專利名稱：新的多拉抑放素衍生物及其制備方法和用途的制作方法
已知象多拉抑放素(Dolastatin)-10(US 4,816,444)和多拉抑放素-15(EP-A-398558)之類的從海洋源分離的肽顯示出有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性(參見(jiàn)生物化學(xué)藥理學(xué)40，8，1859-64，1990；J.Natl.CancerInst.85，483-88，1993以及其中引用的參考文獻(xiàn))?；隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤系統(tǒng)中令人感興趣的結(jié)果，目前正在進(jìn)行這些天然產(chǎn)物的進(jìn)一步臨床前評(píng)價(jià)，以便在癌癥患者中開(kāi)始臨床研究。
然而，天然產(chǎn)物具有缺點(diǎn)，例如在含水溶劑中溶解性差以及合成需要昂貴的原材料。
本文描述的本發(fā)明提供了新肽及其衍生物，這些新肽及其衍生物與多拉抑放素-15相比具有提高的治療贅生性疾病的潛力。而且，本發(fā)明的化合物可以如下面的詳細(xì)描述方便地合成。
本發(fā)明的化合物包括式I的新肽以及它們與生理上可耐受的酸的鹽R1R2N-CHX-CO-A-B-D-E-(F)t-KI其中R1是甲基、乙基或異丙基；R2是氫、甲基或乙基；R1-N-R2一起可以是吡咯烷環(huán)；A是纈氨酰、異亮氨酰、亮氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、2-乙基甘氨酰、正亮氨酰或正纈氨酰殘基；B是N-甲基-纈氨酰、-亮氨酰、-異亮氨酰、-正纈氨酰、-正亮氨酰、-2-叔-丁基甘氨酰、-3-叔-丁基丙氨?；?2-乙基甘氨酰殘基；D是3，4-脫氫脯氨酰、4-氟脯氨酰、4，4-二氟脯氨酰、氮雜環(huán)丁烷-2-碳酰、3-甲基脯氨酰、4-甲基脯氨?；?-甲基脯氨酰殘基；E是脯氨酰、高脯氨酰、羥脯氨?；蜞邕蛲?4-碳酰殘基；F是纈氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、異亮氨酰、亮氨酰、2-環(huán)己基甘氨酰、
正亮氨酰、正纈氨酰、新戊基甘氨酰、丙氨酰、β-丙氨?；虬被惗□埢?；X是烷基(優(yōu)選地是C2-5)、環(huán)丙基或環(huán)戊基；t是0或1；并且K是烷氧基(優(yōu)選地是C1-4)、芐氧基或取代的或非取代的氨基部分。
本發(fā)明也提供了制備式I的化合物的方法、包含這樣的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物、使用該藥物組合物治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法。
具體地說(shuō)，K可以是C1-4-烷氧基、芐氧基、-NH2，-NH-C1-12-烷基、-NH-C(CH3)2CN、-NH-C(CH3)2CCH、-NH-C(CH3)2C＝CH2、-NH-C(CH3)2CH2CH2OH、-NH-C(CH3)2CH2OH、-NH-C3-8-環(huán)烷基、-NH-[3，3，0]-二環(huán)辛基、降麻黃堿基(norephedryl)、降假麻黃堿基(norpseudoephedryl)、-NH-喹啉基、-NH-吡嗪基(pyrazyl)、-NH-CH2-苯并咪唑基、-NH-金剛烷基(adamantyl)、-NH-CH2-金剛烷基、-NH-CH(CH3)-苯基、-NH-C(CH3)2-苯基、-N(C1-4-烷氧基)-C1-4-烷基、-N(C1-4-烷氧基)-CH2-苯基、-N(C1-4-烷氧基)-苯基、-N(CH3)OBzl、-NH-(CH2)v-苯基(v＝0，1，2或3)、-NH-(CH2)m-萘基(m＝0或1)、-NH-(CH2)w-二苯甲基(w＝0，1或2)、-NH-聯(lián)苯基、-NH-吡啶基、-NH-CH2-吡啶基、-NH-CH2-CH2-吡啶基、-NH-苯并噻唑基、-NH-苯并異噻唑基、-NH-苯并吡唑基、-NH-苯并噁唑基、-NH-(CH2)m-芴基(m＝0或1)、-NH-嘧啶基、-NH-(CH2)m-2，3-二氫化茚基(m＝0或1)、-NH-(CH2CH2O)y-CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、-NH-(CH2CH2O)y-CH2CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、-(CH2CH2O)y-CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、-(CH2CH2O)y-CH2CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、-NCH3-NH-C6H5、-NCH3-NH-CH2C6H5；或K是
