專利名稱：胰高血糖素樣肽-2及其治療應(yīng)用的制作方法
與有關(guān)申請的相互參照本申請為1995年4月14日所提交申請(系列號08/422,540)的部分繼續(xù)申請，原申請內(nèi)容在此一并收入，以資參照。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及胰高血糖素相關(guān)性肽，這些肽具有促進(jìn)胃腸組織生長的特性。本發(fā)明還涉及這些肽的治療應(yīng)用，用于治療由于胃腸組織特別是腸組織和胰腺組織生長不良或丟失所引起的各種疾病。發(fā)明背景胰高血糖素基因的表達(dá)產(chǎn)生組織特異性不同的多種肽產(chǎn)物，這些肽產(chǎn)物來自于160個殘基的胰高血糖素原產(chǎn)物的加工過程。自
、大鼠、倉鼠和牛的胰腺制備前胰高血糖素原cDNA，并對其進(jìn)行分子克隆，已經(jīng)闡明這些肽在胰高血糖素原前體中的結(jié)構(gòu)組成。這些分析顯示，前胰高血糖素原不僅含有胰高血糖素和腸高糖素的序列，而且還含有另外兩種胰高血糖素樣肽(GLP-1和GLP-2)，兩個間隔或插入肽(IP-I和IP-II)將這兩種胰高血糖素樣肽相互隔離并將它們與胰高血糖素分開。這些肽的兩側(cè)為數(shù)對堿性氨基酸，具有典型的激素原裂解部位的特征，這表明胰高血糖素原在經(jīng)翻譯后加工之后，可將這些肽游離出來(Drucker，《胰腺)》(Pancreas)，1990，5卷4期484頁)。
例如，對從朗罕氏胰島中胰高血糖素原游離出來的肽進(jìn)行分析，表明游離的胰腺肽主要是29個氨基酸的胰高血糖素，而腸高糖素、泌酸調(diào)節(jié)素、IP-II和胰高血糖素樣肽更多見于小腸和大腸。在腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽促使人們對這些新發(fā)現(xiàn)的腸肽的精確結(jié)構(gòu)和假定功能進(jìn)行了研究。大多數(shù)研究集中在GLP-1，因為幾個方面的證據(jù)都表明GLP-1可能是一種新的重要的調(diào)節(jié)肽。確實，已經(jīng)證實GLP-1是已知最強的刺激胰島素釋放的肽能刺激物，其通過與胰腺β細(xì)胞上的受體相互作用以葡萄糖依賴方式發(fā)揮作用。對GLP-1及其衍生物在糖尿病治療方面應(yīng)用的開發(fā)正在進(jìn)行之中。
腸高糖素和泌酸調(diào)節(jié)素，即所謂的“腸道胰高血糖素”的生理作用，特別是在酸分泌調(diào)節(jié)和腸細(xì)胞生長方面的作用，也正在研究之中。泌酸調(diào)節(jié)素能抑制五肽胃泌素刺激的胃酸分泌，這種作用呈劑量依賴性。對于腸高糖素在引致腸適應(yīng)性改變及腸粘膜生長方面的作用已進(jìn)行了研究，在1994年8月31日出版的EP 612,531上Matsuno等報道了腸高糖素的腸營養(yǎng)效應(yīng)及其治療應(yīng)用。
與GLP-1和其它胰高血糖素相關(guān)性肽相比，盡管已人人類、大鼠、牛、豬、豚鼠、倉鼠和八齒鼠等種系動物中分離到多種GLP-2同源物并弄清了它們的序列，但對于胰高血糖素樣肽(GLP-2)的生理作用仍知之甚少。以人工合成的GLP-2制備抗血清，多個研究組用這種GLP-2抗血清檢測，已經(jīng)證明GLP-2主要存在于腸提取物中，而不是胰腺提取物(參見Mojsov等，《生物學(xué)和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，1986，261卷25期11880頁；Orskov等，《內(nèi)分泌學(xué))》(Endocrinology)，1986，119卷4期1467頁及《糖尿病學(xué)》(Diabetologia)，1987，30卷874頁及《FEBS通訊》(FEBSLetters)，1989，247卷2期193頁；George等，《FEBS通訊》(FEBSLetters)，1985，192卷2期275頁)。關(guān)于GLP-2的生物學(xué)作用，Hoosein等報道(《FEBS通訊》(FEBS Letters)，1984，178卷1期83頁)GLP-2既不與胰高血糖素競爭結(jié)合到大鼠肝組織和腦組織，也不刺激肝臟質(zhì)膜腺苷酸環(huán)化酶的產(chǎn)生；但難以理解的是，當(dāng)GLP-2濃度在30-50pM時就能刺激下丘腦膜和垂體膜的腺苷酸環(huán)化酶。因此，闡明GLP-2的生理作用顯得很有必要。發(fā)明概述目前已證實，GLP-2作為一種營養(yǎng)劑，促進(jìn)胃腸組織的生長。GLP-2的效應(yīng)尤以促進(jìn)小腸生長為明顯，因此，本發(fā)明將這種效應(yīng)稱之為“腸營養(yǎng)”效應(yīng)。值得注意的是，GLP-2的生長促進(jìn)效應(yīng)也表現(xiàn)在促進(jìn)胰島生長，特別是引起胰島的增大和增殖。據(jù)此，本發(fā)明總的目的是，開發(fā)GLP-2及GLP-2類似物在治療及其它相關(guān)方面的應(yīng)用。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明之一方面，提供了一種符合藥用劑型的GLP-2或GLP-2類似物，這種劑型適合于處方配藥以及隨后給病人用藥。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥用組合物，該組合物包含GLP-2或GLP-2類似物和一種藥用載體。
再另一方面，本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)胃腸組織包括小腸和胰島組織生長和增殖的方法，這種方法用于治療有這方面需要的病人，該方法包括給病人施以促進(jìn)胃腸組織生長劑量之GLP-2或GLP-2類似物的步驟。
本發(fā)明之另一方面，提供了一種用于鑒定新的腸營養(yǎng)性GLP-2類似物的方法，包括以下步驟1) 獲取一種腸營養(yǎng)性GLP-2的類似物，該類似物至少有一個氨基酸替換、缺失、增加，或一個含封閉基團(tuán)的氨基酸；2) 以該類似物治療一種哺乳動物，所用治療方案能引起如同大鼠GLP-2產(chǎn)生的腸營養(yǎng)效應(yīng)；以及3) 與模擬治療對照哺乳動物相比較，確定該類似物對小腸重量和/或腺管加絨毛高度和/或胰島大小的影響，由此，腸營養(yǎng)性肽即可視為一種類似物，其能引起上述重量和/或高度和/或大小的增加。
另一方面，本發(fā)明提供了新的GLP-2類似物，這些類似物的類型為脊椎動物GLP-2的腸營養(yǎng)性類似物。這些GLP-2類似物促進(jìn)胃腸組織包括小腸組織和胰島組織的生長和增殖。
本發(fā)明之另一方面，提供了一種方法，用該方法治療病人以修復(fù)胃腸組織，治療包括以下步驟(1)以促進(jìn)組織生長劑量的GLP-2或GLP-2類似物培養(yǎng)上述組織或細(xì)胞，而后(2)將該組織或細(xì)胞植入待治病人體內(nèi)。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)胃腸組織或細(xì)胞的方法，其包括將該組織或細(xì)胞置于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，培養(yǎng)液中添加有促進(jìn)生長劑量的GLP-2或GLP-2類似物。附圖簡述

圖1示出GLP-2劑量-效應(yīng)結(jié)果。給動物注射大鼠GLP-2，檢測其對小腸重量(BW-A圖)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ-B圖)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ-C圖)及遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI-D圖)的影響，以檢測結(jié)果與大鼠GLP-2劑量的關(guān)系制圖。
圖2示出配藥用賦形劑對GLP-2腸營養(yǎng)活性的影響。以大鼠GLP-2溶于明膠(G)或鹽水(PBS)給藥，分別檢測小腸重量(BW)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ)及遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI)。不含大鼠GLP-2的明膠溶液作為對照組(C)。
圖3示出給藥途徑對GLP-2腸營養(yǎng)活性的影響。以皮下(SC)、肌內(nèi)(IM)或腹腔(IP)注射大鼠GLP-2后，檢測小腸重量改變的百分率。標(biāo)以T的矩形條表示樣品來自用GLP-2治療的大鼠，C表示樣品來自用鹽水注射的對照組大鼠。
