專利名稱：?jiǎn)?dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于酵母的轉(zhuǎn)錄上可控制的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在采用基因重組DNA技術(shù)制造有用蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物等的分子生物工程中有用；本發(fā)明也涉及一種DNA，其中所說的啟動(dòng)子以可表達(dá)的方式連接到異源基因上；本發(fā)明也涉及包含所說DNA的載體。本發(fā)明還涉及一種使用包含DNA的載體制造蛋白質(zhì)的方法，所說DNA是通過以可表達(dá)的方式在所說啟動(dòng)子的下游連接上編碼所說蛋白質(zhì)的核酸獲得的。
現(xiàn)有技術(shù)為了以遺傳工程方式生產(chǎn)作為藥物、食品等有用的蛋白質(zhì)，以酵母為宿主在酵母中生產(chǎn)這些物質(zhì)已被廣泛地進(jìn)行。把異源基因引入酵母屬(特別是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，簡(jiǎn)稱為S.cerevisiae)的酵母以用于相應(yīng)異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的技術(shù)已為人們所了解。當(dāng)異源基因(包括基因組DNA和cDNA)在啤酒糖酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，在其上游給出在酵母中可表達(dá)啟動(dòng)子是必要的。迄今為止已知的用于啤酒糖酵母的啟動(dòng)子的例子是已知顯示出強(qiáng)表達(dá)的酒精脫氫酶(ADH1)基因的啟動(dòng)子或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的啟動(dòng)子；在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的GAL1和GAL10啟動(dòng)子；和在具有低濃度無機(jī)磷酸鹽的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的PH05啟動(dòng)子。能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制且具有更高的表達(dá)的啟動(dòng)子是合乎需要的。
對(duì)于用酵母進(jìn)行異源蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)而言，不僅顯示強(qiáng)的表達(dá)而且能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。已知在一合成的基本培養(yǎng)基中，酵母單倍體菌株增加一倍的時(shí)間是大約140分鐘，而在全營養(yǎng)培養(yǎng)基中時(shí)間大約為90分鐘[酶學(xué)方法，194，15(1991)]。這樣，作為培養(yǎng)產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的酵母的條件，富含營養(yǎng)的全營養(yǎng)培養(yǎng)基是優(yōu)選的，這是由于其加速細(xì)胞增殖速率并且能保持高的細(xì)胞密度。然而，迄今已知的能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子目前利用以半乳糖為碳源的培養(yǎng)基或具有低濃度磷酸鹽的培養(yǎng)基。因此，從以異源蛋白質(zhì)的大規(guī)模的產(chǎn)生為目的的細(xì)胞增殖的角度看，它們不是優(yōu)選的。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種從酵母衍生的啟動(dòng)子的核苷酸序列，該啟動(dòng)子能夠由PDR1基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄控制，并且可以用于全營養(yǎng)培養(yǎng)基中，以使上述問題得到解決。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)短梗霉素(aureobasidin)敏感細(xì)胞(野生型菌株)經(jīng)歷一種使其具有短梗霉素抗性的處理(例如基因突變)時(shí)，與短梗霉素的敏感性有關(guān)的基因(從短梗霉素敏感細(xì)胞獲得的)的表達(dá)增加，同時(shí)他們也已考慮提供一種參與所說的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明發(fā)明人從已被處理成具有短梗霉素抗性的突變基因組DNA克隆了參與上述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，并確定了其核苷酸序列。出乎意料的是，當(dāng)研究進(jìn)一步進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了所說啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性被多效藥物抗性基因的PDR1基因的基因產(chǎn)物控制，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下本發(fā)明的第一項(xiàng)涉及一種啟動(dòng)子，其特征在于其是序列表中SEQ ID NO1或其部分所代表的且在酵母中具有啟動(dòng)子活性的DNA。第二項(xiàng)涉及第一項(xiàng)的DNA，其中其可以用PDR1基因產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制。第三項(xiàng)涉及一種DNA，其特征在于其可與第一項(xiàng)的DNA雜交且在酵母中具有啟動(dòng)子活性。第四項(xiàng)涉及一種DNA，其特征在于異源基因以可表達(dá)的方式連接到1-3項(xiàng)之任一的DNA上。第五項(xiàng)涉及一種載體，其特征在于其包含1-4項(xiàng)之任一的DNA。第六項(xiàng)涉及一種酵母，其特征在于其中引入了第四項(xiàng)的DNA或者其被第五項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化過。第七項(xiàng)涉及一種制造蛋白質(zhì)的方法，其特征在于利用經(jīng)包含DNA的載體轉(zhuǎn)化過的酵母，所說DNA是通過以可表達(dá)的方式在1-3項(xiàng)之任一的DNA下游連接上編碼蛋白質(zhì)的核酸獲得的。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示了用scaur2基因?yàn)樘结樀钠【铺墙湍敢吧途昱c短梗霉素抗性菌株的Northern雜交結(jié)果。
圖2顯示了scaur2基因的限制酶圖譜。
發(fā)明詳述在本說明書中使用的“啟動(dòng)子”指這樣的一種啟動(dòng)子處在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1)上游，包含TATA框或與其類似的域(其具有經(jīng)RNA聚合酶從精確位置啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能)，并且可以包含上游激活序列(UAS)以及供控制表達(dá)的與蛋白質(zhì)而不是RNA聚合酶相關(guān)聯(lián)所必需的域。
在本說明書中使用的“啟動(dòng)子活性”是顯示出以下能力和功能的這樣一種活性，即當(dāng)異源基因以可表達(dá)的方式連接到所說啟動(dòng)子的下游并引入宿主(酵母)中時(shí)，在宿主細(xì)胞內(nèi)或外產(chǎn)生所說異源基因的基因產(chǎn)物的能力和功能。
通常，將一種容易定量檢測(cè)的編碼蛋白質(zhì)的基因(報(bào)導(dǎo)基因)以可表達(dá)的方式連接到啟動(dòng)子下游并引入到宿主中，然后測(cè)定所說蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此啟動(dòng)子存在與否和啟動(dòng)子的潛能用啟動(dòng)子活性表示。當(dāng)異源基因以可表達(dá)的方式連接到啟動(dòng)子下游，并引入到宿主中和基因產(chǎn)物的表達(dá)在宿主內(nèi)或外得到證實(shí)時(shí)，這時(shí)所說的啟動(dòng)子在引入它的宿主中具有啟動(dòng)子活性。
在本說明書中使用的“PDR1基因產(chǎn)物”包括直接從PDR1基因獲得的基因產(chǎn)物，也包括從修飾的PDR1基因獲得的基因產(chǎn)物，所說的修飾是通過天然突變或定點(diǎn)突變產(chǎn)生的至少一種一部分核苷酸序列的取代、插入和缺失進(jìn)行的。
在本說明書中使用的“異源基因”是這樣一種基因，其對(duì)宿主(酵母)來說是異源的(即外來的)，是例如非真菌基因、修飾基因、不同真菌物種的基因、自身克隆基因等。異源基因包括在酵母中可表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的基因，來源于酵母的基因的反義DNA或反義RNA，編碼得自酵母的轉(zhuǎn)錄因子的基因，因子結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列，具有與其類似的序列的引誘物(decoy)，還具有切割酵母衍生mRNA的核酶，等。