優(yōu)選的是這樣的式I的化合物，其中的取代基R1、R2、A、B、D、E、X、F和t具有下列含義R1是甲基或乙基；R2是氫、甲基或乙基；A是纈氨酰、異亮氨酰、2-叔-丁基甘氨酰殘基；B是N-甲基纈氨酰、-異亮氨?；?2-叔-丁基甘氨酰殘基；D是3，4-脫氫脯氨酰、4-氟脯氨酰、氮雜環(huán)丁烷-2-碳酰、3-甲基脯氨酰或5-甲基脯氨酰殘基；E是脯氨酰、高脯氨酰、羥脯氨?；蜞邕蛲?4-碳酰殘基；F是D-纈氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、D-異亮氨酰、D-亮氨酰、或氨基異丁酰殘基；X是-CH(CH3)2、-C(CH3)3或-CH(CH3)CH2CH3；t是0或1；K優(yōu)選地是-OC(CH3)3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、-NH(CH2)5CH3、-NH(CH2)6CH3、-NH(CH2)7CH3，K優(yōu)選地是-OC(CH3)3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、-NH(CH2)5CH3、-NH(CH2)6CH3、-NH(CH2)7CH3、-NHCH(CH3)2、-NHCH(CH3)CH2CH3、-NHCH(CH3)CH2CH2CH3、-NHCH(CH2CH3)2、-NH(CH2CH2CH3)2、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH2CH3)CH2CH2CH3、-NHCH(CH3)CH(CH3)2、-NHCH(CH2CH3)CH(CH3)2、-NHCH(CH3)C(CH3)3、-NH-環(huán)丙基、-NH-環(huán)丁基、-NH-環(huán)戊基、-NH-環(huán)己基、-NH-環(huán)庚基、-NH-環(huán)辛基、-NH-二環(huán)[3，3，0]辛基、-N(CH3)OCH3、-N(CH3)OCH2CH3、-N(CH3)OCH2CH2CH3、-N(CH3)OCH(CH3)2、-N(CH2CH3)OCH3、-N(CH2CH3)OCH2CH3、-N(CH(CH3)2)OCH3、-N(CH3)OCH2C6H5、-N(OCH3)CH2-C6H5、-N(CH3)OC6H5、-NH-CH2-C6H5、-NH(CH2)2C6H5、-NH(CH2)3C6H5、-NHCH(CH3)C6H5、-NHC(CH3)2C6H5、-NHC(CH3)2CH2CH3、-NHC(CH3)(CH2CH3)2、-NHCH(CH3)CH(OH)C6H5、-NHCH2-環(huán)己基、-NH-CH2CF3、-NHCH(CH2F)2、-NHC(CH3)2CH2CH2OH、-NH(CH2CH2O)2CH2CH3、-NHC(CH3)2CH(CH3)2、-NHC(CH3)2CN、-NHC(CH3)2CCH、降麻黃堿基、降假麻黃堿基、-NH-喹啉基、-NH-吡嗪基、-NH-金剛烷基(2)、-NH-金剛烷基(1)、-NH-CH2-金剛烷基、-NH-CH2-萘基、-NH-二苯甲基、-NH-聯(lián)苯基、-NH-吡啶基、-NH-CH2-吡啶基、-NH-CH2-CH2-吡啶基、-NH-苯并噻唑基、-NH-苯并異噻唑基、-NH-苯并吡唑基、-NH-苯并噁唑基、-NH-芴基、-NH-嘧啶基、-NH-CH2-(4-甲基)-噻唑基(2)、-NH-CH2-呋喃基(2)、-NH-CH2-噻吩基(2)、-NH-CH2-(5-甲基)-噻吩基(2)、-NH-噻唑基(2)、-NH-異噁唑基(3)、-NH-(3-甲基)異噁唑基(5)、-NH-(3-甲基)異噻唑基(5)、-NH-(2-三氟甲基)-噻二唑基(5)、-NH-(2-環(huán)丙基)噻二唑基(5)、-NHC(CH3)2C＝CH2，或K可以是
這些例子說(shuō)明但不限制本發(fā)明的范圍。
式I的肽是由L-氨基酸組成的，但F也可以是D-氨基酸。
所述新化合物可以以與生理上可耐受的酸的鹽存在，所述酸如鹽酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、磷酸、甲磺酸、醋酸、甲酸、馬來(lái)酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、丙二酸、硫酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、丙酮酸、粘酸、苯甲酸、葡糖醛酸、草酸、抗壞血酸和N-乙酰甘氨酸。
可以用肽化學(xué)的已知方法制備新化合物。這樣，所述肽可以從氨基酸依次裝配或通過(guò)連接適當(dāng)?shù)男‰钠窝b配。在依次裝配中，肽鏈從C末端開(kāi)始以每次一個(gè)氨基酸逐步延長(zhǎng)。在片段偶聯(lián)中，把不同長(zhǎng)度的片段連接在一起是可能的，所述片段同樣可以通過(guò)從氨基酸依次裝配或通過(guò)片段自身偶聯(lián)獲得。
在依次裝配和片段偶聯(lián)中，通過(guò)形成酰胺鍵連接所述單位是必需的。酶促和化學(xué)方法適合于這種連接。
用于形成酰胺鍵的化學(xué)方法在Mueller，Methoden der organischenChemie第XV卷/2，第1-364頁(yè)，Thieme Verlag Stuttgart，1974；Stewart，Young，固相肽合成，第31-34頁(yè)，第71-82頁(yè)，Pierce化學(xué)公司，Rockford，1984；Bodanszky，Klausner，Ondetti，肽合成，第85-128頁(yè)，John Wiley&Sons，紐約，1976以及其它關(guān)于肽化學(xué)的權(quán)威著作中有詳盡描述。