專利名稱：：具有更長(zhǎng)半衰期的變異多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及被突變以含有補(bǔ)救受體結(jié)合表位的多肽。更具體地，本發(fā)明涉及這樣的多肽，它通過(guò)腎臟而被清除，并具有來(lái)自IgG分子Fc區(qū)的表位，從而有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。相關(guān)文獻(xiàn)的描述1964年提出，與血管內(nèi)間隙快速相平衡地存在著特異性受體，它們保護(hù)IgG分子不被降解。Brambell等人，Nature，2031352-2355(1964)。還參見(jiàn)Brambell，TheLancet，1087-1093(1965)。已表明，腎臟是免疫球蛋白片段分解代謝的主要場(chǎng)所，負(fù)責(zé)約90％的內(nèi)源分解代謝。Wochner等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，126207(1967)。受體的存在暗示，Ig分子具有必須與這種受體結(jié)合的特異性序列或構(gòu)象決定簇。因?yàn)榈鞍酌附馑a(chǎn)生的IgG的Fc區(qū)具有與完整IgG分子一樣的體內(nèi)半衰期而且Fab片段被快速地降解(Spiegelberg和Wiegle，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，121323-338；Waldmann和Ghetie，“免疫球蛋白的分解代謝”(＂CatabolismofImmunoglobulins＂)，ProgressinImmunol.，11187-1191[AcademicPress，NewYork1971]；Spiegelberg，AdvancesinImmunology，Vol.19，F(xiàn).J.Dixon和H.G.Kinkel，eds.[AcademicPress，NewYork1974]，pp.259-294；并總結(jié)于Zuckier等人，Semin.Nucl.Med，19166-186)，所以據(jù)信小鼠IgG2b的相關(guān)序列位于CH2或CH3結(jié)構(gòu)域，而且缺失一個(gè)或另一個(gè)結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致快速降解。事實(shí)上，用胰蛋白酶消化Fc片段而生產(chǎn)的人IgG的CH2結(jié)構(gòu)域片段，與Fc片段或IgG分子一樣始終存在于兔的循環(huán)中；與之相反，用胰蛋白酶消化Fc片段也生產(chǎn)的人IgG的CH3結(jié)構(gòu)域片段(pFc′)被快速清除，這表明人IgG的分解代謝位點(diǎn)在CH2結(jié)構(gòu)域中。Ellerson等人，J.Immunol.，116510(1976)；Yasmeen等人，J.Immunol.，116518(1976)。其他研究已表明，CH3結(jié)構(gòu)域的序列，在確定IgG2bT和IgG2bh抗體在小鼠中的不同血管內(nèi)半衰期方面至關(guān)重要。Pollock等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，202021-2027(1990)。不與高親和性Fc受體FcR1或C1q結(jié)合的IgG變異體的分解代謝率，不同于親代野生型抗體的清除速率，這表明分解代謝位點(diǎn)不同于FcR1或C1q結(jié)合中所涉及的位點(diǎn)。Wawrzynczak等人，Molec.Immunol.，29221(1992)。而且，從IgG分子或Fc片段上去除碳水化合物殘基對(duì)體內(nèi)半衰期沒(méi)有影響或影響很小，影響的程度取決于IgG分子的同種型。(Nose和Wigzell，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，806632(1983)；Tao和Morrison，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，1432595(1989)；Wawrzynczak等人，分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)，29213(1992))。已發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌A蛋白-IgG復(fù)合物與未復(fù)合的IgG分子相比，能更快地從血清中清除掉。Dima等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，13605(1983)。為了確定靠近Fc-SpA界面處的殘基是否與IgG清除有關(guān)，Kim等人(歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，24542-548(1994))進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，以改變衍生自鼠免疫球蛋白G1分子的重組Fc-鉸鏈片段的氨基酸殘基，并確定這些突變對(duì)Fc-鉸鏈片段的藥物動(dòng)力學(xué)方面的影響。作者表明，IgG1分子的控制分解代謝速率的位點(diǎn)(分解代謝位點(diǎn))位于CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面，而且與葡萄球菌A蛋白結(jié)合位點(diǎn)是重迭的。還請(qǐng)參見(jiàn)1993年11月11日出版的WO93/22332。在Zuckier等人癌癥(Cancer)，73794-799(1994)中還研究了集中分解代謝現(xiàn)象。Masson，J.Autoimmunity，6683-689(1993)中也論述了IgG分解代謝。WO94/04689公開(kāi)了一種具有細(xì)胞毒結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的肽的蛋白質(zhì)，它含有IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其有在哺乳動(dòng)物血清中的半衰期增加的特性。人Fc片段及其與金黃色葡萄球菌A蛋白的片段B所形成的復(fù)合體的立體圖，由Deisenhofer提供(生物化學(xué)(Biochemistry)，202364(1981))。已表明，當(dāng)有效分子大小超過(guò)70kDa(腎小球過(guò)濾截?cái)啻笮?時(shí)，清除被大大降低。Knauf等人，＂用水溶性聚合物化學(xué)修飾的重白細(xì)胞組介素-2在在鼠中的全身清除與有效分子大小的關(guān)系(RelationshipofEffectiveMolecularSizetoSystemicClearanceinRatsofRecombinantInterleukin-2ChemicallyModifiedwithWater-solublePolymers)＂J.Biochem.，26315064-15070(1988)。發(fā)明概述因此，在一個(gè)例子中，本發(fā)明提供了一種感興趣多肽的多肽變異體，該感興趣的多肽是從腎臟被清除掉的而且不含IgG的Fc區(qū)，該變異體含有IgG的Fc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，而且該變異體具有比感興趣多肽更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。在另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼多肽變異體的核酸、含有該核酸的可復(fù)制載體、含有核酸的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生多肽變異體的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽變異體。核酸分子可以是未標(biāo)記的或用可檢測(cè)分子標(biāo)記的。另一方面，本發(fā)明提供了一種不是Fc的多肽，該多肽含有一個(gè)或多個(gè)下列序列(5′至3′)HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，而且該多肽還含有序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備多肽變異體的方法，它包括對(duì)從腎臟被清除的而且不含IgG的Fc區(qū)的感興趣多肽進(jìn)行改變，從而使其含有IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，而且體內(nèi)半衰期更長(zhǎng)。在另一例子中，本發(fā)明提供了一種制備具有更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的多肽變異體的方法，它包括(1)鑒別出IgG分子Fc區(qū)上的補(bǔ)救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)象；(2)改變從腎臟被清除的而且不含IgG的Fc區(qū)的感興趣多肽，使其含有所鑒別的結(jié)合表位的序列和構(gòu)象；(3)測(cè)試步驟(2)中改變的多肽是否有比感興趣多肽更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期；和(4)如果該多肽沒(méi)有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，進(jìn)一步改變感興趣多肽的序列以包含所鑒別的結(jié)合表位的序列和構(gòu)象，并測(cè)試是否有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，直到獲得更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。在另一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)試LFA-1-介導(dǎo)的疾病的方法，它包括給需要這種治療的哺乳動(dòng)物尤其是病人，施用有效量的上述變異體，其中該多肽是Fab、(Fab′)2、二體、Fv片段、單鏈Fv片段或受體，并且該多肽作為L(zhǎng)FA-1拮抗劑。更佳地，該變異體是具有此處所述更長(zhǎng)血清半衰期的抗-LFA-1的Fab或(Fab′)2(如抗-CD18的Fab或(Fab′)2)。在另一例子中，本發(fā)明提供了一種體外或體內(nèi)檢測(cè)CD11a或CD18的方法，它包括將此處的抗CD11a或CD18抗體片段變異體與懷疑含有CD11a或CD18樣品(尤其是血清樣品)接觸，然后檢測(cè)是否發(fā)生結(jié)合。Fc區(qū)被置于(移植于)不會(huì)改變其構(gòu)象從而不會(huì)喪失其生物活性的、感興趣多肽的某一區(qū)域，而且這種放置不干擾多肽與配體或抗原結(jié)合的能力，從而維持多肽的生物活性。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B顯示了在一次靜脈內(nèi)給藥2mg/kg之后，5種Fab或F(ab′)2構(gòu)建物在小鼠中的血清藥物動(dòng)力學(xué)情況。在圖1A中，F(xiàn)abv1B變異體用實(shí)心方塊表示，F(xiàn)ab對(duì)照用實(shí)心菱形表示，F(xiàn)abv2變異體用實(shí)心三角形表示，F(xiàn)abv2變異體用實(shí)心圓圈表示，而雙-二硫化合物F(ab′)2用空心圓圈表示。在圖1B中，F(xiàn)ab對(duì)照用實(shí)心三角形表示，F(xiàn)abv2變異體用空心圓圈表示；Fabv1變異體用空心方塊表示；Fabv1B變異體用實(shí)心圓圈表示，而雙-二硫化合物F(ab′)2用實(shí)心方塊表示。這些分子在本文的表格中有更詳細(xì)的描述。圖2描述了下列區(qū)域的共有氨基酸序列相關(guān)部分與衍生自抗-CD18抗體(SEQIDNO10)的Fabv1b變異體進(jìn)行序列對(duì)比情況(描述于實(shí)施例中)人IgG1CH1結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO4)、人IgG2CH1結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO5)、人IgG3CH1結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO6)、人IgG4CH1結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO7)、人κCL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO8)、和人λCL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO9)。在該圖中，在Fabv1b序列(即SEQIDNO3和1)中與本發(fā)明有關(guān)和最重要的氨基酸殘基和/或位置，分別用下劃線和星號(hào)表示。優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述定義如本文所用，“感興趣多肽”指具有生物活性、從腎臟被清除而且不含有IgG的Fc區(qū)的多肽。如抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的那樣，“IgG的Fc區(qū)”指同種型IgG免疫球蛋白的Fc部分。這種多肽的例子是肽和蛋白質(zhì)，不論其來(lái)源于真核生物如酵母、鳥(niǎo)類、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物，還是來(lái)自細(xì)菌如大腸桿菌。感興趣多肽可以是從天然來(lái)源中分離出的，或者用人工合成或重組方法制備而得。在一個(gè)優(yōu)選例子中，感興趣多肽含有Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域，如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。從腎臟中清除感興趣多肽，至少部分取決于多肽的分子量。分子量過(guò)大的多肽不會(huì)被哺乳動(dòng)物的腎臟清除。一種確定感興趣多肽(或變異體)是否在腎臟中被清除的測(cè)試方法是臨床研究，其中用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記感興趣多肽或變異體，然后用與實(shí)際處理相同的處理方案，將其施用于待處理的相同類型的哺乳動(dòng)物。隨后，采集哺乳動(dòng)物的臨床尿樣，加以分析以確定是否可在其中檢測(cè)到標(biāo)記物。如果檢測(cè)到標(biāo)記物，則感興趣多肽或變異體已被腎臟清除。原則上，被腎臟清除的多肽的分子量在約5,000-10,000道爾頓，但是分子量稍大或稍小的分子，如果它們能通過(guò)所述的腎清除測(cè)試，那么也符合本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)。如果感興趣多肽有由多肽(不論其處于天然或變性構(gòu)象)或其片段直接或間接造成的體內(nèi)效應(yīng)子或抗原功能或活性，那么它就是有生物活性的。效應(yīng)子功能包括受體結(jié)合以及任何的載體結(jié)合活性、感興趣多肽的促效或拮抗作用，尤其是傳導(dǎo)增殖信號(hào)(包括復(fù)制)、DNA調(diào)控功能、各種生長(zhǎng)因子生的物活性的調(diào)控、受體激活、滅活、正調(diào)控或負(fù)調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)或分化等。生物活性擁有占據(jù)能夠與抗體交叉反應(yīng)的表位或抗原位點(diǎn)，其中該抗體是針對(duì)感興趣多肽或其哺乳動(dòng)物等價(jià)物而產(chǎn)生的。感興趣的哺乳動(dòng)物多肽包括諸如例如腎素(renin)之類的分子，生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素；牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈，胰島素原；血小板生成素；促卵泡激素；降鈣素；促黃體素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和vonWillebrands因子；抗凝血因子如蛋白質(zhì)C；心鈉素；肺表面活性劑(fungsurfactant)；纖溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；α-和β-腫瘤壞死因子；腦啡肽酶；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白，如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白質(zhì)A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3，-4，-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β；心臟營(yíng)養(yǎng)因子(cardiotrophin)(心臟肥大因子)如心臟營(yíng)養(yǎng)因子-1(CT-1)；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF；上皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IgF-I和IgF-II)；脫(1-3)-IgF-I(腦IgF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactors)；免疫毒素；骨形態(tài)形成蛋白(BMP)；干擾素如α-，β-和γ-干擾素；集落刺激因子(CFS)，如M-CFS、GM-CFS和G-CFS；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1至IL-10；沒(méi)有天然IgG的Fc區(qū)的抗-HER-2抗體；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；沒(méi)有天然IgG的Fc區(qū)的抗體；以及上述所列多肽的片段。優(yōu)選的感興趣多肽是哺乳動(dòng)物多肽。這種哺乳動(dòng)物多肽的例子包括抗體片段如沒(méi)有IgGFc區(qū)的Fv、Fab、(Fab)2和抗-HER-2片段、t-PA、gp120、DNA酶、IGF-1、IGF-II、腦IGF-I、生長(zhǎng)激素、松弛素鏈、生長(zhǎng)激素釋放因子、胰島素鏈或胰島素原、尿激酶、免疫毒素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、和抗原。更佳地，多肽是Fab、(Fab)2、二體(diabody)、Fv片段、單鏈Fv片段、或受體。進(jìn)一步優(yōu)選地，多肽是抗-IgE、抗-HER2、或抗-CD18Fab或(Fab′)2，而且最佳地是人的或人源化的。如本文所用，“多肽變異體”指感興趣多肽的氨基酸序列變異體，包括有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入和/或缺失的變異體。這種變異體有如上所述的生物活性，而且必須與感興趣多肽有小于100％的序列相同性。在一個(gè)優(yōu)選例子中，有生物活性的多肽變異體，其氨基酸序列與感興趣多肽有至少70％氨基酸序列相同性，較佳地至少75％，更佳地至少80％，再好至少85％，還要好為至少90％，最好為至少95％?！绑w內(nèi)半衰期”指感興趣多肽或多肽變異體在給定哺乳動(dòng)物的血液中循環(huán)的半衰期。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)Fc區(qū)的表位，它負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。作為例子，圖2用下劃線顯示了代表性表位，用星號(hào)顯示了重要的殘基。IgG1、IgG2和IgG4同種型被優(yōu)選用于確定補(bǔ)救受體結(jié)合表位?！熬酆厦告湻磻?yīng)”或“PCR”指按1987年7月28日授權(quán)的美國(guó)專利No.4,683,195中所描述的那樣，對(duì)少量的一種特定片段的核酸，即RNA和/或DNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法或技術(shù)。一般，需要有關(guān)于感興趣區(qū)域末端或之外的序列信息，從而可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物；這些引物與待擴(kuò)增模板的相反鏈的序列可以相同或相似。兩個(gè)引物的5′端核苷酸可與擴(kuò)增物質(zhì)的末端相符合。PCR可用來(lái)擴(kuò)增特異性RNA序列、來(lái)自總基因組DNA的特異性DNA序列以及從細(xì)胞總RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉(zhuǎn)錄而得的cDNA。一般可參見(jiàn)Mullis等人，ColdSpringHorborSymp.Quant.Biol.，51263(1987)；Erlich編輯，PCRTechnology(StocktonPress，NY，1989)。如本文所用，PCR被認(rèn)為是用于擴(kuò)增核酸測(cè)試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)方法的一種(但不是唯一一種)例子，它包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶來(lái)擴(kuò)增或產(chǎn)生特定片段的核酸?！翱贵w”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。盡管抗體表現(xiàn)出對(duì)特異性抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和其他缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一種類的多肽是，例如，由淋巴系統(tǒng)低水平地產(chǎn)生的以及由骨髓瘤較高水平地產(chǎn)生的?！疤烊豢贵w”和“天然免疫球蛋白”一般是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，它由2條相同的輕鏈(L)和2條相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵而連于重鏈，而在不同的免疫球蛋白同種型的重鏈中，二硫鍵的數(shù)目是不同的。每一重鏈和輕鏈也有有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端有可變區(qū)(VH)，然后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端有可變區(qū)(VL)，在另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)應(yīng)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)應(yīng)。據(jù)信，有特定的氨基酸殘基在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間形成界面(Clothia等人J.Mol.Biol.186651-663；Novotny和Haber，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，824592-4596)。術(shù)語(yǔ)“可變的”指這樣的事實(shí)，即可變區(qū)的某些部分在抗體之間有很大的序列差異，而且該部分被用于每種具體抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，該可變性并不分布于整個(gè)抗體的可變區(qū)。它集中地存在于輕鏈和重鏈可變區(qū)的3個(gè)被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的片段中?？勺儏^(qū)的較高度保守區(qū)域被稱為框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)都含有4種FR區(qū)，大多采用β-折疊構(gòu)型，它們被3個(gè)CDR(它們形成環(huán)狀連接，而在某些情況下成為β-折疊結(jié)構(gòu)的一部分)所連接。每條鏈中的CDR被FR區(qū)緊密地維系在一起，并且與來(lái)自其他鏈的CDR一起對(duì)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)作出貢獻(xiàn)(參見(jiàn)Kabat等人，同上)。恒定區(qū)在抗體結(jié)合于抗原過(guò)程中并不直接相關(guān)，但是它們表現(xiàn)出各種不同的效應(yīng)子功能，如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒。用木瓜蛋白酶消化抗體會(huì)產(chǎn)生2個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，被稱為“Fab”片段，每個(gè)片段有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；以及一殘余的“Fc”片段，其名稱反映了它能方便地結(jié)晶。用胃蛋白酶處理會(huì)產(chǎn)生一個(gè)F(ab′)2片段，它有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而且還能與抗原交聯(lián)。“Fv”是最小的抗體片段，它含有完整的抗原識(shí)別位點(diǎn)和抗原結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由緊密地、非共價(jià)締合的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體所構(gòu)成。它處于這樣的構(gòu)型，其中每個(gè)可變區(qū)的3個(gè)CDR相互作用，在VH-VL二聚體的表面上界定出一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？傊?，這6個(gè)CDR將抗原結(jié)合特異性賦予抗體。然而，甚至單個(gè)可變區(qū)(或僅含有3個(gè)對(duì)抗原特異的CDR的半Fv)也有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和性比完整的結(jié)合位點(diǎn)要低。Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。通過(guò)在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端添加一些殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，可使Fab片段不同于Fab片段。Fab′-SH是此處給恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有一個(gè)游離疏基的Fab′的名稱。F(ab′)2抗體片段最初是以Fab′片段對(duì)形式產(chǎn)生的，它們之間有絞鏈半胱氨酸?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)物也是已知的。“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域以單多肽鏈形式存在。一般，F(xiàn)v多肽還含有VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，它使sFV可形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對(duì)于sFv的總結(jié)，請(qǐng)參見(jiàn)Pluckthun，A.，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol113，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。