在酵母中的可表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的基因的一個(gè)例子是來自酵母的基因，但是本發(fā)明不限于此，來源于微生物(如細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、子囊菌和擔(dān)子菌)和其它生物體(如植物、昆蟲和動(dòng)物)的任何基因，只要其在酵母中是可表達(dá)，都包括在本說明書的異源基因中。
此外，由上述異源基因產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)將被稱為異源蛋白質(zhì)。
在本說明書中使用的“引誘物(decoy)”指來源于酵母的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，具有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)的序列的DNA以及具有與其類似的序列的DNA。當(dāng)“引誘物”作為“引誘鳥(decoy bird)”引入酵母中時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子的功能能夠被抑制。
在本說明書中使用的“核酶”指切割特定蛋白質(zhì)的mRNA和抑制這種特定蛋白質(zhì)翻譯的酶?？蓮木幋a特定蛋白質(zhì)的基因序列設(shè)計(jì)核酶。關(guān)于錘頭型核酶，在FEBS Letter 228，228-230(1988)中論及的方法可被使用。此外，不僅錘頭型核酶，任何核酶(如發(fā)夾核酶和△核酶)，不論其是何種類型的核酶，只要其切割特定蛋白質(zhì)的mRNA和抑制這種特定蛋白質(zhì)翻譯，都可以包括在本說明書的核酶中。
短梗霉素(日本公開專利出版物平-02/138,296，03/022,995，03/220,199，05/279,384和06/065,291；抗生素雜志，44，(9)，919-924；同上，4419)，925-933；和同上，44，(11)，1187-1198(1991))是一種環(huán)狀的depsipeptide，其是作為菌株出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)No.R106(FERM BP-1938)的發(fā)酵產(chǎn)物獲得的，且結(jié)構(gòu)與其它抗真菌素完全不同。如以下所給出的表1和2中所示，短梗霉素A是典型的短梗霉素化合物，在假絲酵母屬的各種酵母(如白假絲酵母(Candidaalbicans))，新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)，莢膜組織孢槳菌(Histoplasma capsulatum)，Blastomyces dermatidis以及曲霉屬真菌上顯示很強(qiáng)的抗真菌性(日本公開專利出版物平-02/138,296)，但是毒性很弱。因此，它是一種具有極好選擇毒性的抗真菌劑。
在下文中，假絲酵母屬、隱球酵母屬和曲霉屬將分別被縮寫為C.，Cr.，A.。在下表1和2中，“MIC”代表短梗霉素對(duì)各種真菌的最小抑制濃度(微克/毫升)。
表1所測(cè)試的微生物TIMM數(shù)量 MIC(微克/毫升)白假絲酵母 0136≤0.04C. albicansvar. 1308≤0.04stellatoidea熱帶假絲酵母 0312 0.08乳酒假絲酵母 0298 0.14近平滑假絲酵母 0287 0.16克魯斯假絲酵母 0270 ≤0.04季氏假絲酵母 0257 0.08C.glabrata 1062 ≤0.04新型隱球酵母 0354 0.63地生隱球酵母 0424 0.31深紅紅酵母 0923 0.63煙曲霉 0063 20.00棒曲霉 0056；0.16表2所測(cè)試的微生物 TIMM數(shù)量 MIC(微克/毫升)構(gòu)巢曲霉 01120.16土曲霉 01205.00普通青霉 13311.25須發(fā)癬菌 118910.00絮狀表皮癬菌 04312.50佩德羅索氏產(chǎn)色芽生菌 04820.31Exophiala werneckii13341.25Cladosporium bantianum 03430.63莢膜組織孢槳菌 07130.16巴西芽生菌 08800.31白地霉 06940.63皮炎芽生菌 01260.31如日本公開專利出版物平-07/313,172所提到的，本發(fā)明發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)真菌如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)(下文縮寫為Schizo.pombe)和啤酒糖酵母對(duì)短梗霉素敏感。
表3所測(cè)試的微生物MIC(微克/毫升)粟酒裂殖酵母 0.08啤酒糖酵母0.31本發(fā)明發(fā)明人已誘變了粟酒裂殖酵母，啤酒糖酵母等對(duì)短梗霉素敏感的野生型菌株給出抗性細(xì)胞(抗性菌株)，同時(shí)成功地從抗性菌株分離了可以賦予短梗霉素抗性的基因(抗性基因)，并從野生型菌株分離了賦予相應(yīng)的短梗霉素敏感性的基因(敏感基因)。本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)而闡明由那些基因編碼的蛋白質(zhì)的存在。此外，本發(fā)明發(fā)明人構(gòu)建了包含所說基因的復(fù)制載體，并成功地表達(dá)了上述基因，用所說的載體轉(zhuǎn)化了細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)明人繼而利用上述基因的DNA片段為探針，成功地從其它短梗霉素敏感真菌發(fā)現(xiàn)了新的短梗霉素敏感性相關(guān)基因。
與短梗霉素敏感性(aur)相關(guān)的基因是與短梗霉素敏感性的相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的編碼基因，該基因包括敏感基因和抗性基因。
為分離與短梗霉素敏感性相關(guān)的基因，通過突變的方法首先從短梗霉素敏感性細(xì)胞(野生型菌株)誘導(dǎo)出抗性菌株，從該抗性菌株的染色體DNA或者cDNA制備DNA文庫，然后從該DNA文庫克隆能夠賦予抗性的基因(抗性基因)。當(dāng)制備了野生型菌株的DNA文庫，然后從DNA文庫分離了可與抗性基因雜交的DNA分子時(shí)，分離敏感基因就是可能的。
誘變的例子是用化學(xué)試劑(如乙基甲磺酸或是N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG))處理的方法和用紫外線或其它輻射處理的方法。獲得抗性的細(xì)胞可通過在適宜條件下，在具有適當(dāng)濃度短梗霉素的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變細(xì)胞來篩選。生成的抗性菌株可以隨使用的突變方法以及所使用的誘變條件而變化。
現(xiàn)用啤酒糖酵母DKD8D菌株(交配型a；基因型leu2-3*112，trp1，ura3-52，his4)作為野生型菌株的例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
用EMS對(duì)短梗霉素敏感性啤酒糖酵母DKD8D誘發(fā)突變，從形成的突變體中分離對(duì)多種藥物不具抗性但對(duì)短梗霉素具有特定抗性的啤酒糖酵母AL33-18C菌株。
所說的菌株命名為啤酒糖酵母AL33-18C。該菌株已以保藏號(hào)FERMP-14920保藏在日本國家生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，MITI(位于1-3，Higashi-1-chome，Tsukuba市，Ibaragi縣305日本)，并且以保藏號(hào)FERM BP-5529在原保藏單位轉(zhuǎn)變?yōu)榘凑詹歼_(dá)佩斯條約的保藏。
然后對(duì)啤酒糖酵母DKD8D菌株和啤酒糖酵母AL33-18C菌株短梗霉素敏感性相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行證實(shí)。為了證實(shí)表達(dá)，從兩種菌株提取總RNA。
當(dāng)總RNA用scaur2基因(例如日本公開專利出版物平-07/313,172提到的)為探針進(jìn)行Northern雜交時(shí)，與短梗霉素敏感性相關(guān)的scaur2基因的表達(dá)能夠得到證實(shí)。
結(jié)果在圖1中給出。如圖1所示，在具有短梗霉素抗性的菌株啤酒糖酵母AL33-18C菌株中，scaur2基因具有很高的表達(dá)。探針scaur2基因包含在pSCAR2質(zhì)粒中。攜帶所說pSCAR2質(zhì)粒的大腸桿菌HB101命名為大腸桿菌HB101/pSCAR2，該菌株已保藏在日本國家生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，MITI。保藏號(hào)為FERM BP-4484。