尤其優(yōu)選的是疊氮化物方法、對(duì)稱的和混合的酸酐方法、原位產(chǎn)生的或預(yù)先形成的活性酯、利用尿烷保護(hù)的氨基酸的N-羧基酸酐以及使用偶聯(lián)試劑/活化劑形成酰胺鍵，所述偶聯(lián)試劑/活化劑尤其是二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDCI)、正丙烷膦酸酐(PPA)、N，N-雙(2-氧代-3-噁唑烷基(oxazolldinyl))-酰氨基磷酰氯化物(BOP-Cl)、溴代-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯(PyBrop)、二苯磷酰疊氮化物(DPPA)、Castro試劑(BOP，PyBop)、鄰苯并三唑基-N，N，N′，N′-四甲基脲鹽(HBTU)、鄰氮雜苯并三唑基-N，N，N′，N′-四甲基脲鹽(HATU)、二乙基磷酰氰化物(DEPCN)、2，5-二苯基-2，3-二氫-3-氧代-4-羥基噻吩二氧化物(Steglich試劑；HOTDO)以及1，1′-羰基二咪唑(CDI)。偶聯(lián)試劑可以單獨(dú)使用或與添加劑一起使用，所述添加劑例如N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)、N-羥基-苯并三唑(HOBt)、N-羥基-苯并三嗪(HOOBt)、氮雜苯并三唑(HOAt)、N-羥基-琥珀酰亞胺(HOSu)或2-羥基吡啶。
然而，在酶促肽合成中省去保護(hù)基通常是可能的，在化學(xué)合成中，不參與酰胺鍵形成的反應(yīng)基團(tuán)的可逆保護(hù)對(duì)兩種反應(yīng)物來(lái)說(shuō)是必要的。對(duì)化學(xué)肽合成而言，優(yōu)選的是三種常規(guī)的保護(hù)基技術(shù)芐氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)以及9-芴基甲氧羰基(Fmoc)技術(shù)。在每種情況下識(shí)別的是鏈延長(zhǎng)單位的α-氨基基團(tuán)上的保護(hù)基團(tuán)。有關(guān)氨基酸保護(hù)基的詳盡綜述由Mueller，Methoden der organischen Chemie第XV卷/1，第20-906頁(yè)，ThiemeVerlag，Stuttgart，1974給出。用于裝配肽鏈的單位可以在溶液、懸浮液中反應(yīng)或通過(guò)類似于由Merrifield在美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志85(1963)2149中描述的方法反應(yīng)。尤其優(yōu)選的方法是其中肽依次裝配或通過(guò)Z、Boc或Fmoc保護(hù)基技術(shù)進(jìn)行片段偶聯(lián)的方法。在所說(shuō)的Merrifield技術(shù)中，把一種反應(yīng)物結(jié)合到不溶性聚合支持物(下文也稱為樹(shù)脂)上。這典型地使所述肽在聚合支持物上依次裝配，在此過(guò)程中使用了Boc或Fmoc保護(hù)基技術(shù)，加長(zhǎng)的肽鏈以C末端共價(jià)結(jié)合到不溶性樹(shù)脂顆粒上(參見(jiàn)

圖1和2)。該方法使通過(guò)過(guò)濾除去試劑和副產(chǎn)物成為可能，這樣就不需要進(jìn)行中間體的再結(jié)晶。
被保護(hù)的氨基酸可以與任何適合的聚合物連接，該聚合物僅僅必須是在所使用的溶劑中不溶性的并具有使過(guò)濾容易的穩(wěn)定的物理形式。聚合物必須包含使第一個(gè)被保護(hù)的氨基酸可以通過(guò)共價(jià)鍵牢固連接到其上的功能基團(tuán)。適合于此目的的聚合物有多種，例如纖維素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、磺化聚苯乙烯、氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(Merrifield樹(shù)脂)、4-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂(MBHA-樹(shù)脂)、苯乙酰氨基甲基樹(shù)脂(Pam-樹(shù)脂)、對(duì)芐氧基-芐基-醇-樹(shù)脂、二苯甲基-胺-樹(shù)脂(BHA-樹(shù)脂)、4-(羥甲基)-苯甲酸基-甲基-樹(shù)脂、Breipohl等的樹(shù)脂(Tetrahedron Letters 28(1987)565；由BACHEM提供)、4-(2，4-二甲氧苯氨甲基)苯氧基-樹(shù)脂(由Novabiochem提供)或鄰氯三苯甲基-樹(shù)脂(由Biohellas供應(yīng))。
適合在溶液中的肽合成的是在反應(yīng)條件下為惰性的所有溶劑，尤其是水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈、二氯甲烷(DCM)、1，4-二噁烷、四氫呋喃(THF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)以及所說(shuō)的溶劑的混合物。在聚合支持物上的肽合成可以在所有惰性有機(jī)溶劑中(其中所使用的氨基酸衍生物是可溶性的)進(jìn)行。然而，優(yōu)選的溶劑還具有樹(shù)脂-膨脹性質(zhì)，如DMF、DCM、NMP、乙腈和DMSO以及這些溶劑的混合物。在合成完全后，把肽從聚合支持物上裂解下來(lái)。在文獻(xiàn)中公開(kāi)了可以從各種樹(shù)脂類型上裂解下來(lái)的條件。最常用的裂解反應(yīng)是酸和鈀催化的，具體來(lái)說(shuō)是在液態(tài)無(wú)水氟化氫、無(wú)水三氟甲磺酸、稀釋的或濃縮的三氟醋酸中的裂解、在弱堿(如嗎啉)存在下，在THF或THF-DCM混合物中的鈀催化的裂解或在醋酸-二氯甲烷-三氟乙醇混合物中的裂解。依賴于所選擇的保護(hù)基，在裂解條件下它們可以保持下來(lái)或同樣地裂解掉。
