專利名稱：植物病原抗性基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物的病原抗性，更具體地說，涉及病原抗性基因的鑒定和應用。本發(fā)明是建立在對擬南芥RPP5基因克隆的基礎之上。
植物總是處于潛在病原微生物的攻擊之中。而農作物植物又特別脆弱，因為它們通常作為遺傳均一的單種栽培體被培育生長；一旦受到疾病侵襲，損失可能是嚴重的。但是，大多數植物對大多數植物病原是有抗性的。為了保護自身，植物已逐漸形成了一系列預先存在的和可誘導的防御系統(tǒng)。病原體，特別是那些通過與活植物細胞的緊密關聯而得到營養(yǎng)的活體營養(yǎng)性病原體。必須專門設法克服宿主的防御機制。如果病原體能夠引起疾病，那么該相互作用被稱為是相容的，但是如果植物是抗性的，那么該相互作用被稱為是不相容的。品種特異性抗性與過敏性反應(HR)有非常密切的關系，這是一種誘導性反應，(推測)借助這種反應，植物通過在病原體企圖侵入的位置使局部細胞死亡來遏制活的宿主細胞中的病原體。
很久以前就已知道，HR-相關的疾病抗性常常是(雖然不是絕對地)由顯性基因(R基因)決定的。Flor曾表明，當病原體突變成能克服這種R基因時，這些突變是隱性的。Flor得出結論，為了使R基因發(fā)揮功能，必須在病原體內也存在被稱為無毒性基因(Avr基因)的相應基因。為了變成有毒性的，病原體必須因而停止制造激活R基因依賴性防御機制的產物(Flor，1971)。一種通常被稱為誘體/受體模型的，被廣泛接受的實用假設是，只要病原體攜帶有相應的Avr基因，R基因則可編碼使植物能夠察覺該病原體存在的產物(Gabriel和Rolfe，1990)。然后，這種識別被轉化成對防御反應的激活作用。
某些相互作用顯示出不同的遺傳特性。表達毒素(Hc毒素)的炭色長蠕孢(Helminthosporium carbonum)能感染缺乏Hm1抗性基因的玉米品系。失去Hc毒素表達的突變是隱性的，并與毒性喪失有關，這與基因對基因的相互作用相反，其中成為有毒性的突變是隱性的。1992年報導了一個顯著的成就，通過標記分離了Hm1基因(Johal和Briggs，1992)。關于基因對基因的相互作用是如何從毒素依賴性毒性演化而來的論據，仍然是似是而非的。例如，其產物是毒素的靶的植物基因，可能突變成使植物對該毒素具有更高的敏感性，導致HR，并且使敏感性基因轉變成抗性基因。但是，這似乎不是Hm1的作用方式，它的基因產物能使Hc毒素失活。
對于病原體無毒性基因的認識仍然很貧乏。幾種細菌的Avr基因編碼與其它類型蛋白質沒有同源性的親水性蛋白質，而另一些基因帶有重復單位，其數目可以變更，從而改變它們在其中能表現無毒性的植物的范圍(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。為了使細菌的Avr基因誘導HR，需要其它細菌基因(hrp基因)，其病原性也需要其它細菌基因(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。還不清楚為什么病原體要制造使植物能夠察覺它們的產物。普遍相信，某些易棄去的Avr基因雖然有助于其病原性，但不是必需的，而其它一些Avr基因很少是非必需的(Keen，1992，Long等，1993)。對兩種真菌無毒性基因的特征鑒定也有報導，暗黃枝孢(Cladosporium fulvum)如Avr9基因使試圖攻擊攜帶Cf-9基因的蕃茄變種的暗黃枝孢無毒性，該Avr9基因編碼一種分泌性富半胱氨酸的多肽，其最后加工后的大小為28個氨基酸，但對其在相容性相互作用中的功能尚不清楚(De Wit，1992)。暗黃枝孢的Avr4基因編碼一種加工后最后大小為106個氨基酸的分泌性多肽(Joosten等，1994)。
近年來，主要是基于遺傳學準則的基因分離技術已取得了顯著的進展，目前許多研究工作者正試圖克隆各種R基因。
基于蕃茄Pto基因克隆的圖譜已被報導，該基因能使蕃茄具有對丁香假單胞菌蕃茄致病變種的“基因對基因”抗性。(Martin等，1993)。對YAC(酵母人工染色體)克隆的鑒定表明，它攜帶有非常緊密地連接于該基因的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記。此YAC可用于分離同源性cDNA克隆。將兩個這種cDNA與一個強啟動子融合，在用于轉化疾病敏感性蕃茄變種之后，其中的一個融合基因表現出能使此種蕃茄對攜帶有相應無毒性基因AvrPto的Pst菌株具有抗性。這兩個cDNAs顯示有相互同源性。的確，用Pto cDNA探針揭示了一個至少有6個成員的小基因家族，其中的5個可以在從中分離出Pto的YAC上找到，因此它確實含有這種根據對其它R基因座的遺傳學分析推測的局部多基因家族。
對于簡單的誘體/受體模型的支持者來說，Pto基因的cDNA序列是令人費解的。它顯示出與其在信號轉導中的作用相符的，與絲氨酸/蘇氨酸激酶的明顯同源性。令人感興趣的是，在芥屬植物(Brassicas)中，存在著對與自身不相容性有關的激酶的強同源性，它們行使類似的功能，其中需要它們阻止基因型確定的不相容花粉管的生長。但是，與芥屬植物SRK激酶不同(Stein等，1991)Pto基因似乎只編碼激酶催化功能區(qū)和可能促進與膜關聯的潛在性N-末端十四酰化位點。如果這樣一種基因產物僅僅在察覺出入侵微生物內的AvrPto基因時，就能夠單獨起作用來完成啟動防御反應所需要的特異性識別作用，那將是令人驚奇的。目前對于由攜帶有AvrPto的Pst菌株所制造的種特異性誘體分子仍無了解，在查明Pto基因產物可能識別這種分子之前，需要對其特征進行鑒定。