圖4示出給藥頻率對GLP-2活性的影響。如圖中X軸所示，給動物皮下注射PBS每12小時一次、2.5μg大鼠GLP-2每12小時一次(q12h)、5μg大鼠GLP-2每天一次(qd)或10μg大鼠GLP-2隔天一次(qod)。對于每一給藥方案，檢測小腸重量(BW)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ)及遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI)。
圖5示出GLP-2用藥時間長短對活性的影響。給動物注射5μg溶于10％明膠的大鼠GLP-2或單純注射10％明膠，每天一次，連用4周(A圖)、8周(B圖)或12周(C圖)，然后將動物處死。檢測小腸重量(BW)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ)及遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI)，通過與對照組比較判定GLP-2的治療效果。
圖6提供了GLP-2腸營養(yǎng)效應(yīng)的時間曲線。給雌性小鼠注射2.5μg溶于PBS的大鼠GLP-2，每天二次，在治療開始后不同天數(shù)處死小鼠，檢測小腸重量。同時用單純注射PBS的動物作對照。
圖7示出受試動物年齡和性別對GLP-2腸營養(yǎng)活性的影響。A圖～H圖中，4～16周齡性別匹配的GLP-2治療動物(CD1小鼠)經(jīng)用大鼠GLP-2治療后，與它們各自的對照組比較小腸重量(BW)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ)及遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI)。
圖8示出多種不同GLP-2和GLP-2類似物與對照組相比的腸營養(yǎng)效應(yīng)。A、C、E、和G圖代表小腸重量(BW)變化；B、D和F圖代表近端空腸腺管加絨毛高度(PJ)的變化。類似物的縮寫詞分別是N-acetyl(以乙?；忾]了氨基端的大鼠GLP-2肽)、Arg+1(在氨基端多含一個精氨酸殘基的大鼠GLP-2)、Arg+34(在羧基端多加了一個精氨酸殘基的大鼠GLP-2)、C-amido(以酰胺基封閉羧基端的大鼠GLP-2)、Arg+1+2(在氨基端多加了兩個精氨酸殘基)。此外，還檢測了八齒鼠GLP-2(degu)對于小鼠的腸營養(yǎng)效應(yīng)。
圖9示出大鼠GLP-2對小腸長度的腸營養(yǎng)效應(yīng)。在用GLP-2治療10天后，檢測相對于對照動物的小腸長度的增加值。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及GLP-2和GLP類似物在治療及相關(guān)方面的應(yīng)用，特別是用于促進(jìn)胃腸組織的生長和增殖，更特別的是小腸組織或胰島。對于小腸組織，這種生長可以很方便地檢測，即GLP-2引起相對于未經(jīng)治療對照組小腸在重量和長度上的增加。正如這里提供的結(jié)果所顯示的那樣，GLP-2對小腸的影響還表現(xiàn)在腺管加上絨毛長軸高度的增加。這種活性在此稱之為“腸營養(yǎng)”活性。另外還可檢測到的對GLP-2的反應(yīng)是腺管細(xì)胞的增殖和/或小腸上皮凋亡的減少。這些細(xì)胞效應(yīng)在空腸表現(xiàn)得最為明顯，包括遠(yuǎn)端空腸，而近端空腸尤為明顯，這些細(xì)胞效應(yīng)也見于遠(yuǎn)端回腸。如果一種化合物符合以下條件，即認(rèn)為這種化合物具有“腸營養(yǎng)效應(yīng)”，這些條件是，當(dāng)以該化合物治療動物時(或通過遺傳工程使動物本身表達(dá)這種化合物)，對參照GLP-2肽有反應(yīng)的脊椎動物類的實驗動物中至少有一種動物明顯表現(xiàn)出小腸重量增加、腺管加絨毛軸高度增加或腺管細(xì)胞增殖加強或小腸上皮凋亡減少。
Matsuno等(參考文獻(xiàn)出處見上)描述了一種適用于確定這種胃腸生長的模型，這一模型在以下實例1中舉例說明。GLP-2和GLP-2類似物對于小腸中腺管加絨毛軸高度的細(xì)胞效應(yīng)的形態(tài)測定分析在以下實例2中描述。
對于胰島，這種生長是通過GLP-2介導(dǎo)的相對于未治療對照組胰島增大和/或增殖來顯示。在以下實例1中舉例說明一種確定化合物的腸營養(yǎng)效應(yīng)的方法，該方法是檢測待測化合物對胰島細(xì)胞生長的影響，包括胰腺細(xì)胞的體積增大和數(shù)量增加兩方面。
術(shù)語“GLP-2肽”在此統(tǒng)指脊椎動物中天然存在的GLP-2和GLP-2天然型的類似物。GLP-2類似物能引致腸營養(yǎng)效應(yīng)，而在結(jié)構(gòu)上與某一特定脊椎動物GLP-2比較有了改變，包括至少一個氨基酸的增加、缺失、替換或引入一個或多個帶有封閉基團(tuán)的氨基酸。
例如，不同脊椎動物類型的GLP-2包括大鼠GLP-2及其同源物，包括牛GLP-2、豬GLP-2、八齒鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、倉鼠GLP-2、人GLP-2、虹鱒GLP-2和雞GLP-2。多位作者已經(jīng)報道了這些GLP-2的序列，包括Buhl等《生物學(xué)和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem)，1988，263卷18期8621頁，Nishi和Steiner，《分子內(nèi)分泌學(xué)》(Mol.Endocrinol.)，1990，4卷1192頁-1198頁，以及Irwin和Wong，《分子內(nèi)分泌學(xué)》(Mol.Endocrinol.)，1995，9卷3期267頁-277頁。這些作者報道的序列在此收入，以資參照。
根據(jù)本發(fā)明所提供的操作指導(dǎo)，脊椎動物GLP-2的類似物可用肽化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法制備并對其腸營養(yǎng)活性進(jìn)行分析。本發(fā)明特別優(yōu)選的類似物是那些根據(jù)人GLP-2序列制備的類似物，序列如下組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-異亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-丙-精-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-異亮-谷氨酰胺-蘇-賴-異亮-蘇-天冬其中一個或多個氨基酸殘基可以被另一個氨基酸殘基保守地替換，只要所產(chǎn)生的類似物仍然保持腸營養(yǎng)活性，例如脊椎動物中的小腸生長、胰島生長和/或腺管/絨毛高度增加。
任何天然存在的GLP-2中的保守性替換，優(yōu)選人GLP-2序列的保守性替換，指的是以下五組中任一組內(nèi)部氨基酸殘基的交換I丙，絲，蘇(脯，甘)II天冬酰胺，天冬，谷，谷氨酰胺III組，精，賴IV蛋，亮，異亮，纈(半胱)V苯丙，酪，色本發(fā)明還包括任何脊椎動物GLP-2序列氨基酸的非保守性替換，只要這些非保守性替換發(fā)生在這樣一些氨基酸位置，這些位置的氨基酸在不同種系動物的GLP-2是各不相同的。將所有已知的脊椎動物GLP-2序列排列起來即可很容易確定非保守殘基位置。例如，Buhl等在《生物學(xué)和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem)，1988，263卷18期8621頁比較了人、豬、大鼠、倉鼠、豚鼠和牛GLP-2序列，發(fā)現(xiàn)13、16、19、27和28位是非保守位置(位置數(shù)目參照人GLP-2序列中的類似位置)。Nishi和Steiner在《分子內(nèi)分泌學(xué)》(Mol.Endocrinol.)，1990，4卷1192頁-1198頁報道，在編碼GLP-2的序列內(nèi)另外一個位置即上述人GLP-2序列中的第20位殘基，在八齒鼠中也不同，八齒鼠是原產(chǎn)于南非的嚙齒類動物。因此，根據(jù)這個標(biāo)準(zhǔn)，在哺乳動物中有差異而可優(yōu)選地被非保守性殘基替換的氨基酸位置是13、16、19、20、27和28位。在脊椎動物中有差異并也可以被非保守性殘基替換的其它氨基酸殘基還出現(xiàn)在位置2、5、7、8、9、10、12、17、21、22、23、24、26、29、30、3 1、32和33。
或者，非保守性替換可以在任一位置進(jìn)行，只要丙氨酸掃描突變法顯示這個位置對突變具有一定的耐受性，即用丙氨酸替換這個位置的氨基酸殘基并不完全破壞腸營養(yǎng)活性。丙氨酸掃描突變技術(shù)由Cunningham和Wells在《科學(xué))》(Science)，1989，244卷1081頁描述，在此完整地收入以資參照。由于絕大多數(shù)GLP-2序列僅由大約33個氨基酸組成(而在人GLP-2，丙氨酸已經(jīng)出現(xiàn)在4個位置上)，因此，正如以下實例所指導(dǎo)的那樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易測定各剩下位置以丙氨酸替換而形成的丙氨酸類似物的腸營養(yǎng)效應(yīng)。