當(dāng)要進(jìn)行某些衍生反應(yīng)時(shí)，肽的部分去保護(hù)也是值得的?？梢酝ㄟ^(guò)下列方法制備在N-末端二烷基化的肽a)通過(guò)在溶液中或在聚合支持物上偶聯(lián)適當(dāng)?shù)腘，N-二-烷基氨基酸，b)通過(guò)在DMF/1％乙酸中用NaCNBH3和適當(dāng)?shù)娜┗蛲€原性烷基化樹(shù)脂-結(jié)合的肽，c)通過(guò)在醛或酮和鈀/C存在下在溶液中氫化所述肽。
本文公開(kāi)的各種非天然存在的氨基酸可以從商業(yè)來(lái)源獲得或使用本領(lǐng)域已知的方法從市售的物料合成。氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、3-甲基-L-脯氨酸、5-甲基-L-脯氨酸和Boc-或Fmoc-保護(hù)的3，4-脫水脯氨酸是市售的起始原料(ACROS，NOVABIOCHEM，BACHEM)。順式-和反式-4-氟脯氨酸可以通過(guò)由Panasik等描述的方法(N.Panasik，E.S.Eberhardt，A.S.Edison，D.R.Powell，R.T.Raines，國(guó)際肽蛋白質(zhì)研究雜志44，1994，262-269)從羥脯氨酸制備。
通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的化合物，可以將本發(fā)明的化合物用于抑制或者治療固體腫瘤(例如肺臟、胸部、結(jié)腸、前列腺、膀胱、直腸或子宮內(nèi)膜腫瘤)或血液腫瘤(例如白血病，淋巴瘤)。
新的化合物的特殊的優(yōu)點(diǎn)是這些化合物與多拉抑放素-15相比對(duì)酶促降解具有更大的抗性。
施用可以通過(guò)任何用于藥劑(優(yōu)選地是腫瘤藥劑)的常規(guī)的方式進(jìn)行，這些方式包括口服和腸胃外方式，如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)。
所述化合物可以單獨(dú)施用或以藥物組合物的形式施用，所述藥物組合物包含式I的化合物與適用于所需的給藥途徑的藥學(xué)上可接受的載體。這樣的藥物組合物可以是組合產(chǎn)物，即也可以包含其它治療活性成分。
對(duì)哺乳動(dòng)物施用的劑量包含抑制腫瘤有效量的活性成分，該活性成分取決于常規(guī)因素；這些因素包括所使用的特定化合物的生物活性；施用方式；接收者的年齡、健康狀況和體重；癥狀的性質(zhì)與程度；治療頻率；其它治療劑的施用；所需的作用。典型的每日劑量是口服施用時(shí)每公斤體重大約0.5至50mg，腸胃外施用時(shí)大約0.05至20mg。
新的化合物可以以常規(guī)的固體或液體藥物施用形式施用，所述形式例如未包衣的或(薄膜)包衣的片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、栓劑或溶液。它們以常規(guī)方式產(chǎn)生。為了這一目的，所述活性物質(zhì)可以與常規(guī)的藥學(xué)助劑加工，所述助劑例如片劑粘合劑、填充劑、防腐劑、片劑分解劑、流動(dòng)調(diào)節(jié)劑、增塑劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、乳化劑、溶劑、緩釋組合物、抗氧化劑和/或推進(jìn)氣體(參見(jiàn)H.Sucker等Pharmazeutische Technologie，Thieme-Verlag，Stuttgart，1978)。以這種方式獲得的施用形式通常包含1-90％(重量比)的活性物質(zhì)。
下列實(shí)施例旨在用于說(shuō)明本發(fā)明。在實(shí)施例中使用已知的三字母代碼縮寫(xiě)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸。使用的其它縮寫(xiě)為Me2Val＝N，N-二甲基纈氨酸，MeVal＝N-甲基纈氨酸，Z＝芐氧羰基。
A.一般步驟I.使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)Z-和Boc-方法通過(guò)經(jīng)典的溶液合成，或者使用Boc和Fmoc保護(hù)基技術(shù)通過(guò)固相合成的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合成權(quán)利要求1要求的肽。
a)Fmoc保護(hù)基技術(shù)的合成循環(huán)1.DMF洗滌 1×1分鐘2.在DMF中的20％哌啶1×4分鐘3.在DMF中的20％哌啶1×16分鐘
4.DMF洗滌 5×1分鐘5.添加預(yù)活化的被保護(hù)的氨基酸(通過(guò)在DMF中的1當(dāng)量的TBTU和5當(dāng)量的DIPEA活化)；肽偶聯(lián) 1×61分鐘6.DMF洗滌 3×1分鐘7.如果轉(zhuǎn)化不完全，重復(fù)偶聯(lián)(返回至5.)8.DMF洗滌 3×1分鐘9.返回至2.
