專利名稱：用于提取dna的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于從細胞懸液提取DNA的方法和裝置。具體地說，本發(fā)明涉及從微生物提取質粒DNA和從微生物和動物細胞提取基因組DNA的方法和裝置。
背景技術：
重組DNA技術的應用通常包括在靶DNA的克隆或操作中使用質?；蛘沉?。通常，通過培養(yǎng)攜帶質?；蛘沉５奈⑸?，和最后從培養(yǎng)物提取質?；蛘沉６鴶U增質?；蛘沉?。提取的DNA常常需要純化。
對于某些重組DNA技術，特別是DNA純化和測序已經研制了自動或半自動程序，而許多方法仍然需要手工操作。特別是對于質粒DNA提取的方法的情況。常規(guī)方法例如堿性裂解或煮沸裂解(參見，Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，1989)包括許多步驟。其是否成功依賴于研究人員的技術水平。因此，由非熟練實驗者對所述方法的重復應用會導致產生的結果有差異。
經常出現的情況是必需從許多不同的培養(yǎng)物中提取質?；蛘沉NA。由于在一些重組DNA技術中使用微滴板，所以在這種情況下要求從成百種不同的培養(yǎng)物中提取DNA。常規(guī)的提取程序不適合自動操作，或甚至半自動操作。因此，從大量的各個培養(yǎng)物中提取質?；蛘沉NA是耗時的和勞動強度大的操作。
因此需要一種可用于從微生物培養(yǎng)物中提取質?；蛘沉NA的方法，該方法比現有的程序更簡便和更具重復性。還需要一種適應于自動操作的提取方法，以便可加工大量的培養(yǎng)物。
同樣，重組DNA技術和DNA分析技術的應用涉及使用動物血液和其它體液的基因組DNA。常規(guī)方法例如用有機溶劑的提取方法(參見，Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，1989)包括許多步驟，其是否成功依賴于研究人員的技術水平。因此，由非熟練實驗者對所述方法的重復應用會導致產生的結果有差異。
經常出現的情況是必需從大量的樣品中提取基因組DNA，特別是對于在聚合酶鏈反應和DNA測序中使用DNA的情況。由于在一些重組DNA技術和遺傳分析中使用微滴板，所以在這種情況下要求從成百種樣品中提取DNA。
因此需要一種可用于從血液和其它體液中提取基因組DNA的方法，該方法比現有的程序更簡便和更具重復性。還需要一種適應于自動操作的提取方法，以便可加工大量的樣品。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供從細胞懸液中提取DNA的方法，該方法克服了現有提取方法中存在的缺點。具體地說，本發(fā)明的一個目的在于提供從細胞懸液中選擇性地提取質粒DNA的方法，該方法克服了現有的用于提取質粒DNA的方法的缺點。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于從細胞懸液提取DNA的裝置。
上文和下文中使用的術語“細胞懸液”包括動物細胞的培養(yǎng)物，微生物培養(yǎng)物，體液例如血液，淋巴液，尿和精液和單個細胞在體液基質中的其它分散體系。
上文和下文中使用的術語“質?！笔侵阜Q作為質粒和粘粒的DNA分子。
根據本發(fā)明的第一個實施方案，提供了從細胞懸液提取DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將細胞懸液加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉懸浮所述細胞的培養(yǎng)基；3)向所述細胞加入裂解溶液，保溫所述細胞足夠長的時間，以便釋放DNA；和4)過濾含有所述DNA的裂解溶液。
根據本發(fā)明的第二個實施方案，提供了從細胞懸液提取DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將細胞懸液加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉懸浮所述細胞的培養(yǎng)基；3)向所述細胞加入裂解溶液，保溫所述細胞足夠長的時間，以便釋放DNA；和4)過濾含有所述DNA的裂解溶液；5)將步驟(4)的濾液加入到離子交換介質中；6)用第一溶液洗滌所述離子交換介質以將除DNA以外的物質洗脫；和7)用第二溶液洗滌所述離子交換介質以洗脫所述DNA。
根據本發(fā)明的第三個實施方案，提供了從微生物培養(yǎng)物中提取質粒DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將攜帶質粒DNA的微生物培養(yǎng)物加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉培養(yǎng)基；3)將裂解溶液加到所述微生物并且保溫所述微生物足夠長的時間以從中釋放質粒DNA；和4)過濾含有所述質粒DNA的裂解溶液。
根據本發(fā)明的第四個實施方案，提供了從微生物培養(yǎng)物中提取質粒DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將攜帶質粒DNA的微生物培養(yǎng)物加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉培養(yǎng)基；3)向所述微生物加入裂解溶液，保溫所述微生物足夠長的時間，以便釋放質粒DNA；和4)過濾含有所述質粒DNA的裂解溶液；5)將步驟(4)的濾液加入到離子交換介質中；6)用第一溶液洗滌所述離子交換介質以將除質粒DNA以外的物質洗脫；和7)用第二溶液洗滌所述離子交換介質以洗脫所述質粒DNA。