自從分離出Pto基因之后，又分離出了若干種其它的抗性基因。Whitham等(1994)報導了從煙草中分離煙草花葉病抗性基因N的工作。Lawrence等(1995)報導了從亞麻中分離亞麻銹病抗性基因L6的工作。還有分離出了兩個有丁香假單胞菌抗性的擬南芥基因的報導。Bent等(1994)和Mindrinors等(1994)報導了對RPS2的分離，Grant等(1995)報導了對RPM1的分離。這些基因可能編碼攜帶有核苷酸結合位點(NBS)和富亮氨酸重復單位(LRR)的細胞質蛋白質。對于與之相互作用的配體尚未進行特性鑒定，并且還不了解為了完成防御反應，它們將與何種植物蛋白質相互作用。我們自己的實驗室已報導分離出賦予對真菌暗黃枝孢抗性的蕃茄Cf-9基因。這已在WO95/18230中公開，并且由Jones等(1994)報導了。我們還克隆了可賦予對暗黃枝孢的抗性的蕃茄Cf-2基因，這在我們1996年4月1日提交的國際專利申請中已經公開，該專利要求1995年3月31日提交的GB9506658.5的優(yōu)先權，并已被Dixon等(1996)報導。它的結構類似于Cf-9基因，據其DNA序列，預測它主要是編碼一種細胞外蛋白質，這種蛋白質具有很多富亮氨酸的重復單位，并且推測攜帶有一個C端膜錨形體。最近還克隆了水稻的Xa22基因(Song等，1995)。預測這種基因的蛋白質產物將顯示具有如下結構一個推測是細胞外的，主要由類似于Cf-9和Cf-2編碼的富亮氨酸的重復單位組成的N-端結構域，一個預測的跨膜結構域，以及一個推測是細胞質內的，與特別是由Pto編碼的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶非常相似的結構域。
本發(fā)明的主要內容是關于“病原抗性基因”或“疾病抗性基因”及其應用。病原抗性基因(R)使植物能察覺表達相應無毒性基因(Avr)的病原體的存在。當察覺出病原體時，則激活防御反應如過敏反應(HR)。借助于這種方式，植物可能通過在病原體企圖侵入的位置使局部細胞死亡來遏制活細胞的病原體。其它的基因，(例如)包括WO93/11241中的PGIP基因，是在由R基因察覺病原體而引起的植物防御反應中被誘導產生的。
設想病原抗性基因可能編碼一種受體來針對病原體產生的Avr依賴性分子。按這種方式，它可能與植物的RADAR連接，用于發(fā)覺病原體。一旦發(fā)覺病原體，植物將建立防御機制，與之有關的基因不是病原抗性基因。在植物中，病原抗性基因的表達引起該植物中防御反應的激活。雖然已有報導認為，可能是在誘體不存在下，抗性基因的過度表達導致了激活作用，但是，這種激活可能是通過植物與病原體或相應的誘體分子接觸而引起的。防御反應可以在局部被激活，例如在植物與病原體或誘體分子接觸的位置，或者也可以在整個植物體中激活。在表達病原抗性基因的植物中，防御反應的激活可能是由于植物與適當的相應誘體分子接觸而引起的。在病原體如寄生霜霉的抽提物中可能含有誘體，可完全或部分地被純化，并且可完全或部分地合成。一種誘體分子，如果它是引起防御反應激活的R基因產物的合適配體，那么可以認為是“相應”。
我們現在已分離出了賦予對霜霉病真菌(寄生霜霉)抗性的擬南芥RPP5基因。確定了其DNA序列，并據此基因推導出最可能的氨基酸序列。

圖1(SEQ ID NO.1)中顯示了擬南芥RPP5基因組基因的DNA序列，推導出的氨基酸序列顯示在圖2(SEQ ID NO.2)中。對氨基酸序列的預測是根據使用為測定此基因組序列而設計的引物通過逆轉錄聚合酶鏈式反應對內含子的鑒定。推測被剪接拼入外顯子的并編碼RPP5多肽的部分DNA序列，以大寫字母顯示在圖1中。圖4(SEQ ID NO 5)顯示出編碼圖2氨基酸序列的鄰接核苷酸序列，是通過把圖1序列的外顯子連接在一起而形成的。
如在下面詳述的，可通過基于基因圖譜的克隆技術分離出擬南芥RPP5基因。根據此技術，可以以相對于與抗性基因結合的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標志物更高的分辨率，測定賦予抗性的基因座的位置。我們鑒定出一種似乎是完全與抗性基因結合的標志物，并應用與此標志物相對應的探針，從以攜帶RPP5基因的擬南芥當地品種Landsbergerecta的DNA構成的文庫中，分離出雙重載體粘粒克隆。被定名為29L17的雙重載體粘粒克隆，當轉化進入疾病敏感的擬南芥時，能賦予其疾病抗性。通過對此克隆的DNA進行DNA序列分析，鑒別出編碼富亮氨酸重復單位的基因。在一種雙重載體中，構建了被定名為pRPP5-1的亞克隆29L17，它含有6304bp的DNA，包括距可能的起始密碼子(圖1)1298bp的5′端(圖1)，和距可能的終止密碼子458bp的3′端。用此亞克隆轉化擬南芥Columbia生態(tài)型，則表現出賦予疾病抗性。通過分析對已變成疾病敏感性的Landsberg的快中子誘導的突變，顯示出此基因的DNA結構發(fā)生了重排。綜合這些資料，為如下結論提供了必要的證據圖1和圖2中顯示的序列相當于RPP5基因。
一方面，本發(fā)明提供了一種編碼病原抗性基因的核酸分離物，該基因的特征在于，它編碼顯示在SEQ ID NO 2中的氨基酸序列，或者其片段，或者表現與其有明顯同源性的氨基酸序列。N和L6可能被排除在外。
舉例來說，根據本發(fā)明的核酸，例如，編碼一種多肽的核酸，此多肽含有圖2中所顯示序列的突變體、衍生物、等位基因或變異體的氨基酸序列(如在此所進一步論述的)，該核酸的實施方案可任選地通過具有如下任何一個或多個特征，而區(qū)別于其它病原抗性基因如N，L6所編碼的多肽具有與圖3中所示煙草N蛋白的氨基酸序列小于30％的同源性，與圖3中所示亞麻L6蛋白的氨基酸序列有小于25％的同源性；它的表達不激活通過植物與作為煙草N蛋白誘體的分子接觸而引起的防御反應；它的表達不激活通過植物與作為亞麻L6蛋白誘體的分子接觸而引起的防御反應；它的表達在煙草植物中不激活通過煙草植物與煙草花葉病毒接觸而引起的防御反應；它的表達在亞麻植物中，不激活通過亞麻植物與亞麻柵銹菌接觸而引起防御反應；