來(lái)自任何脊椎動(dòng)物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)恒定區(qū)氨基酸序列，可以被歸為2種截然不同類型中的一種，稱為κ和λ。根據(jù)它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的類別。有5中主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些還可被進(jìn)一步劃分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。術(shù)語(yǔ)“抗體”被廣義地使用，具體地它包括單克隆抗體(包括促效和拮抗抗體)、具有多表位特異性的抗體復(fù)合物、雙特異性抗體、二體、和單鏈分子，以及抗體片段(如Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一群基本均質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即構(gòu)成該群體的各抗體是相同的，除了可能存在少量天然發(fā)生的突變形式。單克隆抗體是高特異性的，它針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。此外，與常規(guī)的(多克隆)抗體制劑一般含有針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了特異性，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是可由雜交瘤培養(yǎng)法合成，不會(huì)被其它免疫球蛋白所污染。修飾詞“單克隆”表示從基本均質(zhì)的抗體群中獲得的抗體性質(zhì)，不應(yīng)理解為需要用某種具體方法所產(chǎn)生。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以用Kohler和Milstein，自然，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，也可以重組DNA方法(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,816,567[Cabilly等人])產(chǎn)生?！皢慰寺】贵w”還可從噬菌體抗體文庫(kù)中，用例如Clackson等人，自然，352624-628(1991)和Marks等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，222581-597(1991)所述的技術(shù)分離出。此處的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分，與衍生自一特定物種的或?qū)儆谝惶囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列是相同的或同源的；而鏈的其余部分與衍生自另一物種的或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體以及這些抗體片段中的相應(yīng)序列是相同的或同源的，從而使其表現(xiàn)出所需的生物活性(Cabilly等人，同上；Morrison等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，816851-6855)?！叭嗽椿毙问降姆侨?如鼠)抗體是含有來(lái)自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合的亞序列)。對(duì)于絕大多數(shù)情況，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的殘基被來(lái)自非人種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的，具有所需特異性、親和性和容量的CDR的殘基所置換。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基所置換。此外，人源化抗體可含有既不在受體抗體中也不在引入的CDR或框架序列中的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步地改善和優(yōu)化抗體的性能。一般，人源化抗體可含有幾乎所有的至少一個(gè)(典型地為2個(gè))可變區(qū)，其中所有或幾乎所有的CDR區(qū)域?qū)?yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)域，而且所有或幾乎所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體最好還含有至少一部分免疫球蛋白(一般是人免疫球蛋白)的恒定區(qū)(Fc)。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。人源化抗體包括PrimatizedTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)來(lái)自用感興趣抗原免疫獼猴而產(chǎn)生的抗體?！霸谌酥袩o(wú)免疫原性”指，當(dāng)在藥學(xué)上可接受的載體中的感興趣多肽或多肽變異體以治療有效量與人的合適組織接觸后，在一段潛伏期(如8-14天)之后第二次施用感興趣多肽或其變異體時(shí)，沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)感興趣多肽或其變異體的敏感或抗性癥狀。術(shù)語(yǔ)“二體(diabody)”指具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段含有在同一多肽鏈(VH-VL)上連于輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)。通過(guò)使用一個(gè)太短從而不允許在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，就迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在例如EP404，097；WO93/11161；和Holliger等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，906444-6448(1993)中有更完整的描述。術(shù)語(yǔ)“LFA-1介導(dǎo)的疾病”指因LFA-1受體在淋巴細(xì)胞上的細(xì)胞粘附作用而造成的病理狀態(tài)。這種疾病的例子包括T細(xì)胞炎癥應(yīng)答，如包括牛皮癬在內(nèi)的炎癥皮膚疾?。慌c炎癥腸疾病有關(guān)的應(yīng)答(如Crohn氏疾病和潰瘍性結(jié)腸炎)；成年人呼吸窘迫綜合癥；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；過(guò)敏癥狀如濕疹和哮喘以及其他涉及T細(xì)胞過(guò)濾和慢性炎癥應(yīng)答的癥狀；皮膚過(guò)敏反應(yīng)(包括毒長(zhǎng)春藤和毒橡樹(shù))；動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、糖尿病、多發(fā)性硬化、Reynaud氏綜合癥、自身免疫甲狀腺炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎、Sjorgen氏綜合癥、青少年型糖尿病和與由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型過(guò)敏有關(guān)的免疫應(yīng)答，一般見(jiàn)于癆病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎；惡性貧血；與白細(xì)胞滲出有關(guān)的疾病；CNS炎癥疾病、繼發(fā)于敗血病或創(chuàng)傷的多發(fā)性器官受傷綜合癥；自身免疫性溶血性貧血；myethemiagravis；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；各種類型的移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物疾?。怀鲅孕菘?；肺氧毒癥；肺纖維化；傷口修復(fù)；B-細(xì)胞淋巴瘤；等等。具體地，對(duì)CD11a或CD11b抗體的優(yōu)選指征是牛皮癬、移植排斥、哮喘、傷口修復(fù)和肺纖維化；對(duì)CD18抗體的優(yōu)選指征是出血性休克、腦膜炎；腦炎；多發(fā)性硬化；哮喘；和肺氧毒癥；而對(duì)CD20抗體的優(yōu)選指征是B-細(xì)胞淋巴瘤?！疤幚?治療)”指治療性處理和預(yù)防或防御性措施。需要處理的包括那些早已有疾病的、以及那些可能患該疾病的、以及那些待預(yù)防該疾病的。出于處理目的，“哺乳動(dòng)物”指任何劃為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物，如狗、馬、貓、羊、豬、牛等。較佳地，此處的哺乳動(dòng)物為人。術(shù)語(yǔ)“LFA-1拮抗劑”一般指一種針對(duì)CD11a或CD18，或兩者的抗體，但是也包括可溶性的ICAM-1(如ICAM-1胞外結(jié)構(gòu)域)、針對(duì)ICAM-1的抗體、及其片段，或者其他能夠抑制LFA-1與ICAM-1相互作用的分子。術(shù)語(yǔ)“抗-LFA-1抗體”或“抗-LFA-MAb”指針對(duì)CD11a或CD18、或兩者的抗體。抗-CD11a抗體包括例如，MHM24(Hildreth等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，13202-208)、R3.1(IgG1；Rothlein，BoehringerIngeIheimPharmaceuticals，Inc.，Ridgefield，CT)、25-3(或25.3；來(lái)自Immunotech，F(xiàn)rance的IgG1；參見(jiàn)Olive等人編輯，HumanTcellClones.AnewApproachtoImmuneRegulation，Clifton，NJ，Humana，p.173)、KBA(IgG2a；Nishimura等人，細(xì)胞免疫(Cell.Immunol.)，10732；Nishimura等人，細(xì)胞免疫(Cell.Immunol.)，94122)、M7/15(IgG2b；Springer等人，Immunol.Rev.，68171)、IOT16(VermotDesroches等人，斯堪的納維亞免疫學(xué)雜志(Scand.J.Immunol.)，33277-286)、SPVL7(VermotDesroches等人，同上)、和M17(IgG2a；可從ATCC獲得，它是大鼠的抗-鼠CD11a抗體)。抗-CD18抗體的例子包括MHM23(Hildreth等人，同上)、M18/2(IgG2a；Sanches-Madrid等人，J.Exp.Med.，158586)、H52(Fekete等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫雜志(J.Clin.Lab.Immunol.)，31145-149)、Mas191c(VermotDesrocnes等人，同上)、IOT18(VermotDesroches等人，同上)、60.3(Taylor等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫(Clin.Exp.Immunol.)，71324-328)和60.1(Campana等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，16537-542)。包括抗體在內(nèi)的、合適的LFA-1拮抗劑的其他例子描述于，Hutchings等人，自然，348369(1990)、WO91/18011(91年11月28日出版)、WO91/16928(91年11月14日出版)、WO91/16927(91年11月14日出版)、加拿大專利申請(qǐng)2,008,368(1991年6月13日出版)、WO91/15076(90年12月13日出版)、WO91/10652(90年9月20日出版)、EP387,668(90年9月19日出版)、EP379,904(90年8月1日出版)、EP346,078(89年12月13日出版)、美國(guó)專利No.5,071,964、美國(guó)專利No.5,002,869、澳大利亞專利申請(qǐng)8815518(88年11月10日出版)、EP289,949(88年11月9日出版)和EP303,692(89年2月22日出版)。實(shí)施本發(fā)明的方式1.發(fā)明的一般性描述本發(fā)明涉及將IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入感興趣多肽，從而增加其循環(huán)半衰期，但是不喪失其生物活性。這可用任何手段，如在感興趣多肽的合適區(qū)域進(jìn)行突變以模擬Fc區(qū)，或者通過(guò)將表位摻入肽標(biāo)記物中，然后將該標(biāo)記物融合于感興趣多肽的任何一端或者中間，或者通過(guò)DNA或肽合成。一種制備具有更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的多肽的系統(tǒng)方法包括幾個(gè)步驟。首先涉及鑒別出IgG分子Fc區(qū)補(bǔ)救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)象。一旦鑒別出這樣的表位，便可修飾感興趣多肽的序列以含有鑒別出的結(jié)合表位序列和構(gòu)象。在序列突變之后，測(cè)試多肽變異體是否比原始多肽即感興趣多肽有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。如果測(cè)試表明多肽變異體沒(méi)有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，那么進(jìn)一步改變序列以包含鑒別出的結(jié)合表位序列和構(gòu)象。測(cè)試改變的多肽是否有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，并且繼續(xù)該過(guò)程直至獲得更長(zhǎng)半衰期的分子。這樣被摻入感興趣多肽中的補(bǔ)救受體結(jié)合表位可以是任何合適上述表位，而且其性質(zhì)取決于，例如，待修飾的多肽類型。這種轉(zhuǎn)化應(yīng)維持感興趣多肽的生物活性，即轉(zhuǎn)化的部分不會(huì)危害感興趣多肽的構(gòu)象或者危害該多肽結(jié)合于賦予其生物活性的配體。例如，如果感興趣多肽是抗體，那么補(bǔ)救受體結(jié)合表位的放置不應(yīng)干擾抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。較佳地，感興趣多肽含有Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域，而且補(bǔ)救受體結(jié)合表位被置于該Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域中。更佳地，該表位構(gòu)成一個(gè)區(qū)域，在該區(qū)域中，來(lái)自Fc區(qū)的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移至感興趣多肽Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域的類似位置。更加好的是，被轉(zhuǎn)移的是來(lái)自Fc區(qū)一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的三個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。還要好的是，該表位來(lái)自Fc區(qū)(如IgG的Fc區(qū))CH2結(jié)構(gòu)域，并且被轉(zhuǎn)移至Ig或Ig樣結(jié)構(gòu)域的CH1、CH3或VH區(qū)，或者一個(gè)以上這樣的區(qū)域?；蛘撸摫砦粊?lái)自Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域，并且被轉(zhuǎn)移至感興趣多肽Ig或Ig樣結(jié)構(gòu)域的CL區(qū)或VL區(qū)，或者兩者。例如，為了討論感興趣多肽是抗-CD18時(shí)的變異體，參見(jiàn)圖2。該圖顯示了各種Ig的相關(guān)共有一級(jí)結(jié)構(gòu)，即人IgG1CH1結(jié)構(gòu)域、人IgG2CH1結(jié)構(gòu)域、人IgG3CH1結(jié)構(gòu)域、人IgG4CH1結(jié)構(gòu)域、人κCL結(jié)構(gòu)域、人λCL結(jié)構(gòu)域、以及Fabv1b(一種此處優(yōu)選的抗-CD18Fab變異體)的具體序列。此外，圖2顯示了感興趣和最重要的Fabv1b的殘基。在一個(gè)優(yōu)選例子中，重要的殘基是那些在圖2中帶星號(hào)的殘基，即在Fabv1b的一個(gè)環(huán)中的MIS和距MIS一個(gè)氨基酸C-端的T殘基，以及在Fabv1b的另一個(gè)環(huán)中的HQN和距HQN兩個(gè)氨基酸C-端的D殘基和距D殘基一個(gè)氨基酸C-端的K殘基。在一個(gè)最佳例子中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位含有序列(5′至3′)PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)，而且可任選地含有選自下組的序列HQSLGTQ(SEQIDNO11)、HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，尤其當(dāng)感興趣多肽是Fab或(Fab′)2時(shí)。在另一最佳例子中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位是這樣的多肽，該多肽不是Fc但含有序列(5′至3′)HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)和序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。該表位適合融合于感興趣多肽，而且在一個(gè)優(yōu)選方面它被包含在已融合于感興趣多肽的多肽上。適合該目的的感興趣多肽的例子包括那些如果突變其序列會(huì)導(dǎo)致二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)改變并有不利影響的多肽，例如生長(zhǎng)激素或神經(jīng)生長(zhǎng)因子。在一個(gè)例子中，變異體可用重組方法制備。因此，制備編碼變異體的核酸，然后將其置于可復(fù)制的載體中，再用該載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞以表達(dá)。通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽變異體而產(chǎn)生多肽變異體。如果多肽變異體是被分泌的，可從培養(yǎng)基中回收。在另一例子中，多肽變異體的制備是通過(guò)改變?cè)谀I臟中被清除且不含IgGFc區(qū)的感興趣多肽，使其含有IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位并有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。改變步驟優(yōu)選用Kunkel誘變、定點(diǎn)誘變、盒式誘變或PCR誘變進(jìn)行。Kunkel誘變描述于例如，Kunkel，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，82488-492(1985)。2.制備感興趣多肽及其變異體下面的絕大部分論述涉及感興趣多肽或多肽變異體的生產(chǎn)，即通過(guò)培養(yǎng)用含有編碼感興趣多肽或多肽變異體的核酸的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收感興趣多肽或多肽變異體。還可想像，感興趣多肽可用同源重組方法產(chǎn)生，如在1991年5月16日出版的WO91/06667中所提供的方法。簡(jiǎn)而言之，該方法涉及用一構(gòu)建物(即載體)來(lái)轉(zhuǎn)化含有內(nèi)源多肽的原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞如果所需的多肽是人的話)，該構(gòu)建物含有可擴(kuò)增的基因(如二氫葉酸還原酶[DHFR]或其他下面論述的基因)和至少一個(gè)長(zhǎng)度不小于約150bp、與感興趣多肽基因編碼區(qū)域的基因座上的DNA序列同源的側(cè)翼區(qū)域，從而擴(kuò)增編碼感興趣多肽的基因?？蓴U(kuò)增的基因必須處于不干擾編碼感興趣多肽基因的表達(dá)的位置。轉(zhuǎn)化的進(jìn)行使構(gòu)建物被同源地整合入原代細(xì)胞的基因組中，從而界定出一個(gè)可擴(kuò)增區(qū)域。然后，通過(guò)可擴(kuò)增基因或存在于構(gòu)建物的其他標(biāo)記，篩選含有構(gòu)建物的原代細(xì)胞。存在標(biāo)記基因就表明在宿主基因組中存在了和整合了構(gòu)建物。沒(méi)有必要進(jìn)一步選擇原代細(xì)胞，因?yàn)檫x擇將在第二代宿主上進(jìn)行。當(dāng)存在來(lái)自正確同源整合體的DNA時(shí)，如果需要，可用PCR并測(cè)序得到的擴(kuò)增DNA序列或確定PCR片段的合適長(zhǎng)度并且擴(kuò)增僅含有這些片段的細(xì)胞，來(lái)確定同源重組事件的發(fā)生。而且，如果需要，選擇的細(xì)胞可在此時(shí)通過(guò)用合適的擴(kuò)增劑(如氨甲蝶呤，如果可擴(kuò)增基因是DHFR的話)應(yīng)激(stress)細(xì)胞而加以擴(kuò)增，從而獲得多拷貝的靶基因。然而較佳地，也可在下述的第二次轉(zhuǎn)化之后再進(jìn)行擴(kuò)增步驟。在選擇步驟之后，從選擇的原代細(xì)胞中分離出基因組的DNA部分(應(yīng)足夠大以包含整個(gè)可擴(kuò)增區(qū)域)。再用這些基因組DNA部分來(lái)轉(zhuǎn)化第二代哺乳動(dòng)物表達(dá)宿主細(xì)胞，并克隆，然后選擇含有可擴(kuò)增區(qū)域的克隆。接著，如果在原代細(xì)胞中沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)，那么通過(guò)擴(kuò)增劑而擴(kuò)增可擴(kuò)增區(qū)域，最后，使現(xiàn)在含有多拷貝可擴(kuò)增區(qū)域(該擴(kuò)增區(qū)域含有感興趣多肽)的第二代表達(dá)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)，以表達(dá)基因并產(chǎn)生多肽。A.分離編碼感興趣多肽的DNA編碼感興趣多肽的DNA可從任何cDNA文庫(kù)中獲得，該文庫(kù)是從據(jù)信含有編碼感興趣多肽的mRNA并以可檢測(cè)水平表達(dá)該多肽的組織中制備的。編碼感興趣多肽的基因也可從基因組文庫(kù)中獲得，或者通過(guò)體外寡核苷酸合成(假設(shè)已知道完整的核苷酸或氨基酸序列)而獲得。用設(shè)計(jì)用于鑒別感興趣基因或其編碼的蛋白質(zhì)的探針，來(lái)篩選文庫(kù)。對(duì)于cDNA表達(dá)文庫(kù)，合適的探針包括識(shí)別并特異性地與感興趣多肽結(jié)合的單克隆或多克隆抗體；長(zhǎng)約20-80堿基的、編碼來(lái)自相同或類似物種感興趣多肽的cDNA的已知或可疑部分的寡核苷酸；和/或編碼相同或類似基因的互補(bǔ)或同源cDNA或其片段。合適的篩選基因組DNA文庫(kù)的探針包括(但并不限于)編碼相同或相似基因的寡核苷酸、cDNA、或其片段，和/或同源基因組DNA或其片段。用選定的探針來(lái)篩選cDNA或基因組文庫(kù)，可采用Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)10-12章中所描述的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。另一種分離編碼感興趣多肽的基因的方法，是用Sambrook等人(同上)14章中所述的PCR方法。該方法需要利用與感興趣多肽雜交的寡核苷酸探針。選擇寡核苷酸的策略在下面描述。一種優(yōu)選的實(shí)施本發(fā)明的方法是使用精心選定的寡核苷酸序列來(lái)篩選來(lái)自不同組織的cDNA文庫(kù)。選擇作為探針的寡核苷酸序列應(yīng)有足夠的長(zhǎng)度和足夠的明確性，從而降低假陽(yáng)性。實(shí)際的核苷酸序列一般基于保守的或高度同源的寡核苷酸序列。寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)位置上是簡(jiǎn)并的。當(dāng)篩選的文庫(kù)來(lái)自一個(gè)不知道其優(yōu)選密碼子使用情況的物種時(shí)，使用簡(jiǎn)并寡核苷酸就特別重要。寡核苷酸必須被標(biāo)記，從而當(dāng)其與被篩選的文庫(kù)中的DNA雜交時(shí)可以被檢測(cè)。優(yōu)選的標(biāo)記方法是用本領(lǐng)域熟知的32P-標(biāo)記的ATP和多聚核苷酸激酶來(lái)放射性標(biāo)記寡核苷酸。但是，其他方法也可用于標(biāo)記寡核苷酸，其中包括(但并不限于)生物素化或酶標(biāo)。特別感興趣的情況是，編碼感興趣多肽的核酸可編碼全長(zhǎng)的多肽。在某些優(yōu)選例子中，核酸序列包括感興趣多肽的信號(hào)序列。具有所有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸的獲得是通過(guò)用此處第一次公開(kāi)的推導(dǎo)的氨基酸序列來(lái)篩選cDNA或基因組文庫(kù)，而且如果需要，可用常規(guī)的引物延伸方法(如在Sambrook等人(同上)7.79章節(jié)中所述的方法)來(lái)檢測(cè)mRNA前體并處理沒(méi)有被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA中間體。B.制備感興趣多肽變異體可通過(guò)將合適的核苷酸變化(如上述的用于Fc區(qū)的變化)引入編碼感興趣多肽的DNA中，或者通過(guò)體外合成所需的多肽變異體而適宜地制備感興趣多肽變異體。這樣的變異體包含例如，感興趣多肽氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代，從而含有合適的表位并具有更長(zhǎng)的血清半衰期?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合，以制備最終的構(gòu)建物，只要最終構(gòu)建物具有所需的特性。氨基酸改變也可改變感興趣多肽翻譯后的加工過(guò)程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。此外，與大多數(shù)哺乳動(dòng)物基因相同，感興趣多肽可能是由多外顯子基因編碼的。對(duì)于涉及感興趣多肽的氨基酸序列變異體，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)將取決于具體的待修飾的感興趣多肽。例如，免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)設(shè)定結(jié)構(gòu)上與IgGCH2中2個(gè)含有補(bǔ)救受體表位的環(huán)相類似的環(huán)而進(jìn)行最初的修飾。突變位點(diǎn)可個(gè)別或一系列地進(jìn)行修飾，例如通過(guò)(1)用選擇的保守性氨基酸置換第一個(gè)氨基酸，然后根據(jù)所得到的結(jié)果用更廣選擇的殘基進(jìn)行置換，(2)缺失靶殘基，(3)在設(shè)定的位置附近插入相同或不同類別的殘基，或者方法1-3的組合。一種有用的、確定感興趣多肽中那些殘基或區(qū)域是適合誘變的優(yōu)選位置的方法，是Cunningham和Wells，科學(xué)，2441081-1085(1989)中描述的“丙氨酸掃描誘變”。在該方法中，確定一個(gè)或一組靶殘基(如帶電荷的殘基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸)加以替換，以影響氨基酸與細(xì)胞中或細(xì)胞外周圍水性環(huán)境的相互作用。