將脊椎動物GLP-2的已知序列排列起來，可以建立一個通用公式，該公式既考慮了這些種類GLP-2之間已知有差異的殘基，也考慮了它們有意義的序列同源性。這個公式可用于指導(dǎo)選擇特別優(yōu)選的非保守性殘基進(jìn)行替換、插入、缺失或加上氨基酸封閉基團(tuán)修飾。因此，根據(jù)本發(fā)明諸方面之一，本發(fā)明包括的脊椎動物GLP-2特別的類似物是符合于通用公式的脊椎動物GLP-2和GLP-2類似物，該通用公式作為1#序列表示如下R1-[Y]m-組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-aa1-亮-天冬-aa2-亮-丙-aa3-aa4-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-aa5-aa6-蘇-賴-異亮-蘇-天冬-[X]n-R2其中aa表示任何氨基酸殘基，aa1～aa6是從不同種類所獲得的GLP-2序列中已知有差異的那些殘基位置，而X是選自III組的一個或兩個氨基酸，如精、賴或精-精Y是選自III組的一個或兩個氨基酸，如精、賴或精-精n是0或1；n是0或1；R1是H或一個N-端封閉基團(tuán)；而R2是OH或一個C-端封閉基團(tuán)。
在本發(fā)明的數(shù)個實施方案中，aa1～aa6定義如下aa1選自IV組；aa2選自I或II組；aa3選自I組；aa4選自III組；aa5選自IV組；aa6選自II或III組。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，aa1～aa6選自一組殘基，已知該組殘基出現(xiàn)在從不同種系分離的GLP-2的相應(yīng)位置上，所示如下aa1是異亮或纈；aa2是天冬酰胺或絲；aa3是丙或蘇；aa4是賴或精；aa5是異亮或亮；而aa6是谷氨酰胺或組。
人和大鼠GLP-2之間只在19位氨基酸殘基上有差別。在人的序列，該位殘基是丙氨酸；而在大鼠GLP-2，19位是蘇氨酸。因此，本發(fā)明所包括的特別的GLP-2或GLP-2類似物在19位含有一個可變殘基。在本發(fā)明的這些實施方案中，GLP-2肽符合以下所示的2#序列R1-[Y]m-組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-異亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-aa3-精-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-異亮-谷氨酰胺-蘇-賴-異亮-蘇-天冬-[X]n-R2。其中aa3、Y、m、X、n、R1和R2的定義同上述。
在本發(fā)明的具體實施方案中，GLP-2肽選自1)大鼠GLP-2，如下所示的3#序列組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-異亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-蘇-精-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-異亮-谷氨酰胺-蘇-賴-異亮-蘇-天冬；2)人GLP-2，它是大鼠GLP-2蘇19變?yōu)楸?9的等同物，如下所示組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-異亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-丙-精-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-異亮-谷氨酰胺-蘇-賴-異亮-蘇-天冬；3)八齒鼠GLP-2，它是大鼠GLP-2[異亮13變纈13、天冬酰胺16變組16、賴20變精20]的等同物；和4)GLP-2和GLP-2類似物，其加上了一個N-端封閉基團(tuán)和/或N-端殘基延伸如精或精-精；和/或加上了一個C-端封閉基團(tuán)和/或C-端殘基延伸如精或精-精。
“封閉基團(tuán)”以R1和R2表示，它們是肽化學(xué)領(lǐng)域常規(guī)應(yīng)用的化學(xué)基團(tuán)，其賦予肽生化穩(wěn)定性和對外源肽酶消化的抗性。例如，合適的N-端保護(hù)基團(tuán)包括C1-5鏈烷?；缫阴；?。失去了氨基功能的氨基酸類似物也適于作為N-端保護(hù)基團(tuán)。合適的C-端保護(hù)基團(tuán)包括能在C-端羧基的碳原子上形成酮或酰胺的基團(tuán)，或者在羧基的氧原子上形成酯的基團(tuán)。酮和酯形成基團(tuán)包括烷基基團(tuán)，特別是分支或不分支C1-5烷基基團(tuán)，例如，甲基、乙基和丙基。而酰胺形成基團(tuán)包括氨基官能團(tuán)如初級胺，或烷氨基功能團(tuán)，例如單C1-5烷氨基和雙C1-5烷氨基基團(tuán)如甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、甲基乙基氨基等。氨基酸類似物也適于保護(hù)本化合物的C-末端，例如脫羧氨基酸類似物如胍丁胺。
選作促進(jìn)胃腸組織生長特殊形式的GLP-2可以通過熟知的制備肽產(chǎn)物的各種技術(shù)進(jìn)行制備。當(dāng)然，脊椎動物各形式的GLP-2的獲得，可以運用蛋白質(zhì)分離技術(shù)的適當(dāng)組合，從天然來源中提取。如Buhl等(參考文獻(xiàn)出處見上述)描述的那樣，豬GLP-2可以從回腸粘膜的酸-乙醇提取物中分離和純化，采用體積篩選和基于HPLC的分餾方法的組合，并用針對人工合成胰高血糖素原126-159的抗體監(jiān)測分餾產(chǎn)物。作為GLP-2提取法的一種替代方法，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以制備商業(yè)量的這些形式的GLP-2，這些GLP-2不管是脊椎動物GLP-2還是其類似物，均只含L-氨基酸。為此目的，將編碼所需GLP-2或GLP-2類似物的DNA插入一種表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化微生物(如酵母)或其它細(xì)胞宿主，然后在適合于GLP-2表達(dá)的條件下培養(yǎng)。多種基因表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)改造以適應(yīng)此目的，典型的是，通過所選宿主天然采用的表達(dá)調(diào)控來驅(qū)動所需基因的表達(dá)。因為GLP-2不需翻譯后糖基化即已具有活性，因此其制備可以很方便地在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中完成。對于這種制備，編碼選定GLP-2肽的DNA由大腸桿菌的乳糖、色氨酸或PL基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)進(jìn)行有效調(diào)控。除了編碼GLP-2本身的DNA表達(dá)外，另一可供選擇的方式是，對宿主進(jìn)行改造，使其表達(dá)的GLP-2肽是一種融合蛋白，此融合蛋白為GLP-2連接上一種載體蛋白，載體蛋白使表達(dá)產(chǎn)物易于分離并且增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，GLP-2還能從融合蛋白中游離出來。
在一種普遍適用于制備選定GLP-2或GLP-2類似物的方法和一種用于制備含非遺傳編碼氨基酸及N-端和C-端修飾形式的GLP-2肽的方法中，所采用的是很成熟的自動肽合成技術(shù)，其詳細(xì)描述見于J.M.Stewart和J.D Young，《固相肽合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)，第2版，1984，Pierce Chemical Company， Rockford，Illinois；以及M.Bodanszky和A.Bodanszky，《肽合成實踐》(ThePractice of Peptide Synthesis)，1984，Springer-Verlag，NewYork；和《應(yīng)用生物系統(tǒng)430A肽合成儀用戶手冊》(Applied Biosystems430A Users Manual)，1987，ABI Inc.，F(xiàn)oster City，California。在這些技術(shù)中，GLP-2肽自其C-端延伸，即C-端殘基結(jié)合在樹脂上，順次加入用Fmoc或tBoc方案適當(dāng)保護(hù)的氨基酸，如同Orskov等，1989(參考文獻(xiàn)出處同上述)所描述的那樣。
