
因此按本發(fā)明另一方面，我們提供了式I化合物或其藥學(xué)上適用的鹽作為藥物的用途。
按本發(fā)明另一特征，在關(guān)于治療或預(yù)防上述疾病或病癥的藥物制備中我們提供了式I化合物或其藥學(xué)上適用的鹽的用途，并且提供了治療或預(yù)防上述疾病或病癥的方法，該法包括將有效治療量的式I化合物，或其藥學(xué)上適用的鹽給予患有或易患該疾病或癥狀的人。
對(duì)于上述提到的治療的適應(yīng)癥，其給藥量自然將隨著所使用的化合物，給藥方式和治療的需要而改變。然而，一般情況，每天將該化合物以固體形式的日劑量在1～2000mg之間給予人體可獲得滿意的結(jié)果。
式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽，可以以其本身的形式使用，或者使用其適合于腸道或非腸道給藥的藥物制劑。
按本發(fā)明，它提供了藥物組合物，該組合物包括優(yōu)選少于80％和更優(yōu)選少于50％的式I化合物或其藥學(xué)上適用的鹽，與藥學(xué)上適用的稀釋劑或載體相混合。
我們也提供了該藥物制劑的制備方法，它包括將各成分進(jìn)行混合。
該稀釋劑和載體的實(shí)例是片劑和糖錠劑乳糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸；膠囊劑酒石酸或乳糖；注射液水、醇、甘油、植物油；栓劑；天然的或硬化油或臘。
適合于口服給藥的組合物，例如食管給藥包括片劑、膠囊劑和糖錠劑；緩釋組合物包括活性成分與離子交換樹(shù)脂相連接的那些組合物，該樹(shù)脂被任選用擴(kuò)散膜包衣以便改良樹(shù)脂的釋放性質(zhì)。
我們優(yōu)選該組合物中含有不多于50％并更優(yōu)選含不多于25％重量的式I化合物，或其藥學(xué)上適用的衍生物。
氮氧化物合酶有多種同功型存在，而式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽對(duì)氮氧化物合酶的抑制活性可通過(guò)依據(jù)Bredt和Snyder在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊)》(Proc，Natl.Acad.Sci)(1990)87，682-685。和Frstermann等《歐洲藥理學(xué)雜志》(Eur，J，Pharm.)(1992)225；161-165中如下所述的那些方法篩選。氮氧化物合酶將3H-L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?H-L-瓜氨酸，后者可通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離并通過(guò)閃爍記數(shù)定量。篩選A(A)關(guān)于神經(jīng)元的氮氧化物合酶抑制活性的篩選將酶從鼠的海馬或小腦中分離出來(lái)。將雄性Sprague-Dawley鼠(250～275g)用CO2麻醉并斷頭后取出其小腦或海馬。通過(guò)在50mM緩血胺酸-HCl和1mM EDTA緩沖溶液(pH7.2，25℃)中均化后在20,000g下離心15分鐘來(lái)制備小腦或海馬上清液。經(jīng)過(guò)AG-50W-X8鈉形式和氫形式的離子交換樹(shù)脂(Dowex AG-50W-X8 Sodiumform and hydrogen)柱層析成功地將殘余的L-精氨酸從上清液中除去，并進(jìn)一步在1000g離心30秒鐘。
為進(jìn)行試驗(yàn)，在22℃下將25μl最終上清液加到含25μl的L-精氨酸溶液(濃度18μM1H-L-精氨酸，96nM3H-L-精氨酸)和25μl的試驗(yàn)緩沖液〔50mM羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1mM依地酸(EDTA)，1.5mM二氯化鈣，pH7.4〕或者25μl的試驗(yàn)化合物的緩沖液的96孔濾板上96孔中的第一孔中。向每一試驗(yàn)管中加入25μl的完成試驗(yàn)的緩沖液(50mM HEPES，1mM EDTA，1.5mM CaCl2，1mM DTT，100μM NADPH，10μg/ml鈣調(diào)蛋白，pH7.4)以開(kāi)始反應(yīng)并在10分鐘后加入200μl的終止緩沖液(20mM HEPES，2mM EDTA，pH5.5)的漿液和200～400目的AG-500W-X8離子交換樹(shù)脂將反應(yīng)停止。
通過(guò)每一濾板過(guò)濾，將標(biāo)記的L-瓜氨酸從標(biāo)記的精氨酸中分離出，并將75μl的最終反應(yīng)液加到3ml的閃爍合劑中。然后，L-瓜氨酸通過(guò)閃爍記數(shù)定量。