然后試圖克隆被認(rèn)為處在scaur2基因上游，表現(xiàn)出高的表達(dá)的啟動(dòng)子。為克隆該啟動(dòng)子，首先從啤酒糖酵母AL33-18C菌株中克隆與短梗霉素敏感性相關(guān)的scaur2基因。在克隆scaur2基因過程中，可以使用在日本公開專利出版物平-07/313,172所論及的方法。例如，從啤酒糖酵母AZ33-18C菌株制備基因組DNA，并制備基因組文庫。此后，以日本公開專利出版物平-07/313,172提到的scaur2基因?yàn)樘结樛ㄟ^雜交來篩選基因組文庫，從而得到啤酒糖酵母AZ33-18C菌株的scaur2基因。圖2顯示了具有所說的scaur2基因的DNA片段的限制酶圖譜。為了證實(shí)所說的scaur2基因是否是與短梗霉素敏感性相關(guān)的基因，測(cè)定啤酒糖酵母AL33-L8C菌株的scaur2基因的核苷酸序列，并且與日本公開專利出版物平-07/313,172中所提的scaur2基因的核苷酸序列相比較，也與從核苷酸序列推測(cè)的由scaur2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相比較。具有啤酒糖酵母AL33-18C菌株之scaur2基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的域的核苷酸序列在序列表中的SEQIDNO2中顯示，而從所說基因的核苷酸序列推測(cè)的氨基酸序列則在序列表中的SEQ ID NO3中顯示。
結(jié)果證實(shí)啤酒糖酵母AL33-18C菌株的scaur2基因是與短梗霉素敏感性相關(guān)的基因。然后，被克隆認(rèn)為定位在所說scaur2基因上游的啟動(dòng)子。例如，以一種適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂兴f的scaur2基因的DNA片段，以便亞克隆具有scaur2基因上游區(qū)域的DNA片段，由此測(cè)定核苷酸序列。在所說的核苷酸序列中，位于scaur2基因上游的在SEQ ID NO4中顯示。只有scaur2基因的上游區(qū)可以由PCR或類似方法獲得。例如，從SEQ ID NO4設(shè)計(jì)與上述DNA片段的上游相應(yīng)的引物(SEQ ID NO5)，而從SEQ ID NO2設(shè)計(jì)與scaur2基因的上游相應(yīng)的引物(SEQ ID NO6)，然后用這些引物進(jìn)行PCR，由此可以制備包含啟動(dòng)子的DNA片段。所說的DNA片段的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO1顯示。
然后，為了證實(shí)所說的DNA片段是否作為啟動(dòng)子起作用，將所說的DNA片段整合進(jìn)一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中，制備重組載體，其中異源基因與所說DNA片段相同方向的下游連接。并且終止子在相同方向上與異源基因的下游連接。就終止子而言，可以使用任何已知的存在于scaur2基因下游的終止子或?qū)⒋嬖谟趕caur2基因下游的終止子。為了獲得處在scaur2基因的下游的終止子，用與scaur2基因的下游相應(yīng)的引物(SEQ ID NO7)和與重組質(zhì)粒(用具有scaur2基因的DNA片段整合的)的載體序列相應(yīng)的另一個(gè)引物(當(dāng)載體是如pUC119時(shí)，則可以使用M13引物M3(由Takara Shuzo制造))進(jìn)行PCR，從而獲得包含終止子的DNA片段。終止子的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO8顯示。將形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母(或類似的細(xì)胞)中，以檢查異源基因或異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此證實(shí)所說的DNA片段是否作為啟動(dòng)子起作用。例如，將β-半乳糖苷酶基因[酶學(xué)方法，100，293-308(1983)]用作異源基因，在相同方向上與上述的DNA片段的下游連接，從而產(chǎn)生重組載體，把所說的重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母，在包含5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成的重組細(xì)胞，同時(shí)觀察所形成的菌落顏色變藍(lán)與否(由于表達(dá)半乳糖苷酶)，由此證實(shí)所說的DNA片段是否具有啟動(dòng)子活性。
結(jié)果清楚表明，包含本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA片段具有啟動(dòng)子活性。
然后，為證實(shí)在上述啤酒糖酵母DKD8D菌株和啤酒糖酵母AL33-18C菌株之間，是否由于具有上述DNA片段的啟動(dòng)子的活性，而在scaur2基因的表達(dá)上具有明顯的差異，將用于證實(shí)啟動(dòng)子活性的重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)每個(gè)野生型菌株和具有短梗霉素抗性的菌株中?？蛇m用的野生型菌株的例子是啤酒糖酵母DKD8D菌株、啤酒糖酵母SH3328菌株(交配型c；基因型ura3-52，his4，thr4，leu2-3*112)等，而具有短梗霉素抗性的菌株的例子是啤酒糖酵母AL33-18C菌株。培養(yǎng)形成的重組細(xì)胞，收集生長(zhǎng)的細(xì)胞并勻漿。用鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)為底物測(cè)量(冷泉港實(shí)驗(yàn)室1972，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)雜志第352-355頁)粉碎的細(xì)胞勻漿的半乳糖苷酶的活性，由此β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)量可作為β-半乳糖苷酶的酶促活性來測(cè)量。結(jié)果是(包括scaur2基因表達(dá)比較的結(jié)果)，經(jīng)重組載體轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母AL33-18C菌株的重組細(xì)胞顯示出非常高的活性。因此，現(xiàn)在很清楚，存在誘導(dǎo)本發(fā)明的啟動(dòng)子高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。
然后，為證實(shí)這個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是什么，對(duì)啤酒糖酵母AL33-18C菌株進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果弄清了突變?cè)谝阎獮檗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(生物化學(xué)雜志262，(35)，16879-16879(1987))的多效藥物抗性基因中的PDRI基因中發(fā)生；本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄由所說PDR1基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)；本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠用PDR1基因產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
依據(jù)本發(fā)明，通過利用本發(fā)明的啟動(dòng)子，由PDR1基因產(chǎn)物控制連接到所說啟動(dòng)子的下游可表達(dá)位置上的基因的表達(dá)是可能的，所說啟動(dòng)子在有用的重組體蛋白質(zhì)等的制造中也是有用的。此外，當(dāng)酵母作為轉(zhuǎn)化用的宿主時(shí)，本發(fā)明的啟動(dòng)子對(duì)有用重組蛋白質(zhì)的大規(guī)模的產(chǎn)生是有用的，因?yàn)橹亟M細(xì)胞能在具有高營養(yǎng)的全營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而在這種培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖速率是高的，并且保持高細(xì)胞濃度。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以從啤酒糖酵母AL-33-18C菌株制備。通過利用包含本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列，現(xiàn)在制備能夠與所說的核苷酸序列雜交的、與本發(fā)明的啟動(dòng)子性質(zhì)相同的，對(duì)重組蛋白質(zhì)制造有用的啟動(dòng)子是可能的。所說啟動(dòng)子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