為了摻入N-端和/或C-端封閉基團(tuán)，采用了固相肽合成方法的常規(guī)方案。例如，為了摻入C-端封閉基團(tuán)，典型的方案是，先將作為固相的支持樹脂進(jìn)行化學(xué)修飾，再進(jìn)行所需肽的合成，這樣從樹脂上裂解下來的便是具有所需C-端封閉基團(tuán)的GLP-2。例如，為獲得C-端帶初級氨基封閉基團(tuán)的肽，用對甲芐基羥胺(p-methylbenzhydrylamineMBHA)樹脂進(jìn)行肽合成，如此，當(dāng)肽合成完成時，用氫氟酸處理即釋放出所需C-端酰胺化的肽。類似地，用N-甲氨基乙基修飾的DVB樹脂可以在C-端摻入N-甲胺封閉基團(tuán)，經(jīng)HF處理釋放出帶有N-甲酰胺化C-端的肽。運用常規(guī)方法也可以達(dá)到通過酯化作用保護(hù)C-端的目的，這需要應(yīng)用樹脂/封閉基團(tuán)的組合，這種組合允許側(cè)鏈保護(hù)的肽自樹脂上釋放下來，允許用所需的醇進(jìn)行隨后的反應(yīng)，形成酯官能團(tuán)。FMOC保護(hù)基團(tuán)與經(jīng)甲氧烷氧苯基醇或同類連接劑修飾的DVB樹脂的組合，可用于此目的，通過以二氯甲烷配制的TFA處理使肽自支持物上裂解出來。對于經(jīng)適當(dāng)活化的羧基官能團(tuán)的酯化作用，如用DCC，可以通過加入所需的醇來進(jìn)行，然后去保護(hù)并分離酯化的GLP-2肽。
在合成的GLP-2肽還仍然連接在樹脂上的時候，就可以摻入N-端封閉基團(tuán)，例如用合適的酐和腈進(jìn)行處理。例如，為了在N-端摻入乙酰封閉基團(tuán)，偶聯(lián)于樹脂的肽可用以乙腈配制的20％乙酸酐進(jìn)行處理。然后，將N-端封閉的GLP-2肽從樹脂上裂解下來、去保護(hù)以及隨后進(jìn)行分離。
一旦所需的GLP-2肽合成完畢，從樹脂上裂解下來并經(jīng)充分去保護(hù)，即可對該肽進(jìn)行純化以保證回收到一條具有選定氨基酸序列的單一寡肽?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法之任一種進(jìn)行純化，包括反相高壓液相層析(RP-HLPC)，所用柱子為烷化的二氧化硅柱，如C4-、C8-或C18-二氧化硅。這種柱分餾通常用線性梯度洗脫，例如10％～90％逐漸增加有機溶劑如乙腈，有機溶劑以水緩沖液配制，通常含少量(如0.1％)的緩沖配對劑如TFA或TEA。另一種純化方法是基于不同的肽種類所帶電荷性質(zhì)不同，用離子交換HPLC將它們分離。收集層析的各組份，將那些含有所需/要求純度肽的組份任選地合并。本發(fā)明的一個實施方案中，隨后GLP-2肽的處理按既定方式進(jìn)行，即裂解酸(如TFA)換成符合藥用要求的酸如乙酸、鹽酸、磷酸、順丁烯二酸、酒石酸、琥珀酸等，以制備符合藥用的肽的酸性鹽制劑。
作為病人用藥，本發(fā)明之一方面提供了符合藥用型的GLP-2肽或其鹽類，例如作為一種無菌過濾(如通過0.22μ濾膜)制劑并基本上無致熱原。在HPLC上遷移成單一或單獨的峰，經(jīng)分析顯示為均一正確的氨基酸組成和順序，而且還符合各個國家藥用產(chǎn)品質(zhì)量管理部門所制定的標(biāo)準(zhǔn)，這才是合乎要求的可用作處方配藥的GLP-2肽。
作為治療應(yīng)用，所選擇的GLP-2或GLP-2類似物以載體配制，所用載體符合藥用要求并適合于通過所選擇的給藥途徑運送并釋放肽。合適的符合藥用的載體是那些常規(guī)用于肽類藥物的載體，如稀釋劑、賦形劑等。對于藥物配制的一般性指南，參見《雷明頓藥物科學(xué)》(“Remington′s Pharmaceutical Sciences”)，第17版，MackPublishing Company，Easton，Penn.，1985。在本發(fā)明的一個實施方案中，這些化合物被配制作為輸注給藥，例如用作胃腸外全營養(yǎng)治療病人的液體營養(yǎng)添加劑；或者作為注射給藥，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈注射。相應(yīng)地這些化合物配制成無菌無致熱原的水溶液，并有選擇地將酸堿度調(diào)至生理可耐受的pH值，如微酸或生理性pH。因此，這些化合物可以用以下載體配制后給藥，例如蒸餾水，或者更為合乎要求地，用鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或5％葡萄糖溶液配制。如果必要，通過加入一種溶解度增加劑如乙酸可以提高GLP-2或GLP-2類似物的水溶性。
在水性載體或媒介物中加入一定量的明膠作為注射劑，可使GLP-2或GLP-2類似物在注射部分或附近蓄積，因而使其緩慢釋放至所需的作用部位。達(dá)到蓄積效應(yīng)的有效明膠濃度要求在10-20％的范圍。其它的膠化劑如透明質(zhì)酸也可用作蓄積劑。
本發(fā)明的各種GLP-2和GLP-2類似物也可以配制成緩慢釋放的植入性制劑，如此達(dá)到GLP-2持續(xù)給藥和延長給藥時間的目的。這種持續(xù)釋放制劑的例子包括生物相容性多聚體的混合物，例如多聚乳酸、多聚乳糖合羥基乙酸、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原等。數(shù)篇發(fā)表的文章對作為藥物傳遞載體的可降解多聚體的結(jié)構(gòu)、選擇和應(yīng)用都作了綜述，包括A.Domb等的《用于先進(jìn)工藝的多聚體》(Polymers forAdvanced Technologies)，3卷279頁-292頁(1992)。另外，在藥物制備中選擇和應(yīng)用多聚體的指南還見于刊登于M.Chasin和R.Langer編的《藥物和制藥科學(xué)》(“Drugs and the PharmaceuticalSciences”)45卷的文章《作為藥物傳遞系統(tǒng)的生物可降解多聚體》(“Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems)，M.Dakker，New York，1990。脂質(zhì)體也可用于GLP-2或GLP-2類似物的持續(xù)性釋放用藥，有關(guān)如何應(yīng)用和制備所感興趣藥物的脂質(zhì)體制劑的細(xì)節(jié)見于以下其它專利美國專利4,944,948號；美國專利5,008,050號；美國專利4,921,706號；美國專利4,927,637號；美國專利4,452,747號；美國專利4,016,100號；美國專利4,311,712號；美國專利4,370,349號；美國專利4,372,949號；美國專利4,529,561號；美國專利5,009,956號；美國專利4,725,442號；美國專利4,737,323號；美國專利4,920,016號。當(dāng)需要提供局部高濃度的GLP-2或GLP-2類似物時，例如在胰腺附近高濃度GLP-2或GLP-2類似物以促進(jìn)胰腺生長用于治療糖尿病等，這種情況下應(yīng)用持續(xù)釋放制劑具有特別重要意義。
為了用于刺激哺乳動物包括人類小腸生長或胰島細(xì)胞的增殖和增多，本發(fā)明在其多個方面之一方面提供了一種包裝，這種包裝為無菌封裝的小瓶或安瓿，含有單位劑量或多劑量的促進(jìn)組織生長劑量的GLP-2或GLP-2類似物，該包裝還附有一張標(biāo)鑒說明其內(nèi)容物用于促進(jìn)上述組織的生長。在本發(fā)明的一個實施方案中，作為即用型制劑，該包裝含有GLP-2或GLP-2類似物和所要求的載體。而根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該包裝提供的是需進(jìn)一步配制的GLP-2或GLP-2類似物劑型，例如凍干劑型，其需用適當(dāng)?shù)妮d體如磷酸鹽緩沖鹽水現(xiàn)配藥物。
在一個實施方案中，該包裝是無菌封裝的小瓶或安瓿，含有一種注射用溶液，該溶液包含一種溶于水性載劑的有效腸營養(yǎng)劑量GLP-2或GLP-2類似物。
除了注射用制劑，GLP-2或GLP-2類似物還可制備成其它途徑用藥的制劑?？诜┬腿缙瑒?、膠囊等可按照標(biāo)準(zhǔn)的制藥常規(guī)制備。