根據本發(fā)明的第五個實施方案，提供了用于培養(yǎng)細胞和提取DNA的裝置，該裝置包括具有一個開口端和一個閉口端的容器，該閉口端包括允許所述容器內部和外部的液體流通的中空膜濾器；和密封所述閉口端的活動密封物。
根據本發(fā)明的第六個實施方案，提供了用于培養(yǎng)細胞和提取DNA的裝置，該裝置包括多個第五個實施方案所述的裝置。
根據本發(fā)明的第七個實施方案，提供了用于培養(yǎng)細胞和提取DNA的試劑盒，該試劑盒包括至少一種第五個實施方案所述的裝置或至少一種第六個實施方案所述的裝置。
在本領域內術語“中空膜濾器”與術語“中空纖維濾器”可交換使用。但是，本文中僅使用前一術語。
參照本發(fā)明的第一個實施方案，可認識到該方法的原理是裂解相關的細胞并且利用中空膜濾器從細胞碎片分離出含有DNA的裂解液。利用該方法可以從動物細胞和微生物以及這些細胞的培養(yǎng)物提取基因組DNA。如下文中詳細描述的，也可以利用該方法從微生物提取質粒DNA。但是，當用于提取質粒DNA時，使用較溫和的裂解條件。該方法比已知的DNA提取程序具有非常大的優(yōu)點，其中整個程序在中空膜過濾裝置中完成。
就第一個實施方案所述的方法的第一步驟而言，適應于該方法的步驟(3)的裂解的任何細胞均可用于整個程序。如果首先使之分散形成懸液，則也可將凝聚的細胞用于該程序。將凝聚的細胞形成分散液的方法是本領域內技術人員已知的。如上所述，該細胞懸液可以是培養(yǎng)細胞的懸液。利用常規(guī)方法和條件可制備所述培養(yǎng)物。在本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)物可以是另外產生的培養(yǎng)物樣品或如下文詳細描述的，可以在包含中空膜濾器的裝置中生產。因此，在后一情況是原位制備培養(yǎng)物。
可以將過量的懸液培養(yǎng)基過濾掉，在中空膜濾器上保留濃縮的細胞(該方法的步驟(2))。通過在膜濾器的入口一側加正壓或在膜濾器的出口一側加負壓可以實現過濾。通過離心或通過使用氣壓是典型的加正壓的方法。通常負壓可通過抽真空來提供，這是優(yōu)選的的過濾方法。以前的過濾方法也適用于第一個實施方案的隨后步驟，以及適用于第二個實施方案的所有步驟。
第一個實施方案的方法進一步包括將步驟(2)的真空膜濾器上收集的細胞進行洗滌的步驟(2a)。適用于步驟(2a)的洗滌溶液也是本領域內技術人員已知的，通常包括蔗糖或葡萄糖的緩沖溶液。優(yōu)選的洗滌溶液包括16.5％蔗糖36mM Tris.HCl(pH8.0)55mM EDTA洗滌溶液還包括破碎細胞壁成份的酶。所述酶通常是溶菌酶。
通過在正壓或負壓條件下將一定體積的洗滌溶液透過膜濾器可完成對細胞的洗滌。所用的洗滌溶液的體積不是重要的，最方便的是大約相當于細胞懸液的初始體積。
第一個實施方案的步驟(3)的裂解溶液優(yōu)選的是一種有或沒有去污劑的含有離液劑的緩沖液。合適的離液劑包括鹽酸胍，碘化鈉，高氯酸鈉和胍的鹽例如，硫氰酸胍。通常離液劑以3-6M的濃度存在。甚至可以使用離液劑的飽和溶液(某些情況下約8M)。合適的去污劑包括TweenTM20，TritonX-100TM，NonidetTMP-40，Brij58TM，脫氧膽酸鈉，N-月桂酰肌氨酸等等。通常去污劑以0.05-5％的濃度存在。例如TritonX-100TM可以以0.75-5％的濃度存在于裂解溶液中。裂解溶液的pH通常是5-9。裂解溶液中也可以含有變性劑例如脲。
優(yōu)選的裂解溶液包括4M硫氰酸胍0.1M乙酸鈉(pH5.0)
5％TritonX-100TM3M脲該裂解溶液特別適用于從動物細胞提取基因組DNA。
優(yōu)選的是使用最小體積的裂解溶液可避免稀釋提取的DNA。通常，使用約相當于培養(yǎng)物體積的裂解溶液體積。
在裂解溶液存在下保溫細胞足夠長的時間以釋放大量的基因組DNA。對于動物細胞，保溫時間3-15分鐘是合適的。
在本發(fā)明的第一個實施方案的最后步驟過濾含有提取的DNA的裂解溶液。可利用本領域內技術人員已知的技術濃縮DNA或將DNA轉移到另一種溶液。例如，利用有機溶液可以沉淀DNA或將質粒DNA的溶液進行凝膠過濾或透析。
將第一個實施方案的方法的步驟(3)和(4)重復一或多次以提高DNA的產量。重復的步驟僅涉及加入新鮮的裂解溶液，保溫一定的時間以釋放另外的DNA，并過濾裂解溶液。
第二個實施方案的方法提供了用于獲得純化DNA的常規(guī)方法。該方法的開頭四個步驟可以按上文第一個實施方案所述實施，包括任選的步驟(2a)。適用于該方法步驟(5)的離子交換介質是本領域內技術人員已知的，并且包括用已知基團例如DEAE(二乙氨乙基)，QAE(四級氨乙基)和Q(季銨)取代的惰性基質。優(yōu)選的離子交換介質是二氧化硅。
將步驟(3)的裂解溶液設計為允許DNA結合到離子交換介質上，洗脫掉包含于裂解液中的其它化合物。對于與二氧化硅濾器結合，特別優(yōu)選的裂解溶液是上述第一個實施方案的步驟(3)中定義的裂解溶液。