使用BOP-C1和PyBrop作為N-甲基氨基酸之后的氨基酸偶聯(lián)試劑。包括雙偶聯(lián)的反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)地增加。在溶液合成中，分別使用Boc-保護(hù)的氨基酸NCA′s(N-羧酸酐)、Z-保護(hù)的氨基酸NCA′s(N-羧酸酐)或使用氯化新戊酰氯作為縮合劑對(duì)這類偶聯(lián)是最有利的。
II.N-末端的還原性烷基化將如在AIa中制備的肽-樹(shù)脂在N-末端去保護(hù)(AIa中的步驟2-4)，然后在添加3當(dāng)量NaCNBH3后，與在DMF/1％乙酸中的3倍摩爾過(guò)量的醛或酮反應(yīng)。在反應(yīng)完成后(陰性Kaiser試驗(yàn))，樹(shù)脂以水、異丙醇、DMF和二氯甲烷洗滌幾次。
在溶液中的還原性烷基化可以通過(guò)，例如，使用NaCNBH3或氫-鈀/C使N-末端去保護(hù)的肽、肽片段或氨基酸與相應(yīng)的醛或酮反應(yīng)來(lái)完成。
III.如在Ib和II中的方法獲得的肽-樹(shù)脂的處理在減壓下干燥肽-樹(shù)脂，然后以TFA/水混合物(95∶5)處理1.5小時(shí)(Wade，Tregear，Howard Florey Fmoc Workshop手冊(cè)，墨爾本1985)。然后過(guò)濾除去樹(shù)脂并以TFA和DCM洗滌。濃縮濾液和洗滌液，通過(guò)添加乙醚沉淀肽。在冰浴中冷卻后，過(guò)濾除去沉淀，浸溶在30％醋酸中并凍干。
IV.當(dāng)使用鄰氯三苯甲基-樹(shù)脂(由Biohellas提供)時(shí)，在室溫下攪拌在醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷混合物(1∶1∶3)中的肽-樹(shù)脂懸浮液1小時(shí)。然后抽吸過(guò)濾除去樹(shù)脂并以裂解溶液充分洗滌。在真空中濃縮合并的濾液并用乙醚處理。通過(guò)過(guò)濾或離心除去沉淀的固體，以乙醚洗滌并在減壓下干燥。
V.肽的純化和特征確定通過(guò)凝膠色譜(SEPHADEX G-10，G-15/10％HOAc，SEPHADEXLH20/MeOH)和/或中壓色譜(固定相HD-SIL C-8，20-45μm，100埃；流動(dòng)相A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/MeOH的梯度)或制備HPLC(固定相Waters Delta-Pak C-18，15μm，100埃；流動(dòng)相A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/MeOH的梯度)進(jìn)行純化。
通過(guò)分析型HPLC(固定相100 2.1mm VYDAC C-18，300埃；流動(dòng)相以0.1％TFA緩沖的乙腈-水梯度，40℃)測(cè)定形成的產(chǎn)物的純度。
通過(guò)快速原子轟擊質(zhì)譜和核磁共振譜確定特征。
B.具體步驟實(shí)施例1(SEQ ID NO1)Me2Val-Val-MeVal-3，4-脫氫脯氨酰-Pro-酰胺使相當(dāng)于0.25mmol批量(batch size)的0.53g Fmoc-RINK-樹(shù)脂(取代0.46mmol/g)如AIa所述與0.4mmol以下每種反應(yīng)Fmoc-Pro-OHFmoc-3，4-脫氫脯氨酸Fmoc-MeVal-OHFmoc-Val-OHFmoc-Val-OH用PyBrop作為偶聯(lián)劑進(jìn)行雙偶聯(lián)以偶聯(lián)N-甲基氨基酸后的氨基酸。在完成反復(fù)的合成循環(huán)后，對(duì)肽-樹(shù)脂進(jìn)行N-末端去保護(hù)(在AIa中的步驟2-4)，并如AII中所述進(jìn)一步與甲醛水溶液反應(yīng)，然后在減壓下干燥。使形成的樹(shù)脂進(jìn)行如AIII中所述的TFA裂解。通過(guò)制備型中壓色譜純化粗產(chǎn)物(132mg)以產(chǎn)生32mg所需純度的肽(在10分鐘內(nèi)10-40％A；在140分鐘內(nèi)40-90％A)。用快速原子轟擊質(zhì)譜進(jìn)一步確定化合物的特征([M+H]+＝548)。
實(shí)施例2(SEQ ID NO1)Me2Val-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺a)Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸把1.5g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸(11.6mmol)溶解在4ml水和2.33ml 5N NaOH中。在4℃下，1小時(shí)內(nèi)添加2.12ml芐基氯甲基酸鹽(Z-C1；12.8mmol)和6.5ml 2N NaOH。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜后，把pH調(diào)整到10。以二氯甲烷(4×)提取水層，以5NHCl把pH調(diào)整至2，用二氯甲烷(2×)提取。在硫酸鈉上干燥合并的有機(jī)提取物并在真空中蒸發(fā)，產(chǎn)生1.75g為油狀物的所需產(chǎn)物。
b)Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-芐酰胺把1.75g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸(6.62mmol)和1.59g脯氨酸芐酰胺氫氯化物(6.62mmol)溶解在66ml二氯甲烷中并冷卻至4℃。在添加0.89ml N-甲基嗎啉(7.94mmol)、0.304g HOBt(2.21mmol)以及1.28gEDCI(6.62mmol)后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，以150ml二氯甲烷稀釋，并以飽和的碳酸氫鈉溶液(3×)、水(1×)、5％檸檬酸(3×)、水(1×)以及飽和NaCl(1×)洗滌。在硫酸鈉上干燥有機(jī)層并在減壓下濃縮，產(chǎn)生2.63g的高度膠粘的油狀物。