它的表達不激活通過植物與作為擬南芥RPS2蛋白誘體的分子接觸而引起的防御反應；它的表達不激活通過植物與作為擬南芥RPM1蛋白誘體的分子接觸而引起的防御反應；它的表達在擬南芥中，不激活通過植物與丁香假單胞菌接觸而引起的防御反應；所編碼的多肽顯示與蕃茄Cf-9蛋白氨基酸序列的同源性小于20％，并且與蕃茄Cf-2蛋白氨基酸序列的同源性也小于20％；它的表達不激活通過植物與作為蕃茄Cf-9蛋白誘體的分子或者與作為蕃茄Cf-2蛋白誘體的分子接觸而引起的防御反應；它的表達在蕃茄植物中不激活通過蕃茄植物與表達Avr2分子的暗黃枝孢或者與表達Avr9分子的暗黃枝孢接觸而引起的防御反應；所編碼的多肽含有推測的核苷酸結合位點；所編碼的多肽是一種細胞質蛋白；所編碼的多肽含有一個與果蠅Toll蛋白的細胞質結構域具有同源性的區(qū)域。
區(qū)別本發(fā)明的核酸與其它病原抗性基因如N和L6的另一種方法，可以根據它所編碼的多肽，該多肽含有與在圖2中所示RPP5 N末端結構域氨基酸序列(圖1的外顯子1所編碼的)具有大于60％同源性的N末端結構域，和/或含有與在圖2中所示的圖1外顯子2所編碼的RPP5結構域氨基酸序列具有大于40％同源性的核苷酸結合位點結構域，和/或含有與在圖2中所顯的圖1外顯子3編碼的RPP5結構域氨基酸序列具有大于30％同源性的結構域，和/或含有與圖2中所示的圖1外顯子4、5和6所編碼的RPP5富亮氨酸重復單位(LRR)結構域氨基酸序列具有大于30％同源性的結構域。
表2顯示在推測的RPP5結構域與N之間，以及RPP5與L6之間，由基因組序列的外顯子所編碼的相同氨基酸的百分數。
該核酸可能含有一段核苷酸序列，它編碼表現與SEQ ID NO 2中所顯示的氨基酸序列至少有約60％同源性的一段氨基酸序列，優(yōu)選地至少有約70％的同源性，至少約80％的同源性，或者更優(yōu)選地有至少約90％或更高的同源性。通?！鞍被嵬葱缘陌俜謹怠?，可用于表示“相同氨基酸的百分數”。高度同源性可以在合適的條件下，例如在足以排除與不編碼病原抗性基因序列雜交的嚴緊條件下，由互補核酸的雜交能力來表示。因此，術語等位基因，衍生物或突變體，在此情況下可用于任何有關的核苷酸序列，即能夠與編碼含有相關氨基酸序列多肽的任何核苷酸序列雜交的序列。
最優(yōu)選的是，該核酸能編碼SEQ ID NO 2中顯示的氨基酸序列，在此情況下，該核酸可能包含帶有SEQ ID NO 1中顯示的編碼序列DNA，或者含有足夠編碼所需多肽的部分DNA(例如從mRNA的起始甲硫氨酸密碼子至框架下游的第一個終止密碼子)。在一個實施方案中，DNA含有SEQ ID NO 1中核苷酸1966至6511的核苷酸序列，或者是其例如缺乏內含子的突變體、衍生物或等位基因。圖4提供了一個編碼圖2氨基酸序列的鄰接序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一個編碼病原抗性基因的核酸分離物，或者是它的一個片段，它可以通過以如下探針篩選核酸文庫而得到含有SEQ ID NO 1核苷酸1966至6511的探針，或與此互補的核苷酸探針，或者是含有它的一個片段，衍生物，突變體或等位基因的探針，并且還可以通過分離能編碼對植物賦予病原抗性的多肽的核酸而得到。在本專業(yè)領域內，適合的技術是眾所周知的。因此，本發(fā)明也提供了一種鑒定和/或分離編碼病原抗性基因核酸的方法，它包括用一種核酸探測待選物(或“靶標”)核酸，這種核酸具有編碼圖2中所示氨基酸序列的核苷酸序列，它對編碼的序列是互補的，或者，它編碼一個編碼序列的片段，或者是一個與編碼序列互補的片段。待選物核酸(可能是例如cDNA或基因組DNA)可能來自含有或推測含有編碼病原抗性基因核酸的任何細胞或生物體。一個優(yōu)選的核苷酸序列顯示在圖1中。與此序列互補的序列以及它們的片段都可以應用。
對于探測，優(yōu)選的條件是那些對存在簡單模式足夠嚴緊的條件，此模式具有少量鑒定為陽性，可進一步探查的雜交。本領域熟知的方式是逐步增加雜交的嚴緊性，直到僅有少量陽性克隆剩下為止。
本發(fā)明的核酸可編碼SEQ ID NO 2中顯示的氨基酸序列，或者是此序列的突變體，衍生物等位基因。優(yōu)選的突變體，衍生物和等位基因，是那些保留了由野生型基因編碼的蛋白質功能特征的序列，特別是具有賦予病原抗性的能力，可以通過在核酸中插入，刪除或替代一個或多個核苷酸，改變一個序列，產生突變體或衍生物，而導致一個或多個氨基酸被插入，刪除或被替代。當然，對核酸的改變也可能不造成其編碼氨基酸的任何改變。
核酸可以是DNA或RNA，并且可以人工合成，例如以最優(yōu)密碼子用于在選擇的宿主生物體內表達。本發(fā)明的核酸分子和載體，可以通過從其天然環(huán)境中分離和/或純化而得到，以基本純化或均質的形式，或者以所研究品種的游離或基本游離的核酸或基因的形式得到，或者是來源于除編碼具有所需功能多肽的其它序列。本發(fā)明的核酸可以包括cDNA，RNA，基因組DNA并且可能是完全或部分地合成形式。術語“分離物”包括所有這些可能的形式。
另一方面，本發(fā)明提供的是這樣一種核酸，它含有與某種核苷酸序列互補的序列而這種核苷酸序列是能與在此所提供的任何編碼序列雜交的序列。與此相應的另一種途徑是所尋找的核酸是能與本發(fā)明所提供的任何編碼序列互補的核苷酸序列雜交的核酸。當然，DNA通常是雙鏈的，印跡技術如Southern雜交通常在使雙鏈分離之后進行，這種分離無法區(qū)分哪條鏈是雜交的。優(yōu)選的情況是，可雜交的核酸或它的互補體編碼一種能賦予宿主病原抗性的多肽，也就是包含病原抗性基因。優(yōu)選的雜交條件是專業(yè)人員所熟悉的。但是，通常是對所研究的序列與其它序列以外的序列存在陽性雜交的足夠嚴緊的條件，所述其它序列是不編碼能賦予宿主病原抗性的多肽的序列。