洗滌離子交換介質通常包括將幾部分的第一溶液透過該介質。第一溶液優(yōu)選的是不溶解DNA的一種溶液。對于與二氧化硅離子交換介質結合使用，溶于水中的80％異丙醇溶液是優(yōu)選的。
通過將可溶解DNA的一種溶液透過該介質可實現該方法的步驟8對DNA進行洗脫。典型的溶液包括含有低濃度鹽的水，或TE(pH7.4-8.0)(TE溶液是從pH7.0-9.0Tris.HCl原液和pH8.0EDTA原液制備產生由10mM Tris.HCl和1mM EDTA組成的水溶液)。
本發(fā)明第三個和第四個實施方案所述方法分別基本上相同于第一和第二個實施方案的方法，不同的是起始的兩種方法適用于微生物使用。對于第三和第四個實施方案的方法的第一步驟，任何適應于該方法的步驟(3)的裂解的微生物均可用于整個程序。但是通常微生物培養(yǎng)物是細菌培養(yǎng)物。利用常規(guī)方法和條件制備微生物培養(yǎng)物。如前面的實施方案而言，在該方法中使用的培養(yǎng)物可以是另外產生的培養(yǎng)物樣品或如下文詳細描述的，可以在包含中空膜濾器的裝置中生產。因此，在后一情況是原位制備培養(yǎng)物。
第三和第四個實施方案的方法的步驟(3)的裂解溶液同樣可包括一種有或沒有去污劑的含有離液劑的緩沖液。上述限定的離液劑和去污劑也可用于從微生物提取質粒DNA。優(yōu)選的離液劑包括濃度分別為4-6M和3-5M的鹽酸胍和硫氰酸胍。優(yōu)選的裂解溶液包括6M鹽酸胍0.75％TritonX-100TM200mM HEPES(pH6.5)或100mM Tris.HCl(pH6.4)。
在裂解溶液存在下保溫微生物足夠長的時間以釋放大量的質粒DNA，但是應使釋放出的染色體DNA的量和其它細胞物質降低到最小。保溫時間也取決于微生物的類型。對于細菌例如大腸桿菌，保溫時間3-15分鐘是合適的。
如前面的實施方案，可將第三和第四個實施方案的方法的步驟(3)和步驟(4)重復以提高質粒DNA的產量。進一步應認識到第一和第二個實施方案的其它詳細方法也可用于第三和第四個實施方案的方法。
現在描述第五個實施方案，裝置的容器通常是細長的圓筒。該容器可以是任何體積，但是對于用于自動程序的裝置優(yōu)選的是約2毫升的體積。通常中空膜濾器大約不超過容針筒積的25％并且可以包括延伸到容器中的許多指狀物或網狀物，或在容器內軸向延伸的單個圓筒件。
用于密封裝置的閉口端的密封物可以是一種可拔掉的金屬薄片密封物，或以螺絲配合或摩擦配合形式密封末端的蓋。
在優(yōu)選的實施方案中，該裝置也包括在容器的開口端的活動密封物。通常該密封物是透氣的蓋，以便微生物好氧培養(yǎng)。
應認識到該裝置的構型應可以添加培養(yǎng)基。用所需的微生物接種到培養(yǎng)基，在合適的條件下保溫該裝置以便培養(yǎng)細胞。然后根據第一個實施方案的提取程序處理培養(yǎng)物。
另外，可將該裝置用于培養(yǎng)烈性噬菌體(例如，M13或λ)。用宿主微生物接種噬菌體。在培養(yǎng)之后，透過中空膜濾器過濾提取含有噬菌體顆粒的培養(yǎng)基可從宿主微生物分離噬菌體。
還應認識到本發(fā)明的裝置可用于從細胞中直接提取DNA，也即對于提取程序細胞在原位培養(yǎng)不是必要的。
第五個實施方案所述的裝置優(yōu)選的是從對有機溶劑和常規(guī)滅菌技術有抗性的材料制備。合適的材料包括聚丙烯，聚苯乙烯和丙烯酸酯塑料。
第六個實施方案所述的裝置通常包括第五個實施方案所述的裝置的線性組合，其中每個容器是細長的圓筒。優(yōu)選的是，該裝置有8個容器構成以便與標準的8×12孔微滴板的孔相對應，這使該裝置可用于自動操作。
借助于脆性的或固體網狀物可將第六個實施方案的裝置組合中的多個容器連接在一起。另一種可選的方法，可將一種容器的壁的一部分與相鄰容器的壁的一部分相鄰接。
優(yōu)選的是第五和第六個實施方案的裝置在容器的開口端進行改造以接合含有離子交換介質的過濾裝置。這可使含有質粒DNA的裂解溶液直接傳遞到離子交換介質，從而促進DNA的純化。一旦提取的DNA結合到離子交換介質，該裝置與過濾裝置脫離，并且根據第二和第四個實施方案的步驟(6)和(7)實施其余的DNA純化步驟。
利用第六個實施方案的裝置的特別優(yōu)選的方式是與適于連接真空泵的集合管結合。優(yōu)選的是集合管包括有含多個孔的蓋的盤。通常該蓋至少具有8個孔以接收第六個實施方案的裝置的線性組合。優(yōu)選的是，該蓋有微滴板構型的96個孔。
當與集合管結合使用時，將裝置插入到集合管蓋的孔中。在未使用的蓋上加塞子以便使用負壓。然后如果必要在第一到第四個實施方案的方法的步驟(1)-(3)，通過集合管抽真空完成過濾步驟。
如果需要收集提取的DNA，在集合管盤上安裝微滴板以便在集合管孔中收集從裝置組合吸出的含有DNA的裂解溶液。
也可將集合管與第六個實施方案的裝置連接用于純化提取的DNA。在實施第二和第四個實施方案的步驟(1)-(3)之后，在裝置組合和集合管蓋之間可插入離子交換過濾裝置以實施步驟(4)。然后除去裝置組合實施步驟(5)和(6)，最后在集合管盤上安裝微滴板以收集步驟(7)期間洗脫的DNA。
應認識到上面描述的過程可自動控制用于實施提取和純化過程的各個步驟中的試劑的釋放，自動控制在集合管上應用負壓。
除用于提取DNA的裝置以外，第七個實施方案的試劑盒可包括實施提取和純化過程的各個步驟的試劑，和/或用于純化步驟的過濾裝置。
試劑盒也可包括與真空集合管相連的裝置組合。前面所述的試劑盒進一步可包括過濾裝置組合。