那些在功能上表現(xiàn)出對(duì)替換敏感的結(jié)構(gòu)域，再通過(guò)在置換位點(diǎn)處引入進(jìn)一步的或其他的突變而進(jìn)行結(jié)構(gòu)的精細(xì)研究。這樣，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)被預(yù)先確定，但是突變本身的性質(zhì)不必被預(yù)先確定。例如，為了優(yōu)化給定位點(diǎn)處突變的性能，可以對(duì)靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，然后篩選產(chǎn)生的變異體是否有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。氨基酸序列缺失一般為約1-30個(gè)殘基，更佳地為約1-10個(gè)殘基，而且一般是連續(xù)的。連續(xù)缺失一般是偶數(shù)數(shù)目的殘基，但是單個(gè)或奇數(shù)數(shù)目的缺失也在范圍之內(nèi)。作為例子，可在LFA-1抗體的低同源區(qū)域中引入缺失，它們與感興趣多肽的氨基酸序列共享最大的序列相同性，從而改變多肽的半衰期。來(lái)自與其他配體結(jié)合位點(diǎn)中某一位點(diǎn)基本同源的感興趣多肽區(qū)域的缺失，一般更可能會(huì)更明顯地改變感興趣多肽的生物活性?？蛇x擇連續(xù)缺失的數(shù)目，以保留感興趣多肽在受影響的結(jié)構(gòu)域中的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如β-折疊或α-螺旋。氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，長(zhǎng)度為一個(gè)殘基至含100個(gè)或更多殘基的多肽，還包括在序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。序列內(nèi)插入(即插入在成熟多肽序列中)一般為約1-10個(gè)殘基，更佳地1-5個(gè)，最佳地1-3個(gè)。插入最好以偶數(shù)個(gè)殘基進(jìn)行，但這并不是必須的。插入的例子包括插入感興趣多肽的內(nèi)部、以及與融合后會(huì)導(dǎo)致半衰期更長(zhǎng)的、含有所需表位的蛋白質(zhì)或肽在N端或C端融合。第三組變異體是氨基酸置換變異體。這些變異體至少有一個(gè)多肽分子中的氨基酸殘基被移去并在其位置上插入不同的殘基。置換誘變最感興趣所位置包括抗體上的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)。其他感興趣的位置是這樣的位置，其中來(lái)自不同物種的多肽的具體殘基在所有具有感興趣多肽的動(dòng)物物種中都是相同的，這種保守程度暗示在達(dá)到這些分子共同的生物活性中所起的重要性。這些位置，尤其是那些在至少3個(gè)其他同樣保守位置處的序列中的位置，被以較保守的方式進(jìn)行置換。這種保守性置換示于表1，開(kāi)頭的是優(yōu)選的置換。如果這種置換導(dǎo)致生物活性的改變，那么就引入更明顯的變化、表1中指出的代表性置換、或下面進(jìn)一步按氨基酸類型給出的置換，然后篩選產(chǎn)物。表1</tables>對(duì)感興趣多肽功能的基本修飾，可以通過(guò)選擇在下列方面的效應(yīng)上差別明顯的置換而實(shí)現(xiàn)(a)維持取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)維持靶位置處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在的殘基被分成下列幾類(1)疏水的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水的cys，ser，thr；(3)酸性的asp，glu；(4)堿性的asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香類的trp，tyr，phe非保守性取代需要用這些類別中一類的某種氨基酸替換另一類的的某種氨基酸。這樣的置換殘基可以被引入保守性置換位置，或者更佳地被引入其余的(非保守的)位置。有時(shí)可能需要使存在于分子中的一個(gè)或多個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)失活。這些位點(diǎn)可以通過(guò)檢查所編碼的氨基酸序列而鑒別出，例如在胰蛋白酶的情況下是精氨?；蛸嚢滨；?。當(dāng)鑒別出蛋白酶切割位點(diǎn)后，可以用其他殘基(最好用堿性殘基如谷氨酰胺或親水性殘基如絲氨酸)置換靶殘基；或者缺失掉該殘基；或者在該殘基后立刻插入一個(gè)脯氨酰基，使它們對(duì)蛋白酶切割失活。在另一例子中，除了信號(hào)序列的起始甲硫氨?；獾娜魏渭琢虬滨；?，或者位于每個(gè)這樣的甲硫氨酰基每個(gè)N端或C端約3個(gè)殘基之內(nèi)的任何殘基，可以用其他的殘基(尤其根據(jù)表1)加以取代或被缺失掉?；蛘撸谶@些位點(diǎn)附近插入約1-3個(gè)殘基。在維持感興趣多肽的適當(dāng)構(gòu)象中不涉及的任何半胱氨酸殘基也可被取代，一般是用絲氨酸取代，以便改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。在第一個(gè)例子中，編碼感興趣多肽氨基酸序列變異體的核酸分子是用本領(lǐng)域中已知的各種方法制備的。這些方法包括(但并不限于)通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變制備、PCR誘變、和對(duì)早期制備的變異體或多肽的非變異體形式(作為此處變異體的基礎(chǔ))(“感興趣多肽”)進(jìn)行盒式誘變。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是一種優(yōu)選的、制備此處的置換、缺失和插入型多肽變異體的方法。該技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，并且由Adelman等人，DNA，2183(1983)描述。簡(jiǎn)而言之，DNA的改變是通過(guò)，將編碼所需突變的寡核苷酸與DNA模板相雜交，其中模板是含有待改變多肽的未改變或天然DNA序列的、單鏈形式的質(zhì)?；蚴删w。在雜交之后，用DNA聚合酶來(lái)合成模板的完整的第二條互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈中會(huì)因此摻入寡核苷酸引物，從而會(huì)編碼選定的DNA改變。一般，使用至少25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸，在編碼突變的核苷酸兩側(cè)，含有12-15個(gè)與模板完全互補(bǔ)的核苷酸。這保證了寡核苷酸會(huì)合適地與單鏈DNA模板分子雜交。用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，如Crea等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，755765(1978)中所描述的技術(shù)，可以輕易地合成寡核苷酸?？捎媚切┭苌允删wM13載體的載體(市售的M13mp18和M13mp19是合適的)，或者那些含有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的載體(如Viera等人，Meth.Enzymol.，1533(1987)中所述)，來(lái)制備DNA模板。因此，可將待突變的DNA插入這些載體的一種中，以產(chǎn)生單鏈模板。單鏈模板的產(chǎn)生描述于Sambrook等人(同上)4.21-4.41章節(jié)?；蛘撸部捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)使雙鏈質(zhì)粒(或其他)DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA模板。為了改變?cè)糄NA序列以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽變異體，可在合適的雜交條件下使寡核苷酸與單鏈模板雜交。然后加入DNA聚合酶(一般是DNA聚合酶I的Klenow片段)，將寡核苷酸作為合成用引物而合成模板的互補(bǔ)鏈。這樣形成了異源雙鏈體分子，其中一條DNA鏈編碼突變形式的多肽，而另一條鏈(原始模板)編碼原始的、未改變的多肽序列。然后將該異源雙鏈分子轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞，一般用諸如大腸桿菌JM101之類的原核生物。在細(xì)胞生長(zhǎng)后，將它們置于瓊脂糖平板上，用32P放射標(biāo)記的寡核苷酸引物進(jìn)行篩選，以鑒別出含有突變DNA的細(xì)菌克隆。然后將突變區(qū)域取出，再置于合適的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的載體中，一般是在轉(zhuǎn)化合適宿主中典型采用表達(dá)載體類型。上面描述的方法可以加以改進(jìn)，以便產(chǎn)生質(zhì)粒的兩條鏈都含有突變的同源雙鏈。改進(jìn)如下如上所述，將單鏈寡核苷酸與單鏈模板進(jìn)行退火。將3種脫氧核糖核苷酸(脫氧腺苷(dATP)、脫氧鳥(niǎo)苷(dGTP)和脫氧胸苷(dTTP))的混合物，與修飾過(guò)的、稱為dCTP-(αS)的硫代脫氧胞苷(可從AmershamCorporation獲得)混合。將該混合物加至模板-寡核苷酸復(fù)合物。一旦將DNA聚合酶加至該混合物中，會(huì)產(chǎn)生與模板相同(除了突變的堿基)的DNA鏈。此外，該新的DNA鏈含有dCTP-(αS)而不是dCTP，這用于保護(hù)它不被限制性內(nèi)切酶所消化。在雙鏈的異源雙鏈體的模板鏈被合適的限制酶所切時(shí)，模板鏈可用ExoIII核酸酶或其他合適的、通過(guò)含有待誘變位點(diǎn)的區(qū)域的核酸酶加以消化。然后終止反應(yīng)，從而形成一個(gè)僅部分為單鏈的分子。然后在所有4種脫氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA連接酶都存在的情況下，用DNA聚合酶形成完整的雙鏈DNA同源雙鏈體。接著，如上所述，可將該同源雙鏈分子轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞如大腸桿菌JM101。編碼具有一個(gè)以上待置換氨基酸的多肽突變體的DNA，可用幾種方法中一種加以產(chǎn)生。如果這些氨基酸在多肽鏈上位置靠得很近，可以用一個(gè)編碼全部所需氨基酸置換的寡核苷酸同時(shí)進(jìn)行突變。但是，如果這些氨基酸相互之間隔開(kāi)一定距離(隔開(kāi)約10個(gè)氨基酸以上)，則難以形成一個(gè)編碼全部所需變化的寡核苷酸。取而代之，可采用另外2種方法中的一種。在第一種方法中，對(duì)于每個(gè)待取代的氨基酸，分別合成一個(gè)寡核苷酸。然后將這些寡核苷酸同時(shí)與單鏈模板DNA退火，因而從模板合成的第二條DNA鏈含有全部所需的氨基酸置換。另一種方法涉及2輪或更多輪的誘變以生產(chǎn)所需的突變體。第一輪是如上所述用于單個(gè)突變體的將野生型DNA用作模板，將編碼第一個(gè)所需氨基酸取代的寡核苷酸與該模板退火，然后產(chǎn)生異源雙鏈DNA分子。第二輪誘變采用第一輪誘變中所生產(chǎn)的突變型DNA作為模板。因此，該模板早已含有一個(gè)或多個(gè)突變。將編碼另外的所需氨基酸置換的寡核苷酸與該模板退火，這樣形成的DNA便編碼第一輪和第二輪誘變中的突變。這樣形成的DNA可用作第三輪誘變的模板，依此類推。PCR誘變也適用于制造本發(fā)明的氨基酸變異體。盡管下面的論述針對(duì)DNA，但是應(yīng)理解這些技術(shù)也可用于RNA。PCR技術(shù)一般指下列的程序(參見(jiàn)Erlich，同上，R.Higuchi的章節(jié)，p61-70)當(dāng)少量模板DNA被用作PCR的原料時(shí)，可使用與模板DNA相應(yīng)區(qū)域上的序列稍有差別的引物，來(lái)產(chǎn)生較大量的特異性DNA片段，它與模板序列的差別僅在于引物不同于模板的位置。為了將突變引入質(zhì)粒DNA，一個(gè)引物被設(shè)計(jì)成覆蓋突變位置并含有突變；而另一引物的序列必須與質(zhì)粒相反鏈的一段序列相同，但是該序列可以位于質(zhì)粒DNA的任何地方。然而，較佳的是，第二個(gè)引物序列位于第一個(gè)引物序列附近200個(gè)核苷酸以內(nèi)，這樣完整的、被引物結(jié)合的DNA擴(kuò)增區(qū)域最后可以被方便地測(cè)序。使用類似上述的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可形成一群DNA片段，它們?cè)谝锼薅ǖ耐蛔兾恢蒙鲜遣煌?，而且還可能在另外位置上也不同，因?yàn)槟０鍙?fù)制有時(shí)會(huì)有偏差。如果模板與產(chǎn)物材料之比極低，那么絕大多數(shù)產(chǎn)物DNA片段會(huì)摻有所需的突變。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行，可將該產(chǎn)物材料用于替換作為PCR模板的質(zhì)粒中的相應(yīng)區(qū)域。通過(guò)使用第二個(gè)突變引物，或用不同的突變引物進(jìn)行第二輪PCR，然后在3組分(或多組分)連接中將2個(gè)形成的PCR片段同時(shí)連于載體片段，可以同時(shí)引入不同位置上的突變。在PCR誘變的具體例子中，用限制性內(nèi)切酶消化而使模板質(zhì)粒DNA(1微克)線性化，其中該限制酶在質(zhì)粒上的待擴(kuò)增區(qū)域外有唯一的識(shí)別位點(diǎn)。將100ng這種材料加至含有PCR緩沖液和25pmol各種寡核苷酸引物的PCR混合物中至終體積為50微升，其中PCR緩沖液含有4種脫氧核苷三磷酸并且包括在GeneAmp試劑盒中(得自Perkin-ElmerCetus，Norwalk，CT和Emeryville，CA)，反應(yīng)混合物上覆蓋35微升的礦物油。將反應(yīng)混合物在100℃變性5分鐘，快速置于冰上，然后在礦物油層下加入1微升棲熱水生菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶(5單位/微升，購(gòu)自Perkin-ElmerCetus)。反應(yīng)混合物再插在DNA熱循環(huán)儀上(購(gòu)自Perkin-ElmerCetus)，程序如下2分鐘55℃30秒72℃，然后19個(gè)以下的循環(huán)30秒94℃30秒55℃，和30秒72℃。在程序結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)管從熱循環(huán)儀上取下，將水相轉(zhuǎn)至新的管中，用苯酚/氯仿(50∶50體積比)抽提，再用乙醇沉淀，用標(biāo)準(zhǔn)方法回收DNA。隨后將該材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚硪员悴迦胼d體。另一種制備變異體的方法，即盒式誘變基于Wells等人，Gene34315(1985)中所述的技術(shù)。起始原料是含有待突變DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。鑒別出待突變DNA中的密碼子。在每個(gè)鑒別出的突變位點(diǎn)兩側(cè)必須有唯一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在這樣的限制性位點(diǎn)，可以用上述的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法來(lái)將它們引入DNA的適當(dāng)位置，從而產(chǎn)生限制性位點(diǎn)。在將限制性位點(diǎn)引入質(zhì)粒之后，在這些位點(diǎn)出切割質(zhì)粒以線性化。編碼位于限制性位點(diǎn)之間的DNA序列的、但含有所需突變的雙鏈寡核苷酸，用標(biāo)準(zhǔn)方法合成。分別合成2條鏈，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其雜交在一起。這種雙鏈寡核苷酸被稱為“盒”。這種盒被設(shè)計(jì)成其3′和5′端與線性化的質(zhì)粒末端相對(duì)應(yīng)，從而可以直接連入質(zhì)粒。這樣形成的質(zhì)粒就含有突變的DNA序列。C.將核酸插入可復(fù)制的載體編碼多肽變異體的核酸(如cDNA或基因組DNA)被插入可復(fù)制的載體，以便進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA)或表達(dá)。已有許多種質(zhì)粒，而且選擇合適的載體取決于(1)它是否用于DNA擴(kuò)增或DNA表達(dá)，(2)待插入載體的核酸的大小，和(3)待被該載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增DNA或表達(dá)DNA)以及與其相容的宿主細(xì)胞，每種載體可含有各種不同的元件。載體元件一般包括(但并不限于)一種或多種下列元件信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號(hào)序列元件本發(fā)明的多肽不僅可以直接產(chǎn)生，而且可以作為與異源多肽形成的融合蛋白形式產(chǎn)生，較佳地該融合蛋白含有信號(hào)序列或在成熟多肽變異體的N-末端處有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽。一般，信號(hào)序列可以是載體的一部分，或者它也可以作為DNA的一部分而插入載體。選定的異源信號(hào)序列應(yīng)是可被宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即被信號(hào)肽酶所切割)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別和加工感興趣多肽的信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，可用選定的原核信號(hào)序列替換該信號(hào)序列，例如用選自下組的原核信號(hào)序列所替換堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌，原始的或野生型信號(hào)序列可被例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、酵母α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)序列，后者描述于1991年4月23日授權(quán)的美國(guó)專利No.5,010,182中)、酵母酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、鼠唾液淀粉酶前導(dǎo)序列、羧肽酶前導(dǎo)序列、酵母BAR1前導(dǎo)序列、Humicolalanuginosa脂酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP362,179，1990年4月4日出版)或在1990年11月15日出版的WO90/13646中所描述的信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，原始的人信號(hào)序列(如通常在體內(nèi)指導(dǎo)這些天然感興趣多肽(從其得到感興趣的變異體)從人細(xì)胞中分泌出來(lái)的多肽前序列)是令人滿意的，盡管其他的哺乳動(dòng)物信號(hào)序列(如來(lái)自其他動(dòng)物多肽的信號(hào)序列或來(lái)自相同或相關(guān)物種的分泌型多肽的信號(hào)序列)以及病毒分泌前導(dǎo)序列如單純皰疹病毒gD信號(hào)序列也是合適的。將這些前體區(qū)域的DNA按閱讀框連于編碼成熟多肽變異體的DNA。(ii)復(fù)制起點(diǎn)元件表達(dá)載體和克隆載體兩者都含有能使載體在一種或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般而言，在克隆載體中，這種序列是能使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而進(jìn)行復(fù)制的序列，而且它包括復(fù)制起點(diǎn)或自我復(fù)制序列。對(duì)于各種不同的細(xì)菌、酵母和病毒，這類序列是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322(ATCC37,017)的復(fù)制起點(diǎn)、或其他市售的細(xì)菌載體如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(PromegaBiotech，Madison，Wis.)適用于絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母，而各種不同的病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，不需要使用復(fù)制起點(diǎn)元件(使用SV40起點(diǎn)僅僅是因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。大多數(shù)表達(dá)載體是“穿梭”載體，就是說(shuō)它們能夠在至少一類生物體中復(fù)制而且能夠被轉(zhuǎn)至另一種生物體以便表達(dá)。例如，某個(gè)載體被克隆在大腸桿菌中，然后同一載體又被轉(zhuǎn)染入酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞以便表達(dá)，即使它不能獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體進(jìn)行復(fù)制。還可以通過(guò)插入宿主基因組而擴(kuò)增DNA。這可方便地將芽胞桿菌(Bacillus)屬用作宿主，通過(guò)例如在載體中包含一個(gè)與芽胞桿菌基因組DNA的序列相互補(bǔ)的DNA序列而得以實(shí)現(xiàn)。用該載體轉(zhuǎn)染芽胞桿菌會(huì)在基因組DNA和插入的DNA之間產(chǎn)生同源重組。但是，回收編碼多肽變異體的基因組DNA比回收外源復(fù)制載體要復(fù)雜得多，因?yàn)樾枰拗菩悦赶瘉?lái)切取DNA。(Iii)選擇基因元件表達(dá)載體和克隆載體應(yīng)包含選擇基因，也稱為可(供)選擇的標(biāo)記(基因)。該基因編碼轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在選定的培養(yǎng)基中存活或生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)。沒(méi)有被含有選擇基因的載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不會(huì)在培養(yǎng)基上存活。典型的選擇基因所編碼的蛋白質(zhì)是(a)賦予對(duì)抗生素或其他毒素如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤、或四環(huán)素抗性的蛋白質(zhì)，(b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷的蛋白質(zhì)，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒(méi)有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物的蛋白質(zhì)，如桿菌屬(Bacilli)的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。一個(gè)選擇方案的例子是，采用藥物來(lái)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些成功地被異源基因所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生賦予抗藥性的蛋白質(zhì)，因而可以在選定方式中存活下來(lái)。這類顯性選擇的例子使用藥物新霉素(Southern等人，J.Molec.Appl.Genet.1327)、霉酚酸(Mulligan等人，科學(xué)，2091422)或潮霉素(Sugden等人，分子細(xì)胞生物學(xué)，5410-413)。上面給出的3個(gè)例子采用了在真核控制下的細(xì)菌基因，以分別賦予對(duì)合適藥物G418即新霉素(遺傳霉素(geneticin))、xgpt(霉酚酸)、或潮霉素的抗性。另一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞合適的可選擇標(biāo)記基因的例子，是那些能夠鑒別出細(xì)胞組分有能力攝取核酸的標(biāo)記基因，如DHFR或胸苷激酶。將哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化子置于選擇壓力下，使得僅有轉(zhuǎn)化子因?yàn)閿z取了標(biāo)記基因而能夠唯一地存活。選擇壓力的施加是通過(guò)在一定的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，其中培養(yǎng)基中選擇劑的濃度連續(xù)地變化，從而導(dǎo)致擴(kuò)增選擇基因和編碼多肽變異體的DNA。擴(kuò)增是這樣的過(guò)程通過(guò)該過(guò)程，大量需要的、產(chǎn)生對(duì)生長(zhǎng)至關(guān)重要的蛋白質(zhì)的基因，在續(xù)代重組細(xì)胞的染色體中變得串聯(lián)重復(fù)。從擴(kuò)增的DNA合成出大量的多肽變異體。其他可擴(kuò)增基因的例子包括金屬硫蛋白-I和金屬硫蛋白-II(較佳的是靈長(zhǎng)目的金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，先通過(guò)將所有的轉(zhuǎn)化子在含有氨甲蝶呤(Mtx)(一種DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而被鑒別出。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，一種合適的宿主細(xì)胞是在DHFR活性方面有缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，其制備和繁殖如Urlaub和Chasin，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，774216(1980)中所述。再將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞暴露于更高濃度的氨甲蝶呤。這導(dǎo)致合成多拷貝的DHFR基因，同時(shí)還合成了多拷貝的構(gòu)成表達(dá)載體的其他DNA，如編碼多肽變異體的DNA。如果使用對(duì)Mtx有高抗性的突變型DHFR基因，則這種擴(kuò)增技術(shù)可用于任何其他原本不合適的宿主細(xì)胞如ATCCNo.CCL61CHO-K1，盡管該細(xì)胞存在內(nèi)源的DHFR(EP117,060)?；蛘?，用編碼多肽變異體、野生型DHFR蛋白和其他可選擇標(biāo)記如氨基糖苷3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列所轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(尤其是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)，可以通過(guò)在含有針對(duì)可選擇標(biāo)記的選擇劑的培養(yǎng)基中讓細(xì)胞生長(zhǎng)而選擇出，其中選擇劑可以是例如氨基糖苷類抗生素如卡那霉素、新霉素或G418。參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,965,199。合適的用于酵母中的選擇基因，是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，自然28239；Kingsman等人，基因，7141；或Tschemper等人，基因10157)。