在使用小腦上清液典型實(shí)驗(yàn)中，樣品的基本活性比活性為7000dpm/ml的空白試劑增加了20000dpm/ml。試驗(yàn)中用參考標(biāo)準(zhǔn)，N-硝基-L-精氨酸(在1μM濃度時(shí)給出了80％的氮氧化物合酶的抑制活性)試驗(yàn)以驗(yàn)證該方法。篩選B(B)關(guān)于可誘導(dǎo)的氮氧化物合酶抑制活性的篩選誘導(dǎo)后，酶從培養(yǎng)的人的結(jié)腸直腸腺泡癌細(xì)胞珠，DLD-1中制備(從歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本集中獲得)。DLD-1細(xì)胞在用10％胎牛血漿，4mML-谷氨酰胺和抗生素(100單位/毫升青霉素G，100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素B)和100μg/ml卡那霉素補(bǔ)給的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在含有37℃的35ml的培養(yǎng)基并含5％CO2的增濕氣氛的225cm3培養(yǎng)瓶中常規(guī)生長(zhǎng)。
通過(guò)細(xì)胞對(duì)約250U/ml 1型白細(xì)胞介素，1000U/ml γ-干擾素，200U/ml 6型白細(xì)胞介素，和200U/mlα-腫瘤壞死因子干擾蛋白作出反響而產(chǎn)生氮氧化物合酶。培養(yǎng)17-20小時(shí)后，通過(guò)將培養(yǎng)瓶表面的細(xì)胞珠刮到培養(yǎng)基中得到細(xì)胞。通過(guò)離心(1000g 10分鐘)收集細(xì)胞并加入含有50mM緩血胺酸-HCl(pH7.5于20℃)，10％(v/v)甘油，0.1％(v/v)三硝基甲苯-X-100，0.1μM二硫蘇糖醇(DTT)的細(xì)胞顆粒的溶液和含蛋白酶抑制劑的合劑，它包括亮肽素(2μg/ml)，大豆胰蛋白酶抑制劑(10μg/ml)，抑肽酶(5μg/ml)和苯甲磺酰氟(50μg/ml)來(lái)制備溶胞產(chǎn)物。
為進(jìn)行試驗(yàn)，將25μl底物合劑〔50mM緩血胺酸-HCl(pH7.5于20℃)，400μM、NADPH，20μM黃素腺嘌呤二核苷酸，20μM黃素核苷酸，4μM四氫生蝶呤，12μM L-精氨酸和0.025μCi L-[3H]精氨酸〕加到含25μl的試驗(yàn)化合物的50mM緩血胺酸-HCl溶液的96孔濾板(0.45μM孔徑)孔中。加入50μl的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(如上制備的)使反應(yīng)開(kāi)始并在室溫下保溫1小時(shí)，加入50μl的3mM硝基精氨酸水溶液和21mM EDTA使反應(yīng)終止。
用AG-50W離子交換樹(shù)脂把標(biāo)記的瓜氨酸與標(biāo)記的精氨酸分離。整個(gè)試驗(yàn)液被過(guò)濾到96孔板后，加入150μl的25％ 50W(Na+形式)的離子交換樹(shù)脂的水漿液。抽取70μl的濾液試樣后加到含有固體閃爍體的96孔板的板孔中。樣本干燥后通過(guò)閃爍記數(shù)定量L-瓜氨酸。
在典型試驗(yàn)中，在試劑的活性為每70μl 300dpm的對(duì)照試驗(yàn)下樣品的活性增加到1900dpm，用IC50(50％的抑制濃度)為10μM的氨基胍試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)以驗(yàn)證該方法。篩選C(C)對(duì)內(nèi)皮的氮氧化物合酶抑制活性的篩選通過(guò)Pollock等在(1991)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Pro.Nat，Acad，Sci.，)88，10480-10484中介紹的方法從人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中(HUVECs)可分離出酶。HUVECs購(gòu)自Clonetics公司(San Diego，CA，USA)并且培養(yǎng)到融合。細(xì)胞可被維持35～40代而沒(méi)有明顯損失氮氧化物合酶的產(chǎn)量。在細(xì)胞達(dá)到融合時(shí)，它們被重新懸浮在Dulbecco的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，在800rpm下離心10分鐘，將細(xì)胞丸均化在冰冷卻約50mM緩血胺酸-HCl，1mM EDTA，10％甘油，1mM苯甲磺酰氟，2μM亮肽素于pH4.2的混合液。在34,000rpm離心60分鐘后，將丸溶解在均化的也含20mM CHAPS的緩沖液中。在冰上培養(yǎng)30分鐘后，懸浮液在34,000rpm下離心30分鐘。所得上清液使用前被存放在-80℃下。