該核酸可以是以重組載體的形式存在的，例如噬菌體或粘粒載體。為了在宿主細胞(如植物細胞)中表達，該核酸可處于適當的啟動子和調節(jié)因子的控制之下。在DNA的情況下，它可能含有其自身的啟動子和調節(jié)因子，而在cDNA的情況下，它可以在宿主細胞中的適合的啟動子和調節(jié)因子的控制之下進行表達。
本專業(yè)的技術人員都可構建載體，并設計重組基因表達方案?？梢赃x擇或構建適合的載體，使之包含如下適當的調節(jié)序列啟動子序列、終止子片段，聚腺苷酸化序列，增強子序列，標志物基因及其它適合的序列。進一步的詳情可參閱如分子克隆實驗指南，第2版，Sambrook等，1989，冷泉港實驗室出版社。核酸操作的許多已知技術和方案，在分子生物學簡明方案，第2版，Ausubel等編，John Wiley&Sons，1992中都有詳細敘述，例如核酸構建體的制備，誘變，測序，把DNA導入細胞和基因表達，以及蛋白質分析等。Sambrook等和Ausubel等的公開內容，在此也被引入作為參考。
在將一個所選擇的基因構建體導入細胞時，某些對本專業(yè)技術人員熟知的問題必須給予重視。被插入的核酸可裝配在含有將驅動轉錄的有效調節(jié)成分的構建體中。必須有一種將此構建體轉運進入細胞的方法。此構建體一旦進入了細胞膜，根據本發(fā)明不同的實施方案，進入細胞內染色質的整合作用可能發(fā)生，或者不發(fā)生。最后，就植物而言，此靶細胞必須是能夠在整株植物中再生的細胞。
以含有預定序列的DNA片段轉化的植物，可通過已知的植物基因操作標準技術產生。用任何合適的技術可將DNA轉化入植物細胞，例如使用土壤桿菌攜帶的，無效的Ti-質粒載體，它表現天然的基因轉移能力(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR 12(22)8711-87215 1984)，顆?；蛭⒘＾Z擊(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)，顯微注射(WO92/09696，WO94/00583，EP331083，EP175966 )，電穿孔法(EP290395，WO8706614)或DNA直接攝入的其它形式(DE4005152，WO9012096，US4684611)。本專業(yè)的技術人員已將土壤桿菌轉化技術廣泛地用于轉化雙子葉植物。雖然已有報導土壤桿菌能將外源性DNA轉化入某些單子葉植物(WO92/14828)，但當土壤桿菌表現得效率差或沒有作用時，用微粒轟擊法，電穿孔法和DNA直接攝入法是優(yōu)選的。另一種方法是將不同的技術結合在一起，可用于提高轉化過程的效率，例如以包被微粒的土壤桿菌轟擊(EP-A-486234)，或者用微粒轟擊引起創(chuàng)傷，然后與土壤桿菌進行共培養(yǎng)(EP-A-486233)。
對轉化技術的具體選擇，將取決于它轉化某種植物的效率，以及以具體的方法實施本發(fā)明技術人員的經驗和偏好。顯然，技術人員將核酸導入植物細胞的具體的轉化系統(tǒng)，對本發(fā)明不是必需的，也不對本發(fā)明構成限制。
RPP5基因，其修飾形式以及相關的基因，都可以用于對植物賦予病原抗性，例如對霜霉病的抗性，其中相關的基因是指編碼與RPP5基因，及其等位基因，突變體和衍生物的蛋白質產物有明顯同源性的蛋白質的基因。為此目的，上述核酸可用于產生轉基因植物。這種植物可能具有由RPP5基因賦予的病原抗性。
因此，本發(fā)明還進一步包括一種以所公開的載體轉化的宿主細胞，特別是一種植物細胞或微生物細胞。因此，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明核酸的宿主細胞，如一種植物細胞。在此細胞內，該核酸可被摻入到染色體內。
含有本發(fā)明核酸的載體不必包含有啟動子，特別是如果該載體是用于將此核酸導入細胞，并重組進入其基因組時。
本發(fā)明還提供了一種植物細胞，本發(fā)明提供的核苷酸序列已被摻入進它的基因組，此細胞已在控制表達所編碼多肽的啟動子的有效控制之下。本發(fā)明的另一方面是提供了一種構建這種植物細胞的方法，包括把含有此核苷酸序列的載體導入植物細胞。此種導入完成后，可進行載體和植物細胞基因組之間的重組，以便將此核苷酸序列導入基因組內。然后，被導入核酸所編碼的多肽能夠被表達。
本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的植物細胞的植物，并且提供了該植株，種子，自交或雜交子代及后代，以及它們的任何部分的，如插條，種子任何形式的克隆。本發(fā)明提供了任何一種植物繁殖體，它可以是用于再生或繁殖的任何部分，有性或無性的，包括插條，種子等。
本發(fā)明進一步提供了一種方法，包括在將該核酸導入植物或其祖先細胞的先行步驟之后，在植物細胞內，從編碼SEQ ID NO 2氨基酸序列或明顯同源的氨基酸序列的核酸，或者其突變體，等位基因或衍生物進行表達，從而產生所編碼的多肽。這種方法可使植物具有病原抗性。
被穩(wěn)定地摻入植物基因組的基因，代代相傳至植物的后代，該植物后代的細胞可表達所編碼的多肽，并因此可具有更高的病原抗性。可以通過測定對病原體如寄生霜霉或萵苣盤梗霉的相容性來測定病原抗性。
對RPP5基因測序表明，同Cf-9基因和Cf-2基因一樣，它也包含有編碼富亮氨酸重復單位(LRR)區(qū)的DNA序列，并且，同源性檢測已顯示與其它含有LRR的基因有很強的同源性。如在WO95/18230中所論述，并在此發(fā)現中被進一步證實，存在LRR可能是許多病原抗性基因的特征，因此，存在LRR可以在進一步鑒定病原抗性基因的方法中得到應用。