trp1基因提供了一種用于不能在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母突變株如ATCCNo.44076或PEP4-1的選擇標(biāo)記(Jones，遺傳學(xué)8512)。通過(guò)在沒(méi)有色氨酸下的生長(zhǎng)，在酵母宿主細(xì)胞基因組中存在的trp1損傷便提供了一種有效的、檢測(cè)轉(zhuǎn)化的環(huán)境。類似地，可用已知的含有Leu2基因的質(zhì)粒來(lái)互補(bǔ)Leu2-缺陷型的酵母株(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體也可用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母屬的酵母。Bianchi等人，Curr.Genet.12185(1987)。最近，報(bào)道了一種用于乳克魯維酵母(K.lactis)的、大規(guī)模生產(chǎn)重組牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)，VandenBerg，Bio/Technology8135(1990)。還公開(kāi)了由克魯維酵母屬的工業(yè)菌株分泌成熟的重組人血清白蛋白的、穩(wěn)定的多拷貝表達(dá)載體。Fleer等人，Bio/Technology9968-975(1991)。(iv)啟動(dòng)子元件表達(dá)和克隆載體常含有啟動(dòng)子，它為宿主生物體所識(shí)別并可操作地連于核酸。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(5′)的非翻譯序列(一般為約100-1000bp)，它控制與其可操作地相連的具體核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，如本文的多肽變異體的核酸序列。這些啟動(dòng)子通常被分成2類，誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，在其對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)條件的某些變化(如存在或缺乏某種營(yíng)養(yǎng)成分，或者溫度變化)的控制下，它會(huì)開(kāi)始高水平地轉(zhuǎn)錄DNA。目前，大量為各種潛在宿主細(xì)胞所識(shí)別的啟動(dòng)子是眾所周知的。用限制性酶消化從源DNA中切取啟動(dòng)子，然后將分離出的啟動(dòng)子序列插入載體，這樣便可將這些啟動(dòng)子可操作地連于編碼多肽變異體的DNA。感興趣多肽的啟動(dòng)子以及許多異源啟動(dòng)子都可用于指導(dǎo)DNA的擴(kuò)增和/或表達(dá)。但是，優(yōu)選的是異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c感興趣多肽的啟動(dòng)子相比，它們一般可更高地轉(zhuǎn)錄和更大量重組地產(chǎn)生多肽變異體。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等人，自然275615；和Goeddel等人，自然281544)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，核酸研究84057和EP36,776)以及雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(deBoer等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)8021-25)。然而，其他已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)被出版，從而可使技術(shù)人員將它們可操作地連于編碼多肽變異體的DNA(Siebenlist等人，細(xì)胞20269)，其中可使用接頭或銜接頭來(lái)提供任何所需的限制性位點(diǎn)。用于細(xì)菌系統(tǒng)啟動(dòng)子還可含有可操作地連于編碼多肽變異體的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。用于真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核基因含有位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25-30堿基處的富含AT的區(qū)域。另一種在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始位置上游70-80堿基處發(fā)現(xiàn)的序列是CXCAAT區(qū)域，其中X可以是任何核苷酸。在許多真核基因的3′端的是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3′端添加polyA尾的信號(hào)。所有這些序列都適合插入于真核表達(dá)載體中。適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073)或其他糖酵解酶(Hess等人，J.Adv.EnzymeReg.7149；和Holland，生物化學(xué)174900)如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。其他的酵母啟動(dòng)子，即具有額外的由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們是乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮代謝關(guān)聯(lián)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶等的啟動(dòng)子區(qū)域。用于酵母表達(dá)的合適載體和啟動(dòng)子還描述于Hitzeman等人，EP73,657A中。酵母增強(qiáng)子也可與酵母啟動(dòng)子一起有利地使用。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中從載體上轉(zhuǎn)錄出多肽變異體，是被從病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(UK2,211,504，1989年7月5日出版)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和最佳的猴病毒40(SV40)的基因組中獲得的啟動(dòng)子；從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子中獲得的啟動(dòng)子；從熱激啟動(dòng)子中獲得的啟動(dòng)子；或從通常與多肽變異體相關(guān)的啟動(dòng)子所控制，只要這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可方便地以SV40限制性片段的形式獲得，它還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。Fiers等人，自然273113(1978)；Mulligan和Berg，科學(xué)2091422-1427(1980)；Pavlaskis等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)787398-7402(1981)。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得。Greenaway等人，基因18355-360(1982)。用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)公開(kāi)于美國(guó)專利No.4,419,446。這種系統(tǒng)的一種改良形式描述于美國(guó)專利No.4,601,978。還可參見(jiàn)Gray等人，自然295503-508(1982)，內(nèi)容為在猴細(xì)胞中表達(dá)編碼免疫干擾素的cDNA；Reyes等人，自然297598-601(1982)，內(nèi)容為在單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下，在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人β-干擾素cDNA；Canaani和Berg，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)795166-5170(1982)，內(nèi)容為在培養(yǎng)的小鼠和兔細(xì)胞中表達(dá)人干擾素-β1基因；以及Gorman等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)796777-6781(1982)，內(nèi)容為在CV-1猴腎細(xì)胞、雞胚胎成纖維細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和小鼠NIH-3T3細(xì)胞中，用Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子，表達(dá)細(xì)菌的CAT序列。(v)增強(qiáng)子元件通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體，通?？梢栽诟呒?jí)真核生物中，增加轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明多肽變異體的DNA的水平。增強(qiáng)子是順式作用的DNA元件，一般為10-300bp，它作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄作用。增強(qiáng)子取向和位置是相對(duì)獨(dú)立的，已發(fā)現(xiàn)可位于轉(zhuǎn)錄單元的5′端(Laimins等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)78993)和3′端(Lusky等人，Mol.CellBio.31108)，可位于內(nèi)含子(Banerji等人，細(xì)胞33729)，也可位于編碼序列本身(Osborne等人，Mol.CellBio.41293)?，F(xiàn)在，許多哺乳動(dòng)物基因的增強(qiáng)子序列是已知的(珠蛋白、彈性蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。然而，典型地，人們可使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括在復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)(堿基對(duì)100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。還可參見(jiàn)Yaniv，自然29717-18(1982)，內(nèi)容為用于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件。增強(qiáng)子可以被剪接入載體中多肽變異體編碼序列的5′或3′的位置，但是最好位于啟動(dòng)子5′端的某個(gè)位置。(vi)轉(zhuǎn)錄終止元件用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人、或來(lái)自其他多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列。這樣的序列一般可從真核或病毒DNA或cDNA的5′(以及偶爾的3′)不翻譯區(qū)域中獲得。這些區(qū)域，含有在編碼多肽變異體的mRNA的不翻譯部分中以聚腺苷酸片段形式轉(zhuǎn)錄的片段。(vii)載體的構(gòu)建和分析可采用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)構(gòu)建含有一個(gè)或多個(gè)上述元件的合適載體。分離出的質(zhì)粒或DNA片段被切割、剪裁并重新連接成所需的形式，從而產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。為了分析以證實(shí)在構(gòu)建的質(zhì)粒中序列正確，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12株294(ATCC31,446)，并且合適的話，用氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇出成功的轉(zhuǎn)化子。制備來(lái)自轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶消化法和/或用Messing等人，核酸研究9309(1981)或Maxam等人，酶學(xué)方法65499(1980)的方法測(cè)序而加以分析。(viii)瞬時(shí)表達(dá)載體在實(shí)施本發(fā)明中特別有用的是，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)編碼多肽變異體的DNA的表達(dá)載體。一般，瞬時(shí)表達(dá)涉及使用能夠在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制的表達(dá)載體，從而在宿主細(xì)胞中積累許多拷貝的表達(dá)載體，并因而可合成高水平的由表達(dá)載體編碼的所需多肽。Sambrook等人，同上，pp16.17-16.22。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)包括合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，它可方便地正確鑒定出克隆的DNA所編碼的多肽變異體，以及快速地篩選具有所需生物特性或生理特性的變異體。因此，為了鑒別出有生物活性的多肽變異體，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在本發(fā)明中特別有用。(ix)合適的代表性脊椎動(dòng)物細(xì)胞載體適用于在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中合成多肽變異體的其他方法、載體和宿主細(xì)胞，描述于Gething等人，自然293620-625(1981)；Mantei等人，自然28140-46(1979)；EP117,060；和EP117,058。對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生多肽變異體特別有用的質(zhì)粒是pRK5(EP307,247)或pSVI6B(PCT出版物No.WO/08291，1991年6月13日出版)。pRK5的衍生質(zhì)粒pRK5B(Holmes等人，科學(xué)，2531278-1280)在此處特別適合用于這種表達(dá)。D.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化用于克隆或表達(dá)此處載體的其他合適宿主細(xì)胞是上述的原核、酵母或其他更高級(jí)的真核細(xì)胞。用于該目的的合適原核生物包括真細(xì)菌如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏桿菌屬(Escheriachia)(比如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門(mén)氏菌屬如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和蘚樣芽胞桿菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD266,710中所公開(kāi)的蘚樣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，盡管其他的菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)、大腸桿菌DH5α、和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子僅僅是闡述性的，并不起限制作用。菌株W3110是特別優(yōu)選的宿主或親代宿主，因?yàn)樗怯糜谥亟MDNA產(chǎn)品發(fā)酵的常用宿主菌株。較佳地，宿主細(xì)胞應(yīng)分泌最少量的蛋白酶。例如，可以修飾菌株W3110，從而在編碼宿主內(nèi)源蛋白質(zhì)的基因上造成遺傳突變，其中這類宿主的例子包括大腸桿菌W3110株1A2，其完整基因型是tonAΔ；大腸桿菌W3110株9E4，其完整基因型是tonAΔptr3；大腸桿菌W3110株27C7(ATCC55,244)，其完整的基因型是tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-1ac)169ΔdegPΔompTkanr；大腸桿菌W3110株37D6，其完整的基因型是tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169ΔdegPΔompTΔrbs7ilvGkanr；大腸桿菌W3110株40B4，它是無(wú)卡那霉素抗性、具有degP缺失突變的株37D6；和在美國(guó)專利No.4,946,783(1990年8月7日授權(quán))中所公開(kāi)的、具有突變的外周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌株。另外，體外克隆方法，如PCR或其他核酸聚合酶反應(yīng)，也是適用的。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適用于多肽變異體編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵(Saccharomycescerevisiae)，即常見(jiàn)的發(fā)面酵母，是低級(jí)真核宿主微生物中最常用的。然而，大量其他屬、種或株通常是可供此處使用的，如裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse，自然，290140；EP139,383，1985年5月2日出版)；克魯維酵母屬宿主(美國(guó)專利No.4,943,529；Fleer等人，同上)如乳克魯維酵母(K.lactis)[MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt等人，細(xì)菌學(xué)雜志737(1983)]、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wicheramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906；VandenBerg等人，同上)、K.thermotolerans和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；yarrowia[EP402,226]；巴士德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP183,070；Sreekrishna等人，J.BasicMicrobiol.28265-278)；念珠菌屬；Trichodermareesia[EP244,234]；粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(Case等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)765259-5263)；許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(Schwanniomycesoccidentalis)(EP394,538，1990年10月31日出版)；和絲狀真菌如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉菌屬(penicillium)、Tolypocladium(WO91/00357，1991年1月10日出版)和曲霉屬(Aspergillus)如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.112284-289；Tilburn等人，基因26205-221；Yelton等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)811470-1474)和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志4475-479)。適用于產(chǎn)生多肽變異體的宿主細(xì)胞可衍生自多細(xì)胞生物體。這種宿主細(xì)胞能夠進(jìn)行復(fù)雜的加工并有糖基化活性。原則上，任何高級(jí)的真核生物細(xì)胞都可行，無(wú)論是來(lái)自脊椎動(dòng)物還是來(lái)自無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)的細(xì)胞。已經(jīng)鑒別出許多桿狀病毒株和變異株，以及相應(yīng)的來(lái)自宿主(如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(蠋)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyxmori))的允許性昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞?？蓞⒁?jiàn)例如Luckow等人，Bio/Technology647-55(1988)；Miller等人，遺傳工程(GeneticEngineering)，Setlow等人編輯，Vol8(PlenumPublishing，1986)，pp.277-279；和Maeda等人，自然315592-594(1985)。用于轉(zhuǎn)染的各種不同的病毒株是公眾可以獲得的，如苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1變異體和家蠶NPV的Bm-5株，而且這類病毒可根據(jù)本發(fā)明在此處用作病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物可以被用作宿主。典型地，通過(guò)與細(xì)菌根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的某些株一起孵育而轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，其中事先已對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行操作使其含有該DNA。在將植物細(xì)胞培養(yǎng)物和根瘤農(nóng)桿菌一起孵育時(shí)，將編碼多肽變異體的DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞宿主中，從而使其被轉(zhuǎn)染并且在合適的條件下表達(dá)該DNA。此外，與植物細(xì)胞相容的調(diào)控序列和信號(hào)序列是可以獲得的，如胭脂堿合成酶啟動(dòng)子和聚腺苷酸信號(hào)序列。Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.1561(1982)。此外，從T-DNA780基因的上游區(qū)域中分離出的DNA片段，能激活或增加在含重組DNA的植物組織中可被植物表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄水平。EP321,196，1989年6月21日出版。然而，脊椎動(dòng)物細(xì)胞是最感興趣的，而近年來(lái)通過(guò)培養(yǎng)繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞(組織培養(yǎng))已經(jīng)成為一種常規(guī)的程序(TissueCulture，AcademicPress，Kruse和Patterson，編輯者)。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是被SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚腎細(xì)胞系(293或亞克隆的懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham等人，J.GenVirol.3659)；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，774216)；小鼠Sertoli細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251)；猴腎細(xì)胞(CV1ATCCCCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34)；水牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75)；人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝癌系(HepG2)。宿主細(xì)胞用本發(fā)明的上述表達(dá)或克隆載體加以轉(zhuǎn)染以及更佳地加以轉(zhuǎn)化，然后在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基被加以改進(jìn)以便誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。轉(zhuǎn)染指表達(dá)載體被宿主細(xì)胞所攝入，而不論任何編碼序列是否真的被表達(dá)。對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言，有許許多多轉(zhuǎn)染方法是已知的，例如磷酸鈣法和電穿孔法。當(dāng)宿主細(xì)胞中有這種載體操作的跡象，一般便認(rèn)為是成功的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化意味著將DNA引入某個(gè)生物體，從而使該DNA作為染色體外元件或因整合到染色體上而被復(fù)制，取決于所用的宿主細(xì)胞，用適合該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如在Sambrook等人(同上)1.82章節(jié)所描述的用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理法，或者電穿孔法，一般可以用于原核或其他含有基本細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。用根瘤農(nóng)桿菌進(jìn)行的感染，可用于轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞，如Shaw等人，基因23315(1983)和WO89/05859(1989年6月29日出版)所述。此外，植物可用超聲波處理進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如1991年1月10日出版的WO91/00358中所述。對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選的是Graham和vanderEb，Virology52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的總體情況，已經(jīng)描述于1983年8月16日授于Axel的美國(guó)專利No.4,399,216中。轉(zhuǎn)化酵母通常是按VanSolingen等人，J.Bact.130946(1977)和Hsiao等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)763829(1979)的方法進(jìn)行。然而，其他將DNA引入細(xì)胞的方法，如核微注射、電穿孔、用完整的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌原生質(zhì)體融合、或聚陽(yáng)離子如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鳥(niǎo)氨酸等也可使用。