為進(jìn)行試驗(yàn)，在22℃下將25μl最終上清液加到含25μl的L-精氨酸溶液(濃度為12μM1H-L-精氨酸，64nM3H-L-精氨酸)和25μl的試驗(yàn)緩沖液(50mM HEPES，1mM EDTA，1.5mM CaCl2，pH7.4)或者和25μl試驗(yàn)化合物的緩沖液的96孔濾板中每一孔中。向每一孔中加入25μl的完成試驗(yàn)的緩沖液(50mM HEPES，1mM EDTA，1.5mM CaCl2，1mM DTT，100μM NADPH，10μg/ml鈣調(diào)蛋白，12μM四氫生喋呤，pH7.4)以開(kāi)始反應(yīng)，并且在30分鐘后加入200μl的50％終止緩沖液(20mM HEPES，2mM EDTA，pH5.5)和200-400目的AG-50W-X8離子交換樹(shù)脂的漿液以終止反應(yīng)。
通過(guò)過(guò)濾到另一個(gè)96孔板中，將標(biāo)記的L-瓜氨酸與標(biāo)記的L-精氨酸分離，并將75μl的終止的反應(yīng)液加到3ml的閃爍合劑中。然后通過(guò)閃爍記數(shù)來(lái)定量L-瓜氨酸。
在典型實(shí)驗(yàn)中，樣品的基本活性比活性為1500dpm/ml的空白試劑增加了5000dpm/ml。試驗(yàn)中使用N-硝基-L-精氨酸(在1μM的濃度時(shí)給出了70-90％的氮氧化物合酶的抑制活性)作為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)以驗(yàn)證該方法。化合物也可在離體的試驗(yàn)中進(jìn)行試驗(yàn)以測(cè)定其對(duì)腦穿透性的程度。篩選D(D)對(duì)神經(jīng)元的氮氧化物合酶抑制活性的離體試驗(yàn)按10mg/kg的劑量通過(guò)靜脈給雄性Sprague-Dawley鼠(250-275g)注入溶解在0.9％鹽水中的試驗(yàn)化合物，或者單用鹽水作為對(duì)照組。給藥后在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)(一般為2-24小時(shí))，將動(dòng)物處死，按在篩選A所描述的方法取出小腦并制備其上清液，對(duì)氮氧化物合酶的活性進(jìn)行試驗(yàn)。
作為進(jìn)一步證實(shí)性的試驗(yàn)，一部分小腦上清液加到2′，-5′-ADP瓊脂糖柱中(該柱結(jié)合氮氧化物合酶)，接著用NADPH洗脫。該洗脫液按篩選A的方法試驗(yàn)氮氧化物合酶的活性。
滲透到鼠腦中并抑制神經(jīng)元的氮氧化物合酶的化合物既降低了上清液制備物的氮氧化物合酶的活性也降低了2′-5′-ADP瓊脂糖柱洗脫液中氮氧化物合酶的活性。
在對(duì)氮氧化物合酶的抑制活性篩選中，化合物的活性以IC50表示(試驗(yàn)中給出50％酶抑制的藥物的濃度)。對(duì)于試驗(yàn)化合物的IC50值最初從1，10和100μM的化合物溶液的抑制活性估計(jì)。至少50％抑酶活性的10μM的化合物，使用更適合的濃度重新試驗(yàn)以便測(cè)定其IC50。
在上述的篩選A中(對(duì)神經(jīng)元的氮氧化物合酶同功型活性篩選)，在下述實(shí)例1的化合物的IC50小于10μM，這表明預(yù)期它會(huì)顯示出有用的治療活性。在篩選B和C中(對(duì)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮的氮氧化物合酶同功型活性篩選)實(shí)施例1所給的該化合物的IC50值比在篩選A中所獲得的IC50值高10倍表明具有所需的選擇性。在篩選A中也試驗(yàn)了實(shí)施例2的化合物并給出了小于10μM的IC50值。因此，該化合物預(yù)期也會(huì)顯示出有用的治療活性。
當(dāng)與以前本領(lǐng)域的化合物比較時(shí)，本式I化合物和其藥學(xué)上適用鹽具有的優(yōu)點(diǎn)是，可能的毒性小，更有效，作用時(shí)間更長(zhǎng)，具有廣譜活性，更高的效價(jià)，對(duì)神經(jīng)元的氮氧化物合酶同功型有更高選擇性，產(chǎn)生較少的副作用，更易吸收或有其它方面的有用藥理性質(zhì)。