附圖簡述

圖1是包括單個培養(yǎng)容器和濾器的裝置的斷面?zhèn)纫晥D。該圖也顯示了用于DNA純化的濾器。
圖2是包括多個培養(yǎng)容器和濾器的裝置的斷面?zhèn)纫晥D，顯示了連接的DNA純化濾器。
圖3是從真空集合管的上方觀察的平面圖。
圖4是真空集合管的斷面圖。
圖5-10描繪了溴化乙錠染色的凝膠，用于分析來自于各種提取步驟的DNA樣品。
實施本發(fā)明的最好方式和其它方式首先參照附圖描述本發(fā)明的裝置。對于圖1，顯示了包括用于接收培養(yǎng)基3的圓筒部件2。該裝置含有包括中空膜濾器5的閉口端4。蓋子6形式的密封物可以摩擦配合的方式安裝到閉口端4，以便阻止裝置內的液體穿過中空膜濾器丟失。
裝置1具有開口端7，通過該末端向容器添加物質。如果必要在開口端加蓋具有滲氣盤的蓋8以便保持無菌。蓋子的透氣性使微生物好氧發(fā)酵。
圖1描繪的裝置總的直徑為40毫米×8毫米OD，是用聚丙烯或聚苯乙烯制備的。
其中具有二氧化硅網10的漏斗型過濾裝置9顯示于裝置1下方。從該圖可看到降低末端4的直徑以便末端4進入裝置9的開口端11。圓筒部件2的壁和裝置9的開口端11之間的摩擦配合提供了防漏密封。
現在描述圖2，其中顯示了由圖1的8個裝置組成的線性組合21。裝置通過網狀物保持于組合中，其中一種網狀物指示于22。對于質粒DNA純化，將組合22與圖1的過濾裝置組合23結合使用。
圖3描繪了從上面觀察時的真空集合管31?？煽吹郊瞎芫哂?排孔，每排有12個孔。
在圖4中提供了顯示于圖3的集合管的斷面?zhèn)纫晥D?？梢钥吹缴w32和盤33。設有部件34用于與由箭頭35指示的真空泵連接。圖3和4的集合管31以不同于裝置圖2的比例繪制。
圖3和4描繪的集合管的構型便于用于質粒DNA的提取。在該構型中，在組合21和集合管31之間插入了圖2的過濾裝置組合23。每個濾器的漏斗型部分具有頸24，固定到集合管蓋32的孔中，并且形成密封。
應理解的是當與之固定時，組合23可以占據蓋32的一排的所有孔。然后裝置組合21可以固定到組合23用于質粒DNA純化。通過固定到集合管蓋32的組合21和23，通過二氧化硅濾器從裝置組合的每個容器吸出液體并且進入到盤33。
也可認識到可將微滴板置于集合管31的室36中以便將通過孔的液體收集到微滴板的特定孔中。
下面是非限制性實施例。實施例1質粒DNA的提取和純化在這一系列實驗中，利用第二個實施方案的方法評價各種裂解溶液的效果。
將攜帶質粒pGem5Zf-的大腸桿菌DH10B接種到LB(LuriaBertani)培養(yǎng)基中并且按照標準程序在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。借助于5毫升注射針筒作為漏斗將過夜培養(yǎng)的1毫升樣品加到0.2微米DynagardTMME中空膜過濾裝置。將玻璃纖維過濾裝置固定到中空膜過濾裝置的出口以形成濾器集合。所述過濾裝置是本領域內技術人員已知的，可通過商業(yè)途徑購買的。
通過在濾器集合的出口抽真空可以將細胞固定到中空膜濾器。為了裂解固定的細胞并且釋放質粒DNA，將1毫升的裂解溶液加到過濾集合，使之與固定化細胞一起在室溫保溫5分鐘。所檢測的裂解溶液含有離液劑(鹽酸胍，硫氰酸胍或碘化鈉)和去污劑(TritonX-100TM或Brij58TM，脫氧膽酸鈉)的組合。在該步驟，質粒DNA從細胞釋放并且進入使DNA結合到玻璃纖維濾器的溶液中。然后將溶液通過濾器集合，即通過中空纖維膜濾器和然后通過玻璃纖維濾器-從而將質粒DNA固定到玻璃纖維濾器。
在低鹽緩沖液中洗脫質粒DNA之前，除去濾器集合的中空纖維濾器部分，保留玻璃纖維濾器。然后在真空條件下用1毫升的80％異丙醇，10mM HEPES(pH6.5)洗滌該濾器三次。在真空條件下將100微升的低鹽水溶液或TE加入到真空干燥的玻璃纖維濾器以洗脫純化的DNA。
將上述程序純化的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并且通過溴化乙錠染色檢測DNA譜帶。為了比較，也對大腸桿菌堿性裂解制備的pGem5Zf-進行分析。所使用的質粒DNA制劑的堿性裂解方法描述于Sambrook等人(見上文)。
染色的凝膠描繪于圖5，泳道2-9上樣了25％的由1毫升的細菌培養(yǎng)物產生的總質粒量。分析下面的樣品泳道1，EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2，使用堿性裂解獲得的純化質粒pGem5Zf-的對照；泳道3，用3.2M硫氰酸胍和0.5％TritonX-100TM裂解制備的pGem5Zf-；泳道4，用3.2M硫氰酸胍和0.5％Brij58TM和0.2％脫氧膽酸鈉裂解制備的pGem5Zf-；泳道5，用4.8M鹽酸胍和0.5％TritonX-100TM裂解制備的pGem5Zf-；泳道6，用4.8M鹽酸胍和0.5％Brij58TM和0.2％脫氧膽酸鈉裂解制備的pGem5Zf-；泳道7，用4.5M碘化鈉，90mM亞硫酸鈉和0.5％TritonX-100TM裂解制備的pGem5Zf-；泳道8，用4.5M碘化鈉，90mM亞硫酸鈉，0.5％Brij58TM和0.2％脫氧膽酸鈉裂解制備的pGem5Zf-。