c)(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-芐酰胺把2.63g Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-芐酰胺(5.8mmol)溶解在43ml甲醇中。在添加105mg 10％鈀/炭后，使反應(yīng)混合物氫化過(guò)夜。過(guò)濾并蒸發(fā)至干，產(chǎn)生1.88g去保護(hù)的二肽。
d)Z-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基］-Pro-芐酰胺把1.54g Z-MeVal-OH(5.8mmol)和1.88g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-芐酰胺(5.8mmol)溶解在58ml二氯甲烷并冷卻至4℃。在添加0.78ml N-甲基嗎啉(6.96mmol)、0.266g HOBt(1.93mmol)以及1.12g EDCI(5.8mmol)后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，以120ml二氯甲烷稀釋，并以飽和的碳酸氫鈉溶液(3×)、水(1×)、5％檸檬酸(3×)、水(1×)以及飽和NaCl(1×)洗滌。在硫酸鈉上干燥有機(jī)層并在減壓下濃縮，產(chǎn)生3.01g白色泡沫狀的產(chǎn)物。
e)MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺把3.01g Z-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺(5.33mmol)溶解在39ml甲醇中。在添加96mg 10％鈀/炭后，使反應(yīng)混合物氫化3小時(shí)。過(guò)濾并蒸發(fā)至干，產(chǎn)生2.18g澄清油狀的去保護(hù)的三肽。
f)Z-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺把1.28g Z-Val-OH(5.11mmol)溶解在10ml二氯甲烷中。在添加0.73ml三乙胺(5.37mmol)并冷卻至-10℃后，緩慢添加0.66ml新戊酰氯(5.37mmol)?；旌衔镌?10℃下攪拌1.5小時(shí)，其后添加2.18g MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺(5.11mmol)和在10ml二氯甲烷中的0.73ml三乙胺(5.37mmol)。反應(yīng)混合物在-10℃下攪拌1.5小時(shí)并在室溫下過(guò)夜，以二氯甲烷稀釋，并以飽和的碳酸氫鈉溶液(3×)、水(1×)、5％檸檬酸(3×)、水(1×)以及飽和NaCl(1×)洗滌。在硫酸鈉上干燥有機(jī)層并在真空中濃縮，產(chǎn)生2.75g干泡沫狀的產(chǎn)物。
g)Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺把2.75g Z-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺(4.13mmol)溶解在30ml甲醇中。在添加0.34ml濃HCl(4.13mmol)和78mg 10％鈀/炭后，使反應(yīng)混合物氫化3小時(shí)。過(guò)濾并蒸發(fā)至干，產(chǎn)生2.23g干的白色泡沫狀的去保護(hù)的三肽。再把粗制品溶解在50ml水中，用1N HCl把pH調(diào)整到2-3。以二氯甲烷提取水層(3×)，以5N NaOH把pH調(diào)整至10，然后再以二氯甲烷提取(3×)。在硫酸鈉上干燥合并的有機(jī)提取物并在減壓下濃縮，產(chǎn)生1.71g去保護(hù)的四肽芐酰胺。
h)Me2Val-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺把0.47g Me2Val-OH(3.24 mmol)和1.71g Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基－吡咯烷-2-羰基]-Pro-芐酰胺(3.24mmol)溶解在32ml干DMF中。在冷卻至4℃后，添加1.07ml DEPCN(6.48mmol)和1.88ml三乙胺(12.96mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，在減壓下蒸發(fā)DMF。把殘余物溶解在100ml二氯甲烷中并以飽和的碳酸氫鈉溶液(3×)、水(1×)、5％檸檬酸(3×)、水(1×)以及飽和NaCl(1×)洗滌。在硫酸鈉上干燥有機(jī)層并在減壓下濃縮，產(chǎn)生0.88g無(wú)色油狀產(chǎn)物。把粗制品溶解在煮沸的二異丙基醚中并通過(guò)冷卻沉淀。收集沉淀并干燥，產(chǎn)生0.56g純化產(chǎn)物。通過(guò)快速原子轟擊質(zhì)譜進(jìn)一步確定所述化合物的特征([M+H]+＝655.6)。