本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例說(shuō)明，但決不是對(duì)本發(fā)明的限制實(shí)施例1N-(1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯(a)2-(7-氨基-1，2，3，4-四氫異喹啉)2，2，2-三氟乙酰胺在0℃，向7-硝基-1，2，3，4-四氫異喹啉4.21g(23.6mmol)和三乙胺3.6mL(926mmol)的100mL的二氯甲烷溶液中加入三氟醋酸酐3.5mL(25mmol)。反應(yīng)混合物被攪拌過(guò)夜。用稀鹽酸萃取該反應(yīng)混合物。水相被堿化后用二氯甲烷萃取。干燥的有機(jī)相(用硫酸鎂干燥)將給出N-(7-硝基-1，2，3，4-四氫異喹啉)三氟醋酰胺一種黃色固體。立刻將該化合物溶于200mL的乙醇中，加入0.5g 5％鈀碳，該反應(yīng)混合物在Parr氫化裝置上于45psi壓力氫化1.5小時(shí)。過(guò)濾除去催化劑后將溶劑蒸發(fā)。用100mL的石油醚研磨殘?jiān)玫揭环N灰色固體的標(biāo)題化合物5.45g(95％)，m.p.61-3℃(b)1，2，3，4-四氫異喹啉-7-硫脲在控制回流率下向異硫氰酸苯甲酰酯1.3mL(9.7mmol)的13mL的丙酮溶液回流中迅速加入2-(7-氨基-1，2，3，4-四氫異喹啉)三氟醋酰胺。加畢，將該反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)。在冷卻下收集固體，再用30mL的丙酮洗滌，得到灰白色的1-苯甲酰基-3-〔2-(2，2，2-三氟乙酰胺)1，2，3，4-四氫異喹啉-7-硫脲中間體1.74g(83％)。該化合物被立刻加到20mL的5％氫氧化鈉溶液中，將得到的溶液在80℃加熱1小時(shí)。當(dāng)冷卻到室溫時(shí)，該溶液被過(guò)濾得到標(biāo)題化合物0.78g(74％)，m.p.198～203℃(c)N-(1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯向1，2，3，4-四氫異喹啉-7-硫脲0.75g(3.61mmol)的異丙醇的10mL的懸浮溶液中加入甲磺酸0.35g(3.7mmol)的2mL的異丙醇溶液。該反應(yīng)混合物被攪拌0.25小時(shí)后 加入甲磺酸乙酯0.85mL(8.4mmol)再將反應(yīng)混合物加熱回流4小時(shí)。真空蒸去溶劑得到一種油狀物。將該油狀物溶在100mL水中。水相用飽和碳酸氫鈉堿化，用100mL的二氯甲烷萃取8次。合并的萃取液加硫酸鎂干燥 后濃縮得到放置時(shí)可固化的油狀物0.61g。在硅膠柱上用氨飽和的10％甲醇的氯仿溶液層析提供了白色固體狀標(biāo)題化合物0.45g(53％)，MS236(M+H)。實(shí)施例2N-5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)脲基硫代酸乙酯(a)2-((3-氯苯基)碳?；?氨基-5-硝基-2，3-二氫茚在0℃，向2-氨基-5-硝基2，3-二氫茚鹽酸鹽(1.5g，7.0mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入三乙胺(2.1mL，15.0mmol)，接著加入3-氯苯甲酰氯(1.0mL，7.5mmol)。該混合物被立刻傾入水中并分離水層。水層用二氯甲烷(2×20mL)萃取并將合并的萃取液用水洗，用MgSO4干燥。過(guò)濾，并濃縮成油狀物，該油狀物通過(guò)TLC單一化后立即用于下步反應(yīng)。M.S.(M+H)+＝317。(b)2-((3-氯苯基)甲基)氨基-5-硝基2，3-二氫茚向2-(( 3-氯苯基)碳酰)氨基-5-硝基2，3-二氫茚(2.2g，7.0mmol)的四氫呋喃(75ml)溶液中滴加BH3·THF(1.0M，35ml，35mmol)。將混合物回流12小時(shí)，冷卻至0℃，用4N HCl(60mL)淬滅，再回流1小時(shí)。所得溶液被蒸發(fā)成油狀物。用50％的NaOH堿化，并用二氯甲烷(3×20mL)萃取。合并的萃取液用水洗，用MgSO4干燥，過(guò)濾后濃縮成油狀物。用異丙醇/HCl處理得到2-((3-氯苯基)甲基)氨基-5-硝基2，3-二氫茚(2.1g，88％兩步)；m.p.234-237℃。(c)2-((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基-5-硝基2，3-二氫茚向2-((3-氯苯基)甲基)氨基-5-硝基2，3-二氫茚(4.4g，14.5mmol)的甲酸(5.5ml)的溶液中加入甲醛(12mL)。該混合物被加熱回流30分鐘，冷卻，用2N NaOH中和，并用乙酸乙酯(3×70mL)萃取。合并的萃取液用水洗，用MgSO4干燥，過(guò)濾，并濃縮成油狀物(4.2g，91％)；M.S.(M+H)+＝317。