而且，在RPP5與煙草花葉病毒抗性基因N和亞麻銹病抗性基因L6之間，存在一些顯著的同源性(圖3)。(如可以從圖3看出，RPP5與N之間的總體同源性是33％氨基酸相同，而RPP5與L6的數值是27％)。這些同源性還可用于進一步鑒定抗性基因，例如可應用根據序列保守性，優(yōu)選地是根據氨基酸序列的保守性設計的寡核苷酸(例如一個簡并集合體)。具體地說，可以設計在如下區(qū)域之間擴增DNA的引物編碼氨基酸序列FYDVDP(SEQ ID NO 6)的RPP5和N基因區(qū)域，在L6中此區(qū)域編碼FYMVDP(SEQ ID NO 7)，以及RPP5的IACFF(SEQ ID NO 8)區(qū)域，此區(qū)域在L6中的序列是相同的，在N中是IACFL(SEQ ID NO 9)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定植物病原抗性基因的方法，包括使用一種寡核苷酸來尋找新的抗性基因，此寡核苷酸含有在病原抗性基因如RPP5，N和L6之間保守的一個或幾個序列。因此，又提供了一種獲得含有病原抗性基因核酸(編碼能賦予病原抗性的多肽)的方法，包括使一個寡核苷酸(其詳情在本文中論述)，或一個含有此寡核苷酸的核酸分子，與靶標/待選核酸雜交。靶標或待選核酸可能含有例如從一個已知編碼病原抗性基因的生物體中得到的基因組文庫或cDNA文庫?？梢詫Τ晒Φ碾s交進行鑒定，靶標/待選核酸可以被分離出來，用于進一步研究和/或應用。
雜交可包括在適當的嚴緊條件下探測核酸和鑒定陽性雜交作用(根據已知的技術)，以及/或者以寡核苷酸作引物，用于核酸擴增法如PCR中。對于探測，優(yōu)選的條件是那些對存在具有少量可進一步研究的，鑒定為陽性雜交的簡單模式是足夠嚴緊的條件。本領域熟知的方式是逐步增加雜交的嚴緊性，直到僅有少量陽性克隆剩下為止。
作為一種可選的探測法，雖然仍然是利用核酸雜交作用，但是被設計用于擴增DNA序列的寡核苷酸，可用于PCR反應或涉及用常規(guī)方法擴增核酸的其它方法。參見例如，“PCR方案，方法指南和應用”Innis等編，1990，Academic Press，New York。
適合用于設計探針或PCR引物的優(yōu)選氨基酸序列，是在至少兩個能賦予病原抗性的多肽之間保守(完全、基本或部分保守)的序列，例如那些被RPP5和N，以及/或者L6編碼的多肽。根據氨基酸序列的信息，可設計寡核苷酸探針或引物，考慮到遺傳密碼的簡并性，以及在適當的情況下，從待選核酸可推導出生物體密碼子的用途。優(yōu)選的核苷酸序列可包括那些含有或具有編碼如下氨基酸的序列；(i)FYDVDP(SEQ ID NO 6)(ii)IACFF(SEQ ID NO 8)或者是與這些編碼序列互補的序列。可以應用這些序列的適當片段。例如，從氨基酸序列FYDVDP可推導出寡核苷酸TTC/T TAC/T GAC/T GTX GAT/C CC(SEQ ID NO 10)。在與引物AAG/A AAG/A CA XGC T/G/A AT(SEQID NO 11)的組合物中，從編碼IACFF的序列的底鏈推導出的這種寡核苷酸引物可用于PCR。(所有序列以5′至3′的形式給出，見圖3)。X表示A，G，C或T。
本發(fā)明的寡核苷酸，例如用于核酸擴增的寡核苷酸，優(yōu)選地具有大約10個或較少的密碼子(如6，7或8個)，即，大約30或較少些的核苷酸長度(如18，21或24個核苷酸)。
可以按各種方式評估這種PCR產物是否與抗性基因相對應。來自這種反應的PCR帶可包含有復雜的產品混合物?？梢詫蝹€產物進行克隆，并且，為了連接于已知的疾病抗性基因，對每一個產物都可單獨地進行篩選，此抗性基因是在對這種探針顯示多態(tài)性的子代中分離的基因?？蛇x地，可以以一種能夠使之在變性聚丙烯酰胺凝膠上表現出多態(tài)性的方法處理這種PCR產物，并且，在克隆之前可預先挑選出連接于抗性基因的特異性電泳帶。一旦待選的PCR帶被克隆，并且顯示已連接于一個已知的抗性基因，就可以把它用于分離cDNA克隆，這樣可檢查此cDNA克隆是否有其它特征，以及是否與RPP5，N或L6有同源性。然后可通過轉化對它進行分析，測定它在被導入所研究的疾病敏感性植物變種后的功能。另一種情況是，此PCR帶或通過對它分析而推導出的序列，可用于幫助植物育種者控制有用抗性基因的分離。
利用RPP5序列鑒定其它抗性基因的另一種方法是，用計算機尋找表達的序列標志(EST)和其它DNA序列的基本數據，用于鑒定其它品種中編碼具有顯著RPP5同源性的蛋白質的基因。例如，用一種BLAST計算法(Altschul等，1990)得到至少為60的同源性分值將表明存在一個待選的抗性基因。
已經用這些方法得到了核酸，為了例如對植物賦予病原抗性含有全部或部分所得到的核酸序列的核酸分子可用于產生轉基因植物。
對于本專業(yè)的技術人員，對上述各方面和實施方案的修改，以及本發(fā)明進一步的方面和實施方案，將是顯而易見的。所有被引述的文獻在此引入作為參考。
圖1顯示RPP5基因的基因組DNA序列(SEQ ID NO.1)。圖中用非大寫字母顯示內含子。特征核酸序列-在核苷酸1966開始翻譯；在核苷酸6512停止翻譯。
圖2顯示預測的RPP5蛋白質氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。
圖3顯示由RPP5(SEQ ID NO 2)，N(SEQ ID NO 3)和L6(SEQ ID NO 4)基因預測的氨基酸序列的比較。按照所預測的蛋白質結構域，將蛋白質序列排列成直線。圖3是用Wisconsin大學遺傳學計算機小組序列分析軟件包7.2版的PRETTYBOX和PilelUp程序繪制的。