根據(jù)本發(fā)明，GLP-2或GLP-2類似物用于治療那些會獲益于胃腸組織生長的病人。一方面，治療候選者是那些會獲益于小腸組織生長的病人。正如本發(fā)明的實施例結(jié)果表明的那樣，GLP-2對這種組織的效應(yīng)非常顯著，很顯然這對于那些患有以小腸粘膜異常為特征的疾病或疾病狀態(tài)的病人大有益處，這些疾病或疾病狀態(tài)包括潰瘍和炎癥性疾病；先天性或獲得性消化和吸收疾病包括吸收不良綜合征；以及由于腸粘膜功能喪失所導(dǎo)致的疾病和疾病狀態(tài)，特別是接受長期胃腸外給養(yǎng)的病人或者那些因接受腸切除外科手術(shù)而患了短腸綜合征和盲管綜合征的病人。對這些伴有腸道粘膜功能降低的病人實施GLP-2肽治療，目的是減輕或消除疾病的癥狀。例如，GLP-2或GLP-2類似物用于患腸道炎癥的病人，所用劑量應(yīng)足以改善因炎癥狀態(tài)所致的腸道不適和腹瀉。此外，GLP-2或GLP-2類似物可以用于吸收不良癥病人，以促進(jìn)營養(yǎng)吸收，從而改善這些病人的營養(yǎng)狀況。
一般來說，那些會獲益于小腸量的增加而小腸粘膜功能隨之增強的病人是應(yīng)用GLP-2或GLP-2類似物治療的候選者?？梢杂肎LP-2治療的特殊疾病狀態(tài)包括各種類型的口炎性腹瀉，這些類型包括小麥中α-麥膠蛋白所致毒性反應(yīng)引起的腹瀉，其特點是腸道絨毛大量丟失；感染引起的熱帶口炎性腹瀉，其特點是絨毛部分變平；低丙種球蛋白性腹瀉，這種腹瀉常見于患常見的可變型免疫缺陷病或低丙種球蛋白血癥的病人，其特點是絨毛高度明顯降低。GLP-2治療效果的檢驗可通過腸活檢檢查絨毛形態(tài)學(xué)、生化檢測營養(yǎng)吸收狀況、病人體重增加或這些疾病狀態(tài)相關(guān)癥狀的改善。其它可以用GLP-2或GLP-2類似物治療或者GLP-2或GLP-2類似物可能起到預(yù)防作用的疾病狀態(tài)，包括放射性腸類、感染或感染后腸炎、局限性腸炎(Crohn′s病)、毒物或其它化療制劑所致的小腸損傷，以及患腸短綜合征的病人。
另一方面，應(yīng)用GLP-2或GLP-2類似物治療的候選者是那些會獲益于胰島生長，特別是胰島增大或增殖或再生的病人。這些病人包括患了以胰島缺乏或減少或者胰島功能降低為特點的疾病或疾病狀態(tài)的病人。特別的治療候選者是那些患1型或2型糖尿病的病人，以及由于胰腺浸潤、炎癥或破壞引起繼發(fā)型糖尿病的病人。用于治療這些病人的GLP-2或GLP-2類似物的劑量應(yīng)足以恢復(fù)至少部分胰腺功能、增高內(nèi)源性胰島素水平和改善病人癥狀。
用于病人治療最合適的治療劑量和方案當(dāng)然因所治疾病或疾病狀態(tài)而異，而且應(yīng)根據(jù)病人體重和其它參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明下面提供的結(jié)果顯示，GLP-2或GLP-2類似物的劑量相當(dāng)于約2.5mg/kg(或更低，參見下述)、每天用藥兩次、療程超過10天可以明顯增加小腸重量及腺管/絨毛高度特別是近端空腸腺管/絨毛高度?？梢灶A(yù)料，更低劑量如在μg/kg范圍和更短或更長療程或治療次數(shù)增多，也將獲得有效的治療結(jié)果，即小腸重量的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義。作為人用的最適劑量大小和給藥方案可以本發(fā)明提供的結(jié)果作指導(dǎo)，并經(jīng)嚴(yán)格設(shè)計的臨床試驗進(jìn)一步確定。
有效的劑量和治療方案可用經(jīng)典方法來確定，在實驗動物從低劑量開始，然后在監(jiān)測治療效果的同時逐漸加大劑量，以及全面變更劑量方案。當(dāng)臨床醫(yī)生為某一特定病人確定最佳劑量時，他要充分考慮許多因素，其中最主要的因素是血漿中正常循環(huán)的GLP-2量，靜止?fàn)顟B(tài)下GLP-2正常值在151pmol/ml左右，而健康成人在攝入營養(yǎng)物后，該正常值升高至225pmol/ml。Orskow，C.和Helst，J.J.，1987，《斯堪的納維亞臨床和實驗研究雜志》(Scand.J.Clin.Lav.Invest.)47卷165頁。其它因素包括病人高矮、年齡、一般狀況，正在治療的特殊疾病，疾病的嚴(yán)重性，是否正在用著其它藥物，GLP-2肽的體內(nèi)活性，等等。在考慮了動物研究結(jié)果和臨床文獻(xiàn)資料后，選定一個試驗劑量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在計算劑量時還應(yīng)考慮象GLP-2結(jié)合常數(shù)和Ki值這樣一些資料，這些資料是從體外GLP-2競爭結(jié)合試驗中獲得的。
GLP-2肽典型的人用劑量是約10μg/kg體重/天～約10mg/kg/天，優(yōu)選約50μg/kg/天～約5mg/kg/天，最優(yōu)選約100μg/kg/天～約1mg/kg/天。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于已確定為候選病人的治療方法，這種治療采用細(xì)胞植入法，待植入的細(xì)胞首先在體外或體內(nèi)經(jīng)GLP-2或GLP-2類似物孵育或處理作適應(yīng)性培養(yǎng)，或者待植入的細(xì)胞經(jīng)基因工程操作使其自身產(chǎn)生GLP-2或GLP-2類似物。離體細(xì)胞的適應(yīng)性培養(yǎng)可以簡單地將待移植的細(xì)胞或組織培養(yǎng)在已經(jīng)添加有促進(jìn)生長量的GLP-2或GLP-2類似物的培養(yǎng)基中，另外這種培養(yǎng)基要適合于培養(yǎng)這些細(xì)胞。在經(jīng)過適當(dāng)時間的適應(yīng)性培養(yǎng)后，這些細(xì)胞被直接植入病人體內(nèi)，或者用已經(jīng)成熟的細(xì)胞包囊技術(shù)將這些細(xì)胞包入膠囊后再植入病人體內(nèi)。
本發(fā)明還有一個方面，包括體內(nèi)應(yīng)用GLP-2肽治療動物，以促進(jìn)小腸組織生長或增加胰島細(xì)胞的大小或數(shù)目。在小腸和/或胰島增大后，這些組織可用作異種移植。因為在將非人動物組織移植到人的異種移植中，移植器官或組織的大小往往是移植成功的限制因素，因此，在進(jìn)行異種組織移植之前對動物進(jìn)行這樣的GLP-2肽治療很有益處。例如，用GLP-2肽治療供體動物豬，以增加小腸體積，之后，將豬的小腸組織移植到需要這種器官的人身上。
另外，待移植的這些細(xì)胞可以在體外從一個細(xì)胞擴增培養(yǎng)起來，這個細(xì)胞先經(jīng)遺傳工程操作使其表達(dá)或高表達(dá)胰高血糖素基團(tuán)，或更直接地，表達(dá)僅編碼GLP-2的DNA。從選定的GLP-2的氨基酸序列很容易確定這種DNA的序列，但其局限性是這種方式只能產(chǎn)生含遺傳編碼氨基酸的GLP-2類型。多種適合于將遺傳信息導(dǎo)入人類細(xì)胞的病毒載體可以采用，將編碼GLP-2的DNA插入病毒載體中使其處于表達(dá)調(diào)控區(qū)的調(diào)節(jié)下，這些表達(dá)調(diào)控能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能。一旦經(jīng)過遺傳改變，便可應(yīng)用本領(lǐng)域已建立的方法將這些遺傳工程細(xì)胞移植至病人體內(nèi)。實例1在第一個實驗中研究了腸高糖素對小腸生長的影響，兩組小鼠(8周齡，CD1雌性，獲自Charles River實驗室)，每組6只鼠，按以下方法進(jìn)行治療。給每只小鼠皮下注射0.5cc含41.5μg肽的16％明膠溶液，每12小時一次，連續(xù)10天。腸高糖素(大鼠)易溶于10ml水。對照組小鼠只注射0.5cc 16％明膠溶液，不含肽，每12小時一次。小鼠以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料喂養(yǎng)，給小鼠自由進(jìn)食和飲水，小鼠處死前12小時開始撤出食物而僅給飲水。為稱取小腸重量，切下全部小腸，然后除去胃(近端)和闌尾/盲腸/大腸(遠(yuǎn)端)。剩下的小腸用鹽水清洗以除去糞便，然后稱重。結(jié)果如下<
>
以上結(jié)果表明，腸高糖素的腸營養(yǎng)效應(yīng)不明顯，為此進(jìn)行了第二個實驗，用同樣的方案研究其它胰高血糖素原基因編碼產(chǎn)物的效果，包括GLP-1和GLP-2。為此目的，采用基于tBoc的固相方法人工合成3#序列的大鼠GLP-2和人GLP-1(7-36酰胺)。分析顯示大鼠GLP-2純度為95％，分析方法用分析性HLPC(10mg/ml的樣品20μl；Vydac C18柱5μl；0.1％TFA/20-60％CH3CN洗脫超過20分鐘，洗脫速率1.5ml/分)。
用作注射的GLP-2制劑按下法配制明膠溶于溫水中使其重量比濃度為16％，50ml這種溶液經(jīng)高壓蒸汽滅菌并冷卻至室溫。另外單獨制備肽溶液，即5mg GLP-2于稍少于10ml的水中混勻，然后加入1N乙酸(10～20μl)使肽完全溶解。之后，加入等量的1N NaOH(10～20μl)將pH調(diào)至約7.0，再加入蒸餾水將溶液的體積補足10ml。為配制用作注射的制劑，將10ml肽溶液和50ml 16％明膠溶液混勻，用0.5ml胰島素用小注射器抽取注射所用量。同樣的方法用于配制GLP-1，不同的是由于GLP-1在水中的溶解度相對較高，因此無需酸/堿調(diào)節(jié)。