對(duì)通過雜交方法制備所需啟動(dòng)子的方法而言，可以使用例如下面的方法。這樣，首先，將從目的基因源獲得的染色體DNA與質(zhì)?；蚴删w載體連接并按照常規(guī)方法引入宿主，由此制備DNA文庫。在平板上培養(yǎng)文庫，將生長(zhǎng)的菌落或噬斑取到硝酸纖維素膜或者是尼龍膜上并進(jìn)行變性處理，使噬斑菌落中的DNA固定到膜上。在包含事先用32P(或類似標(biāo)記物)標(biāo)記的探針(就這里使用的探針而言，可以使用具有序列表中SEQ ID NO1和4的核苷酸序列或其部分的探針)的溶液中保持膜至溫?zé)幔谀ど闲纬蒁NA和探針之間的雜交體。這樣，例如，將其中固定有DNA的膜在溶液中于65℃下與所說探針雜交20小時(shí)，所說溶液包含6×SSC、1％月桂基硫酸鈉、100微克/毫升鮭精DNA和5×Denhardt溶液(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和菲可各0.1％)。雜交后，洗去非特異性吸附物，借助放射自顯影術(shù)(或類似方法)鑒定與探針形成雜交體的克隆質(zhì)粒或者噬菌體。重復(fù)這樣的操作直到雜交克隆成為單一的克隆為止。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的啟動(dòng)子被插入到如此制備的克隆質(zhì)?；蚴删w中。
通過例如以下方式測(cè)定形成的DNA的核苷酸序列，以證實(shí)所形成的DNA是不是目的啟動(dòng)子。
這樣，在通過雜交獲得克隆的質(zhì)粒的情況下，用試管(或類似器皿)培養(yǎng)重組體大腸桿菌，并用常規(guī)方法從重組體中提取質(zhì)粒。用限制酶切割質(zhì)粒，提取出所插入的片段并亞克隆到M13噬菌體載體(或類似載體)中，通過雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列。當(dāng)重組體是噬菌體時(shí)，基本采用相同的步驟來測(cè)定核苷酸序列。從培養(yǎng)到核苷酸序列測(cè)定的基本的實(shí)驗(yàn)方法在例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室T.Maniatis等，1982)中有描述。
為了證實(shí)形成的DNA是否為目的啟動(dòng)子，將證實(shí)的核苷酸序列與本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列以及在序列表中在SEQ ID NO1中提及的序列進(jìn)行比較，從而使其基因結(jié)構(gòu)得到闡明。
當(dāng)形成的DNA不含有啟動(dòng)子的所有區(qū)域時(shí)，通過合成DNA(基于所形成的DNA制備)經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的DNA中缺乏的區(qū)域，或者用DNA片段為探針進(jìn)一步篩選DNA文庫，由此可以測(cè)定與本發(fā)明啟動(dòng)子雜交的啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域的核苷酸序列。
例如，可以從對(duì)短梗霉素具有抗性的啤酒糖酵母L22-8B菌株獲得目的啟動(dòng)子，該菌株被作為基因源在日本公開專利出版物平-07/313,L72中提及。
進(jìn)而，在本發(fā)明啟動(dòng)子的核苷酸序列基礎(chǔ)上，進(jìn)行具有所說核苷酸序列的DNA的定點(diǎn)突變(至少一種核苷酸的取代、插入或缺失)，以修飾所說的核苷酸序列的一部分，由此，修飾本發(fā)明啟動(dòng)子的功能并產(chǎn)生類似于本發(fā)明啟動(dòng)子的啟動(dòng)子是可能的。關(guān)于定點(diǎn)突變，已知有幾種方法，例如缺口雙鏈體方法(酶學(xué)方法，154，350-367頁(1987))，尿嘧啶DNA方法(酶學(xué)方法，154，367-382頁(1987))，亞硝酸鹽法(美國國家科學(xué)院會(huì)議錄，79，7258-7262頁(1982))以及盒式誘變法(基因雜志，34，315-323頁(1985))。
在本發(fā)明啟動(dòng)子的核苷酸序列基礎(chǔ)上，將具有所說核苷酸序列或其部分的DNA連接到已知啟動(dòng)子的DNA或其一部分上或者用已知啟動(dòng)子的DNA或其一部分取代，以制備嵌合啟動(dòng)子(美國國家科學(xué)院會(huì)議錄，79，7266-7270頁(1991))是可能的，由此可以獲得與本發(fā)明啟動(dòng)子一樣，可由PDR1基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
這樣制備的啟動(dòng)子可以通過以下方法證實(shí)在細(xì)胞中是否起作用，即在其下游位置連接各種報(bào)導(dǎo)基因和通過與在本發(fā)明啟動(dòng)子上采用的相同方法測(cè)量啟動(dòng)子活性。
通過單獨(dú)或和終止子一起與適當(dāng)載體整合，本發(fā)明的啟動(dòng)子和能夠與所說啟動(dòng)子雜交且與本發(fā)明的啟動(dòng)子具有相同性質(zhì)的啟動(dòng)子可以被用作重組載體。就用于酵母的載體的情況下，能被利用的載體的例子是pYR型，pYC型，pYE型，pYI型等。一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因可以以可表達(dá)方向整合進(jìn)所說的重組載體中。此外，用包含信號(hào)序列的所說結(jié)構(gòu)基因整合的重組載體是優(yōu)選的，所說信號(hào)序列將從所說結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外。就用于所說重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和與結(jié)構(gòu)基因整合的重組載體而言，任何細(xì)胞都可用，只要本發(fā)明的啟動(dòng)子或能夠與本發(fā)明的啟動(dòng)子雜交且具有與本發(fā)明啟動(dòng)子相同性質(zhì)的啟動(dòng)子在該細(xì)胞中具有啟動(dòng)子活性，其優(yōu)選的例子是酵母。就用于將所說重組載體或具有結(jié)構(gòu)基因的重組載體轉(zhuǎn)化到那些細(xì)胞的方法而言，任何已知方法都可以使用，如原生質(zhì)體法、鋰醋酸鹽法、電穿孔法等。
此外，當(dāng)所說的重組載體或具有結(jié)構(gòu)基因的重組載體和具有PDR1基因的重組載體以可在合適載體中表達(dá)的方式整合，并轉(zhuǎn)化進(jìn)同一細(xì)胞中時(shí)，調(diào)節(jié)本發(fā)明的啟動(dòng)子或能夠與本發(fā)明的啟動(dòng)子雜交且具有與本發(fā)明啟動(dòng)子相同性質(zhì)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可能的。
而且，當(dāng)所說的重組載體或整合進(jìn)結(jié)構(gòu)基因(或類似基因)的重組載體用于無細(xì)胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成和PDR1基因產(chǎn)物從外部添加其中或從初期階段置于其中時(shí)，調(diào)節(jié)從本發(fā)明的啟動(dòng)子或能夠與本發(fā)明的啟動(dòng)子雜交且具有與本發(fā)明啟動(dòng)子相同性質(zhì)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可能的，并且以比通常的情況更好的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)合成也是可能的。
現(xiàn)在，將通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，盡管本發(fā)明不限于此。實(shí)施例1啤酒糖酵母的短梗霉素抗性突變體的分離將對(duì)短梗霉素A的敏感濃度為0.31微克/毫升的啤酒糖酵母DKD8D菌株(交配型a；基因型leu2-3*112，trip1，ura3-52，his4)的大約1×108個(gè)細(xì)胞懸浮在具有0.9％的氯化鈉的1毫升磷酸鹽緩沖液中。用3％(最終濃度)EMS在30℃的條件進(jìn)行突變90分鐘。用8毫升5％的硫狀硫酸鈉使EMS滅活，通過五分鐘的離心(2,500轉(zhuǎn)/分)回收處理后的細(xì)胞，用6毫升鹽溶液洗滌兩次并懸浮在2毫升YPD培養(yǎng)基(具有2％的葡萄糖、1％的酵母提取物和2％的聚胨)中。懸浮液在攪拌下于30℃保持五小時(shí)，涂布在具有濃度為1.5微克/毫升的短梗霉素A的YPD平板上(YPD培養(yǎng)基具有1.5％的瓊脂)，并培養(yǎng)三到四天。這樣得到的啤酒糖酵母菌株的抗性突變體甚至對(duì)濃度為25微克/毫升的短梗霉素A具有抗性，推測(cè)對(duì)許多其它化學(xué)藥品不具抗性而只對(duì)短梗霉素具有抗性。