圖4顯示編碼圖2中顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的鄰接核苷酸序列(SEQ ID NO 5)，并且是通過將圖1序列(SEQ ID NO 1)的外顯子序列連接在一起繪制的?？寺M南芥RPP5基因用基于基因圖譜的克隆方案克隆RPP5基因，其原理類似于前面簡述的，用于分離蕃茄Pto基因的方法。
(i)RPP5基因圖位置的排列以前對在擬南芥RFLP基因圖譜上RPP5基因圖譜的定位已有報導(Parker等，1993)此論文詳述了兩個被定名為Columbia和Landsbergerecta的當地擬南芥品種，是如何對定名為NoCo-2的寄生霜霉表現出不同的反應，Landsberg erecta是抗性的，而Columbia是敏感的。已構建了重組近交系(Lister和Dean，1993)，是從正在進行單一種子世代的F2種子上產生的，此F2種子是從Landsberg和Columbia間的F1產生的，并且對這些重組近交系進行對NoCo-2的抗性或敏感性的測定。這些分析表明，RPP5基因位于染色體4上，在RFLP標志物m226和g4539之間。用RAPD(隨機擴增的多態(tài)性DNA)技術分析了Landsberg和Columbia的DNA(Williams等，1990)，并對Landsberg和Columbia間的多態(tài)性分析了其與RPP5的連鎖。用操縱子引物OPC18產生的一種多態(tài)性是絕對連鎖于RPP5的，此引物在Columbia擴增產生了一條擴增帶，但在Landsberg中沒有產生?？寺×诉@條540 bp的DNA帶(在Parker等，1993中被定名為OPC18540)，并將形成的探針稱為C18探針。
(ii)在標志物m226和標志物g4539間的物理圖譜的建立擬南芥基因組項目的目的是建立染色體4的物理圖譜，并且最終建立整個擬南芥基因組的物理圖譜。C18探針可用于鑒定雜交酵母的人工染色體(YAC)克隆。這有利于建立在4539和226之間摻入其它連接標志物如g13683的物理重疊群(contig)。已克隆出C18 RAPD帶，并用作對Columbia和Landsberg基因組DNA的探針。此探針的雜交作用顯示，在這兩個基因型中，存在一個非常多態(tài)性的小多基因家族。對重組近交系雜交表明，此多基因家族的所有成員是完全與抗性基因座連接的(Lister和Dean，1993)。用CAPS程序(Konieczny和Ausubel，1993)在從Columbia和Landsberg雜交的F1通過自花受精產生的F2群體中，對其個體進行連接的標志物Ara-1和4539之間重組體的篩選。用于Ara-1基因座的引物是Ara-15′TCG ACG ACT CTC AAG AAC CC 3′Ara-25′CAC AAG CTA TAC GAT GCT CAC C 3′這樣在Columbia和Landsberg中得到700bp的帶，用Acc消化后，切割Landsberg DNA，得到360bp和340bp的帶。用于4539基因座的引物是4539 F5′GGT CAT CCG TTC CCA GGT AAA G 3′4539 R5′GGA CGTAGA ATC TGA GAG CTC 3′在用Hind III消化后，Columbia的600bp帶仍然未被切割，而Landsberg帶被切割成480bp和120bp的片段。按此方式，在此間隔內可產生另外24個重組體。對這些重組體的分析表明，C18多基因家族的所有成員，再次恰好是以RPP5共分隔的。因為所連接的多基因家族具有疾病抗性基因的特性(Martin等，1993，Jones等，1994，Whitham等，1994)，我們對C18帶可能與RPP5基因雜交的假設進行了驗證。對載體pCLD04541中來自Landsberg雙重載體粘粒文庫的粘粒進行了鑒定(C.Dean，pers.com.Bem等，1994)，并對與C18探針雜交的粘?？寺∵M行了鑒定。表1列舉出了這些雜交的克隆。其中的每一種都被用于以對NoC0-2敏感并易于轉化的擬南芥當地品種No-O進行的轉化試驗。對以粘粒29L17轉化而產生的轉化體進行了鑒定，并對此轉化體的自交子代進行了抗寄生霜霉NoC0-2抗性的分離。這證明，攜帶有與C18 RAPD探針雜交帶的克隆29L17帶有功能性寄生霜霉抗性基因。
(iii)對29L17植物DNA插入片段的DNA序列分析從29L17制備粘粒DNA，超聲處理，并克隆進入pUC18載體，以及進行隨機測序。對隨機克隆上的240個DNA進行測序反應，此隨機克隆被鑒定為與29L17插入DNA片段雜交的克隆，即攜帶有植物DNA插入片段的克隆。根據此DNA序列資料的計算機分析，可將DNA序列的重疊群編制成含有14.3Kb的DNA。并檢查了此DNA序列是否存在編碼富亮氨酸重復單位的序列。在SEQ ID NO.1中，發(fā)現一個這樣的區(qū)域，是從核苷酸3000至核苷酸6138。
(iv)對與RPP5突變有關的DNA重排的分析用于確定植物DNA的一個被表征的區(qū)域是否與所研究的基因相對應的標準之一是，檢查在相對應的基因中是否有由電離輻射引起的，與所研究區(qū)域內DNA重排有關的突變。可用寄生霜霉篩選快中子誘變的Landsberg種子突變體對疾病的敏感性。發(fā)現三種突變，并通過Southern印跡試驗分析了與此基因相應的，攜帶富亮氨酸重復單位的DNA中的干擾或重排。一個突變品系FNB387顯示出不同的Southern印跡雜交模式。更進一步的分析表明，此干擾是由270bp的DNA片段在攜帶富亮氨酸重復單位的閱讀框架C端插入而構成。對此區(qū)域的序列分析表明，270bp的插入片段已在粘粒29L17上攜帶的基因中由幾個LRR復制而產生。這充分有力地證明RPP5基因相當于攜帶富亮氨酸重復單位的閱讀框架。