制備了下列化合物，并且這些化合物可以按照實(shí)施例1和2的方法制備3.Xaa Val Xab Xac Xad4.Xaa Val Xab Xac Xae5.Xaa Val Xab Xac Xaf6. Xaa Val Xab Xac Xag7. Xaa Val Xab Xac Xah8. Xaa Val Xab Xac Xai9. Xaa Val Xab Xac Xak10.Xaa Val Xab Xac Xal11.Xaa Val Xab Xac Xam12.Xaa Val Xab Xac Xan13.Xaa Val Xab Xac Xao14.Xaa Val Xab Xac Xap15.Xaa Val Xab Xac Xaq16.Xaa Val Xab Xac Xar17.Xaa Val Xab Xac Xas18.Xaa Val Xab Xac Xat19.Xaa Val Xab Xac Xat20.Xaa Val Xab Xac Xav21.Xaa Val Xab Xac Xaw22.Xaa Val Xab Xac Xax23.Xaa Val Xab Xac Xav24.Xaa Val Xab Xac Xaz25.Xaa Val Xab Xac Xba26.Xaa Val Xab Xac Xbb27.Xaa Val Xab Xac Xbc28.Xaa Val Xab Xac Xbd29.Xaa Val Xab Xac Xbe30.Xaa Val Xab Xac Xbf31.Xbg Val Xab Xac Xar32.Xbg Val Xab Xac Xas33.Xbh Val Xab Xac Xar34.Xbh Val Xab Xac Xas35.Xaa Ile Xab Xac Xar36.Xaa Ile Xab Xac Xas37.Xaa Xbk Xab Xac Xar38.Xaa Xbk Xab Xac Xas39.Xaa Val Xbi Xac Xar40.Xaa Val Xbi Xac Xas41.Xaa Val Xab Xac Xbl42.Xaa Val Xab Xac Xbm43.Xaa Val Xab Xac Xbn44.Xaa Val Xab Xbo Xae45.Xaa Val Xab Xbo Xbp46.Xaa Val Xab Xbo Xar47.Xaa Val Xab Xbo Xas48.Xaa Val Xab Xbo Xbm49.Xaa Val Xab Xbq Xae50.Xaa Val Xab Xbq Xar51.Xaa Val Xab Xbq Xas52.Xaa Val Xab Xbq Xbm53.Xaa Val Xab Xbr Xbp54.Xaa Val Xab Xbr Xae55.Xaa Val Xab Xbr Xas56.Xaa Val Xab Xbr Xar57.Xaa Val Xab Xbs Xae58.Xaa Val Xab Xbs Xas59.Xaa Val Xab Xbs Xar60.Xaa Val Xab Xac Xbu61.Xaa Val Xab Xac Xbt62.Xaa Val Xab Xbq Xbu63.Xaa Val Xab Xbq Xbt64.Xaa Val Xab Xac pro Xbv65.Xaa Val Xab Xac pro Xbw66.Xaa Val Xab Xac Pro Xbx67.Xaa Val Xab Xac Pro Xby68.Xaa Val Xab Xac Pro Xbz64.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbv65.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbw66.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbx67.Xaa Val Xab Xbq Pro Xby68.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbz69.Xaa Val Xab Xbo Xaz70.Xaa Val Xab Xbq Xaz71.Xaa Val Xab Xbq Xbn72.Xaa Val Xab Xbo Xbn下表中給出了合成的新化合物的MS-定性的實(shí)例。
實(shí)施例[編號(hào)]快速原子轟擊MS分析[分子量(測(cè)量值)]45.62753.655表I-按照實(shí)施例1和2的方法制備的化合物的序列識(shí)別號(hào)(SEQ ID NO)化合物編號(hào)序列識(shí)別號(hào)1-34，39-63，69-72 135，36 237，38 364-68 4在概述中符號(hào)Xaa具有下述含義XaaN，N-二甲基纈氨酸XabN-甲基纈氨酸Xac3，4-脫氫脯氨酸
Xbg N，N-二甲基異亮氨酸Xbh N，N-二甲基-2-叔丁基-甘氨酸Xbi N-甲基異亮氨酸Xbk 2-叔丁基甘氨酸
Xbo L-氮雜環(huán)丁烷-2-碳酰
Xbq (4-氟代)-L-脯氨酸Xbr (5-甲基)-L-脯氨酸Xbs (3-甲基)-L-脯氨酸
可以通過(guò)常規(guī)方法(包括，例如，如下所述的方法)測(cè)定本發(fā)明的化合物的抗癌活性。
A.體外方法使用用于貼壁細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法(如微量培養(yǎng)四唑測(cè)定(MTT))測(cè)定細(xì)胞毒性。這種測(cè)定的細(xì)節(jié)已經(jīng)發(fā)表(Alley，MC等，癌癥研究，48589-601，1988)。使用腫瘤細(xì)胞(如，HT-29結(jié)腸癌或LX-1肺臟腫瘤)的指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)物制作微滴定板培養(yǎng)物。細(xì)胞以96-孔平板上每孔5000-20,000個(gè)細(xì)胞接種(在150μl培養(yǎng)基中)，在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。以從10-4M到10-10M變化的10倍的稀釋倍數(shù)添加試驗(yàn)化合物，然后培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。為了測(cè)定每個(gè)孔中存活的細(xì)胞的數(shù)量，添加MTT染料(50μl在鹽水中的3 mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)。將該混合物在37℃下培養(yǎng)5小時(shí)，然后向每個(gè)孔添加50μL的25％SDS(pH 2)。培養(yǎng)過(guò)夜后，使用ELISA讀數(shù)儀讀出在550nm下各孔的吸光度。利用公式％T/C從重復(fù)孔計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值+/-SD(％處理的存活細(xì)胞/對(duì)照)。