所說的菌株被命名為啤酒糖酵母AL33-18C，于1995年5月11日保藏在日本國家生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，MITI(位于1-3，Higashi-1-chome，Tsukuba市，Ibaragi縣305日本)，保藏號(hào)為FERM P-14920，于1996年5月9日在原單位轉(zhuǎn)變?yōu)閲H保藏，保藏號(hào)為FERM BP-5529。實(shí)施例2啤酒糖酵母DKD8D菌株和啤酒糖酵母AL33-18C菌株中scaur2基因的表達(dá)用Jensen等的方法(美國國家科學(xué)院會(huì)議錄，80，3035-3039頁(1983))，從啤酒糖酵母菌株的野生型菌株啤酒糖酵母DKD8D和實(shí)施例1中制備的具有短梗霉素抗性的菌株啤酒糖酵母AL33-18C中提取總RNA并純化。然后將poly(A)RNA用oligotex-dT30(由Takara Shuzo制造)純化。用含有甲醛1.2％的瓊脂糖凝膠電泳分離純化的poly(A)RNA(2.5μg)，并在轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N型；由Amersham公司制造)上后固定。作為證實(shí)scaur2基因表達(dá)的探針，pSCAR2從大腸桿菌HB101/pSCAR2(FERM BP-4484)制備，所說大腸桿菌攜帶有質(zhì)粒pSCAR2，該質(zhì)粒包含來源于啤酒糖酵母L22-8B菌株的scaur2基因，該菌株是短梗霉素(日本公開專利出版物平-07/313,172提及的)抗性的，然后用HindIII(由Takara Shuzo制造)和PstI(由Takara Shuzo制造)對(duì)pSCAR2進(jìn)行雙重消化，隨后用瓊脂糖凝膠電泳收集和純化scaur2基因的HindIII-PstI片段(1.2kbp)。用(α-32P)dCTP標(biāo)記所說的DNA片段，將該DNA片段用作探針與上述固定的poly(A)RNA雜交。結(jié)果在圖1中給出。這樣，圖1是從野生型菌株或具有抗性的菌株獲得的mRNA通過含有甲醛的1.2％的瓊脂糖凝膠電泳并接著進(jìn)行Northern雜交之結(jié)果的放射自顯影。圖中泳道1和2分別表示從野生型菌株和抗生菌株獲得的mRNA。結(jié)果顯示，在啤酒糖酵母AL33-18C菌株中的scaur2 mRNA的表達(dá)比在啤酒糖酵母DKD8D菌株中的高50倍或更多。實(shí)施例3 scaur2基因啟動(dòng)子的克隆(1)scaur2基因的克隆。
為克隆scaur2基因的啟動(dòng)子，從啤酒糖酵母AL33-18C菌株克隆scaur2基因。
采用Philippsen等的方法(酶學(xué)方法雜志，194 169-175(1981))從實(shí)施例1中制備的具有短梗霉素抗性的菌株啤酒糖酵母AL33-18C中提取基因組DNA并純化。
將純化的基因組DNA(8μg)在37℃下，用HindIII5單位進(jìn)行10分鐘的部分消化，用苯酚-三氯甲烷脫蛋白并用乙醇沉淀，以給出一種部分消化DNA。將這種DNA在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，分離并純化3-15kbp范圍的DNA。將這種DNA連接到酵母-大腸桿菌穿梭載體pWH5(2μg)上，該載體已用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo制造)被HindIII(質(zhì)粒，15，156-158頁(1986))完全消化，然后將這種DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌HB101中，以制備基因組文庫。將包含基因組文庫的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)一夜。將形成的菌落轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N型)上并進(jìn)行菌落雜交。作為探針，使用8.5kbp的DNA片段，該片段包含用于實(shí)施例2中的scaur2基因，其是日本公開專利出版物平-07/313,172中提及的，并且用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(由TakaraShuzo制造)用(α-32P)dCTP標(biāo)記過。篩選2×104個(gè)菌落的結(jié)果是得到與探針雜交的幾個(gè)克隆。那些克隆包含由4.6kbp和3.9kbp的HindIII DNA片段組成的8.5kbp的DNA片段。從那些DNA片段的限制酶圖譜發(fā)現(xiàn)其是在日本公開專利出版物平-07/313,172上提到的scaur2基因。所說的8.5kbp的DNA片段在圖2中顯示。
將形成的8.5kbp的DNA片段亞克隆到pUC118(由Takara Shuzo制造)中，然后測(cè)定DNA核苷酸序列(SEQ ID NO2)?；谛蛄斜碇蠸EQ ID NO2的核苷酸序列估計(jì)由序列表中SEQ ID NO3代表的氨基酸序列。
此外，將所說8.5kbp的DNA片段亞克隆到pUC118(由Takara Shuzo制造)的HindIII位點(diǎn)上，該質(zhì)粒被命名為pUscaur2，具有所說的pUscaur2的大腸桿菌被命名為大腸桿菌HB101/pUscaur2。
(2)scaur2基因的啟動(dòng)子的克隆和核苷酸序列的測(cè)定。
實(shí)施例3-(1)中制備的pUscaur2由限制酶BamHI(由Takara Shuzo制造)消化，用0.8％瓊脂糖進(jìn)行電泳，從中提取并純化被認(rèn)為包含啟動(dòng)子的大約2kbp的DNA片段。然后，用DNA平端化試劑盒(由Takara Shuzo制造)使所說的DNA片段的變成平端形式，并插入到pUC118的SmaI位點(diǎn)中。形成的質(zhì)粒用于測(cè)定核苷酸序列。在測(cè)定的核苷酸序列中，處在scaur2基因上游的序列由序列表中的SEQ ID NO4顯示。
然后，為了僅獲得具有處在scaur2基因上游的啟動(dòng)子的DNA片段，設(shè)計(jì)一種引物，其中HindIII識(shí)別序列被添加到與由序列表中的SEQ ID NO4顯示的上述DNA片段的上部區(qū)域相應(yīng)的核苷酸序列的5′-末端側(cè)。所說引物的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO5顯示。接下來，設(shè)計(jì)另一種引物，其中BamHI識(shí)別序列被添加到與序列表中的SEQ ID NO6顯示的scaur2基因的上游區(qū)域相應(yīng)的核苷酸序列的5′-末端側(cè)。所說的引物的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO6顯示。利用這兩種引物并以質(zhì)粒pUscaur2作為模板進(jìn)行PCR。PCR的產(chǎn)物由HindIII-BamHI消化并用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從而使由PCR得到的大約1.4kbp的HindIII-BamHI DNA片段得到分離和純化。將所說的DNA片段克隆到pUC119的HindIII-BamHI位點(diǎn)，以測(cè)定核苷酸序列。在所說的核苷酸序列中，與pUscaur2相應(yīng)的序列由序列表中的SEQ ID NO1顯示。
(3)scaur2基因終止子的克隆和核苷酸序列的測(cè)定。
為了克隆包含在scaur2基因的下游的終止子的DNA片段，設(shè)計(jì)一種引物，其中SmaI識(shí)別序列被添加加到與scaur2基因的下游區(qū)相應(yīng)的核苷酸序列的5′-末端側(cè)。所說引物的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO7顯示。
用所說的引物和M13引物M3(由Takara Shuzo制造)以pUscaur2為模板進(jìn)行PCR。用SmaI(Takara Shuzo制造)消化PCR產(chǎn)物，用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從而分離和純化由PCR獲得的大約1.1kbp的SmaI DNA片段。將所說DNA片段克隆到pUC119的SmaI位點(diǎn)，以測(cè)定核苷酸序列。在所說的核苷酸序列中，與pUscaur2相應(yīng)的序列由序列表中的SEQ ID NO8顯示。實(shí)施例4.啟動(dòng)子活性的測(cè)定(1)其中β-半乳糖苷酶引入scaur2基因的啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒的構(gòu)建。
將包含實(shí)施例3-(2)中獲得的啟動(dòng)子的HindIII-BamHI DNA片段(大約1.4kbp)插入到pUC119的HindIII-BamHI位點(diǎn)，然后以與包含啟動(dòng)子的DNA片段相同的方向插入包含實(shí)施例3-(3)中所獲得的終止子的SmaI DNA片段(大約1.1kbp)，由此制備質(zhì)粒pUscaur2P-T。
下一步，按照下列方法將β-半乳糖苷酶基因插入到pUscaur2P-T中。這樣，就β-半乳糖苷酶(lacZ)基因而言，用BamHI切割質(zhì)粒pMC1871(酶學(xué)方法雜志，100，293-308(1983))，并以0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離所需的大約3.1kbp的DNA片段，從而回收和純化該片段。將這一3.1kbp的DNA片段以與上面描述的包含啟動(dòng)子DNA片段相同的方向插入到pUscaur2P-T的BamHI位點(diǎn)，以給出具有在所說啟動(dòng)子下游的β-半乳糖苷酶基因的pUAR2LZ質(zhì)粒。
(2)其中β-半乳糖苷酶基因被引入到scaur2啟動(dòng)子的下游的酵母復(fù)制pYC質(zhì)粒的構(gòu)建。
用HindIII消化pUAR2LZ，包含scaur2基因啟動(dòng)子、scaur2基因的終止子和β-半乳糖苷酶基因的大約5.4kbp的DNA片段通過用8％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收和純化該片段。將被DNA平端化試劑盒平端化的5.4kbp的DNA片段與為pYC載體的pYEUra3(由Clontech制造)的平端化BamHI-EcoRiI位點(diǎn)連接。這樣制備的質(zhì)粒被命名為pYCAR2LZ。
(3)來自scaur2基因的啟動(dòng)子的β-半乳糖苷酶基因在野生型菌株和短梗霉素抗性菌株中的表達(dá)。