(d)2-((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基-5-氨基苯向2-((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基-5-硝基2，3-二氫茚(4.3g，13.6mmol)于85％AcOH/H2O(100ml)溶液中加入金屬鋅(7.1g，109.0mmol)。將混合物攪拌5分鐘，通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并將其蒸發(fā)成油狀物。將該油狀物倒入堿水中并用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。用水洗滌合并的萃取液，用MgSO4干燥，過(guò)濾，并濃縮成油狀物(3.6g，92％)；M.S.(M+H)+＝287(e)5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)-1-苯甲?；?2-硫脲。
向預(yù)先加熱到呈溫和回流狀態(tài)的異硫氰酸苯甲酰酯(2.7g，16.5mmol)的15mL無(wú)水丙酮溶液中，在控制回流速率情況下，快速加入2-((3-氯苯基)甲基(甲基)氨基)-5-氨基苯(3.6g，12.4mmol)溶于10mL無(wú)水丙酮的溶液。將反應(yīng)混合物回流30分鐘，在劇烈攪拌下傾入冰中，并用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并的萃取液用水洗，用MgSO4干燥，過(guò)濾，并濃縮成固體，該固體用異丙醇重結(jié)晶(3.12g，58％)；m.p.128～130℃。(f)5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)-2-硫脲在攪拌下將5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)-1-苯甲?；?2-硫脲(3.1g，7.12mmol)和2.5N氫氧化鈉水溶液40mL的混合物于90℃加熱35分鐘。在攪拌下將溫?zé)岬姆磻?yīng)混合物傾入60mL的水中。產(chǎn)物用二氯甲烷分三次萃取。用水洗滌合并的萃取液，用硫酸鎂干燥，濃縮至干。殘留物用硅膠柱層析(8∶1，乙酸乙酯/己烷)并濃縮成油狀物(2.2g，93％)；M.S.(M+H)+＝246。(g)N-5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)脲基硫代酸乙酯將5-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)-2-硫脲(2.2g，6.33mmol)懸浮于20ml的乙醇中。并將該混合物用0.41ml的甲磺酸，和1.35ml的甲磺酸乙酯處理。將該混合物回流4小時(shí)，蒸發(fā)，用飽和碳酸氫鹽堿化，再用二氯甲烷(3×30ml)萃取。水洗合并的萃取液，用MgSO4干燥，過(guò)濾，并濃縮成油狀物，將該油狀物溶于乙酸乙酯，用異丙醇/HCl處理。濾出固體后用異丙醇洗滌(2.40g，83％)；m.p，分解點(diǎn)＞150℃。實(shí)施例3N-(2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯二鹽酸鹽(a)7-硝基-2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽將7-硝基異喹啉4.00g(18.7mmol)在甲酸10ml和38％的甲醛17ml中的溶液加熱回流1小時(shí)。將該反應(yīng)混合物冷卻，傾入冰中，并用氨水堿化。將所沉淀的膠質(zhì)殘留物用二氯甲烷萃取兩次。干燥(用MgSO4)有機(jī)相，再濃縮得到稠油狀的粗品7-硝基-2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉。該油狀物被立即溶于乙醇(50ml)后加入鹽酸乙醇溶液直到該溶液對(duì)石蕊呈酸性。加入乙醚產(chǎn)生沉淀并收集固體得到黃色固體狀的標(biāo)題化合物3.99g(93％)，m.p.236-8℃(分解點(diǎn))。(b)7-氨基-2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽7-硝基-2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽3.98g(17.5mmol)和10％的鈀-碳0.4g于200ml的乙醇懸浮液在50psi氫化2小時(shí)。濾出催化劑后用少量水洗滌。將濾液濃縮變?yōu)樗芤?。