對(duì)于用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見(jiàn)Keown等人，酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)(1989)，Keown等人，酶學(xué)方法185527-537(1990)和Mansour等人，自然336348-352(1988)。E.培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽變異體多肽的原核細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)基如在Sambrook等人(同上)中所述的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)。用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽變異體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可在各種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售的培養(yǎng)基如Ham′sF10(Sigma)、F-12(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)和D-MEM/F-12(GibcoBRL)都適合培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞。此外，任何在例如下列文獻(xiàn)中描述的培養(yǎng)基也可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham和Wallace，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes和Sato分析化學(xué)(Anal.Biochem)102255(1980)，美國(guó)專利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469；或4,560,655；美國(guó)專利RENo.30\985；WO90/03430；WO87/00195。所有這些培養(yǎng)基都可按需要添加激素和/或其他的生長(zhǎng)因子(如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、或表皮生長(zhǎng)因子[EGF])、鹽類(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素(GentamycinTM)藥物)、痕量元素(定義為以微摩爾級(jí)的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等價(jià)的能量源。任何其他必要的補(bǔ)充物也可以合適的濃度加入，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是以往用于選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，這是一般技術(shù)人員所熟知的。一般而言，用于擴(kuò)大體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)量的原則、方案和實(shí)際技術(shù)可在MammalianCellBiotechnologyaPracticalApproach，M.Butler，ed.，IRLPress，1991中找到。在該公開(kāi)內(nèi)容中所指的宿主細(xì)胞包括體外培養(yǎng)中的細(xì)胞以及在宿主動(dòng)物中的細(xì)胞。F.基因擴(kuò)增/表達(dá)的檢測(cè)根據(jù)本文所提供的序列，采用適當(dāng)標(biāo)記的探針，可在樣品中直接檢測(cè)基因擴(kuò)增和/或表達(dá)，例如通過(guò)常規(guī)的Southern印跡法、Northern印跡法來(lái)定量分析mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，775201-5205)、斑點(diǎn)印跡法(DNA分析)、或原位雜交?？刹捎酶鞣N不同的標(biāo)記，最常用的是放射性同位素，尤其是32P。但是，也可采用其他技術(shù)，例如使用被生物素修飾的核苷酸，以便將其引入多聚核苷酸。然后，生物素便作為結(jié)合親和素或抗體(它們可被各種不同的標(biāo)記物如放射性核素、熒光物質(zhì)、酶等所標(biāo)記)的位點(diǎn)?；蛘撸墒褂媚茏R(shí)別特定雙鏈的抗體，其中包括DNA雙鏈、RNA雙鏈、和DNA-RNA雜合雙鏈或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體?？贵w也可被標(biāo)記，并在雙鏈體固定于某表面的情況下進(jìn)行分析，這樣一旦在表面上形成雙鏈體，這能夠檢測(cè)到存在結(jié)合于雙鏈體的抗體?；蛘?，基因表達(dá)可用免疫方法來(lái)直接定量分析基因產(chǎn)物的表達(dá)，如組織切片的免疫組織化學(xué)染色法和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液分析。用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)時(shí)，先制備細(xì)胞(一般通過(guò)脫水和固定)，然后與對(duì)偶聯(lián)的基因產(chǎn)物特異的、標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)，其中該標(biāo)記通常是可通過(guò)視覺(jué)檢測(cè)的，如酶標(biāo)、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記等。一種特別靈敏的、適用于本發(fā)明的染色技術(shù)由Hsu等人，Am.J.Clin.Path.，75734-738(1980)。用于免疫組織化學(xué)染色和/或樣品液體分析的抗體，可以是單克隆或多克隆抗體，而且可以是在任何哺乳動(dòng)物中制備的。常規(guī)地，可根據(jù)在下面章節(jié)4中所述的那樣，制備針對(duì)多肽變異體的抗體。G.純化多肽如果變異體是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，那么作為第一個(gè)步驟，將顆粒碎屑(宿主細(xì)胞或裂解的碎片)去除，例如通過(guò)離心或超過(guò)濾；任選地，蛋白質(zhì)可用市售的蛋白質(zhì)濃縮過(guò)濾器加以濃縮，然后用一個(gè)或多個(gè)選自下組的步驟將多肽變異體與其他雜質(zhì)分開(kāi)免疫親和色譜，離子交換柱分級(jí)(如在二乙氨乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基的基質(zhì)上)，在Blue-瓊脂糖凝膠(Sepharose)、CMBlue-瓊脂糖凝膠、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-瓊脂糖凝膠、麥胚凝集素-瓊脂糖凝膠、伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖凝膠、乙醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl、或蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的色譜，SDS-PAGE色譜，氧化硅色譜，層析聚焦，反相HPLC(如具有側(cè)鏈脂族基團(tuán)的氧化硅凝膠)，使用例如Sephadex分子篩的凝膠過(guò)濾或分子排阻色譜，在選擇性地結(jié)合多肽的柱上進(jìn)行的色譜，以及乙醇或硫酸銨沉淀。在細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組多肽變異體，其分離通常是先從細(xì)胞沉淀物中抽提出，然后進(jìn)行一次或多次的濃縮、鹽析、水性離子交換或分子排阻色譜步驟。此外，重組多肽變異體可用親和色譜加以純化。最后，在最后的純化步驟中可采用HPLC。用于表達(dá)編碼多肽變異體的核酸的微生物細(xì)胞，可用任何常規(guī)的方法進(jìn)行破碎，其中包括凍融循環(huán)、超聲波處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。在上述的任一步驟中，可加入蛋白酶抑制劑如甲基磺酰氯(PMSF)以抑制蛋白水解，還可加入抗生素以防止不定污染物的生長(zhǎng)。在另一個(gè)例子中，來(lái)自系統(tǒng)(該系統(tǒng)將重組多肽變異體分泌入培養(yǎng)基中)的上清液先用市售的蛋白質(zhì)濃縮過(guò)濾器，如Amicon或MilliporePellicon的超過(guò)濾裝置進(jìn)行濃縮。在濃縮步驟之后，將濃縮物加至合適的純化基質(zhì)中。例如，合適的親和基質(zhì)可包括固定于適當(dāng)載體上的用于蛋白質(zhì)的配體、凝集素或抗體分子?；蛘?，可采用離子交換樹(shù)脂，例如具有側(cè)鏈DEAE基團(tuán)的基質(zhì)或基底。合適的基質(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或其他在蛋白質(zhì)純化中常用的類型?；蛘?，還可采用陽(yáng)離子交換步驟。合適的陽(yáng)離子交換劑包括各種不溶的、含有磺丙基或羧甲基的基質(zhì)?；潜貏e優(yōu)選。最后，可采用一個(gè)或多個(gè)RP-HPLC步驟來(lái)進(jìn)一步純化多肽變異體組合物，其中采用疏水的RP-HPLC介質(zhì)，如具有側(cè)鏈甲基或其他脂族基團(tuán)的氧化硅凝膠。以各種形式組合的、上述純化步驟中部分或全部，也可被用于提供均質(zhì)的重組多肽變異體。對(duì)以分泌多肽形式產(chǎn)生多肽變異體的酵母進(jìn)行發(fā)酵，可大大簡(jiǎn)化純化過(guò)程。由大規(guī)模發(fā)酵所產(chǎn)生的分泌的重組多肽變異體，可用Urdal等人，J.Chromatog.，296171(1984)中所描述的類似方法進(jìn)行純化。該文獻(xiàn)描述了2個(gè)依次的PR-HPLC步驟，以便在制備性的HPLC柱上純化重組的人IL-2?；蛘撸捎弥T如親和色譜等技術(shù)來(lái)純化多肽變異體。在重組培養(yǎng)物中合成的哺乳動(dòng)物多肽變異體，其特征是存在非人的細(xì)胞組分(包括蛋白質(zhì))，其數(shù)量和性質(zhì)取決于從培養(yǎng)物中回收多肽變異體所采用的純化步驟。這些組分一般來(lái)自酵母、原核生物、或非人的高等真核生物，而且較佳地以無(wú)害污染程度的數(shù)量存在，其數(shù)量級(jí)小于約1％(重量)。H.多肽變異體的共價(jià)修飾多肽變異體的共價(jià)修飾形式被包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。它們可用化學(xué)合成或者酶切或化學(xué)切割多肽變異體(如果適用的話)而形成。多肽變異體的其他類型的共價(jià)修飾形式，可通過(guò)將多肽變異體的靶氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑(derivatizingagent)反應(yīng)而被引入分子，其中該衍生劑能與選定的側(cè)鏈或者N端或C端殘基反應(yīng)。半胱氨酰基，最常見(jiàn)地是與α-鹵代乙酸化合物(和相應(yīng)的胺)如氯代乙酸或氯代乙酰胺，反應(yīng)從而形成羧甲基或羧基?；谆苌铩０腚装滨；€可通過(guò)與下列物質(zhì)的反應(yīng)而進(jìn)行衍生溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸(α-bromo-β-(5-imidozoyl)propionicacid)、氯代乙酰磷酸鹽、N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對(duì)氯(高)汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯代-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)。組氨?；赏ㄟ^(guò)與二乙基焦碳酸(diethylpyrocarbonate)在pH5.5-7.0的反應(yīng)而進(jìn)行衍生，因?yàn)樵撛噭?duì)組氨?；鶄?cè)鏈?zhǔn)禽^特異的。還可使用對(duì)溴苯甲酰甲基溴；該反應(yīng)優(yōu)選在0.1M二甲胂酸鈉，pH6.0中進(jìn)行。賴氨?；桶被藲埢膳c琥珀酸或其他羧酸的酸酐反應(yīng)。與這些試劑的衍生反應(yīng)可影響賴氨酰基的電荷。其他合適的、用于衍生含α-氨基殘基的試劑包括亞氨酸酯如甲基吡啶酰亞胺酸(picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、chloroborohydride、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮、和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。精氨?；赏ㄟ^(guò)與一種或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)而被修飾，其中包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生需要反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜δ軋F(tuán)的pKa高。此外，這些試劑可與賴氨酸的基團(tuán)和精氨酸ε-氨基反應(yīng)。酪氨酰基的特異性修飾，可通過(guò)與芳香重氮化合物或四硝基甲烷的反應(yīng)而完成，尤其是為了將光譜標(biāo)記引入酪氨?；?。最常見(jiàn)的是，用N-乙?；溥蚝退南趸淄閬?lái)分別形成O-乙?；野滨；N類和3-硝基衍生物。酪氨?；?25I或131I進(jìn)行碘化，以便用于放射性免疫測(cè)定，其中上述的氯胺T法是合適的。羧基側(cè)鏈(天冬氨酰基或谷氨?；?的選擇性修飾，可通過(guò)與碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R′，其中R和R′是不同的烷基)如與1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺的反應(yīng)。此外，天冬氨?；蚬劝滨；€可通過(guò)與銨離子的反應(yīng)，被轉(zhuǎn)變成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；?。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；ǔ１幻撊グ被?，分別形成相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；?。這些殘基在中性或堿性條件下被脫去氨基。這些殘基的脫氨基修飾在本發(fā)明范圍之內(nèi)。其他的修飾形式包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&amp;Co.，SanFrancisco，pp.79-86)，N端胺基的乙?；腿魏蜟端羧基的胺化。包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)的、多肽變異體的另一種共價(jià)修飾形式，是改變多肽變異體的原始糖基化方式。改變”指刪去一個(gè)或多個(gè)在多肽變異體中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物部分，和/或增加一個(gè)或多個(gè)在多肽變異體中不存在的糖基化位點(diǎn)。多肽變異體的糖基化通常是N-連接的或O-連接的?！癗-連接”指碳水化合物部分連在天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸這樣的三肽序列是將碳水化合物酶促連于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中存在任何一種這樣的三肽便可形成一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)?！癘-連接的”糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖中的一種被連于羥基氨基酸上，最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基絲氨酸。在多肽變異體中添加糖基化位點(diǎn)，通?？赏ㄟ^(guò)改變氨基酸序列從而使其含有一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn)而言)而實(shí)現(xiàn)。還可以通過(guò)在原始的多肽變異體中添加或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基而實(shí)現(xiàn)改變(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn)而言)。為了方便起見(jiàn)，優(yōu)選通過(guò)在DNA水平進(jìn)行改變，而改變多肽變異體的氨基酸序列，尤其是通過(guò)使編碼多肽變異體的DNA在預(yù)定的堿基處發(fā)生突變，從而產(chǎn)生會(huì)被翻譯成所需氨基酸的密碼子。DNA突變可用上述的方法進(jìn)行。另一種增加多肽變異體上碳水化合物分子數(shù)目的方法，是將糖苷用化學(xué)或酶法偶聯(lián)于多肽變異體。這些程序有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾恍枰诰哂蠳-或O-連接糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽變異體。取決于所用的偶聯(lián)方式，糖可連于(a)精氨酸和組氨酸；(b)自由的羧基；(c)自由的巰基，如半胱氨酸的巰基；(d)自由的羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的羥基；(e)芳香殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于WO87/05330(1987年9月11日出版)和Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。將多肽變異體上存在的碳水化合物部分去除可以用化學(xué)法或酶法?；瘜W(xué)法去糖基化，需要將多肽變異體暴露于三氟甲烷磺酸化合物或等價(jià)的化合物中。這種處理導(dǎo)致切除大部分或全部的糖，除了連接性的糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，并且保留完整的多肽變異體?；瘜W(xué)法去糖基化描述于Hakimuddin，等人，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem，118131(1981)。將多肽變異體上的碳水化合物部分用酶法切除，可用Thotakura等人，Meth.Enzymol.，138350(1987)中所述的各種內(nèi)切和外切糖苷酶而實(shí)現(xiàn)。如Duskin等人，J.Biol.Chem.，2573105(1982)所述，通過(guò)使用化合物衣霉素，可防止在潛在的糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基化。衣霉素阻斷蛋白質(zhì)-N-糖苷鍵的形成。另一種多肽變異體的共價(jià)修飾包括，將多肽變異體連于各種非蛋白質(zhì)的聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法描述于美國(guó)專利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中。3.治療組合物變異體的施用抗-CD18變異體的用途包括抗-Macl/抗嗜中性細(xì)胞以及抗-LFA-1應(yīng)用。如果多肽變異體作為抗體，那么它可任選地融合于第二個(gè)多肽，并且可用抗體或融合蛋白來(lái)分離和純化某種蛋白，該蛋白能被其從原料中結(jié)合出來(lái)，如CD11或CD18抗原。在另一例子中，本發(fā)明提供了一種體外或體內(nèi)檢測(cè)CD11a或CD18的方法，它包括將此處的抗-CD11a或CD18的抗體片段變異體，與懷疑含有CD11a或CD18的樣品尤其是血清樣品接觸，然后檢測(cè)是否發(fā)生了結(jié)合。此處的多肽變異體還適用于定量診斷分析，作為標(biāo)準(zhǔn)物或?qū)φ瘴镉糜谥苽涞暮形粗獢?shù)量的多肽變異體的樣品。將具有所需純度的多肽變異體與任選的生理上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑(Remington′sPharmaceuticalSciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以凍干的餅狀物或水溶液形式進(jìn)行混合，可以制得多肽變異體的用于特定病癥的治療制劑，以便儲(chǔ)藏?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑，對(duì)接受者而言在所用的劑量和濃度下應(yīng)是無(wú)毒的，并且可含有緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑如維生素C；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。典型地，用于本發(fā)明方法的多肽，是通過(guò)在室溫、合適的pH和所需純度下將其與生理上可接受的載體(即對(duì)接受者而言在所用的劑量和濃度下無(wú)毒的載體)而制備的。制劑的pH主要取決于具體的用途和變異體的濃度，但是一般在約3-8范圍內(nèi)。在pH約5-8的緩沖液中的制劑是一個(gè)合適的例子。用于此處的多肽變異體優(yōu)選是無(wú)菌的。無(wú)菌可通過(guò)無(wú)菌的(0.2微米)膜過(guò)濾而方便地實(shí)現(xiàn)。多肽變異體一般以水溶液形式儲(chǔ)存，但是凍干制劑(以便重組成(reconstitution))也是可以的。變異體組合物可按照良好的醫(yī)療實(shí)踐進(jìn)行配制、分劑和給藥。在上下文中應(yīng)考慮的因素包括待治療的具體疾病、待處理的具體哺乳動(dòng)物、各病人的臨床癥狀、疾病原因、藥劑給藥部位、給藥方法、給藥日程安排、以及醫(yī)療人員已知的其他因素?！爸委熡行Я康摹贝┯枚嚯淖儺愺w由這些考慮因素所決定，而對(duì)于LFA-1拮抗劑變異體而言，是防止、改善或治療LFA-1介導(dǎo)的疾病所需的最低數(shù)量，包括治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、減弱炎癥應(yīng)答、誘導(dǎo)對(duì)免疫刺激物的忍受度、防止產(chǎn)成移植物被宿主(或相反)排斥的免疫應(yīng)答、或延長(zhǎng)植入的移植物的生存時(shí)間。變異體的數(shù)量，最好低于會(huì)對(duì)宿主造成毒性或賦予宿主更明顯的對(duì)感染易感性的數(shù)量。作為一般性的建議，每個(gè)腸胃外給藥劑量中LFA-1拮抗劑變異體的初始藥物有效量是約0.1-20毫克/千克病人體重/每天，而使用的典型LFA-1拮抗劑變異體初始范圍是約0.3-15毫克/千克/天。但是，如上所述，LFA-1拮抗劑變異體的這些建議數(shù)量將用于大量治療的具體情況。在選擇合適的劑量和日程安排時(shí)的關(guān)鍵因素是如上所述的、所獲得的結(jié)果。例如，對(duì)于最初治療正發(fā)作和急性的移植排斥，或者在后期階段治療急性排斥(其特征是移植物功能突然下降)，可能需要較高的劑量。當(dāng)隨后的劑量小于100％初始劑量時(shí)，在每日劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)行計(jì)算。因此，例如，如果劑量方案是每天注射2mg/kg/天，共2周；隨后是每2周劑量為0.5mg/kg/天，共99天，那么以每天為基礎(chǔ)計(jì)算，隨后劑量約為1.8％初始劑量(即，2/天/100％＝0.5/14天/x％，x＝～1.8％)。較佳地隨后的劑量小于約50％，更佳地小于約25％，更好地小于約10％，再好地小于約5％，最佳地小于約2％初始劑量的LFA-1拮抗劑變異體。根據(jù)具體疾病，為了獲得LFA-1拮抗劑變異體的最有效結(jié)果，初始給藥應(yīng)盡可能地根據(jù)第一病征、診斷、臉色或疾病發(fā)生等情況，或在自身免疫疾病緩和過(guò)程中進(jìn)行。較佳地，初始給藥應(yīng)在暴露于抗原前開(kāi)始，如在移植的移植物的情況中。此外，當(dāng)初始給藥是在暴露于抗原之前或幾乎同時(shí)時(shí)，最好隨后給藥所持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)于初始給藥的時(shí)間(尤其對(duì)于移植而言)，而且它可以是連續(xù)的、間歇維持劑量(對(duì)于病人的一生而言不必是連續(xù)的)。LFA-1拮抗劑變異體的優(yōu)選日程表是，初始給藥(即在不良的免疫應(yīng)答發(fā)生之時(shí)或之前施用一定劑量，其給藥頻率不高于每天一次，并也包括通過(guò)輸液連續(xù)地給藥)以及隨后的給藥，是以間隔不超過(guò)約1周的頻率進(jìn)行的。更佳地，取決于具體的疾病以及尤其對(duì)于移植，最初每天給藥在暴露于抗原(如移植物)或開(kāi)始急性免疫應(yīng)答(如自身免疫性疾病中)之后應(yīng)持續(xù)至少約1周，較佳地至少約2周；而且在初始給藥結(jié)束之后，隨后劑量的施用應(yīng)不少于每2周一次(較佳地為每2周一次)，并持續(xù)至少約5周、更佳地持續(xù)約10周。在另一優(yōu)選例子中，尤其是當(dāng)拮抗劑變異體是抗-CD11a或抗-CD18抗體的Fab或(Fab′)2時(shí)，初始給藥在進(jìn)行移植后約1天-4周，較佳地約1-3周，更佳地約2-3周時(shí)結(jié)束；而初始給藥可在進(jìn)行移植之前約1周至與移植幾乎同時(shí)之間的時(shí)間內(nèi)開(kāi)始。多肽變異體可用任何合適的方式給藥，如腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)，而且如果需要用于局部免疫抑制治療，可通過(guò)損傷內(nèi)給藥(包括灌注或在移植前將移植物與拮抗劑進(jìn)行接觸)。腸胃外輸液包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。此外，LFA-1拮抗劑變異體施用用脈沖輸液法進(jìn)行給藥，尤其是LFA-1拮抗劑變異體的劑量逐漸下降時(shí)。較佳地，這些變異體的給藥是通過(guò)注射，最佳地是通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于給藥是短暫的還是長(zhǎng)期的。此處的多肽變異體不必(但是可任選地)與一種或多種目前用于預(yù)防或治療有關(guān)疾病的藥物一起配制。例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，LFA-1拮抗劑變異體可與糖皮質(zhì)類固醇一起給藥。此外，T細(xì)胞受體肽治療是防止出現(xiàn)自身免疫腦脊髓炎的臨床病癥的合適輔助療法。Offner等人，科學(xué)，251430-432(1991)。對(duì)于移植，LFA-1拮抗劑變異體可與上述的免疫抑制劑(如環(huán)孢菌素A)一起給藥或獨(dú)立地給藥，以便調(diào)控免疫抑制劑的作用。這些其他藥劑的有效量取決于制劑中LFA-1拮抗劑變異體的數(shù)量、疾病或治療的類型、和其他上述的因素。它們通常以相同的劑量進(jìn)行使用，并通過(guò)上述的途徑給藥，并且占目前使用劑量的約1-99％。各種上述的自身免疫疾病，用LFA-1拮抗劑變異體，以在因疾病而處于攻擊下，能誘導(dǎo)對(duì)自身抗原的免疫耐受性的方式進(jìn)行治療。在這方面，自身免疫疾病類似于宿主對(duì)移植物的排斥，它可用LFA-1拮抗劑變異體以類似的方式進(jìn)行治療。