將實(shí)施例4-(2)獲得的pYCAR2LZ用鋰醋酸鹽法轉(zhuǎn)化進(jìn)啤酒糖酵母SH3328菌株(交配型α；基因型ura3-52，his4，thr4，leu2-3*112)(野生型)和啤酒糖酵母AL33-18C菌株(短梗霉素抗性型)。
這樣，將細(xì)胞懸浮在0.1M鋰醋酸鹽溶液中(pH7.5)，此外加入5μg的pYCAR2LZ和850μl(具有0.1M鋰醋酸鹽的)40％的聚乙二醇，將混合物在30℃下保持30分鐘，在42℃下進(jìn)行15分鐘加工，離心，在5ml YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基包含1％的酵母提取物，2％的聚胨和2％的葡萄糖)收集的細(xì)胞。將培養(yǎng)液接種到SD瓊脂培養(yǎng)基(一種無尿嘧啶的基本瓊脂培養(yǎng)基；包含0.67％的無氨基酸酵母氮基質(zhì)，2％的葡萄糖和2％的瓊脂)上，在30℃下培養(yǎng)。在三至四天后，得到已變成不需尿嘧啶的轉(zhuǎn)化體。然后為檢驗(yàn)lacZ的表達(dá)，將那些轉(zhuǎn)化體接種到平板上(平板是SD瓊脂培養(yǎng)基或YPD瓊脂培養(yǎng)基，含有0.004％的X-gal和0.1M的磷酸鉀緩沖液(pH7.0))。在30℃培養(yǎng)兩至三天后，比較轉(zhuǎn)化體菌落藍(lán)色的變化，觀察到從啤酒糖酵母SH3328菌株獲得的轉(zhuǎn)化體為淺藍(lán)色，從啤酒糖酵母AL33-18C菌株獲得的轉(zhuǎn)化體形成藍(lán)到深藍(lán)色的菌落。這樣，證實(shí)了由scaur2基因啟動(dòng)子控制的β-半乳糖苷酶的表達(dá)在抗性菌株中具有顯著的增加。在抗性菌株中表達(dá)的增加進(jìn)一步通過測(cè)量β-半乳糖苷酶活性得到證實(shí)。為了測(cè)量活性，將轉(zhuǎn)化體在30℃下在YPD斜面上培養(yǎng)一夜。刮取細(xì)胞并懸浮在鹽溶液中使OD600為大約15。將細(xì)胞懸液(100μl)與玻璃珠(425-600微米；由西格馬公司制造)混合，用渦旋攪拌器勻漿(每次30秒，共三次)細(xì)胞，并用冰冷卻。然后將Z緩沖液(具有0.1M鈉磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，0.01M的KCl，1mM的MgSO4和0.05M的2-巰基乙醇)添加到勻漿中使總體積達(dá)到1ml。用ONPG為底物(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)雜志，第352-355頁(1972)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，用勻漿(0.5ml)測(cè)量半乳糖苷酶活性。這樣，使0.5ml細(xì)胞勻漿和0.5ml Z緩沖液混合，在28℃下保持混合物五分鐘，再加入0.2ml的ONPG溶液(4毫克/毫升磷酸鹽緩沖液(pH7.0))以啟動(dòng)酶促反應(yīng)。在28℃下保持20-40分鐘，然后加入0.5ml 1M Na2CO3使反應(yīng)終止。此后，在10,000rpm下離心一分鐘，測(cè)量上清液的OD420和OD550?；钚杂上铝斜磉_(dá)式計(jì)算。
活性(單位/OD600)＝1000×OD420-1.75×OD550/t×v×OD600其中OD420，OD550在反應(yīng)溶液的上清液中測(cè)量的OD600細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度t反應(yīng)時(shí)間(單位分鐘)v用于反應(yīng)的細(xì)胞懸液的量(ml)結(jié)果在表4中給出。如表4所示，在scaur2基因啟動(dòng)子控制下的β-半乳糖苷酶的表達(dá)，在短梗霉素抗性菌株啤酒糖酵母AL33-18C中比在野生型菌株啤酒糖酵母SH3328中高大約20倍。
表 4活性(單位/OD600)具有pYCAR2LZ的野生型菌株(啤酒糖酵母SH3328)克隆12.12克隆21.99克隆32.09克隆41.86克隆52.28具有pYCAR2LZ的抗性菌株(啤酒糖酵母AL33-18C)克隆136.6克隆254.4克隆348.6克隆453.8克隆545.7實(shí)施例5短梗霉素抗性菌株啤酒糖酵母AL33-18C的抗性基因的鑒別對(duì)啤酒糖酵母AL33-18C菌株進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)抗性基因存在于鄰近第七染色體著絲點(diǎn)，從四分體分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)它鄰近LEU1基因標(biāo)記(＜4.1cM(分摩))。已知為多效藥物抗性基因的PDR1基因出現(xiàn)在這個(gè)位置，現(xiàn)在清楚了，在啤酒糖酵母AL33-18C菌株中，突變發(fā)生于PDR1基因之中。PDR1基因和scaur2基因是完全不同的基因，此外，PDR1基因產(chǎn)物已知為轉(zhuǎn)錄控制因子，從而發(fā)現(xiàn)PDR1基因產(chǎn)物控制scaur2基因的轉(zhuǎn)錄。
如上所述，本發(fā)明提供了能夠轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子，它對(duì)用基因重組技術(shù)制造異源蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物來說是有用的。所說啟動(dòng)子可用于全營養(yǎng)培養(yǎng)基中，另外由PDR1基因產(chǎn)物進(jìn)行其轉(zhuǎn)錄控制是可能的。
上述的出芽短梗霉No.R106菌株已被指定為這一名稱，并按照布達(dá)佩斯條約，于1988年7月8日保藏在日本國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，MITI(位于1-3，Higashi-1-chome，Tsukuba市，Ibaragi縣305日本)，保藏號(hào)為FERM BP-1983。
此外，上述攜帶質(zhì)粒pSCAR2的大腸桿菌HB101被命名為大腸桿菌HB101/pSCAR2，并以保藏號(hào)FERMBP-4484保藏在日本國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，MITI(位于1-3，Higashi-1-chome，Tsukuba市，Ibaragi縣305日本)(原始保藏日期1993年4月13日；請(qǐng)求轉(zhuǎn)變?yōu)閲H保藏的日期1993年12月1日)。
序列表SEQ ID NO1長(zhǎng)度1 366類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型基因組DNA序列描述TCCAACCCTG CGCATTCACC ATTATCAAAC TCGTCTTTTT TGTCTTTACG TTTTAATTTA 60GCACCGAGCC CAACGTTGTC GTCCTTAATT GACACTTTGA TATGCGAAGT GTTCGAATTC 120ATGGGGGATA ACCCCAGACC CATACCGGGT TTCCATCCAA ACTTTTCTAG AAATTGGTGC 180CCGAATCTCG AGGTGTCGTT ACTCCATGCC GTATTTCTGG GGTCTAAACC AAACCGCTGT 240TTGGTTCTTG TAGCTGCCAA ACCCATTCTG CTTCTTTGTT TAATGGTGTA AGCTGCCTAT 300ATGTTACTAT TGAGTACTCA TCTCATCGCT TCTTTCAGAA CAAAATTTTT CATATTTTTT 360TTTTTTCCTT TTCTTTTTTT TTTTTTCTTT GACTGTTACC CGGTTGTTTA TATTTGTAGG 420AAAACAACAA CGACAGAGAA AATATCCTTG CAGTGGCGGC TAATTTGTTA GTTGACTGAT 480TGATCACCTT CACTTATTAA AGTAAAATCA GCATACAAGA GATCAGAAGG GAGAAAGAGA 540GTGGGCAAGG CTATAGTACT TTGAAGAAAG CATCTTTGAA CCGACTAGTT CTCTTCACAA 600GCAAAATCTA TATGACTAAC CGCAAGGGGC AAAGGGTTGT GAGAGGGCCC GTCTTTCTCC 660CGCTATAGCC GTCACTGGTA TCCCTCCTGG CTGCACAAAT CCGATAGAAA GGGGAAGAAG 720GAAGTTTAGT GCCACCTTAT AGCACGCAGT TACTGTTTAC GCTAAGGAGA GGCATACTCA 780ATTTTTATTA GTCGCCTTCT TTAGTTGCTG 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ATACATATAT ATATTTATTA CACACATCTG TCAGAGGTAG CTAGCGAAGG 300TGTCACTGAA ATATTTTTTG TTCCAGTTAG TATAAATACG GAGGTAGAAC AGCTCTCCGC 360GTGTATATCT TTTTTTGCGC TATACAAGAA CAGGAAGAAC GCATTTCCAT ACCTTTTTCT 420CCTTACAGGT GCCCTCTGAG TAGTGTCACG AACGAGGAAA AAGATTAATA TTACTGTTTT 480TATATTCAAA