產(chǎn)生50％生長(zhǎng)抑制的T/C的試驗(yàn)化合物的濃度指定為IC50值。
實(shí)施例的化合物IC50[M]1.1×10-92.1×10-945. 1×10-753. 1×10-8B.體內(nèi)方法在臨床前測(cè)定中也試驗(yàn)了本發(fā)明的化合物的體內(nèi)活性，這種體內(nèi)活性表示臨床效用。用移植(異種移植)進(jìn)腫瘤組織(優(yōu)選地是人起源的)的裸鼠實(shí)施這樣的測(cè)定，這在本領(lǐng)域是熟知的。在把試驗(yàn)化合物施用到進(jìn)行異種移植的小鼠中后評(píng)價(jià)其抗腫瘤功效。
更具體地說(shuō)，利用大約50mg大小的腫瘤片段把在無(wú)胸腺的裸鼠中生長(zhǎng)的人胸部腫瘤(MX-1)移植進(jìn)新的受體小鼠。把移植的日期指定為第0天。六至十天后，以靜脈內(nèi)注射的試驗(yàn)化合物處理小鼠(各劑量下，以5-10只小鼠為一組)。每隔一天施用化合物，共施用3周，劑量為1-100mg/kg體重。每周測(cè)定兩次腫瘤直徑和體重。利用游標(biāo)卡尺測(cè)定的直徑和下式計(jì)算腫瘤體積(長(zhǎng)度×寬度2)/2＝mm3腫瘤體積計(jì)算每個(gè)處理組的平均腫瘤體積，測(cè)定每組相對(duì)于未處理的對(duì)照腫瘤的T/C值。
新的化合物具有良好的抑制腫瘤性質(zhì)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl-Bosch-Strasse 38(C)城市Ludwigshafen(E)國(guó)家Bundesrepublik Deutschland(F)郵區(qū)代碼D-67056(G)電話0621/6048526(H)傳真0621/604 31 23(I)電傳1762175170(ii)發(fā)明名稱新的肽及其制備方法和用途(iii)序列數(shù)4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)，3.5英寸，2DD(B)計(jì)算機(jī)IBM AT-兼容機(jī)，80286處理器(C)操作系統(tǒng)MS-DOS 5.0版(D)軟件WordPer fect(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Val Xaa Xaa Xaa(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Ile Xaa Xaa Xaa(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Val Xaa Xaa Pro Xaa
權(quán)利要求
1.式I的新肽以及它們與生理上可耐受的酸的鹽R1R2N-CHX-CO-A-B-D-E-(F)t-KI其中R1是甲基、乙基或異丙基；R2是氫、甲基或乙基；R1-N-R2一起可以是吡咯烷環(huán)；A是纈氨酰、異亮氨酰、亮氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、2-乙基甘氨酰、正亮氨?；蛘i氨酰殘基；B是N-甲基-纈氨酰、-亮氨酰、-異亮氨酰、-正纈氨酰、-正亮氨酰、-2-叔-丁基甘氨酰、-3-叔-丁基丙氨?；?2-乙基甘氨酰殘基；D是3，4-脫氫脯氨酰、4-氟脯氨酰、4，4-二氟脯氨酰、氮雜環(huán)丁烷-2-碳酰、3-甲基脯氨酰、4-甲基脯氨?；?-甲基脯氨酰殘基；E是脯氨酰、高脯氨酰、羥脯氨?；蜞邕蛲?4-碳酰殘基；F是纈氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、異亮氨酰、亮氨酰、2-環(huán)己基甘氨酰、正亮氨酰、正纈氨酰、新戊基甘氨酰、丙氨酰、β-丙氨酰或氨基異丁酰殘基；X是烷基(優(yōu)選地是C2-5)、環(huán)丙基或環(huán)戊基；t是0或1；并且K是烷氧基(優(yōu)選地是C1-4)、芐氧基或取代的或非取代的氨基部分。
2.用于醫(yī)藥，尤其是治療腫瘤疾病的醫(yī)藥中的式I的化合物或其鹽。
3.一種藥物組合物，該藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
4.一種治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該方法包括對(duì)患有這樣的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用腫瘤-抑制量的如權(quán)利要求1所限定的式I的化合物。
5.制備按照權(quán)利要求1的式I化合物的方法，其特征在于按照肽化學(xué)的已知方法制備它們。
全文摘要
本文描述了式(Ⅰ):R
文檔編號(hào)C07K5/103GK1187198SQ96194467
公開(kāi)日1998年7月8日 申請(qǐng)日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者A·浩伯特, F·艾姆林, C·A·羅莫道 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司