然而，與在移植前移植例子不同，在這些疾病中，病人早已開(kāi)始對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答，因此，需要用常規(guī)方法在這樣的病人中先誘導(dǎo)并維持暫時(shí)的免疫抑制狀態(tài)，如一般通過(guò)使用環(huán)孢菌素A或其他常規(guī)的免疫抑制劑(單獨(dú)地使用或與LFA-1拮抗劑變異體一起使用)，或者監(jiān)視病人直至發(fā)生一段時(shí)間的病情緩和(自身免疫應(yīng)答的病理或功能指征的消失或大大減少)。較佳地，暫時(shí)的免疫抑制用常規(guī)療法通過(guò)T細(xì)胞貧乏而加以誘導(dǎo)。然后使用LFA-1拮抗劑變異體，以防止撤去免疫抑制誘導(dǎo)劑時(shí)或當(dāng)癥狀緩解會(huì)停止時(shí)發(fā)生反彈?；蛘?，癥狀緩解的病人狀況被置于嚴(yán)密監(jiān)控突發(fā)(flare)病征之下，一旦表現(xiàn)出功能的或生物化學(xué)的突發(fā)情況，將立刻開(kāi)始最初的給藥方案并維持到突發(fā)消退。在該階段中LFA-1拮抗劑變異體的施用就是本文其他地方所述的初始給藥。在自身免疫疾病的情況下，初始給藥維持約1-16周。之后，更低劑量的LFA-1拮抗劑變異體維持治療方案，用與此處所述的基本相同的方式進(jìn)行給藥，以便改善移植物或宿主的排斥，盡管在某些情況下可能需要將隨后的或維持性劑量維持時(shí)間延長(zhǎng)得比移植更長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)例子中，如果已知抗原或含有抗原的組合物可導(dǎo)致自身免疫應(yīng)答，那么就在初始LFA-1拮抗劑變異體給藥及隨后進(jìn)行的拮抗劑變異體給藥之后，將該抗原施用于病人(可任選地與IL-1和/或γ干擾素一起施用)，以便抑制產(chǎn)生針對(duì)該抗原的自身免疫應(yīng)答，同時(shí)又最小限度地免疫抑制病人對(duì)其他抗原的應(yīng)答。在初次用LFA-1拮抗劑變異體進(jìn)行治療時(shí)，病人最好被隔離，較佳地是在無(wú)菌環(huán)境中，如目前用于移植操作的環(huán)境。病人應(yīng)沒(méi)有任何感染。沒(méi)有必要在維持給藥階段保持這樣的條件，而且事實(shí)上這正是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。就是說(shuō)，在用維持劑量進(jìn)行治療時(shí)，病人能夠?qū)χ車目乖?移植物或自身抗原除外)產(chǎn)生基本正常的免疫應(yīng)答。本發(fā)明特別適用于延長(zhǎng)移植的移植物的生存情況并提高其耐受性。在手術(shù)后的關(guān)鍵階段(最初的3個(gè)月)，可任選地用任何合適的方法系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)移植物的功能。一種這樣的方法是使用99Tcm-高锝酸鹽進(jìn)行的放射性核素靜脈內(nèi)血管造影術(shù)，如Thomsen等人，ActaRadiol.，29138-140(1988)中所述。此外，本發(fā)明方法還適用于同時(shí)進(jìn)行的多器官灌注和移植。Toledo-Pereyra和MacKenzie，Am.Surg.，46161-164(1980)。在某些情況下，會(huì)需要修飾移植物的表面使其具有帶正電荷或負(fù)電荷的基團(tuán)，如用合適的氨基酸或聚合物或?qū)⑸砩峡山邮艿膸щ姾傻墓倌軋F(tuán)連接上去。例如，對(duì)于血管，為了減少血液凝結(jié)，帶負(fù)電荷的表面是合適的。在某些情況下，還會(huì)需要賦予表面疏水性或親水性，如通過(guò)將例如苯丙氨酸、絲氨酸或賴氨酸等偶聯(lián)于表面。一種對(duì)于表面修飾特別有效的免疫抑制劑是戊二醛。如上所述，在移植之前，可任選地施用有效量的LFA-1拮抗劑變異體，以便誘導(dǎo)對(duì)移植物的耐受性?？刹捎门c移植后初始給藥相同的劑量和日程表。此外，在移植之前，移植物可任選地如美國(guó)專利No.5,135,915所述的那樣，與TGF-β組合物接觸。該專利的公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。簡(jiǎn)而言之，這種接觸可包括用組合物灌注移植物或與移植物一起溫育，或?qū)⒔M合物施涂在移植物的一個(gè)或多個(gè)表面上。處理過(guò)程一般至少進(jìn)行1分鐘，較佳地為1分鐘-72小時(shí)，更佳地為2分鐘-24小時(shí)，這取決于制劑中TGF-β的濃度、待處理的移植物和制劑的具體類型等因素。還應(yīng)注意，移植物可同時(shí)地或獨(dú)立地用LFA-1拮抗劑變異體進(jìn)行灌注。灌注可用任何合適的方法完成。例如，器官可通過(guò)某一提供恒定灌注壓力的設(shè)備進(jìn)行灌注，它具有位于泵和器官之間的壓力調(diào)節(jié)器和溢流裝置，比如1984年9月5日出版的DD213,134中所述的設(shè)備?；蛘撸鞴倏赏ㄟ^(guò)密封門(mén)而被置于超壓箱中，而灌注液通過(guò)泵被輸送至超壓箱中，其中該泵從儲(chǔ)液器(reservior)抽取液體，并將用過(guò)的灌注液通過(guò)閥而送回儲(chǔ)液器，如1984年11月21日出版的EP125,847中所述。在移植物被處理之后，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存或立刻用于移植程序。如上所述，儲(chǔ)存期可以延長(zhǎng)，如通過(guò)在制劑中使用血液替代品(如全氟代化學(xué)乳劑)；或者通過(guò)用含有冷等滲劑和抗凝結(jié)劑的TGF-β制劑灌注移植物，然后用甘油灌注，從而可以冷凍取出的器官而不會(huì)破壞細(xì)胞(如1985年4月9日出版的JP60061501中所述)。此外，器官可用已知的灌注液(含有所述的TGF-β和/或LFA-1拮抗劑)進(jìn)行保藏，同時(shí)器官可被冷卻至冰凍溫度，以便半永久地保藏器官而不造成細(xì)胞壞死(necrocytosis)，如美國(guó)專利No.4,462,215和4,494,385中所述。至于具體的心臟移植，Parent等人，Cryobiology，18571-576(1981)報(bào)道了，在移植前在5℃進(jìn)行冷冠狀灌注，可提高在植入最初階段對(duì)同種移植物的保護(hù)。任何這樣的程序，或其他的程序，在本發(fā)明范圍之內(nèi)，如果被認(rèn)為是保存移植物所必需的。在移植之前，最好用不含TGF-β組合物的溶液洗滌移植物，如浸泡在生理鹽水中或通過(guò)其他適合該目的的手段。不需要在移植之前去除LFA-1拮抗劑變異體。同樣，在移植之前，宿主可任選地進(jìn)行一次或多次供體特異性輸血操作，以利于移植物的存活。另一種方法是在移植操作之前或之后，讓宿主進(jìn)行淋巴輻射。任何其他移植前的、對(duì)特定的移植接受者有益的程序，都可作為本發(fā)明方法的一部分而進(jìn)行。4.制備抗體(其中變異體衍生自抗體)(i)原料和方法免疫球蛋白(Ig)及其某些變化形式是已知的，而且許多已經(jīng)在重組細(xì)胞培養(yǎng)中被制備。例如參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,745,055；EP256,654；EP120,694；EP125,023；EP255,694；EP266,663；WO88/035559；Faulkner等人，自然298286(1982)；Morrison，免疫學(xué)雜志123793(1979)；Kohler等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)772197(1980)；Raso等人，癌癥研究412073(1981)；Morrison等人，Ann.Rev，Immununol.2239(1984)；Morrison，科學(xué)，2291202(1985)；Morrison等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)816851(1984)。重配的免疫球蛋白鏈也是已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,444,878；WO88/03565；和EP68,763以及本文中提及的文獻(xiàn)。本發(fā)明的多肽變異體中免疫球蛋白部分，可以從IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM中獲得，但較佳地是從IgG-1或IgG-3中獲得。(ii)多克隆抗體通常通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射有關(guān)的抗原和佐劑，在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體?？捎秒p官能試劑即衍生劑(derivatizingagent)，如馬來(lái)酰亞胺苯甲?；虼牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-巰基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，將有關(guān)的抗原偶聯(lián)于在待免疫的動(dòng)物中有免疫原性的蛋白質(zhì)如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白抑制劑上。通過(guò)將1毫克或1微克肽或偶聯(lián)物(分別對(duì)兔或小鼠)與3份體積的Freud完全佐劑混合，然后將溶液在多個(gè)部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，使動(dòng)物對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，用1/5至1/10最初數(shù)量的、Freud完全佐劑中的偶聯(lián)物，在多個(gè)部位進(jìn)行皮下注射，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物放血，分析血清的抗體效價(jià)。繼續(xù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫直至效價(jià)呈平臺(tái)。較佳地，用偶聯(lián)于不同的蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的、相同抗原的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫動(dòng)物。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中以融合蛋白形式制造。而且，聚集劑如明礬適宜用來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體可以從一群基本均質(zhì)的抗體中獲得單克隆抗體，即構(gòu)成該群體的各抗體是相同的，除了可能存在少量天然存在的突變。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”是指這樣的特性即抗體不是不同抗體的混合物。例如可用Kohler&amp;Milstein，自然，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法，或者用重組DNA方法(Cabilly等人，美國(guó)專利No.4,816,567)來(lái)制備單克隆抗體。在雜交瘤法中，按上述那樣免疫小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以獲得產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，該抗體可特異性地結(jié)合于免疫中所用的蛋白質(zhì)?；蛘撸隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后用合適的融合劑如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原則和實(shí)踐(MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracice)，pp.59-103[AcademicPress，1986])。將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行接種，并在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可防止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些可有效地融合、支持選定的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定而高水平地表達(dá)抗體、并且對(duì)培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是鼠骨髓瘤細(xì)胞系如衍生自MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤的細(xì)胞系(可從SalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，California，USA獲得)和SP-2細(xì)胞(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockiville，MarylandUSA獲得)。已有描述將人骨髓瘤和鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001；和Brodeur等人，單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。對(duì)在其中生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，分析其是否產(chǎn)生了針對(duì)有關(guān)抗原的單克隆抗體。較佳地，由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性，用免疫沉淀法或體外結(jié)合測(cè)試(如放射性免疫測(cè)定(RLA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))加以測(cè)定。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以用例如Munson&amp;Pollard，Anal.Biochem.107220(1980)中的Scatchard分析法加以確定。在鑒別出可產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞之后，可用有限稀釋程序?qū)寺∵M(jìn)行亞克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行生長(zhǎng)(Goding，同上)。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括例如，Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(D-MEM)或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞還可在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水瘤而生長(zhǎng)。由亞克隆分泌的單克隆抗體可適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基、腹水液或血清中，用常規(guī)的免疫球蛋白純化方法而分離出，如蛋白質(zhì)A-Sepharose、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜。用常規(guī)方法，可方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA，并加以測(cè)序(如使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性地結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞可作為這種DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦被分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后再將表達(dá)載體植入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或本來(lái)不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。在細(xì)菌中表達(dá)編碼抗體的DNA方面的總結(jié)性文章，包括Skerra等人，Curr.OpinioninImmunol.，5256-262(1993)和Pluckthum，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。在另一例子中，用合適的抗原如CD11a、CD18、IgE或HER-2來(lái)選擇合適的抗體或抗體片段，可從抗體噬菌體文庫(kù)中分離出抗體或抗體片段，而這種噬菌體文庫(kù)是用McCafferty等人，自然，348552-554(1990)中所述的技術(shù)而產(chǎn)生的。Clackson等人，自然，352624-628(1991)和Mark等人，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體的過(guò)程。隨后的出版物描述了，用鏈改組法(chainshuffling)(Mark等人，Bio/Technol.10779-783)、以及組合感染和體內(nèi)重組等作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)(Waterhouse等人，核酸研究，212265-2266)的策略，產(chǎn)生高親和性(nM范圍)的人抗體。因此，對(duì)于分離“單克隆”抗體，這些技術(shù)是傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的有力替代技術(shù)。DNA還可被修飾，如用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替換同源的鼠序列(Cabilly等人，同上；Morrison等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，816851(1984))，或者將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)連接于免疫球蛋白的編碼序列。典型地，這樣的非免疫球蛋白多肽可替換抗體的恒定區(qū)，或者替換抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，從而產(chǎn)生嵌合的兩價(jià)抗體，該抗體具有一個(gè)對(duì)一種抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)以及另一個(gè)對(duì)不同抗原有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。嵌合的或雜合的抗體，還可用蛋白質(zhì)化學(xué)合成中的已知方法在體外進(jìn)行制備，其中包括那些使用交聯(lián)劑的方法。例如，可用二硫化物交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵而構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑包括亞胺硫羥酸鹽(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁酰亞胺鹽(butyrimidate)。對(duì)于診斷用途，本文中衍生自抗體的變異體一般被可檢測(cè)的部分標(biāo)記?？蓹z測(cè)的部分可以是任何能夠直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。例如可檢測(cè)的部分可以是放射性同位素如3H、14C、32P、35S或125I；熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，如熒光素、異硫氰酸酯、羅丹明、或螢光素；放射性同位素標(biāo)記，如125I、32P、14C、或3H；或酶如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。任何本領(lǐng)域中已知的、單獨(dú)地將多肽變異體偶聯(lián)于可檢測(cè)部分的方法都可使用，其中包括Hunter等人，自然144945(1962)；David等人，生物化學(xué)131014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40219(1981)；和Nygren，組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)雜志30407(1982)中所述的方法。(iv)人源化抗體和人抗體使非人的抗體人源化的方法是本領(lǐng)域中公知的。一般，人源化的抗體具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源并被引人其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基一般被稱為“引入的”殘基，它們通常來(lái)自“引入的”可變區(qū)。人源化過(guò)程可基本上按Winter及同行的方法(Jones等人，自然，321-522-525；Riechmann等人，自然332323-327；Verhoeyen等人，科學(xué)，2391534-1536)，通過(guò)用嚙齒動(dòng)物CDR或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)序列而進(jìn)行。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabilly，同上)，其中大體小于完整的人可變區(qū)被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所替換。實(shí)踐中，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中某些CDR殘基或可能某些FR殘基，被嚙齒動(dòng)物抗體中類似部位的殘基所替換。選擇用于制備人源化抗體的人可變區(qū)(包括重可變區(qū)和輕可變區(qū))，對(duì)于減少抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最匹配”法，嚙齒動(dòng)物抗體可變區(qū)的序列，可針對(duì)已知的人可變區(qū)序列的完整文庫(kù)進(jìn)行篩選。與嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列，被作為人源化抗體的人框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901)。另一種方法使用特定的框架，該框架來(lái)自某一具體輕鏈或重鏈亞組的、所有人抗體的共有序列。這種相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，894285；Presta等人，J.Immunol.，1512623)。此外，重要的是被人源化的抗體應(yīng)保留對(duì)抗原的高親和性和其他有利的生物特性。為了實(shí)現(xiàn)該目的，在一種優(yōu)選方法中，通過(guò)用親代序列和人源化序列的三維模型，分析親代序列和各種概念的人源化產(chǎn)物，從而制備人源化抗體。這些免疫球蛋白的空間模型是通常已有的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。已有計(jì)算機(jī)程序可闡述和顯示所選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些顯示，可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中可能起的作用，即分析會(huì)影響候選免疫球蛋白結(jié)合抗原的能力的殘基。用這種方法，可從共有區(qū)和引入序列中選擇出FR殘基，并合并FR殘基，從而實(shí)現(xiàn)所需的抗體特性，如更高的對(duì)靶抗原的親和性。一般，CDR殘基直接地而且最顯著地涉及對(duì)抗原結(jié)合產(chǎn)生影響?；蛘?，現(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，一旦免疫，它們能夠在沒(méi)有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生所有種類的人抗體。例如，已有報(bào)道，在嵌合的種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失，會(huì)導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體的產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因群(genearray)轉(zhuǎn)入這種種系突變的小鼠中，會(huì)導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人的抗體。參見(jiàn)例如Jakobovits等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，902551-255(1993)和Jakobovits等人，自然362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year.InImmuno.，733(1993)。還可從噬菌體展示文庫(kù)中產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227381；Marks等人，J.Mol.Biol.，222581)。(v)雙特異性抗體雙特異性抗體(Bispecificantibodies，BsAbs)是具有對(duì)至少2種不同抗原的結(jié)合特異性的抗體。雙特異性抗體可衍生自全長(zhǎng)的抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的。傳統(tǒng)的全長(zhǎng)雙特異性抗體的產(chǎn)生方法，是以兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)為基礎(chǔ)的，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello，自然，305537-539)。因?yàn)槊庖咔虻鞍字劓満洼p鏈的隨機(jī)組配(assortment)，所以這些雜交瘤(四瘤(quadromas))產(chǎn)生潛在的、由10種不同抗體分子構(gòu)成的混合物，而其中只有一種分子有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)正確分子進(jìn)行純化，通常是通過(guò)親和性色譜步驟完成，類似的方法公開(kāi)于WO93/08829(1993年5月13日出版)和Traunecker等人，EMBOJ.，103655-3659(1991)。根據(jù)一種不同的而更佳的方法，具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)被融合于免疫球蛋白的恒定區(qū)序列。這種融合優(yōu)選是與免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)(包括至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū))融合。優(yōu)選的是，在至少一種融合體中存在含有輕鏈結(jié)合所必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體(以及如果需要，免疫球蛋白輕鏈)的DNA，被插入不同的表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w。當(dāng)用于構(gòu)建的3種多肽鏈的比例不相等才有最佳產(chǎn)率時(shí)，這樣可極靈活地調(diào)節(jié)實(shí)際情況中3種多肽片段的相互比例。