從圖5可清楚地看到，盡管沒有提供如堿性裂解程序一樣的較高產量，但在第二個實施方案方法中檢測的裂解溶液可以回收高純度的質粒DNA。含有4.8M鹽酸胍和0.5％TritonX-100TM的裂解溶液似乎特別有效。實施例2裂解條件的檢測利用含有4.8M鹽酸胍和各種濃度的TritonX-100TM的裂解溶液進行進一步的實驗。對各種裂解條件也進行了檢測。其它實驗條件和步驟參見實施例1的描述。采用瓊脂糖凝膠電泳對來自1毫升細菌培養(yǎng)物的總質粒產量的25％的樣品進行分析。
圖6顯示瓊脂糖凝膠分析的結果。分析下列樣品泳道1，用EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2和3，使用堿性裂解獲得的純化質粒pGem5Zf-的對照；泳道4，用含有1％TritonX-100TM裂解溶液裂解5分鐘制備的pGem5Zf-；泳道5，用含有2％TritonX-100TM裂解溶液裂解5分鐘制備的pGem5Zf-；泳道6，用含有1％TritonX-100TM裂解溶液保溫兩個5分鐘裂解制備的pGem5Zf-；泳道7，用含有2％TritonX-100TM裂解溶液保溫兩個5分鐘裂解制備的pGem5Zf-；泳道8，在真空條件下以不變的流速用含有1％TritonX-100TM裂解溶液裂解5分鐘制備的pGem5Zf-；和泳道9，在真空條件下以不變的流速用含有2％TritonX-100TM裂解溶液裂解5分鐘制備的pGem5Zf。
圖6顯示的結果可以看出，用于泳道6和7的裂解溶液和裂解條件提供的質粒DNA的產量和純度基本上相當于堿性裂解程序。實施例3洗滌對質粒產量的影響進行一系列的實驗對在裂解步驟之前洗滌細菌細胞的效果進行評價。洗滌溶液含有16.5％的蔗糖，36mM Tris.HCl(pH8.0)和55mMEDTA，在室溫下在洗滌溶液中保溫細菌細胞不同的時間。通過在含有4.8M的鹽酸胍，1％TritonX-100TM和160mM HEPES(pH6.5)的溶液中，于室溫下保溫細胞5分鐘實施細菌細胞的裂解。其它實驗條件和步驟參見上述實施例1的描述。如前面的實施例，采用瓊脂糖凝膠電泳對來自1毫升細菌培養(yǎng)物的總質粒產量的25％的樣品進行分析。
圖7描繪了瓊脂糖凝膠電泳的結果，其中分析下面的樣品泳道1，EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2，使用堿性裂解獲得的純化質粒pGem5Zf-的對照；泳道3，用洗滌溶液保溫5分鐘，然后裂解的pGem5Zf-；泳道4，用洗滌溶液保溫30分鐘，然后裂解的pGem5Zf-；泳道5，用洗滌溶液保溫5分鐘，然后裂解的pGem5Zf-；泳道6，用洗滌溶液保溫30分鐘，然后裂解的pGem5Zf-。
在泳道3和4分析的質粒DNA的制備期間，通過過濾裝置以-2kPa吸出溶液，而在泳道5和6分析的質粒DNA的制備期間，使用-13kPa。
圖7顯示上述實施方案所述方法使質粒DNA制劑的產量和純度至少相當于常規(guī)程序例如堿性裂解程序。所述實施過程的巨大優(yōu)點是利用單套裝置可實施該方法，并且不需要轉移含有DNA的溶液。實施例4從血液提取和純化基因組DNA在一系列實驗中，利用從牛血液中回收的基因組DNA評價各種裂解溶液的效果。
以100微升體積的含有0.1％(重量/體積)含水EDTA的牛血液作為抗凝劑，加入到400微升的TE。這提供了裂解血液中存在的紅細胞的工具(血紅素裂解)。將該溶液加入到5cm2的0.2微米的聚丙烯中空膜濾器，所述濾器用100％乙醇預濕潤以便溶液流過該濾器。從其它材料例如乙酸纖維素和硝酸纖維素的混合物形成這種類型的濾器可通過商業(yè)途徑購買，并且以同樣方式起作用。將玻璃纖維過濾裝置固定到中空膜過濾裝置的出口以形成濾器集合。
通過在濾器集合的出口抽真空可以將含有核的細胞從血紅素裂解的血液中固定到中空膜濾器。為了裂解固定的細胞并且釋放基因組DNA，將1毫升的裂解溶液加到濾器集合，使之與固定化細胞一起在室溫保溫5分鐘。所檢測的裂解溶液含有4M硫氰酸胍，5％TritonX-100TM，0.1M乙酸鈉(pH6.5)和濃度從0.5M-4M的脲。在該步驟，從細胞的核釋放基因組DNA并且進入使DNA結合到玻璃纖維濾器的溶液中。該步驟重復3次，以完全釋放DNA。
然后在真空條件下用1毫升的80％異丙醇，10mM Tris.HCl(pH6.4)洗滌該濾器三次。在真空條件下將100微升的TE(pH8.5)的低鹽溶液加入到玻璃纖維濾器以洗脫純化的基因組DNA。
將純化的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并且通過溴化乙錠染色檢測DNA譜帶。為了比較，也分析利用Progen ProgenomeTMI基因組DNA純化試劑盒(從Progen工業(yè)有限公司，2806 IpswichRoad，Darra，Queensland 4076，Australia獲得)制備的基因組DNA進行分析。
圖8描繪了染色的凝膠。泳道2-7上樣了從100微升的牛血液產生的25％的總基因組DNA。分析下列樣品泳道1，EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2，使用ProgenomeTMI純化的基因組DNA的對照；泳道3，用含有0.5M脲的裂解溶液裂解制備的基因組DNA；泳道4，用含有1M脲的裂解溶液裂解制備的基因組DNA；泳道5，用含有2M脲的裂解溶液裂解制備的基因組DNA；泳道6，用含有3M脲的裂解溶液裂解制備的基因組DNA；泳道7，用含有4M脲的裂解溶液裂解制備的基因組DNA。