以不含或含肽(62.5μg/劑量)的0.5ml 16％明膠，給小鼠注射，4組每組4只(8周齡，CD1雌性，獲自Charles River實驗室)，每天注射2次，連續(xù)10天。結(jié)果列表如下
以上結(jié)果表明，與不用肽的對照組比較，以及與用另一種胰高血糖素相關(guān)肽GLP-1治療的實驗組比較，GLP-2組在劑量約2.5mg/kg(640nmole/kg)，每天治療2次連續(xù)10天后，顯示小腸重量的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。與這里提供的腸高糖素的結(jié)果比較，也很清楚GLP-2是其中一個主要的腸組織生長因子。
對4只GLP-2治療小鼠和4只對照組小鼠的胃腸器官作切片檢查，以進(jìn)一步研究GLP-2用藥對這些小鼠的效果，所用方法為石蠟包埋切片和標(biāo)準(zhǔn)的組織病理技術(shù)。通過形態(tài)測定分析法測量胰島面積。蘇木素和伊紅染色切片用作定量分析。對每張切片均測量其總的胰腺面積和總的胰島面積。所得資料顯示，在對照組胰島面積平均是總胰腺面積的0.31％。相比之下，GLP-2治療組的胰島面積占總胰腺面積的0.70％，表明在GLP-2治療組胰島面積增加了2倍多。除了胰島的大小外，還觀察到胰島的數(shù)目也增多。實例2GLP-2肽對小腸生長的影響被進(jìn)一步研究，特別是評價組織反應(yīng)與劑量、時間、給藥途徑和給藥頻率、制劑類型以及受治者性別年齡之間的關(guān)系。這些效應(yīng)的檢測不僅通過小腸重量的增加來反映，還通過腺管和絨毛高度的增加來反映。
為了這些目的，大鼠GLP-2的制備如實例3所述。這種大鼠GLP-2以磷酸鹽緩沖鹽水配制，或者配制為含明膠的蓄積制劑。用磷酸鹽緩沖鹽水配制GLP-2肽的方法如下首先配制10×PBS貯存液，即稱取80g NaCl(BDH ACS 783)、2g KCl(BDH ACS 645)、11.5gNa2HPO4(Anachemia AC-8460)和2g KH2PO4(Malinckrodt AR7100)，這些試劑溶于無菌蒸餾水，總體積為1升。最終工作液的配制是用無菌蒸餾水將貯存液作10∶1稀釋，如有必要再用數(shù)毫升10NNaOH(氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH至7.3-7.4。然后將工作液高壓蒸汽滅菌30分鐘。最終的PBS工作液中，各種試劑的濃度為137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4·7H2O和1.4mM KH2PO4。
PBS配制GLP-2肽的制備方法是，按所需配制的肽濃度將肽的粉劑加入BPS工作液。例如，要配制濃度為130mg/L肽的PBS溶液，4.2mgGLP-2溶于40ml PBS中即得到GLP-2濃度為130μg/ml。一只小鼠的給藥劑量是2.5mg/kg的話，大約注射這種溶液0.5ml，一天2次。
明膠制劑的制備方法是，首先配制明膠溶液，即將12克明膠(Sigma，G-8150批號#54HO7241A型從豬皮膚制備[9000-70-8]-300Bloom)溶于100ml蒸餾水。而后將明膠溶液高壓蒸汽滅菌，保溫于37℃，然后將GLP-2肽加入而得到含所需特定肽濃度的溶液，其中GLP-2肽按上述方法預(yù)先溶于磷酸鹽緩沖鹽水。將GLP-2的PBS制劑與按剛才所述方法配制的明膠溶液混合，即制備成所需GLP-2濃度的GLP-2明膠制劑。例如，要配制濃度為130mg/L GLP-2的明膠制劑，用4.2毫克GLP-2制備10ml GLP-2的PBS溶液，將此溶液以30ml按上法配制的20％明膠工作液稀釋。通過用吸液管輕輕抽吸將溶液混勻，便得到GLP-2終濃度為130mg/L含15％明膠的PBS溶液。
同實例1，受試者是CD1小鼠，獲自Charles River實驗室(Ontario，Canada)。除非特別指明，CD1小鼠是年齡匹配的雌鼠(每組n＝3～4)，在注射藥物時的年齡為6周齡。在開始每次實驗之前，先讓動物有一段適應(yīng)實驗室環(huán)境的時間，這段適應(yīng)時間不少于24小時。用耳朵打孔法給動物標(biāo)號。在整個實驗過程中，不限制小鼠的飲食或活動。光/黑循環(huán)為12小時，在晚6點～早6點之間。絕大多數(shù)注射用12％明膠或PBS作為載劑。對照組為年齡和性別匹配的動物(n＝3～4)，僅注射單純PBS或明膠制劑。每種肽配制成特定濃度，溶于0.5cc載劑中。肽通過皮下注射給藥，小鼠被每日照管在實驗室。藥物注射開始后14天處死動物，處死前20～24小時讓動物禁食。
小鼠以CO2麻醉并通過心臟穿刺放血。血液收集于75μl TED(Trasyool；EDTA(5000KIU/ml1.2mg/ml；Diprotin-A)，血液于14k×g離心5分鐘，吸取血漿置-70℃保存待分析。從腹腔中切取小腸，部位為自幽門至盲腸，清洗切下的小腸，稱重并測量長度。為便于比較，各只動物的組織切片均取自同一解剖部位。從距離幽門8±2cm、18±2cm、32±2cm處切取1.5～2.0cm長的腸段分別代表近端空腸、遠(yuǎn)端空腸和遠(yuǎn)端回腸，用于組織形態(tài)學(xué)檢查。將各小腸腸段置于組織臺上，沿其腸系膜緣縱向切開，然后放入10％福爾馬林(體積/體積)過夜，之后轉(zhuǎn)移至70％乙醇。
為做顯微測量和形態(tài)測定分析，特別是評價GLP-2對腺管/絨毛高度的影響，組織切片切成5μm厚并以蘇木素和伊紅染色。用帶攝象機的顯微鏡(Leitz，Wetzar，Germany)進(jìn)行腸的顯微測量，顯微鏡的攝象機與計算機顯示器連接。顯微鏡的放大倍率校到4×、10×、25×，用同一顯微鏡進(jìn)行所有顯微測定。為測量腺管加絨毛高度，每張近端空腸、遠(yuǎn)端空腸和遠(yuǎn)端回腸的切片至少檢查20條縱向絨毛，測量自腺管基底至絨毛頂端的距離，結(jié)果以μm±S.E.M表示。
各項分析結(jié)果示于所附圖1～7和圖9，參照這些圖，現(xiàn)將結(jié)果概述如下劑量反應(yīng)圖1示大鼠GLP-2皮下給藥劑量與治療反應(yīng)的關(guān)系。大鼠GLP-2配成12％明膠制劑(即GLP-2在PBS中)，檢測指標(biāo)為小腸重量(BW-A圖)、近端空腸腺管加絨毛高度(PJ-B圖)、遠(yuǎn)端空腸腺管加絨毛高度(DJ-C圖)和遠(yuǎn)端回腸腺管加絨毛高度(DI-D圖)。大鼠GLP-2肽通過皮下注射給藥。結(jié)果以相對于對照組的變化百分率表示，對照組僅接受12％明膠載劑注射。星號表示與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義的差別(*＝p＜0.005，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001)。從圖1所示結(jié)果可以看出，GLP-2肽注射的劑量為1.0～5.0μg時所引起小腸重量的增加有統(tǒng)計學(xué)意義。而對于腺管/絨毛高度，劑量低至0.25μg時仍能獲得所需要的效果。制型的影響圖2示用GLP-2的明膠制劑(G)或PBS制劑(PBS)給藥的結(jié)果，GLP-2的劑量為2.5μg，皮下給藥，每天2次。A圖示對于小腸重量(以克計)影響的差別，B圖示對于近端空腸(PJ)、遠(yuǎn)端空腸(DJ)和遠(yuǎn)端回腸(DI)的腺管/絨毛高度(以μm表示)影響的差別?？梢钥闯鰞煞N劑型引起以上檢測指標(biāo)的增加均具有統(tǒng)計學(xué)意義?？赡苡捎诿髂z制劑能使GLP-2從注射部位以一種更持續(xù)的方式釋放，其引起的反應(yīng)要比PBS制劑稍微強些。給藥途徑的影響圖3示大鼠GLP-2以皮下注射(SC)、肌內(nèi)注射(IM)或腹腔內(nèi)注射(IP)給藥引起腸重量(BW)增加的百分率，大鼠GLP-2以磷酸鹽緩沖鹽水載劑配制，劑量為2.5μg，每天2次?？梢钥闯?，與只接受PBS載劑皮下注射的對照組比較，不管選擇何種給藥途徑，GLP-2肽均能引起明顯反應(yīng)。皮下注射引致的反應(yīng)最強。給藥頻率的影響圖4示評價小腸重量和腺管/絨毛高度與GLP-2給藥頻率之間關(guān)系的結(jié)果。GLP-2按所標(biāo)示劑量皮下給藥，每12小時一次(q12h)、每天一次(qd)或隔天一次(qod)。從所示結(jié)果可以看出，與只接受單純PBS的對照組比較，所有的給藥頻率均引起小腸重量變化百分率明顯增加。對小腸重量和腺管/絨毛高度增加最多的是最頻繁的給藥方式，即每12小時一次。長期用藥的影響大鼠GLP-2以10％明膠配制，皮下給藥，每天一次單一劑量5μg，連續(xù)用藥4周(A圖)、8周(B圖)或12周(C圖)。