AAGAGTAAAG CCGTTGCTAT ATACGAATAT GACGATTACC GTGGGGGATG 540CAGTTTCGGA GACGGAGCTG GAAAACAAAA GTCAAAACGT GGTACTATCT CCCAAGGCAT 600CTGCTTCTTC AGACATAAGC ACAGATGTTG ATAAAGACAC ATCGTCTTCT TGGGATGACA 660AATCTTTGCT GCCTACAGGT GAATATATTG TGGACAGAAA TAAGCCCCAA ACCTACTTGA 720ATAGCGATGA TATCGAAAAA GTGACAGAAT CTGATATTTT CCCTCAGAAA CGTCTGTTTT 780CATTCTTGCA CTCTAAGAAA ATTCCAGAAG TACCACAAAC CGATGACGAG AGGAAGATAT 840ATCCTCTGTT CCATACAAAT ATTATCTCTA ACATGTTTTT TTGGTGGGTT CTACCCATCC 900TGCGAGTTGG TTATAAGAGA ACGATACAGC CGAACGATCT CTTCAAAATG GATCCGAGGA 960TGTCTATAGA GACCCTTTAT GACGACTTTG AAAAAAACAT GATTTACTAT TTTGAGAAGA 1020CGAGGAAAAA ATACCGTAAA AGACATCCAG AAGCGACAGA AGAAGAGGTT ATGGAAAATG 1080CCAAACTACC TAAACATACA GTTCTGAGAG CTTTATTATT 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2820AGTTGTCACT GATTGAGAGA GCTTCTAGAG TCATCGTTTT AGGTACTGAT GGCCAAGTCG 2880ATATTGGTAC TGTTGATGAG CTAAAAGCTC GTAATCAAAC TTTGATAAAT CTTTTACAAT 2940TCTCTTCTCA AAATTCGGAG AAAGAGGATG AAGAACAGGA AGCGGTTGTT TCCGGTGAAT 3000TGGGACAACT AAAATATGAA CCAGAGGTAA AGGAATTGAC TGAACTGAAG AAAAAGGCTA 3060CAGAAATGTC ACAAACTGCA AATAGTGGTA AAATTGTAGC GGATGGTCAT ACTAGTAGTA 3120AAGAAGAAAG AGCAGTCAAT AGTATCAGTC TGAAAATATA CCGTGAATAC ATTAAAGCTG 3180CAGTAGGTAA GTGGGGTTTT ATCGCACTAC CGTTGTATGC AATTTTAGTC GTTGGAACCA 3240CATTCTGCTC ACTTTTTTCT TCCGTTTGGT TATCTTACTG GACTGAGAAT AAATTCAAAA 3300ACAGACCACC CAGTTTTTAT ATGGGTCTTT ACTCCTTCTT TGTGTTTGCT GCTTTCATAT 3360TCATGAATGG CCAGTTCACC ATACTTTGCG CAATGGGTAT TATGGCATCG AAATGGTTAA 3420ATTTGAGGGC TGTGAAAAGA ATTTTACACA CTCCAATGTC ATACATAGAT ACCACACCTT 3480TGGGACGTAT TCTGAACAGA TTCACAAAAG ATACAGATAG CTTAGATAAT GAGTTAACCG 3540AAAGTTTACG GTTGATGACA TCTCAATTTG CTAATATTGT AGGTGTTTGC GTCATGTGTA 3600TTGTTTACTT GCCGTGGTTT GCTATCGCAA TTCCGTTTCT TTTGGTCATC TTTGTTCTGA 3660TTGCTGATCA 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NO3長(zhǎng)度1477類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述Met Thr Ile Thr Val Gly Asp Ala Val Ser Glu Thr Glu Leu Glu5 10 15Asn Lys Ser Gln Asn Val Val Leu Ser Pro Lys Ala Ser Ala Ser20 25 30Ser Asp Ile Ser Thr Asp Val Asp Lys Asp Thr Ser Ser Ser Trp
35 40 45Asp Asp Lys Ser Leu Leu Pro Thr Gly Glu Tyr Ile Val Asp Arg50 55 60Asn Lys Pro Gln Thr Tyr Leu Asn Ser Asp Asp Ile Glu Lys Val65 70 75Thr Glu Ser Asp Ile Phe Pro Gln Lys Arg Leu Phe Ser Phe Leu80 85 90His Ser Lys Lys Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr Asp Asp Glu Arg95 100 105Lys Ile Tyr Pro Leu Phe His Thr Asn Ile Ile Ser Asn Met Phe110 115 120Phe Trp Trp Val Leu Pro Ile Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr125 130 135Ile Gln Pro Asn Asp Leu Phe Lys Met Asp Pro Arg Met Ser Ile140 145 150Glu Thr Leu Tyr Asp Asp Phe Glu Lys Asn Met Ile Tyr Tyr Phe155 160 165Glu Lys Thr Arg Lys Lys Tyr Arg Lys Arg His Pro Glu Ala Thr170 175 180Glu Glu Glu Val Met Glu Asn Ala Lys Leu Pro Lys His Thr Val185 190 195Leu Arg Ala Leu Leu Phe Thr Phe Lys Lys Gln Tyr Phe Met Ser200 205 210Ile Val Phe Ala Ile Leu Ala Asn Cys Thr Ser Gly Phe Asn Pro215 220 225Met Ile Thr Lys Arg Leu Ile Glu Phe Val Glu Glu Lys Ala Ile230 235 240Phe His Ser Met His Val Asn Lys Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Gly245 250 255Ala Cys Leu Met Met Phe Val Asn Gly Leu Thr Phe Asn His Phe260 265 270Phe His Thr Ser Gln Leu Thr Gly Val Gln Ala Lys Ser Ile Leu275 280 285Thr Lys Ala Ala Met Lys Lys Met Phe Asn Ala Ser Asn Tyr Ala290 295 300Arg His Cys Phe Pro Asn Gly Lys Val Thr Ser Phe Val Thr Thr305 310 315Asp Leu Ala Arg Ile Glu Phe Ala Leu Ser Phe Gln Pro Phe Leu320 325 330Ala Gly Phe Pro Ala Ile Leu Ala Ile Cys Ile Val Leu Leu Ile335 340 345Val Asn Leu Gly Pro Ile Ala Leu Val Gly le Gly Ile Phe Phe350 355 360Gly Gly Phe Phe Ile Ser Leu Phe Ala Phe Lys Leu Ile Leu Gly365 370 375Phe Arg Ile Ala Ala Asn Ile Phe Thr Asp Ala Arg Val Thr Met380 385 390Met Arg Glu Val Leu Asn Asn Ile Lys Met Ile Lys Tyr Tyr Thr395 400 405Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Lys Asn Ile Gln Asp Ile Arg Thr Lys410 415 420Glu Ile Ser Lys Val Arg Lys Met Gln Leu Ser Arg Asn Phe Leu425 430 435Ile Ala Met Ala Met Ser Leu Pro Ser Ile Ala Ser Leu Val Thr440 445 450Phe Leu Ala Met Tyr Lys Val Asn Lys Gly Gly Arg Gln Pro Gly455 460 465Asn Ile Phe Ala Ser Leu Ser Leu Phe Gln Val Leu Ser Leu Gln470 475 480Met Phe Phe Leu Pro Ile Ala Ile Gly Thr Gly Ile Asp Met Ile485 490 495Ile Gly Leu Gly Arg