(v)證明29L17的亞克隆含有RPP5為了證實通過誘變鑒定的基因對賦予疾病抗性不但是必要的。而且是充分的，在雙重載體SLJ7292中構建29L17的亞克隆。此亞克隆被定名為pRPP5-1，它含有由BglII限制酶5′位點對該基因(SEQ ID NO.1中的核苷酸668和由PstI限制酶3′位點對該基因(SEQ ID NO.1中的核苷酸6971)規(guī)定的6304bp的DNA片段。pRPP5-1被用于轉化擬南芥的Columbia生態(tài)型，并顯示賦予疾病抗性的能力。
(vi)對RPP5轉錄物的RT-PCR分析從苗葉的信使RNA可制備cDNA的第一條鏈，再從此cDNA，用內含子側翼引物進行PCR擴增。這些引物是對于內含子1，5′-GAGTTCGCTCTATCATCTCC和5′-TTATTGCATTCGAAACATCATTG；對于內含子2和3，5′-AAATTGATCGTGCAAAGTCC和5′-AAGATTCGCATTCTTCAAGATT；對于內含子4，5′-GAAGATGGATTTGTATAATTCC和5′-TCAAATTCGGGCATCCAGTG。對于內含子5采用了嵌套PCR方案，將一小份第一次擴增的產物用作第二次擴增的模板。采用的引物是對于第一次擴增，5′-TGGTGACACTTCCTTCCTCG和5′-CCAAACTTTTGCAGTTGTTG；對于第二次擴增，5′-TCTCAATGTGAGCGGCTGCAAGC和5′-AACTTGAGCAACCACTGAGATCG。用載體特異性和引物特異性插入片段的組合，對克隆的PCR產物進行測序。內含子序列被顯示在SEQ ID NO.1(圖1)中的下面一套序列中，位于顯示在上面一套序列中的外顯子序列之間。
(vii)RPP5基因序列與其它抗性基因序列的比較將RPP5序列與基因N和L6相比較，整個N-末端區(qū)顯示出非常強的同源性。這些區(qū)域在圖3中被突出。它們包括與核苷酸結合有關的，被稱為激酶-1a，激酶-2，激酶-3a的區(qū)域，激酶-1a常常被稱為P-環(huán)。N-末端到核苷酸結合結構域的區(qū)域，也表明有顯著的同源性。引物被設計成特別針對攜帶氨基酸序列FYDVDP的保守區(qū)(RPP5的氨基酸104至109)，以及氨基酸IACFF區(qū)(RPP5的437-441)。當基于氨基酸序列的簡并寡核苷酸引物被用于PCR反應時，不論在擬南芥基因組DNA上，還是在由其它品種的RNA制備的cDNA上，都觀察到大小與可能的編碼抗性基因一致的產物。
這些引物可單獨地，或者與編碼已鑒定的抗性基因保守區(qū)和非保守區(qū)的其它引物共同用于分離其它的同源基因序列，所述同源基因序列可能包含以前未被表征的抗性基因。
表1與C18雜交的雙重載體粘?？寺‰p重載體04541轉化入No-o的3D2327E229L1738G1042P15隨后被鑒定的45F818A1056G2
表2RPP5和N間以及RPP5和L6間相同氨基酸的百分數N外顯子1 N外顯子2 N外顯子3 N外顯子4+5RPP5外顯子155外顯子2 36外顯子326外顯子4，5+6 26L6外顯子1 L6外顯子2 L6外顯子3 L6外顯子4RPP5外顯子137外顯子2 30外顯子317外顯子4，5+6 26參考文獻1.Bent AF，et al.，(1994)擬南芥的RPS2Science2651856.2.De Wit PJGM(1992).Ann.Rev.Phytopathol.30391-418.3.Dixon，MD，et al.(1996)Cell 84451-459.4.Flor HH(1971).Ann.Rev.Phytopathol.9275-296.5.Gabriel DW，et al.，(1990).Ann.Rev.Phytopathol.28365-391.6.Grant，MR，et al.Science 269843-846(1995)7.Johal GS，et al.，(1992).Science(Wash.).258985-987.8.Jones DA，et al.，(1994).Science 266789-793.9.Joosten MHAJ，et al.，(1994).Nature 367384.10.Keen NT，(1992).Ann.Rev.Gen.24447-463.11.Konieczny A，et al.，(1993).Plant Journal4403-407.12.Lawrence，GJ et al.Plant Cell 71195-1206(1995)13.Lister C，et al.，(1993).Plant Journal(inpress).14.Long SR，et al.，(1993).Cell 73921-935.15.Martin GB，et al.，(1993).Science2621432-1436.16.Mindrinos M，et al.，(1994).Cell 781089-1099.17.Parker JE，et al.，(1993).Plant Journal4821-831.18.Song W-Y，et al.(1995).Science 2701804-1806.19.Stein JC，et al.，(1991).proc.Natl.Acad.Sci.USA.888816-8820.20.Whitham S，etal.，(1994).Cell 781011-1115.21.Williams JGK，et al.，(1991).Nucl.Acids Res.186531-6535.22.Altschul，S.F.，et al.，(1990).J.Mol.Biol.215403-410.