圖5示與只接受10％明膠的對照組(C)比較，治療組(T)GLP-2介導(dǎo)的對小腸重量(BW)及腺管加絨毛高度(PJ、DJ和DI)的效應(yīng)。小腸重量結(jié)果表明，GLP-2介導(dǎo)的小腸重量增加可以出現(xiàn)在用藥期間內(nèi)并持續(xù)存在于所檢查的整個用藥期，近端空腸腺管/絨毛高度的結(jié)果也是如此。類似的反應(yīng)也見于遠(yuǎn)端空腸。對所有動物在處死時進(jìn)行了徹底的尸檢，沒有發(fā)現(xiàn)任何一只動物有組織學(xué)異常。時間曲線評價圖6示CD1雌性小鼠經(jīng)單純PBS(對照組)或2.5μg大鼠GLP-2PBS制劑皮下給藥治療小腸重量變化百分率。給藥方式為每天2次，按圖中所標(biāo)示天數(shù)連續(xù)用藥。結(jié)果清楚表明，經(jīng)用藥4天后即可獲得明顯效果，隨著繼續(xù)用藥這種效果持續(xù)存在。另外的研究還清楚表明，GLP-2用藥所獲得的小腸重量增加在停止治療約10天后退回原水平。但GLP-2對于絨毛的增生效應(yīng)并不完全消退，特別是在老齡鼠(24月齡)，這表明在這些老齡受試者腸組織更新率比較慢。因此，在GLP-2治療期間有必要給受試者以維持劑量的GLP-2。受試者性別和年齡評價圖7示4～16周齡性別匹配的CD1小鼠以2.5μgGLP-2每天給藥2次治療的結(jié)果，在小腸重量和組織學(xué)兩方面與它們各自的對照組比較。從所示結(jié)果可以看出，GLP-2對小腸的效應(yīng)與受試者的性別無關(guān)。在一個相關(guān)的實驗中，以GLP-2治療年齡為6月～2歲的C57BLK雌性小鼠(Charles River，U.S.)，發(fā)現(xiàn)GLP-2對于6個月～2歲齡的小鼠均能有效地促進(jìn)小腸生長。GLP-2對小腸長度影響的評價圖9示GLP-2用藥對小腸長度的影響。CD1小鼠以PBS(對照組)或大鼠GLP-2的PBS制劑治療(2.5μg，每天2次)10天，處死小鼠，測量自胃至回盲瓣間的小腸長度，以厘米表示。
在GLP-2治療中觀察到的絨毛延長可能源自GLP-2對細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng)或抑制細(xì)胞衰老。為檢驗這兩種可能性，檢查了刺激組和對照組小腸組織的石蠟切片，檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)作為增殖指標(biāo)，而用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞以作凋亡分析。GLP-2治療小鼠近端空腸的增值率高于對照小鼠(124％)(對照組為46.0±1.2％；治療組為57±5.5％)。在對照組小鼠，增殖局限于小腸的腺管部；絨毛不含PCNA陽性細(xì)胞。在GLP-2治療組，在絨毛和腺管-絨毛軸的交接處均可檢測到增殖細(xì)胞。GLP-2治療組小鼠近端空腸凋亡率比對照組小鼠低。在對照組小鼠凋亡細(xì)胞主要見于絨毛頂端或側(cè)緣；腸的腺管部無凋亡細(xì)胞可見。在GLP-2治療組小鼠，凋亡細(xì)胞的分布相似，但它們的數(shù)目少得多。實例3鑒于大鼠GLP-2用于受試小鼠所觀察到的結(jié)果，推測各種脊椎動物的大鼠GLP-2同源物和類似物也能介導(dǎo)腸營養(yǎng)效應(yīng)。為此目的，人工合成了多種GLP-2和GLP-2類似物并對它們的活性進(jìn)行評價，如下所述。
在300毫升(ml)的容器中按3毫克分子(mmole)的規(guī)模手工進(jìn)行固相肽合成(SPPS)，所用固相為6克(g)氯甲基(Merrifield)樹脂(用于C端游離酸的肽)，每克取代0.5毫當(dāng)量(meq)。在氨基端以叔丁氧羰基(tBoc)基團(tuán)保護(hù)氨基酸。氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)采用芐基(Bz，用于絲氨酸和蘇氨酸)、芐氧甲基(BOM，用于組氨酸)、2-溴芐氧羰基(2-BrZ，用于酪氨酸)、2-氯芐氧羰基(2-ClZ，用于賴氨酸)、環(huán)己基(cHex，用于天冬氨酸和谷氨酸)，以及甲苯磺酸基(Ts，用于精氨酸)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和氯甲基(Merrifield)樹脂。在含氟酸鉀(KF)的條件下，通過保護(hù)氨基酸的酯化作用將第一個氨基酸與氯甲基樹脂偶連。對于C-端酰胺肽的合成，固相載體用4-甲芐基羥胺(MBHA)樹脂，即用6g樹脂，每克取代0.5毫當(dāng)量，按3mmol的規(guī)模合成。按照下述肽延伸的方法將第一個氨基酸與MBHA樹脂偶連。
用以CH2Cl2配制的50％三氟乙酸(TFA)使氨基去保護(hù)，然后用CH2Cl2配制的10％三乙胺(Bt3N)洗滌2次進(jìn)行中和。用CH2Cl2/二甲基甲酰胺(DMF)配制的N，N-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCC/HOBt)使肽延伸。延長中的肽鏈在每一步延伸之后都用溶于二氯甲烷(CH2Cl2)的20％乙酐(Ac2O)蓋帽。在每個延伸、蓋帽和去保護(hù)步驟之后，肽-樹脂用異丙醇(iPrOH)和甲醇(MeOH)洗滌。洗滌重復(fù)一次。N-端乙酰肽的制備是通過用溶于CH2Cl2的20％Ac2O使末端氨基乙酰化。樹脂連接產(chǎn)物用含二甲基硫醚(DMS)和對甲苯酚作清潔劑的氟化氫通過由低到高的程序進(jìn)行常規(guī)裂解。
肽的粗制品經(jīng)制備型高壓液相層析(HPLC)純化，用Vydac C18、15反相二氧化硅柱，孔徑20μm寬，2英寸×12英寸，用乙腈修飾水配制的0.1％TFA進(jìn)行梯度洗脫。以220毫微米(nm)波長監(jiān)測洗脫過程。所收集的各組份用分析性HPLC進(jìn)行純度分析，即用Vydac C18反相二氧化硅柱，5μm，4.6×254毫米(mm)，用乙腈修飾水配制的0.1％TFA進(jìn)行梯度洗脫并以215nm波長監(jiān)測。純度大于95％的組份合在一起進(jìn)行冷凍干燥。從肽的TFA鹽制備肽的乙酸鹽有以下步驟將凍干粉劑溶于水，必要時加入乙腈以助溶。溶液通過質(zhì)子化的Bio-Rex 70陽離子交換樹脂。該樹脂以5倍柱床體積的水洗滌，之后用以水配制的50％乙酸將樹脂所結(jié)合的肽洗脫下來，洗脫物用水稀釋并冷凍干燥。
最終的凍干粉劑通過兩次分析性反相HPLC方法分析其純度，所用柱子為Vydac C18反相二氧化硅柱，5μm，4.6×254mm。所用的兩種溶劑系統(tǒng)是，以三乙胺磷酸鹽調(diào)節(jié)pH至2.25的乙腈修飾水梯度和乙腈修飾并含0.1％TFA的水梯度。層析柱洗脫物在215nm波長處監(jiān)測。各產(chǎn)物通過氨基酸分析和電噴霧質(zhì)譜分析證實。
通過這種方法，本發(fā)明制備了以下GLP-2或GLP-2類似物的乙酸鹽a)3#序列的大鼠GLP-2；b)N-乙酰大鼠GLP-2，其中大鼠GLP-2的氨基端被乙?；忾]；c)[Arg+1]大鼠GLP-2，其為在氨基端額外加上一個精氨酸殘基修飾的大鼠GLP-2；d)C-酰胺大鼠GLP-2，其為在羧基端加上一個酰胺基的大鼠GLP-2(溶解1mg需用1％乙酸(110μl)，再以450μl 2N NaOH中和)；e)[Arg+1+2]大鼠GLP-2，其為在氨基端額外加上兩個精氨酸殘基修飾的大鼠GLP-2；f)[Arg+34]人GLP-2，其為在33位殘基之后加上一個精氨酸殘基的人GLP-2；以及g)八齒鼠GLP-2。除另指明外，這些肽在室溫下完全溶于水。
按實例2所述的方法對這些GLP-2′s和GLP-2類似物的腸營養(yǎng)效應(yīng)進(jìn)行了評價。特別地，肽以PBS配制，每次注射劑量0.5ml含2.5μg，給CD1雌性小鼠皮下注射，每12小時一次，連用10天或14天。與模擬劑(單純PBS)治療小鼠比較腸重量和腺管絨毛高度。
這些實驗的結(jié)果示于圖8。通過將化學(xué)基團(tuán)加到氨基端對GLP-2進(jìn)行修飾，特別是[N-乙酰]-GLP-2，或額外在N-端加上氨基酸，[Arg+1]-GLP-2，或者加到羧基端，如[Arg+34]-GLP-2，由此產(chǎn)生的GLP-2衍生物仍然在體內(nèi)顯示有小腸生長因子的特性，例如在小鼠14天的實驗中(圖8，A圖～F圖)促進(jìn)小腸生長和增加腺管加絨毛高度(與鹽水治療對照組比較)。此外，利用各種種系GLP-2樣相關(guān)分子的序列信息，也可制備具有有效的小腸生長因子樣特性的GLP-2相關(guān)分子。例如，八齒鼠GLP-2序列在小鼠的10天實驗中也顯示小腸生長因子樣活性，其對小腸重量的增加幾乎與大鼠GLP-2的效果相當(dāng)(兩種肽均是皮下給藥，2.5μg，每天2次)。這項資料表明，對GLP-2肽結(jié)構(gòu)的這些修飾，如這里所示，產(chǎn)生的分子在體內(nèi)仍顯示天然GLP-2樣特性。與此相反，當(dāng)該分子的羧基端區(qū)域被加入氨基封閉基團(tuán)修飾時，[C-酰胺]-GLP-2，所產(chǎn)生的肽在體內(nèi)無明顯的GLP-2生物學(xué)活性(圖8C-D)。