加入無(wú)水乙醇后，蒸發(fā)帶除過(guò)量水直到生成固體為止。將該固體溶于熱乙醇(60ml)并慢慢加入乙醚來(lái)析出結(jié)晶。收集固體得到灰白色固體狀的標(biāo)題化合物3.38g(97％)，m.p.114-9℃。(c)2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-硫脲7-氨基-2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽3.88g(19.5mmol)于100ml水中的溶液用碳酸鉀溶液堿化后再用二氯甲烷萃取兩次。將干燥(用硫酸鎂)的有機(jī)相濃縮，結(jié)果得到油狀的游離堿3.13g(99％)。將該油狀物溶于丙酮(75ml)并加入三氟醋酸2.21g(19.4mmol)于100ml的丙酮中的溶液。將溶液加熱回流，同時(shí)，滴加異硫氰酸芐酯5.2ml(39mmol)。將反應(yīng)混合物加熱1小時(shí)后冷至室溫。真空除去溶劑，并將所得油狀物溶于甲醇(150ml)和2.5M氫氧化鈉(50ml)中，該溶液被加熱到65℃ 1小時(shí)后冷至室溫。真空中蒸去甲醇后將剩下的水溶液冷卻去沉淀出產(chǎn)品。收集固體產(chǎn)物得到淡黃色標(biāo)題化合物固體2.22g，m.p，184-6℃，二次處理也得到標(biāo)題化合物(0.79g，總產(chǎn)率69％)。(d)N-(2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯二鹽酸鹽向2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-硫脲0.88g(4.0mmol)的8ml異丙醇懸浮液中加入甲磺酸0.39g(3.9mmol)。由于鹽和游離堿都不溶于異丙醇該溶液被加熱回流0.5小時(shí)來(lái)保證甲磺酸鹽的生成。向該溶液加入甲磺酸乙酯1.5ml(14mmol)后繼續(xù)加熱過(guò)夜得到清澈溶液。真空除去溶劑后將得到的油狀物溶于水中，用碳酸鉀堿化后再用二氯甲烷萃取兩次。將干燥(用MgSO4)的有機(jī)相濃縮成油狀物。該油狀物溶于乙醇后用鹽酸乙醇溶液酸化直到對(duì)石蕊顯酸性。加入乙醚后該鹽以粘稠油狀物析出。溶劑被傾出后，用乙醚將該油洗數(shù)次。該油溶于水(250ml)后其溶液用脫色碳處理。將該溶液過(guò)濾后，濾液用500ml水稀釋。所得溶液被冰凍干燥得到標(biāo)題化合物的一水合物1.06g(78％)。MS(CI)250(M+H)；NMR(DMSO/D2O)7.33(d，1H)，7.21(d，1H)，7.17(s，1H)，4.36(寬s，2H)，3.0-3.6(m，6H)，3.17(s，3H)，1.30(t，3H)。實(shí)施例4N-(2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸甲酯二鹽酸鹽向2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)硫脲(實(shí)施例3，步驟(c))1.00g的10ml異丙醇懸浮液中加入甲磺酸0.44g(4.5mmol)。由于其鹽和游離堿都不溶于異丙醇，因此為確保該甲磺酸鹽的形成將上述溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。向該溶液中加入碘代甲烷6.7g(47mmol)后將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。真空除去溶劑后將殘留物溶于水中，用脫色碳脫色和過(guò)濾后得到一種澄清的、無(wú)色的水溶液。該水溶液被碳酸鉀堿化后再用二氯甲烷萃取兩次。合并有機(jī)相，干燥(用MgSO4)，并真空濃縮得到游離堿形式的產(chǎn)物1.02g(96％)。將該油狀物溶于乙醇后，加入鹽酸的乙醇溶液使其呈酸性。加入過(guò)量的乙醚使鹽以油狀物形式分離出。溶劑被傾出后用乙醚將該油狀物洗滌數(shù)次。再將油狀物溶于250ml的水中并再次用脫色碳處理。該溶液過(guò)濾后用水500ml稀釋。冷凍干燥此溶液得到白色的標(biāo)題化合物固體。MS(CI)236(M+H)。NMR(DMSO/D2O)11.6～11.9(寬，1H)，9.4-9.7(寬，1H)，7.36(d，1H)，7.24(d，1H)，7.18(s，1H)，4.2-4.6(寬，m，2H)，3.0-3.7(寬，m，4H)，2.87(s，3H)，2.70(s，3H)。
權(quán)利要求
1.式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽，