權利要求
1.一種編碼病原抗性基因的核酸分離物，它包含編碼含有圖2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述病原抗性基因在植物中的表達可導致該植物中防御反應的激活。
2.權利要求1的核酸，其中所述激活是通過將植物與病原體或相應的誘體分子接觸而引發(fā)的。
3.權利要求1的核酸，其中核苷酸序列包括圖1所示的編碼序列。
4.權利要求1的核酸，其中核苷酸序列包括圖1所示的編碼序列的等位基因、衍生物或突變體，它們是通過添加、插入、刪除或替換一個或多個核苷酸而產生的。
5.編碼病原抗性基因的核酸，它含有編碼一種多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一段氨基酸序列，該氨基酸序列含有圖2所示的氨基酸序列的等位基因、衍生物或突變體，它們是通過添加、插入、刪除或替換一個或多個氨基酸而產生的；所述病原抗性基因在植物中的表達可引起該植物中防御反應的激活；條件是所編碼的多肽與圖2中所示的氨基酸序列有至少約60％的同源性。
6.編碼病原抗性基因的核酸，它含有編碼一種多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一段氨基酸序列，該氨基酸序列含有圖2所示的氨基酸序列的等位基因、衍生物或突變體，它們是通過添加、插入、刪除或替換一個或多個氨基酸而產生的；所述病原抗性基因在植物中的表達可引起該植物中防御反應的激活；條件是該核酸的表達能導致防御反應的激活，該激活是通過將植物與卵菌亞綱真菌，如寄生霜霉，或其提取物接觸而引發(fā)的。
7.權利要求5或6的核酸，其中所述激活是通過將植物與病原體或相應的誘體分子接觸而引發(fā)的。
8.作為一種載體的核酸，它包含權利要求1-7中任一權項的核酸。
9.權利要求8的核酸，它進一步包含用于所述多肽表達的調控序列。
10.上述權利要求中任一權項的核酸在轉基因植物的生產中的應用。
11.一種宿主細胞，它含有權利要求1-9中任一權項的核酸。
12.權利要求11的宿主細胞，它是微生物。
13.權利要求11的宿主細胞，它是植物細胞。
14.一種植物或其任意部分，它含有權利要求13的細胞。
15.權利要求14的植物的種子，自交或雜交子代，或者其后代或衍生物或提取物，或者其任意部分。
16.一種方法，它包括將權利要求1-9中任一權項的核酸導入宿主細胞。
17.權利要求16的方法，其中宿主細胞是植物細胞或微生物細胞。
18.一種對植物賦予病原抗性的方法，該方法包括首先將權利要求1-9中任一權項的核酸導入植物或其祖先的細胞，然后在植物細胞中使該核酸表達。
19.權利要求18的方法，其中核酸編碼圖2中所示的氨基酸序列。
20.一段寡核苷酸，它包含編碼一段氨基酸序列的序列，所述序列在擬南芥RPP5和另一種病原抗性基因之間保守；或包含與編碼該氨基酸序列的核苷酸序列互補的序列。
21.權利要求20的寡核苷酸，其中病原抗性基因是煙草的N基因，或亞麻的L6基因。
22.權利要求21的寡核苷酸，它包含編碼下列氨基酸序列之一的核苷酸序列(i)FYD/MVDP；和(ii)IACFF/L或者包含與該編碼序列互補的核苷酸序列。
23.權利要求22的寡核苷酸，它包含選自下列序列的序列(i)TTC/TTAC/TGAC/TGTXGAT/CCC；(ii)AAG/AAAG/ACAXGCT/G/AAT；和(iii)與(i)或(ii)互補的序列。
24.一段寡核苷酸，它含有一段序列，該序列是權利要求20-23中任一權項的寡核苷酸序列的變異體或衍生物，它們是通過添加、插入、刪除或替換一個或多個核苷酸而產生的。
25.一種獲得含有病原抗性基因的核酸的方法，其包括使權利要求20-24中任一權項的寡核苷酸或含有該寡核苷酸的核酸分子與靶核酸雜交。
26.權利要求25的方法，其包括核酸擴增技術的應用。
27.權利要求25或26的方法，其中在雜交后對成功的雜交進行鑒定，并分離出靶核酸。
28.一種方法，其中在用權利要求25-27中任一權項的方法獲得核酸之后，將含有全部或部分所得核酸序列的核酸分子用于產生轉基因植物。
29.權利要求28的方法，其中所述核酸分子被用于對所述植物賦予病原抗性。
全文摘要
本發(fā)明克隆出擬南芥RPP5基因,提供了它的序列,并同時提供了它所編碼的氨基酸序列?？蓪⒕幋a該多肽的DNA,或其等位基因,突變體或衍生物導入植物細胞,對所編碼的多肽進行表達,可對含有這種細胞和其后代的植物賦予病原抗性。RPP5序列含有富亮氨酸的重復單位,這種重復單位的存在可用于鑒定其它的植物病原抗性基因。RPP5和其它病原抗性基因之間的同源性,顯示出可用于鑒定其它病原抗性基因的基元。
文檔編號C07K14/37GK1190439SQ9619419
公開日1998年8月12日 申請日期1996年4月9日 優(yōu)先權日1995年4月7日
發(fā)明者J·D·G·喬尼斯, J·帕爾克爾, M·科勒曼, M·J·達尼爾斯, V·扎波 申請人:約翰·英尼斯創(chuàng)新中心有限公司