在沒有提供如ProgenomeTMI基因組DNA純化試劑盒一樣的較高產量時，所檢測的裂解溶液提供了高純度的基因組DNA制劑。含有4M鹽酸胍和5％TritonX-100TM，0.1M乙酸鈉pH5.0和濃度3M的脲的裂解溶液似乎特別有效。實施例5培養(yǎng)方法的比較攜帶質粒pMW5的大腸桿菌DH10B接種到LB培養(yǎng)基并且根據標準程序在37℃振蕩保溫過夜。(pMW5是由Progen工業(yè)有限公司構建的并且包括pUC19中的部分λ噬菌體)。為了檢測各種培養(yǎng)方法，也將該菌株接種到LB培養(yǎng)基并且在有或沒有通氣條件下在0.2微米(5cm2)聚丙烯中空纖維過濾裝置中于37℃培養(yǎng)過夜。通過施加可調壓縮空氣到中空纖維過濾裝置的出口可實現培養(yǎng)物的通氣。通氣是可見形式的穿過培養(yǎng)基的氣泡。
在過夜保溫之后，將250微升的標準培養(yǎng)物應用到中空膜過濾裝置，該裝置預先用100％乙醇濕潤以便允許溶液流過濾器。中空膜濾器是如上所述應用原位培養(yǎng)的相同類型的裝置。所以，隨后的分析用標準樣品進行，從中空膜過濾裝置去除原位過夜培養(yǎng)物，將250微升部分加到類似于用100％乙醇預先濕潤的類似新鮮裝置。但是實際上，原位培養(yǎng)物在用于培養(yǎng)的中空膜過濾裝置中過濾，并且不轉移到新鮮裝置。將玻璃纖維過濾裝置固定到中空膜過濾裝置的出口以形成濾器集合。
通過在濾器集合的出口抽真空可以將細胞固定到中空膜濾器。在細菌裂解和釋放質粒DNA之前，將1毫升的含有16.5％的蔗糖，40mM Tris.HCl(pH8.0)和60mMEDTA的溶液洗滌細胞，通過應用含有6M鹽酸胍，0.1M Tris.HCl(pH6.4)，0.75％TritonX-100TM的溶液進行細菌細胞的裂解和質粒DNA的釋放，在室溫下與固定細胞一起保溫5分鐘。然后在真空條件下將含有質粒DNA的溶液從濾器集合吸出，從而將質粒DNA固定到玻璃纖維濾器。然后重復裂解步驟以便最大程度回收質粒DNA。
從玻璃纖維濾器洗脫質粒DNA之前，去除過濾集合的中空纖維濾器部分，保留玻璃纖維濾器。然后在真空條件下用1毫升的80％異丙醇，10mM Tris.HCl(pH6.4)洗滌后一濾器三次。在真空條件下將100微升體積的TE的低鹽溶液(pH8.5)加入到真空干燥的玻璃纖維濾器以洗脫純化的DNA。
由上述程序純化的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并且用溴化乙錠染色檢測DNA譜帶。
染色的凝膠描繪于圖9。泳道2-4上樣了25％的從250微升的細菌培養(yǎng)物產生的總質粒。分析下面的樣品泳道1，用EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2，沒有通氣情況下在0.2微米中空纖維過濾裝置中于37℃培養(yǎng)過夜的細菌純化的質粒DNA；泳道3，在通氣情況下在0.2微米中空纖維過濾裝置中于37℃培養(yǎng)過夜的細菌純化的質粒DNA；泳道4，根據標準方法在37℃培養(yǎng)過夜的細菌純化的質粒DNA。
從圖9可以清楚的看到，在通氣情況下在中空纖維過濾裝置中培養(yǎng)的細菌沒有妨礙質粒的回收。該結果證實在用于隨后的DNA提取步驟的相同的中空膜濾器中培養(yǎng)細菌是可能的。實施例6從培養(yǎng)的動物細胞提取DNA進行一系列的實驗對利用本發(fā)明的提取步驟從培養(yǎng)的哺乳動物細胞回收的基因組DNA進行評價。
將于McCoys 5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人腸癌細胞(HCT-116；ATCC保藏號CCL 247)的懸液借助于5毫升注射針筒作為漏斗加到0.2微米DynagardTMME中空纖維過濾裝置。將玻璃纖維過濾裝置固定到中空膜過濾裝置的出口以形成濾器集合。
通過在濾器集合的出口應用真空將細胞從溶液固定到中空纖維濾器。為了裂解細胞并且釋放基因組DNA，將1毫升的裂解溶液加到濾器集合，使之與固定化細胞一起在室溫保溫5分鐘。
裂解溶液含有4M硫氰酸胍，5％TritonX-100TM，0.1M乙酸鈉(pH5.0)和3M脲。在該步驟，從細胞釋放基因組DNA并且進入使DNA結合到玻璃纖維濾器的溶液中。該步驟重復3次，以最大程度從固定細胞釋放DNA。
在從玻璃纖維濾器洗脫基因組DNA之前，去除中空纖維濾器部分，保留玻璃纖維濾器的集合。然后在真空條件下用1毫升的80％異丙醇，10mM Tris.HCl(pH6.4)洗滌該濾器三次。在真空條件下將100微升體積的TE的低鹽溶液(pH8.5)加入到玻璃纖維濾器以洗脫純化的基因組DNA。
將基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并且用溴化乙錠染色檢測DNA譜帶。
染色的凝膠描繪于圖10。其中泳道2-5上樣了25％的總基因組DNA產量。分析下面的樣品泳道1，用EcoRI消化的Spp-1分子量標記物；泳道2，從1毫升懸液裂解人腸癌細胞制備的基因組DNA；泳道3，從2毫升懸液裂解人腸癌細胞制備的基因組DNA；泳道4和5，從5毫升懸液裂解人腸癌細胞制備的基因組DNA。
描繪于圖10的結果顯示本發(fā)明的提取方法可有效地應用到培養(yǎng)的動物細胞。
應認識到可對上述方法和裝置作許多的修飾，而不會脫離本發(fā)明的寬界限和范圍，所述界限和范圍由所附的權利要求限定。