但是，當(dāng)至少2個(gè)多肽鏈為等比例時(shí)會(huì)導(dǎo)致高產(chǎn)率時(shí)，或當(dāng)比例并不特別重要時(shí)，也可以將編碼2種或全部3種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在這種方法的一個(gè)優(yōu)選例子中，雙特異性抗體由在一個(gè)臂上有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在另一臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二種結(jié)合特異性)所構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有助于從不需要的免疫球蛋白鏈混合物中分離出所需的雙特異性化合物，因?yàn)閮H在雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這提供了一種便利的分離方法。這種方法公開(kāi)于1994年3月3日出版的WO94/04690。對(duì)于產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，可參見(jiàn)例如Suresh等人，MethodsinEnzymology，212210(1986)。雙特異性抗體包括交聯(lián)的即“異共軛(heteroconjugate)”抗體。例如，異共軛體中的一個(gè)抗體可被偶聯(lián)于親和素，而另一抗體被偶聯(lián)于生物素。這樣的抗體已經(jīng)被提出，例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)向有害細(xì)胞(美國(guó)專利No.4,676,980)以及用于治療HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。異共軛抗體可用常規(guī)的交聯(lián)方法制備。在本領(lǐng)域中合適交聯(lián)劑是已知的，并與多種交聯(lián)技術(shù)一起公開(kāi)于美國(guó)專利No.4,676,980中。用抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)，在文獻(xiàn)中也有描述。例如，雙特異性抗體可用化學(xué)連接方法制備。Brennan等人，科學(xué)，22981(1985)描述了一種方法，其中完整的抗體被蛋白酶解切斷，產(chǎn)生F(ab′)2片段。這些片段在二硫酚復(fù)合劑亞砷酸鈉存在下被還原，從而穩(wěn)定鄰位的二硫酚并防止形成分子間的二硫鍵。產(chǎn)生的Fab′接著被轉(zhuǎn)變成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物中的一種然后通過(guò)用巰基乙胺還原而被再轉(zhuǎn)變成Fab′-巰基，再與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物相混合，從而形成BsAb。產(chǎn)生的BsAb可用作選擇性地固定酶的試劑。最近的進(jìn)展已便于從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段，這些片段然后可被化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了產(chǎn)生一種完全人源化的BsAbF(ab′s)2分子。每個(gè)Fab′片段都是獨(dú)立地由大腸桿菌所分泌，然后在體外進(jìn)行直接的化學(xué)偶聯(lián)以形成BsAb。這樣形成的BsAb能夠結(jié)合過(guò)度表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞，并引發(fā)人細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳房腫瘤靶目標(biāo)的裂解活性。還可參見(jiàn)Rodrigues等人，Int.J.Cancers(Suppl.)745-50(1992)。用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接制造和分離BsAb片段的各種不同技術(shù)，已有描述。例如，已經(jīng)用亮氨酸拉鏈(zipper)產(chǎn)生了雙特異性F(ab′)2異二聚體。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合，將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連于兩種不同的抗體的Fab’部分?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原以形成單體，然后再次被氧化以形成抗體異二聚體。Hollinger等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(USA)，906444-6448(1993)描述的“二體(diabody)”技術(shù)提供了另一種制造BsAb片段的方法。這些片段含有一重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，它們通過(guò)一接頭相連，該接頭過(guò)短以致不能使相同鏈上的兩個(gè)區(qū)之間發(fā)生配對(duì)。所以，一個(gè)片段上的VH和VL區(qū)被迫與另一片段上互補(bǔ)的VL和VH區(qū)配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了另一種使用單鏈Fv(sFv)二聚體而制造BsAb片段的方法。參見(jiàn)Gruber等人，J.Immunol.1525368(1994)。這些研究者設(shè)計(jì)的抗體含有第一個(gè)抗體的VH和VL區(qū)，它們通過(guò)一個(gè)25氨基酸殘基的接頭與第二個(gè)抗體的VH和VL區(qū)相連。重新折疊的分子可結(jié)合熒光素和T細(xì)胞受體，而且可重新介導(dǎo)那些表面上共價(jià)地連有熒光素的人腫瘤細(xì)胞發(fā)生裂解。5.抗體變異體的用途變異型抗體可用于感興趣抗原的診斷分析，如是否在特異性的細(xì)胞、組織或血清中產(chǎn)生。變異型抗體可按上述的相同方式進(jìn)行標(biāo)記和/或固定在不溶性的基質(zhì)上。在抗原結(jié)合分析的一個(gè)例子中，一種可與抗原結(jié)合的抗體組合物被固定于不溶性基質(zhì)上，讓測(cè)試樣品與固定的變異型抗體組合物接觸以吸附抗原，然后被固定的抗原用對(duì)該抗原特異的變異型抗體進(jìn)行接觸，用單一標(biāo)記物如各種熒光團(tuán)等進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)確定每種單一標(biāo)記物的存在與否和/或數(shù)量，可以確定抗原的數(shù)量和相對(duì)比例。本發(fā)明的變異型抗體還可用于被動(dòng)性免疫病人。變異型抗體還可用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來(lái)源中親和純化感興趣的抗原。合適的用于抗原及其變異型抗體的診斷方法，其本身都是人們眾所周知的。除了在下面實(shí)施例(其中候選變異體被測(cè)試以確定是否有合適的生物活性和更長(zhǎng)的半衰期)中所描述的生物分析方法之外，競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法和立體抑制免疫測(cè)定技術(shù)都是可使用的。競(jìng)爭(zhēng)性法和夾心法采用相分離步驟作為整體方法的一部分，而立體抑制分析是在單一反應(yīng)混合物中進(jìn)行的。一般而言，用相同的方法來(lái)分析抗原及與抗原結(jié)合的物質(zhì)，盡管根據(jù)待分析物質(zhì)的分子量可能某些方法是優(yōu)選的。因此，待測(cè)試(分析)物質(zhì)在此處被稱為“分析物”，而不論其原來(lái)的狀態(tài)是抗原或是變異型抗體；而結(jié)合于分析物的蛋白質(zhì)被命名為“結(jié)合配偶體”，而不論它們是抗體、細(xì)胞表面受體、還是抗原。對(duì)于抗原或其變異型抗體的分析方法都采用一種或多種下列試劑標(biāo)記的分析物類似物、固定的分析物類似物、標(biāo)記的結(jié)合配偶體、固定的結(jié)合配偶體和立體共軛體。標(biāo)記的試劑還被稱為“示蹤物”。對(duì)于某些分析方法，需要將試劑加以固定。固定化需要將結(jié)合配偶體從在溶液中保持游離的分析物中分離出。其完成常規(guī)地是通過(guò)在分析程序之前固定結(jié)合配偶體或分析類似物，如吸附于水不溶性基質(zhì)或表面(Bennich等人美國(guó)專利No.3,720,760)，或者通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)(如用戊二醛進(jìn)行交聯(lián))，或者在此之后通過(guò)固定配偶體或類似物(如免疫沉淀)。其他分析方法，已知的競(jìng)爭(zhēng)性法或夾心法，都是十分成熟的并被廣泛地用于商業(yè)性的診斷產(chǎn)業(yè)。競(jìng)爭(zhēng)性法依賴于，示蹤類似物與測(cè)試樣品分析物對(duì)共同的結(jié)合配偶體上有限數(shù)目結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)能力。結(jié)合配偶體通常在競(jìng)爭(zhēng)之前或之后呈未溶解形態(tài)，然后從未結(jié)合的示蹤物和分析物中分離出結(jié)合于結(jié)合配偶體的示蹤物和分析物。這種分離是通過(guò)傾析(當(dāng)結(jié)合配偶體是預(yù)先未溶解時(shí))，或通過(guò)離心(當(dāng)結(jié)合配偶體在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)之后被沉淀時(shí))。測(cè)試樣品分析物的數(shù)量，與用標(biāo)記物質(zhì)數(shù)量測(cè)得的、結(jié)合示蹤物的數(shù)量成反比。制作對(duì)于已知數(shù)量分析物的劑量-反應(yīng)曲線，然后與測(cè)試結(jié)果比較以定量地確定測(cè)試樣品中的分析物數(shù)目。當(dāng)酶被用作可檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，這類分析法被稱為ELISA法。另一種競(jìng)爭(zhēng)性分析被稱為“均相”分析，它不需要進(jìn)行相分離。在這種方法中，制備和使用酶與分析物構(gòu)成的共軛物，這樣當(dāng)抗-分析物結(jié)合于分析物時(shí)，便因抗-分析物的存在而改變了酶活力。在該例子中，抗原或其免疫活性片段通過(guò)雙官能的有機(jī)橋連物而偶聯(lián)于酶(如過(guò)氧化物酶)。對(duì)共軛物進(jìn)行選擇，以便與抗-多肽一起使用，這樣抗-多肽的結(jié)合便可抑制或增加標(biāo)記的酶活力。這種方法本身被廣泛使用，名稱是EMIT。在立體位阻法的均相分析中，使用立體共軛物。這些共軛物是通過(guò)將低分子量的半抗原共價(jià)連于小的分析物上而合成的，這樣針對(duì)半抗原的抗體基本上就不能與抗-多肽同時(shí)結(jié)合共軛物。在這種分析方法中，存在于樣品中的分析物可結(jié)合抗-多肽，從而允許抗-半抗原結(jié)合于共軛物，這樣造成共軛半抗原性質(zhì)的改變，如當(dāng)半抗原是熒光團(tuán)時(shí)造成熒光變化。夾心法特別適用于確定多肽變異體或多肽變異體的抗體。在依序夾心分析中，用固定化的結(jié)合配偶體來(lái)吸附測(cè)試樣品分析物，然后通過(guò)洗滌除去測(cè)試樣品，結(jié)合的分析物被用于吸附標(biāo)記過(guò)的結(jié)合配偶體，再將結(jié)合的物質(zhì)與其余的示蹤物分開(kāi)。結(jié)合的示蹤物的數(shù)量與測(cè)試樣品分析物的數(shù)量直接成正比。在“同步”夾心分析中，在加入標(biāo)記的結(jié)合配偶體之前，不分離測(cè)試樣品。使用單克隆抗體作為一種抗體并使用多克隆抗體作為另一種抗體的依序夾心分析，可用于測(cè)定樣品中的抗原活性。上述內(nèi)容僅僅是代表性的、分析多肽變異體和變異型抗體的診斷方法。目前及以后開(kāi)發(fā)的、用于確定這些分析物的其他方法也被包括在本范圍之內(nèi)，其中包括上述的生物分析。下面的實(shí)施例用于闡述目的而不起限制作用。在說(shuō)明書(shū)中提及的文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都明確地以引用方式參考。實(shí)施例1方法質(zhì)粒構(gòu)建在本實(shí)施例中用于構(gòu)建Fabs(以下稱為Fab)的模板質(zhì)粒pH52，如Cunningham等人，科學(xué)，2431330-1336(1989)所述，衍生自質(zhì)粒pB0475。將位于F1起點(diǎn)兩側(cè)的2個(gè)BamHI位點(diǎn)從PB0475中去除，然后用編碼抗-CD18FabH52的DNA(形式OZ)(Eigenbrot等人，蛋白質(zhì)(Proteins)，1849-62)，通過(guò)EcoRV和SphI位點(diǎn)替換編碼人生長(zhǎng)激素的DNA。這樣，pH52含有編碼抗-CD18FabH52的DNA(形式OZ)、輕鏈和重鏈的STII信號(hào)肽、堿性磷酸酶啟動(dòng)子區(qū)域和M13輔助噬菌體區(qū)域，以及氨芐青霉素抗性。用下列寡核苷酸，通過(guò)pH52的Kunkel誘變(Kunkel，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，82488-492(1985))構(gòu)建Fab變異體寡聚V1A5′GTGACCGTGCCTCACCAGAGCTTGGGCAC3′(SEQIDNO12)將Ser195-Ser196改為His195-Gln196寡聚V1B5′TGGCACCCTCCCCTAAGAACTCGAGCATGATCAGCAACACACCGGCCCTGGGC3′(SEQIDNO13)將Ser127-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thr-Ala-Ala139(SEQIDNO14)改為Ser127-Pro-Lys-Asn-Ser-Ser-Met-Ile-Ser-Asn-Thr-Pro-Ala139(SEQIDNO15)寡聚V1C5′TGGCACCCTCCAAATCGAGCATCACAGCGGCCCT3′(SEQIDNO16)將Ser127-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thr137(SEQIDNO17)改為Ser127-Lys-Ser-Ser-Ile-Thr137(SEQIDNO18)寡聚V25′TGGTGACCGTGATCTCGAGCCACTTGGGCCAGCAGACCTACATC3′(SEQIDNO19)將Val193-Pro-Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln203(SEQIDNO20)改為Val193-Ile-Ser-Ser-His-Leu-Gly-Gln-Gln203(SEQIDNO21)氨基酸殘基編號(hào)依照Kabat等人，同上，NIHPubl.No.91-3242，Vol.I，pp.647-669(1991)中所述的編號(hào)體系。Fabv1摻入了寡聚物V1A和V1C；Fabv1b摻入了寡聚物V1A和V1B；Fabv2摻入了寡聚物V2。選擇編碼Fabv1、Fabv1b和Fabv2的質(zhì)粒，并用雙脫氧核苷酸測(cè)序法(SequenaseTM方案，UnitedStatesBiochemical)檢查DNA序列。F(ab′)2構(gòu)建物的制備是通過(guò)，將編碼IgG1鉸鏈區(qū)的DNA(其后為′亮氨酸拉鏈′)插入H52重鏈恒定區(qū)的C末端。插入的氨基酸序列如下CPPCPAPELLGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER(SEQIDNO22)另一套Fab形式是以Fabv1b為基礎(chǔ)的，即具有更長(zhǎng)半衰期的變異體，使用的是下列寡核苷酸寡聚V1D5′TCGAGCATGATCTCTAGAACACCGGCCC3′(SEQIDNO23)將Asn136改為Arg136寡聚V1E5′GCCTCACCAGAACCTAGGCACCAAGACCTACATCTG3′(SEQIDNO24)將Ser197改為Asn197以及將Gln203改為L(zhǎng)ys203寡聚V1F5′GCCTCACCAGAACTTAAGCGACGGAAAGACCTACATCTGC3′(SEQIDNO25)將Gln196-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln-Thr204(SEQIDNO26)改為Gln196-Asn-Leu-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr204(SEQIDNO27)寡聚V1F5′GCCTCACCAGAATATTACAGATGGCAAGACCTACATCTGC3′(SEQIDNO28)將Gln196-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln-Thr204(SEQIDNO29)改為Gln196-Asn-Ile-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr204(SEQIDNO30)Fabv3摻入了寡聚物V1D；Fabv14摻入了寡聚物V1E；Fabv5摻入了寡聚物V1F；以及Fabv6摻入了構(gòu)建物V1G。表達(dá)編碼變異體的DNA對(duì)于每種變異體，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。然后將轉(zhuǎn)化子置于含5微克/毫升羧芐青霉素的LuriaBroth(LB)平板上，在37℃溫育過(guò)夜。將單菌落接種于5毫升[LB+5微克/毫升羧芐青霉素]中，在37℃生長(zhǎng)6-7小時(shí)。然后將5毫升培養(yǎng)物加至位于2升帶擋板的燒瓶中500毫升AP5極限培養(yǎng)基中，并在37℃生長(zhǎng)16小時(shí)。AP5極限培養(yǎng)基的制備如下每1升加入1.5克葡萄糖(SigmaTMG-7021)、2.2克工業(yè)制造的酪蛋白氨基酸(DifcoTM0231-01-0)、0.3克鑒定的酵母提取物(DifcoTM0127-01-7)、0.19克無(wú)水硫酸鎂或0.394克MgSO4·7H2O(SigmaTMM2773)、1.07克氯化銨(SigmaTMA9434)、0.075克氯化鉀(SigmaTMP5405)、4.09克氯化鈉(SigmaTMS3014)、120.0毫升1M三乙醇胺pH7.4，適量至1.0升Super-QTM水，以及1M三乙醇胺pH7.4(由133.21毫升三乙醇胺、Liquid(SiamaTMT1377)和950毫升Super-QTM水構(gòu)成，用HCl(MallinkrodtTM2612)調(diào)至pH7.4，適量至1.0升Super-QTM水)。通過(guò)0.1微米的SealkleenTM過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，然后儲(chǔ)存于2-8℃。保質(zhì)期為6個(gè)月。細(xì)胞在1L離心瓶中于3000rpm下離心30分鐘，棄去上清液，將沉淀細(xì)胞冰凍1小時(shí)。將沉淀物重新懸浮于10毫升冷TE緩沖液(10mMTRIS、1mMEDTA，pH7.6)中，并加入100微升苯甲脒(Sigma)。重新懸浮的沉淀物在冰上攪拌1小時(shí)，在18,000rpm上離心15分鐘，傾倒出上清液并保持在冰上。然后，讓上清液通過(guò)蛋白質(zhì)G-SepharoseTMFastFlow(Pharmacia)柱(該柱預(yù)先讓10毫升TE通過(guò)柱而加以平衡)。再用10毫升TE緩沖液洗滌柱，然后用2.5毫升100mM乙酸將Fab洗脫在含0.5毫升TRIS(pH8.0)的管子中。在Centricon-30TM(Amicon)離心器上將洗脫物濃縮至0.5毫升，將2毫升磷酸鹽緩沖液加至濃縮的洗脫物中，再將形成的混合物濃縮至0.5毫升。進(jìn)行SDS-PAGE以確定已產(chǎn)生了蛋白質(zhì)。在抗-CD11/CD18Fab變異體和F(ab′)2抗體片段的純化程序中所用的分析方法用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和兩種不同的高效液相色譜(HPLC)，來(lái)分析純化方法中每個(gè)步驟中獲得的產(chǎn)物。使用的HPLC包括反相色譜和陽(yáng)離子交換色譜(在WATERSTMHPLC系統(tǒng)中進(jìn)行)。反相色譜是在維持于50℃的反相PLRP-STM4.6×50mm柱、8毫米顆粒大小(PolymerLaboratories，Shropshire，UK)上進(jìn)行。用逐漸增加的線性梯度(從31％B至41％B)來(lái)洗脫蛋白質(zhì)。緩沖液A含有0.1％在去離子水中三氟乙酸，而緩沖液B含有0.1％在HPLC級(jí)乙腈中的三氟乙酸。流速維持在2毫升/分鐘，在214納米處監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)曲線。陽(yáng)離子交換色譜分析是在維持于50℃的、Bakerbond羧基-嗍(sulfon)(CSX)TM50×4.6mm柱(J.T.BakerPhillipsburg，NJ)上進(jìn)行。用用逐漸增加的線性梯度(從pH6.0至pH8.0)，在2毫升/分鐘下洗脫蛋白質(zhì)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280納米。緩沖液A含有16mMHEPES/PIPES/MES中的每一種，pH6.0；而緩沖液B含有16mMHEPES/PIPES/MES中的每一種，pH8.0。對(duì)于分離不同的Fab變異體，采用從25％B至56％B的線性梯度，時(shí)間22分鐘。對(duì)于分離拉鏈-F(ab′)2和F(ab′)抗體片段，線性梯度為40％B至100％B，時(shí)間22分鐘。SDS-PAGE分析在預(yù)制的NovexTM凝膠(Novex，SanDiego，CA.)上進(jìn)行。蛋白質(zhì)用Morrissey銀染法進(jìn)行染色。Morrissey，Anal.Biochem.，117307-310(1981)。純化抗-CD11/CD18抗體片段和Fab變異體抗-CD11/CD18抗體片段以及不同的Fab變異體，用相同的抽提和純化法進(jìn)行分離。抽提冰凍的細(xì)胞沉淀物(100克)，在室溫下重懸浮于120mMMES緩沖液(pH6.0，含5mMEDTA)(5毫升緩沖液/克細(xì)胞沉淀物)，通過(guò)微流化器(Microfluidizer)(MicrofluidicsCorporation，Newton，MA)3次而被完全破碎。勻漿被調(diào)節(jié)至含0.25％(v/v)聚乙烯亞胺(PEI)，然后通過(guò)離心(7280×g，30分鐘，4℃)除去固體碎片。ABX色譜含有抗體片段的上清液用純水稀釋至導(dǎo)電率為2.5毫西門(mén)子(millisiemen)，在0.22微米過(guò)濾器上過(guò)濾(Suporcap-50TM，GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)，然后上樣于在50mMMES/5mMEDTA二鈉pH6.0(緩沖液A)中平衡過(guò)的1.6×9.5厘米BakerbondABX柱(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。流出液在280納米處進(jìn)行UV監(jiān)測(cè)。在上樣后，用緩沖液A洗滌柱，直到UV軌跡返回至基線。用20倍柱體積的梯度(在緩沖液中的從0-100mM硫酸銨)洗脫抗體片段。洗脫組分按上面分析方法章節(jié)中所述，在陽(yáng)離子交換柱上進(jìn)行分析，并相應(yīng)合并。SPSepharose高效(SPHP)色譜為了注射，ABX的合并物用水稀釋至導(dǎo)電率小于4mS，然后上樣于用50mMMOPS緩沖液pH6.9平衡過(guò)的1.6×9.2厘米SPHP柱(PharmaciaBiotechInc.，Piscataway，NJ)。通過(guò)用20倍柱體積的線性梯度(在25mMMOPS緩沖液中的從0-200mM乙酸鈉)實(shí)現(xiàn)分離。洗脫組分按上面分析方法章節(jié)中所述，通過(guò)CSXHPLC和SDS-PAGE進(jìn)行分析，并相應(yīng)合并。配制含有抗體片段的SPHP的合并物，用Amicon攪拌器和YM10濾膜(Amicon，Inc.Beverly，MA)濃縮至5毫克/毫升。純化的濃縮抗體樣品，通過(guò)在SephadexTMG25(PharmaciaBiotechInc.，Piscataway，NJ)柱的凝膠滲透色譜，將緩沖液更換成磷酸鹽緩沖液(PBS)。內(nèi)毒素測(cè)定用Limulus變形細(xì)胞裂解測(cè)試法(AssociatesofCapeCodInc.，WoodsHole，MA)進(jìn)行內(nèi)毒素測(cè)定。將含有小于2內(nèi)毒素單位(Eu)/毫克蛋白質(zhì)的樣品用于藥物動(dòng)力學(xué)研究。純化抗-CD11/CD18F(ab′)2抗體片段作為亮氨酸拉鏈F(ab′)2變異體[拉鏈-F(ab′)2]，F(xiàn)(ab′)2片段最初通過(guò)ABX色譜進(jìn)行純化。該構(gòu)建物的構(gòu)建，是通過(guò)在H52重鏈的鉸鏈區(qū)后增加亮氨酸拉鏈區(qū)。在純化之后，通過(guò)胃蛋白酶切除亮氨酸拉鏈，然后用下述的SPHP和PhenylToyopearlTM色譜純化F(ab′)2。拉鏈-F(ab′)2抗體片段的抽提和ABX色譜拉鏈-F(ab′)2抗體片段的抽提和ABX色譜，與上述Fab抗體片段變異體一樣進(jìn)行。拉鏈-F(ab′)2抗體片段的胃蛋白酶消化用胃蛋白酶處理ABX純化的拉鏈-F(ab′)2以去除分子的亮氨酸拉鏈部分，產(chǎn)生F(ab′)抗體片段。在Amicon攪拌器上濃縮由ABX純化的樣品至5mg/ml，然后用pH3.5的100mM檸檬酸鈉以1∶3.5稀釋。在該溶液中加入溶解在pH3.5100mM檸檬酸鈉中的胃蛋白酶，胃蛋白酶與蛋白質(zhì)之比為1∶1.2。室溫4小時(shí)后，用10％NaoH將混合物的pH調(diào)高至pH6.4。對(duì)用胃蛋白酶處理過(guò)的拉鏈-F(ab′)2抗體片段進(jìn)行SPHP色譜從亮氨酸拉鏈區(qū)和不需要的抗體片段中純化出F(ab′)2抗體片段，是通過(guò)上述用于Fab抗體片段變異體的SPHP色譜完成的。對(duì)SPHP-純化過(guò)的F(ab′)2抗體片段進(jìn)行PhenylToyopearlTM色譜通過(guò)添加固體硫酸銨，調(diào)節(jié)SPHP-純化過(guò)的F(ab′)2合并物使硫酸銨濃度為1.5M。調(diào)節(jié)后的合并物再上樣于用緩沖液A(1.5M硫酸銨，50mM乙酸鈉，pH5.4)平衡過(guò)的PhenylToyopearlTM650(Tosohaas，Montgomeryville，PA)1.6×10厘米柱上。采用的是20倍柱體積的梯度，即在50mM乙酸鈉pH5.4(緩沖液B)中的從70％緩沖液A至100％0.15M硫酸銨。洗脫組分按上面分析方法章節(jié)中所述，通過(guò)反相色譜和CSXHPLC和SDS-PAGE進(jìn)行分析。配制F(ab′)2抗體片段和內(nèi)毒素測(cè)定純化的F(ab′)2抗體片段的配制，如上述的Fab抗體片段變異體一樣進(jìn)行。在內(nèi)毒素測(cè)定后，含有小于2Eu/毫克蛋白質(zhì)的樣品用于下述的藥物動(dòng)力學(xué)研究。在靜脈內(nèi)給藥后，抗-CD11/18構(gòu)建物在小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)研究這個(gè)5種人源化huH52抗-CD18抗體片段(構(gòu)建物)在小鼠中的單劑量藥物動(dòng)力學(xué)研究的目的，是為了確定通過(guò)恒定區(qū)氨基酸的改變，是否會(huì)影響抗體片段的非特異性清除。在24小時(shí)內(nèi)從雄性CD1小鼠中收集血清樣品，用ELISA法測(cè)定人抗-CD18的血清濃度。被研究的抗-CD18抗體片段，來(lái)自上述的由大腸桿菌產(chǎn)生的重組人源化單克隆Fab抗體片段。研究了Fab片段和2個(gè)Fab′亞基被2個(gè)二硫鍵連接在一起的構(gòu)建物。最后，通過(guò)改變恒定區(qū)的氨基酸，構(gòu)建原始Fab的3種新的形式。