Leu Gln Ser Leu Leu Glu Ala Pro Glu Asp500 505 510Asp Pro Asn Gln Met Ile Glu Met Lys Pro Ser Pro Gly Phe Asp515 520 525Pro Lys Leu Ala Leu Lys Met Thr His Cys Ser Phe Glu Trp Glu530 535 540Asp Tyr Glu Leu Asn Asp Ala Ile Glu Glu Ala Lys Gly Glu Ala545 550 555Lys Asp Glu Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Arg Lys Asp Thr Trp560 565 570Gly Lys Pro Ser Ala Ser Thr Asn Lys Ala Lys Arg Leu Asp Asn575 580 585Met Leu Lys Asp Arg Asp Gly Pro Glu Asp Leu Glu Lys Thr Ser590 595 600Phe Arg Gly Phe Lys Asp Leu Asn Phe Asp Ile Lys Lys Gly Glu605 610 615Phe Ile Met Ile Thr Gly Pro Ile Gly Thr Gly Lys Ser Ser Leu620 625 630Leu Asn Ala Met Ala Gly Ser Met Arg Lys Ile Asp Gly Lys Val635 640 645Glu Val Asn Gly Asp Leu Leu Met Cys Gly Tyr Pro Trp Ile Gln650 655 660Asn Ala Ser Val Arg Asp Asn Ile Ile Phe Gly Ser Pro Phe Asn665 670 675Lys Glu Lys Tyr Asp Glu Val Val Arg Val Cys Ser Leu Lys 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Ile Leu Val Val Gly Thr Thr Phe Cys Ser Leu Phe Ser Ser905 910 915Val Trp Leu Ser Tyr Trp Thr Glu Asn Lys Phe Lys Asn Arg Pro920 925 930Pro Ser Phe Tyr Met Gly Leu Tyr Ser Phe Phe Val Phe Ala Ala935 940 945Phe Ile Phe Met Asn Gly Gln Phe Thr Ile Leu Cys Ala Met Gly950 955 960Ile Met Ala Ser Lys Trp Leu Asn Leu Arg Ala Val Lys Arg Ile965 970 975Leu His Thr Pro Met Ser Tyr Ile Asp Thr Thr Pro Leu Gly Arg980 985 990Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Ser Leu Asp Asn Glu99510001005Leu Thr Glu Ser Leu Arg Leu Met Thr Ser Gln Phe Ala Asn Ile101010151020Val Gly Val Cys Val Met Cys Ile Val Tyr Leu Pro Trp Phe Ala102510301035Ile Ala Ile Pro Phe Leu Leu Val Ile Phe Val Leu Ile Ala Asp104010451050His Tyr Gln Ser Ser Gly Arg Glu Ile Lys Arg Leu Glu Ala Val105510601065Gln Arg Ser Phe Val Tyr Asn Asn Leu Asn Glu Val Leu Gly Gly107010751080Met Asp Thr Ile Lys Ala Tyr Arg Ser Gln Glu Arg Phe Leu Ala108510901095Lys Ser Asp Phe Leu Ile Asn Lys Met Asn Glu Ala Gly Tyr Leu110011051110Val Val Val Leu 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Gly Gly Ala Ile Ala Lys Asp Asp Leu Pro132513301335Glu Val Lys Leu Gln Lys Pro Asp Glu Asn Gly Thr His Gly Lys134013451350Met His Lys Phe His Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Glu Gly Ser135513601365Asn Phe Ser Leu Gly Glu Arg Gln Leu Leu Ala Leu Thr Arg Ala137013751380Leu Val Arg Gln Ser Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser138513901395Ser Val Asp Tyr Glu Thr Asp Gly Lys Ile Gln Thr Arg Ile Val140014051410Glu Glu Phe Gly Asp Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu141514201425Lys Thr Ile Val Asn Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly143014351440Glu Val Ala Glu Phe Asp Thr Pro Trp Thr Leu Phe Ser Gln Glu144514501455Asp Ser Ile Phe Arg Ser Met Cys Ser Arg Ser Gly Ile Val Glu146014651470Asn Asp Phe Glu Asn Arg Ser1475SEQ ID NO4長(zhǎng)度1512類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型基因組DNA序列描述GGATCCCACG TGCTTGCTAA ACTTCACCCT TCACAAAATG GATACCCCAT TTTCCGTCAA60TAATCTTCTG CTTTCTCTGC GTGTCCAATT CCTCTGATAT TTTGCTTTCC TTTCCGTTCA 120GCCTACCAAG AATTCGCTGG AAGACATCCA ACCCTGCGCA TTCACCATTA TCAAACTCGT 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1.一種DNA，該DNA是一種由序列表中SEQ ID NO1或其部分所代表的且在酵母中具有啟動(dòng)子活性的DNA。
2.按照權(quán)利要求1的DNA，其中所說的DNA是轉(zhuǎn)錄上可由PDR1基因產(chǎn)物控制的。
3.一種DNA，該DNA可與權(quán)利要求1所說的DNA雜交且在酵母中具有啟動(dòng)子活性。
4.按照權(quán)利要求1-3之任一的DNA，其中以可表達(dá)的方式連接了異源基因。
5.按照權(quán)利要求4的DNA，其中所說的異源基因是選自編碼蛋白質(zhì)的核酸、反義DNA、反義RNA、編碼引誘物和核酶的核酸的一種核酸。
6.一種載體，該載體包含按照權(quán)利要求1-5之任一的DNA。
7.按照權(quán)利要求6載體，其中所說的載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。
8.一種引入了權(quán)利要求4或5的DNA的酵母。
9.一種由權(quán)利要求6或7的載體轉(zhuǎn)化的酵母。
10.一種通過酵母制造蛋白質(zhì)的方法，其特征在于培養(yǎng)一種酵母，然后從所說的培養(yǎng)產(chǎn)物中收獲蛋白質(zhì)，所說的酵母是由包含DNA的載體轉(zhuǎn)化過的，所說DNA是通過以可表達(dá)的方式在按照權(quán)利要求1-3之任一的DNA下游連接上編碼蛋白質(zhì)的核酸獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來源于酵母的啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子可以用于全營養(yǎng)培養(yǎng)基中,并且是轉(zhuǎn)錄上可由PDR1基因產(chǎn)物控制的。因此,本發(fā)明提供了一種由序列表中SEQ ID NO:1或其部分所代表的且在酵母中具有啟動(dòng)子活性的DNA;一種轉(zhuǎn)錄上可由PDR1基因產(chǎn)物控制的且具有以上提到的啟動(dòng)子活性的DNA;一種可與上述DNA雜交且在酵母中具有啟動(dòng)子活性的DNA。
文檔編號(hào)C07K14/37GK1194004SQ96194289
公開日1998年9月23日 申請(qǐng)日期1996年5月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月30日
發(fā)明者大門尚志, 竹迫一任, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社