權利要求
1.從細胞懸液提取DNA的方法，所述方法包括下列步驟1)將細胞懸液加到具有中空膜濾器的過濾裝置中，2)如果需要，過濾去掉懸浮所述細胞的培養(yǎng)基；3)向所述細胞加入裂解溶液，保溫所述細胞足夠長的時間，以便釋放DNA；和4)過濾含有所述DNA的裂解溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述DNA是基因組DNA。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸液是培養(yǎng)的動物細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸液是選自于包括血液，淋巴液，精液和尿的體液。
5.根據權利要求1所述的方法，其中進一步包括洗滌在步驟(2)收集在中空纖維濾器上的細胞的步驟。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述裂解溶液包括離液劑的緩沖溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述離液劑選自于鹽酸胍，硫氰酸胍，碘化鈉和高氯酸鈉。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述裂解溶液進一步包括去污劑。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述去污劑選自于TweenTM20，TritonX-100TM，NonidetTMP-40，Brij58TM，脫氧膽酸鈉，N-月桂酰肌氨酸。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述裂解溶液包括4M硫氰酸胍，0.1M乙酸鈉(pH5.0)，5％TritonX-100TM和3M脲。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述過濾裂解溶液的步驟是通過在所述裝置的出口應用真空完成的。
12.根據權利要求1所述的方法，包括重復步驟(3)和(4)。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)于所述細胞過濾裝置。
14.根據權利要求13所述的方法，包括向所述裝置中供應空氣。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述空氣通過所述中空膜濾器供應給所述培養(yǎng)物。
16.從細胞懸液提取DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將細胞懸液加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉懸浮所述細胞的培養(yǎng)基；3)向所述細胞加入裂解溶液，保溫所述細胞足夠長的時間，以便釋放DNA；和4)過濾含有所述DNA的裂解溶液；5)將步驟(4)的濾液加入到離子交換介質中；6)用第一溶液洗滌所述離子交換介質以將除DNA以外的物質洗脫；和7)用第二溶液洗滌所述離子交換介質以洗脫所述DNA。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述離子交換介質是由二乙氨乙基，四級氨乙基或季銨基團取代的惰性基質。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述離子交換介質是二氧化硅。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述第一溶液是不溶解所述DNA的醇溶液。
20.根據權利要求16所述的方法，其中所述第二溶液是溶解所述DNA的水溶液。
21.根據權利要求16所述的方法，其中所述過濾裝置直接結合到包括所述離子交換介質的裝置上。
22.從微生物培養(yǎng)物提取質粒DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將攜帶質粒的微生物培養(yǎng)物加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉培養(yǎng)基；3)向所述微生物加入裂解溶液，保溫所述微生物足夠長的時間，以便釋放質粒DNA；和4)過濾含有所述質粒DNA的裂解溶液。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物是細菌培養(yǎng)物。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述微生物是在所述裝置中培養(yǎng)的。
25.根據權利要求22所述的方法，其中進一步包括洗滌在步驟(2)收集在中空纖維濾器上的細胞的步驟。
26.根據權利要求22所述的方法，其中所述裂解溶液包括離液劑的緩沖溶液。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述離液劑選自于鹽酸胍，硫氰酸胍，碘化鈉和高氯酸鈉。