其中D代表C1-6烷基T代表由-(CH2)m-NXY取代的飽和或不飽和的C3-5的亞烷基鏈；由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH；或-U-((H2)a-N(X)-(CH2)b-；U代表NH，O或CH2；a和b兩者可相同或不同，代表0-3的整數(shù)，其中給定的a+b在13內(nèi)；X和Y，兩者可以相同或不同，每一個(gè)代表氫、C1-6烷基，或-(CH2)nQ基團(tuán)，或NXY一起代表哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基或四氫異喹啉基；Q代表由C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、鹵素、硝基或氰基任選取代的苯基；m和n獨(dú)立地代表0～5中的一個(gè)整數(shù)
2.按權(quán)利要求1的式1化合物，其中T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-。
3.按權(quán)利要求1或2的式I化合物，其中T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-和U代表CH2。
4.按權(quán)利要求1-3的式I化合物，其中T代表-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-，U代表CH2并且a和b每一個(gè)代表1。
5.按權(quán)利要求1-4的式I化合物，其中D代表乙基。
6.按權(quán)利要求1的式1化合物，其中它們是N-(1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯；N-6-(2-(((3-氯苯基)甲基)(甲基)氨基)茚滿基)脲基硫代酸乙酯；N-(2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸乙酯；N-(2-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉-7-基)脲基硫代酸甲酯；或它們中任何一種藥學(xué)上適用的鹽。
7.按權(quán)利要求1-6的任何一種權(quán)利要求的化合物作為藥物的應(yīng)用。
8.一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求1-6的任何一種權(quán)利所要求的化合物與藥學(xué)上適用的稀釋劑或載體混合。
9.權(quán)利要求1-6中的任何一種權(quán)利所要求的化合物在治療或預(yù)防神經(jīng)變性病癥，或?qū)τ陬A(yù)防或逆轉(zhuǎn)鴉片制劑和二氮雜類藥物的耐藥性或?qū)λ幬锍砂a性治療的藥物制備中的用途。
10.權(quán)利要求1-6的任何一種權(quán)利要求所定義的式I化合物和其藥學(xué)上適用的鹽的制備方法，該方法包括(a)其中X或X和Y之一或兩者都代表氫的相應(yīng)的式I化合物與式II化合物反應(yīng)制備其中X或X和Y至少一個(gè)代表C1-6烷基或代表-(CH2)nQ基的式I化合物R1-LII其中R1代表C1-6烷基或-(CH2)nQ基并且L是離去基團(tuán)；或(b)其中T代表由-(CH2)m-L取代的C3-5飽和或不飽和的亞烷基鏈，或代表由-(CH2)m-L取代的-O-(CH2)2-NH-并且L是離去基團(tuán)的式I化合物與式III化合物反應(yīng)來(lái)制備其中T代表由-(CH2)m-NXY取代的C3-5飽和的或不飽和的亞烷基鏈，或代表由-(CH2)m-NXY取代的-O-(CH2)2-NH的式I化合物XYNHIII其中X和Y如權(quán)利要求1所定義的；或(c)式IV化合物與式V化合物反應(yīng)
其中T如權(quán)利要求1所定義的，D-LV其中D為如權(quán)利要求1所定義并且L是離去基團(tuán)，并且在必要的時(shí)候或需要可將反應(yīng)的最終化合物變?yōu)槠渌帉W(xué)上適用的鹽或反之亦然。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的式(Ⅰ)化合物及其制備方法,提供了含有它們的組合物和它們的治療用途。預(yù)計(jì)式(Ⅰ)化合物特別是在治療神經(jīng)變性病癥方面有用。其中D代表C
文檔編號(hào)C07D271/04GK1181070SQ9619312
公開(kāi)日1998年5月6日 申請(qǐng)日期1996年2月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月11日
發(fā)明者J·E·馬克多那爾德 申請(qǐng)人:阿斯特拉公司