對(duì)于這些構(gòu)建物的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)下面的研究設(shè)計(jì)表。構(gòu)建物的抗原結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)白細(xì)胞表面上CD11/CD18糖蛋白復(fù)合體的CD18亞基。這些抗體片段是黑猩猩和人特異性的；因此，在小鼠中的血清藥物動(dòng)力學(xué)信息，提供了這些片段的非特異性清除情況。因?yàn)轭A(yù)計(jì)在該研究中是線性藥物動(dòng)力學(xué)，所以選擇的2毫克/千克的單劑量水平，而不是多劑量水平。研究設(shè)計(jì)表aa每個(gè)組別由20只雄性小鼠構(gòu)成；每只小鼠接受2毫克/千克劑量。在雄性CrlCD-1(ICR)BRVAF/Plus小鼠(約20-30克)中，研究5種抗體構(gòu)建物的藥物動(dòng)力學(xué)。5個(gè)組別，每個(gè)組別由20只小鼠構(gòu)成，通過(guò)尾靜脈而接受2毫克/千克的靜脈內(nèi)丸藥(bolus)劑量。在給藥后5和30分鐘，1、2、4、8、12、16、20和24小時(shí)，采集血液樣品。收獲血清，如下用MAC-1捕獲ELISA法測(cè)定抗體片段的濃度96孔的微量滴定板用鼠抗-CD18單克隆抗體包被過(guò)夜。在4℃溫育過(guò)夜之后，用ELISA洗滌緩沖液洗滌滴定板3次，用ELISA稀釋液封閉1小時(shí)。ELISA洗滌緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)/0.05％聚山梨醇酯TM20。該緩沖液的制備是，對(duì)于每1升，將50毫升20×PBS/1.0％聚山梨醇酯TM20(通過(guò)將160克氯化鈉、4.0克氯化鉀、22.6克磷酸氫二鈉和4.0克磷酸二氫鉀溶解在玻璃蒸餾的水或去離子水中，再加入10.0毫升聚山梨醇酯TM20[SigmaTMP-1379或等價(jià)物]，適量至1000毫升，用0.22微米或更小的過(guò)濾器進(jìn)行滅菌過(guò)濾而獲得的混合物)，和適量至1.0升的蒸餾水或去離子水混合。然后儲(chǔ)存在室溫下。保質(zhì)期是從制備之日起2周。ELISA稀釋液是PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨醇酯TM20/0.01％ThimerosalTM/1mM氯化鈣/1mM氯化鎂。該稀釋液的制備是，對(duì)于每1升，將5.0克牛血清白蛋白(ArmourTMN0068或等價(jià)物)、50毫升20×PBS/1.0％聚山梨醇酯TM20/0.2％ThimerosalTM(通過(guò)將160克氯化鈉、4.0克氯化鉀、22.6克磷酸氫二鈉和4.0克磷酸二氫鉀溶解在玻璃蒸餾的水或去離子水中，再加入10.0毫升聚山梨醇酯TM20[SigmaTMP-1379或等價(jià)物]和2.0克ThimerosalTM[SigmaT-5125或等價(jià)物]，適量至1000毫升而獲得的混合物)、0.1％(v/v)氯化鈣(GenentechTMA3165)、0.01％(v/v)氯化鎂(GenentechTMA3167)，和適量至1.0升的蒸餾水或去離子水混合。然后儲(chǔ)存在2-8℃。保質(zhì)期是從制備之日起1個(gè)月。在封閉之后，再用ELISA洗滌緩沖液洗滌滴定板3次。接著可溶性MAC1(如Berman等人，J.Cell.Biochem.，52183-195所述)，被從濃介質(zhì)中捕獲出來(lái)，用表達(dá)截短的CD11b/CD18異二聚體的CHO細(xì)胞加以調(diào)理(conditioned)。在2小時(shí)溫育期之后，用ELISA洗滌緩沖液洗滌滴定板6次，然后加入100微升待測(cè)試的鼠血清樣品或含有同源的重組人抗-CD18Fab的標(biāo)準(zhǔn)物。鼠血清樣品先在ELISA稀釋液中進(jìn)行1/10稀釋，然后再1/4稀釋成為樣品稀釋液；從這種最初的1/40稀釋液中取出100微升。樣品稀釋液是在ELISA稀釋液中的10％瑞士Webster鼠血清。在第二個(gè)2小時(shí)溫育期之后，再用ELISA洗滌緩沖液洗滌滴定板6次，然后加入100微升針對(duì)人Fab的辣根過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)的F(ab′)2。在室溫下溫育1小時(shí)后，如上用ELISA洗滌緩沖液洗滌滴定板，然后向每個(gè)孔加入100微升含2.2mmol/L鄰苯二胺(OPD)和0.012％(v/v)過(guò)氧化氫(H2O2)的磷酸鹽緩沖液，pH7.2。當(dāng)顏色完全顯現(xiàn)時(shí)，用每孔100微升4.5mol/L硫酸來(lái)終止反應(yīng)。孔內(nèi)含物的吸光度用SLTLabinstruments的自動(dòng)滴定板讀數(shù)儀在492納米處測(cè)量，并減去405納米處的背景吸光度。根據(jù)非線性參數(shù)的最小二乘算法，通過(guò)4參數(shù)曲線擬合程序來(lái)歸納數(shù)據(jù)。血清濃度vs時(shí)間數(shù)據(jù)，用非線性曲線擬合程序加以分析，隨后評(píng)估藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。D′Argenio和Schumitzky，ADAPTIIUser′sGuide，BiomedicalSimulationsResource，UniversityofSouthernCalifornia，LosAngeles，Release2，1990。用雙區(qū)室模型(two-compartmentmodel)來(lái)表征5個(gè)組別的血清濃度對(duì)時(shí)間的數(shù)據(jù)。對(duì)于一級(jí)模型參數(shù)和計(jì)算出的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，參見(jiàn)表2。雙區(qū)室模型擬合曲線疊加在數(shù)據(jù)上，并顯示于圖1A和1B。數(shù)據(jù)清單列于表3。對(duì)于所有組別，中心區(qū)室的體積接近血漿體積。表2在將2毫克/千克構(gòu)建物給小鼠服用后確定出的、一級(jí)和二級(jí)藥物動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)值</tables>a用公式V＝劑量/∑Ai計(jì)算出的中心區(qū)室體積。bKe是與材料從中心區(qū)室被消除有關(guān)的速率常數(shù)。cKcp是與材料從中心區(qū)室轉(zhuǎn)移至外周區(qū)室有關(guān)的速率常數(shù)。dKpc是與材料從外周區(qū)室轉(zhuǎn)移至中心區(qū)室有關(guān)的速率常數(shù)。e重量歸一化后的血清清除率。ft1/2α和t1/2β是與每個(gè)指數(shù)階段有關(guān)的初期和后期半衰期。g最大觀察濃度的時(shí)間。h最大觀察濃度。l根據(jù)配置函數(shù)∑Ai估算出的0時(shí)間的濃度。j在血清濃度對(duì)時(shí)間曲線下的劑量歸一化面積。k持續(xù)時(shí)間。表3數(shù)據(jù)清單對(duì)于2毫克/千克人抗CD18構(gòu)建物的濃度對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)a濃度(微克/毫升)a濃度數(shù)據(jù)為一個(gè)樣品/小鼠bLTS＝低于測(cè)試靈敏度(組別1和3-5為0.13微克/毫升；組別2為0.06微克/毫升)結(jié)果結(jié)果示于圖1A和1B，其中圖1A顯示了全部5種構(gòu)建物在0-5小時(shí)內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)情況，而圖1B顯示了全部5種構(gòu)建物在0-25小時(shí)內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)情況。最初的(或α-相)半衰期與最終的(β-相)半衰期一樣發(fā)生改變。Fabv1B變異體的清除率為80毫升/小時(shí)/千克，這比雙二硫化合物(Fab′)2高約3倍。Fabv1、Fab和Fabv2的清除率比Fabv1B高約3倍，比雙二硫化合物(Fab′)2高約6倍，分別為173、189和190毫升/小時(shí)/千克。原始Fab的有效分子量為49kD，其清除率為189毫升/小時(shí)/千克。Fab形式1、1B和2都具有與原始Fab相類似的分子量，但形式1B從血清中被清除的速度慢2倍。因此，改變Fab恒定區(qū)的氨基酸序列可影響清除。在β-相半衰期中所見(jiàn)的效果表明，即使是2個(gè)最不成功的變異體1和2，也有可檢測(cè)的效應(yīng)，盡管該效應(yīng)不足以在所有持續(xù)時(shí)間內(nèi)都顯著增加。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Genentech，Inc.(ii)發(fā)明名稱具有更長(zhǎng)半衰期的變異多肽(iii)序列數(shù)目31(iv)通信地址(A)收信人Genentech，Inc.(B)街道460PointSanBrunoBlvd(C)城市SouthSanFrancisco(D)州California(E)國(guó)家USA(F)郵編94080(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型3.5inch，1.44Mb軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WinPatin(Genentech)(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Lee，WendyM.(B)登記號(hào)00,000(C)參考/案卷號(hào)P0932PCT(ix)通訊信息(A)電話415/225-1994(B)傳真415/952-9881(C)電傳910/371-7168(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO1HisGlnAsnLeuSerAspGlyLys158(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO2HisGlnAsnIleSerAspGlyLys158(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO3ProLysAsnSerSerMetIleSerAsnThrPro151011(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO4AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSer151015LysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO5AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerAsn657075PheGlyThrGlnThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysThrVal9598(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO6AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrGlnThrTyrThrCysAsnValAsnHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO7AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO8ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAsp151015GluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsn202530AsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsn354045AlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAsp505560SerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSer657075LysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThr808590HisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGly95100105GluCys107(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度105氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO9GlnProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSer151015GluGluLeuGlnAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeuIleSer202530AspPheTyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspSer354045SerProValLysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGln505560SerAsnAsnLysTyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrPro657075GluGlnTrpLysSerHisArgSerTyrSerCysGlnValThrHis808590GluGlySerThrValGluLysThrValAlaProThrGluCysSer95100105(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度100氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO10AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerPro151015LysAsnSerSerMetIleSerAsnThrProAlaLeuGlyCysLeu202530ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSer354045GlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGln505560SerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProHis657075GlnSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAshValAsnHisLys808590ProSerAsnThrLysValAspLysArgVal95100(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO11HisGlnSerLeuGlyThrGln157(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO12GTGACCGTGCCTCACCAGAGCTTGGGCAC29(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO13TGGCACCCTCCCCTAAGAACTCGAGCATGATCAGCAACACACCGGCCCTG50GGC53(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO14SerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla151011(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO15SerProLysAsnSerSerMetIleSerAsnThrProAla151013(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO16TGGCACCCTCCAAATCGAGCATCACAGCGGCCCT34(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO17SerSerLysSerThrSerGlyGlyThr159(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO18SerLysSerSerIleThr156(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度44堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO19TGGTGACCGTGATCTCGAGCCACTTGGGCCAGCAGACCTACATC44(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO20ValProSerSerSerLeuGlyThrGln159(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO21ValIleSerSerHisLeuGlyGlnGln159(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45.氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO22CysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyArgMetLys151015GlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHis202530LeuGluAsnGluValAlaArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg354045(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO23TCGAGCATGATCTCTAGAACACCGGCCC28(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO24GCCTCACCAGAACCTAGGCACCAAGACCTACATCTG36(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO25GCCTCACCAGAACTTAAGCGACGGAAAGACCTACATCTGC40(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO26GlnSerLeuGlyThrGlnThr157(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO27GlnAsnLeuSerAspGlyLysThr158(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO28GCCTCACCAGAATATTACAGATGGCAAGACCTACATCTGC40(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO29GlnSerLeuGlyThrGlnThr157(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO30GlnAsnIleSerAspGlyLysThr158(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO31ValIleSerSerHisLeuGlyGln158權(quán)利要求1.一種感興趣多肽的變異體，該感興趣多肽是在腎臟中被清除的而且不含IgG的Fc區(qū)，其特征在于，該變異體含有IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，而且該變異體具有比感興趣多肽更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。2.如權(quán)利要求1所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽含有Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣的結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域不是CH2結(jié)構(gòu)域。3.如權(quán)利要求2所述的變異體，其特征在于，該表位被包含在Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣的結(jié)合域中。4.如權(quán)利要求3所述的變異體，其特征在于，Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣的結(jié)合域是CH1區(qū)。5.如權(quán)利要求3所述的變異體，其特征在于，該表位取自Fc區(qū)的一個(gè)或二個(gè)環(huán)，并被轉(zhuǎn)至Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣的結(jié)合域。6.如權(quán)利要求5所述的變異體，其特征在于，該表位取自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域，并被轉(zhuǎn)至Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)合域的CH1、CH3或VH區(qū)域，或一個(gè)以上這樣的區(qū)域。7.如權(quán)利要求5所述的變異體，其特征在于，該表位取自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域，并被轉(zhuǎn)至Ig結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)合域的CL區(qū)域或VL區(qū)域，或同時(shí)這2個(gè)區(qū)域。8.如權(quán)利要求3所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽是Fab、(Fab′)2、二體、Fv片段、單鏈Fv片段、或受體。9.如權(quán)利要求8所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽是LFA-1拮抗劑。10.如權(quán)利要求9所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽是抗LFA-1抗體的Fab或(Fab′)2。11.如權(quán)利要求10所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽是抗-CD18Fab或抗-CD18(Fab′)2。12.如權(quán)利要求11所述的變異體，其特征在于，它是人的或人源化的。13.如權(quán)利要求12所述的變異體，其特征在于，該表位含有序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。14.如權(quán)利要求13所述的變異體，其特征在于，還含有HQSLGTQ(SEQIDNO11)。15.如權(quán)利要求13所述的變異體，其特征在于，還含有HQNLSDGK(SEQIDNO1)。16.如權(quán)利要求13所述的變異體，其特征在于，還含有HQNISDGK(SEQIDNO2)。17.如權(quán)利要求13所述的變異體，其特征在于，還含有VISSHLGQ(SEQIDNO31)。18.如權(quán)利要求1所述的變異體，其特征在于，該表位含有序列HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、HQSLGTQ(SEQIDNO11)或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，以及PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。19.如權(quán)利要求18所述的變異體，其特征在于，該表位被融合于感興趣多肽。20.如權(quán)利要求19所述的變異體，其特征在于，感興趣多肽是生長(zhǎng)激素或神經(jīng)生長(zhǎng)因子。21.編碼權(quán)利要求1所述變異體的核酸。22.含有權(quán)利要求21所述核酸的可復(fù)制載體。23.含有權(quán)利要求21所述核酸的宿主細(xì)胞。24.一種產(chǎn)生多肽變異體的方法，其特征在于，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收變異體。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，變異體是從培養(yǎng)基中回收的。26.一種多肽變異體，它不是Fc，其特征在于，它含有序列HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，以及PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。27.一種制備多肽變異體的方法，其特征在于，它包括改變?cè)谀I臟中被清除的而且不含IgGFc區(qū)的感興趣多肽，從而使其含有IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，并且具有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，改變步驟是通過(guò)定點(diǎn)誘變、盒式誘變或PCR誘變進(jìn)行的。29.一種制備具有更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的多肽變異體的方法，其特征在于，它包括(1)鑒別出IgG分子Fc區(qū)上的補(bǔ)救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)象；(2)改變從腎臟被清除的而且不含IgGFc區(qū)的感興趣多肽，使其含有所鑒別的結(jié)合表位的序列和構(gòu)象；(3)測(cè)試步驟(2)中改變的多肽是否有比感興趣多肽更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期；和(4)如果該多肽沒(méi)有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，進(jìn)一步改變感興趣多肽的序列以包含所鑒別的結(jié)合表位的序列和構(gòu)象，并測(cè)試是否有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，直到獲得更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。30.一種治療LFA-1介導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于，給需要這種治療的哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求9所述的變異體。31.一種治療LFA-1介導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于，給需要這種治療的病人有效量的權(quán)利要求12所述的變異體。全文摘要改變?cè)谀I臟中被清除而且在原始形式下不含IgGFc區(qū)的多肽,使其含有IgGFc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位,從而使其具有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。文檔編號(hào)C07K14/48GK1186517SQ9619434公開(kāi)日1998年7月1日申請(qǐng)日期1996年3月28日優(yōu)先權(quán)日1995年4月14日發(fā)明者L·G·普雷斯塔,B·R·斯內(nèi)德克申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司