28.根據權利要求26所述的方法，其中所述裂解溶液進一步包括去污劑。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述去污劑選自于TweenTM20，TritonX-100TM，NonidetTMP-40，Brij58TM，脫氧膽酸鈉，N-月桂酰肌氨酸。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述裂解溶液包括6M鹽酸胍，0.75％Triton X-100TM和200mM HEPES(pH6.5)或100mMTris.HCl(pH6.4)。
31.根據權利要求22所述的方法，其中所述過濾裂解溶液的步驟是通過在所述裝置的出口應用真空完成的。
32.根據權利要求22所述的方法，包括重復步驟(3)和(4)。
33.根據權利要求22所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)于所述細胞過濾裝置。
34.根據權利要求33所述的方法，包括向所述裝置中供應空氣。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述空氣通過所述中空膜濾器供應給所述培養(yǎng)物。
36.從微生物培養(yǎng)物提取質粒DNA的方法，該方法包括下列步驟1)將攜帶質粒DNA的微生物培養(yǎng)物加到具有中空膜濾器的過濾裝置中；2)如果需要，過濾去掉培養(yǎng)基；3)向所述微生物加入裂解溶液，保溫所述微生物足夠長的時間，以便釋放質粒DNA；和4)過濾含有所述質粒DNA的裂解溶液；5)將步驟(4)的濾液加入到離子交換介質中；6)用第一溶液洗滌所述離子交換介質以將除質粒DNA以外的物質洗脫；和7)用第二溶液洗滌所述離子交換介質以洗脫所述質粒DNA。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述離子交換介質是用二乙氨乙基，四級氨乙基或季銨基團取代的惰性基質。
38.根據權利要求36所述的方法，其中所述離子交換介質是二氧化硅。
39.根據權利要求36所述的方法，其中所述第一溶液是不溶解所述DNA的醇溶液。
40.根據權利要求36所述的方法，其中所述第二溶液是溶解所述DNA的水溶液。
41.根據權利要求36所述的方法，其中所述過濾裝置直接結合到包括所述離子交換介質的裝置上。
42.用于培養(yǎng)細胞和從中提取DNA的裝置，該裝置包括具有一個開口端和一個閉口端的容器，該閉口端包括允許所述容器內部和外部的液體交流的中空膜濾器；和密封所述閉口端的活動密封物。
43.根據權利要求42所述的裝置，其中所述容器是具有約2毫升體積的圓筒。
44.根據權利要求43所述的裝置，其中所述中空膜濾器是在容器內軸向延伸的單個圓筒件。
45.根據權利要求42所述的裝置，其中所述用于密封裝置的閉口端的密封物可以是一種可拔掉的金屬薄片密封物，或以螺絲配合或摩擦配合形式密封末端的蓋。
46.根據權利要求42所述的裝置，其中進一步包括在所述容器的開口端的活動密封物。
47.根據權利要求46所述的裝置，其中所述活動密封物是透氣的蓋。
48.根據權利要求42所述的裝置，其中所述容器的閉口端適于固定包括離子交換介質的過濾裝置。
49.根據權利要求42所述的裝置，其中所述裝置容器從選自于聚丙烯，聚苯乙烯和丙烯酸酯塑料制備。
50.用于培養(yǎng)細胞并且從中提取DNA的裝置，該裝置包括多個權利要求42所述裝置。
51.用于培養(yǎng)細胞并且從中提取DNA的裝置，該裝置包括多個權利要求42所述裝置的線性組合，其中每個容器是細長的圓筒。
52.根據權利要求51所述的裝置，它由8個容器構成以便與標準的8×12孔微滴板的孔相對應。
53.根據權利要求52所述的裝置，其中所述容器借助于脆性的網狀物連接。
54.根據權利要求52所述的裝置，其中一個容器的壁的至少一部分與相鄰容器的壁的至少一部分相鄰接。
55.根據權利要求52所述的裝置，其中在所述裝置組合中的每個容器的閉口端適于固定包括離子交換介質的過濾裝置。
56.用于培養(yǎng)細胞和從中提取DNA的試劑盒，該試劑盒包括至少一種選自于權利要求42，50或51任一項所述裝置。
57.根據權利要求56所述的試劑盒，進一步包括用于提取所述DNA的試劑。
58.根據權利要求56所述的試劑盒，進一步包括適于接合權利要求50或51的裝置的真空集合管。
59.根據權利要求56所述的試劑盒，進一步包括用于離子交換純化DNA的裝置。
60.根據權利要求59所述的試劑盒，其中所述離子交換裝置包括適于接合權利要求50或51的裝置的組合。
61.根據權利要求56所述的試劑盒，進一步包括直接或依次與權利要求60的離子交換裝置連接的適于接合權利要求50或51的裝置的真空集合管。
62.根據權利要求61所述的試劑盒，其中所述真空集合管適于接合標準的8×12孔的微滴板。
全文摘要
描述了用于從細胞懸液中提取DNA的方法和裝置。所述方法利用中空的膜濾器在細胞裂解后將DNA與細胞碎片分離。細胞懸液可以是培養(yǎng)的細胞或包含于體液例如血液中的細胞的懸液。在該方法中可以包括離子交換步驟以便使DNA純化。該容器具有與一個末端相結合的中空膜濾器(5)。所描述的方法可用于從細胞提取基因組DNA,特別適用于從微生物提取質粒DNA。
文檔編號C07H1/08GK1187196SQ96194606
公開日1998年7月8日 申請日期1996年6月11日 優(yōu)先權日1996年6月11日
發(fā)明者蒂莫西·馬丁·伊文斯, 羅伯特·體·唐 申請人:普羅金工業(yè)有限公司