上面所寫就的說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。誠然，分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然能對上述實施本發(fā)明的方法進(jìn)行各種改良，但這些改良仍將屬于下述權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般資料(i)申請人Drucker，Daniel J(ii)發(fā)明題目胰高血糖素樣肽-2及其治療應(yīng)用(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)收件人Pannie &amp; Edmonds(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市New York(D)州N.Y.
(E)國家U.S.A(F)郵政編碼10036-2711(v)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBM兼容的個人計算機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PetentIn Release #1.0，version #1.25(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類(ix)電訊資料(A)電話(202)638-5000(B)電傳(202)638-4810(2)1#序列資料(i)序列特性(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置13(D)其它資料/注＝“一種中性/極性/大/非芳香族氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置16(D)其它資料/注＝“一種中性/極性氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置19(D)其它資料/注＝“一種中性氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置20(D)其它資料/注＝“一種中性氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置27(D)其它資料/注＝“一種中性/極性/大/非芳香族氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置28(D)其它資料/注＝“一種中性或堿性氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置34(D)其它資料/注＝“一種選自精氨酸、賴氨酸或精-賴氨酸鏈的氨基酸”
(xi)序列表述1#序列組 丙 天冬 甘絲 苯丙 絲 天冬 谷 蛋 天冬酰胺 蘇1 510Xaa 亮 天冬 Xaa 亮 丙 Xaa Xaa 天冬 苯丙 異亮1520天冬酰胺 色 亮 Xaa Xaa 蘇 賴 異亮 蘇 天冬 Xaa2530(2)2#序列資料(i)序列特性(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置19(D)其它資料/注＝“一種中性氨基酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾部位(B)位置34(D)其它資料/注＝“一種選自精氨酸、賴氨酸或精-賴氨酸鏈的氨基酸”(xi)序列表述2#序列組 丙 天冬 甘 絲 苯丙 絲 天冬 谷 蛋 天冬酰胺 蘇1 5 10異亮 亮 天冬 天冬酰胺 亮 丙 Xaa 精 天冬 苯丙 異亮15 20天冬酰胺 色 亮 異亮 谷氨酰胺 蘇 賴 異亮 蘇 天冬25 30Xaa(2)3#序列資料(i)序列特性(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ii)序列表述3#序列組 丙 天冬 甘 絲 苯丙 絲 天冬 谷 蛋 天冬酰胺 蘇1 5 10異亮 亮 天冬 天冬酰胺 亮 丙 蘇 精 天冬 苯丙 異亮15 20天冬酰胺 色 亮 異亮 谷氨酰胺 蘇 賴 異亮 蘇 天冬25 30
權(quán)利要求
1.一種藥用組合物，包含一種GLP-2肽和一種符合藥用要求的載體，GLP-2肽選自脊椎動物GLP-2或脊椎動物GLP-2的腸營養(yǎng)性類似物，后者與脊椎動物GLP-2的不同之處在于其具有至少一個氨基酸的增加、缺失、替換或含N-端或C-端氨基酸封閉基團(tuán)的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用組合物，其中GLP-2肽符合公式R1-[Y]m-組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-aa1-亮-天冬-aa2-亮-丙-aa3-aa4-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-aa5-aa6-蘇-賴-異亮-蘇-天冬-[X]n-R2其中aa1、aa2、aa3、aa4、aa5或aa6指任一氨基酸殘基，而X是選自III組的一個或兩個氨基酸；Y是選自III組的一個或兩個氨基酸；m是0或1；n是0或1；R1是H或一個N-端封閉基團(tuán)；而R2是OH或一個C-端封閉基團(tuán)。
3.權(quán)利要求2的藥用組合物，其中aa1選自IV組；aa2選自I或II組；aa3選自I組；aa4選自III組；aa5選自IV組；aa6選自II或III組；
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥用組合物，其中GLP-2肽的氨基酸序列是R1-[Y]m-組-丙-天冬-甘-絲-苯丙-絲-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-蘇-異亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-aa3-精-天冬-苯丙-異亮-天冬酰胺-色-亮-異亮-谷氨酰胺-蘇-賴-異亮-蘇-天冬-[X]n-R2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用組合物，其中GLP-2肽是一種脊椎動物GLP-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中GLP-2肽是大鼠GLP-2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中GLP-2肽是人GLP-2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用組合物，其中GLP-2的用量能發(fā)揮腸營養(yǎng)效應(yīng)。
9.一種促進(jìn)腸組織生長的方法，用于有這方面需要的病人，其包括給病人施以權(quán)利要求8的藥用組合物的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的藥用組合物，其中GLP-2肽的用量能有效地促進(jìn)胰島生長。
11.一種促進(jìn)胰島生長的方法，用于有這方面需要的病人，其包括給病人施以權(quán)利要求10的藥用組合物的步驟。
12.一種符合藥用要求的GLP-2肽的酸加成鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的符合藥用要求的GLP-2肽酸加成鹽，其中所說的GLP-2肽是一種脊椎動物GLP-2肽。
14.一種用于鑒定新的腸營養(yǎng)性肽的方法，包括以下步驟a)獲取一種腸營養(yǎng)性脊椎動物GLP-2肽的類似物，該類似物至少有一個氨基酸替換、缺失、增加，或一個含封閉基團(tuán)的氨基酸；b)以該類似物治療一種哺乳動物，所用治療方案能引起如同大鼠GLP-2產(chǎn)生的腸營養(yǎng)效應(yīng)；以及c)與模擬治療對照組哺乳動物相比較，確定該類似物對小腸重量和/或腺管加絨毛高度和/或胰島大小的效應(yīng)，由此，該腸營養(yǎng)性肽即被鑒定為一種類似物，其能引起上述重量和/或高度和/或大小的增加。
15.一種治療病人以修復(fù)胃腸組織的方法，該胃腸組織取自胰島和腸組織，該方法包括以下步驟細(xì)胞以含GLP-2肽的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，之后，將細(xì)胞植入上述病人體內(nèi)。
16.一種治療胃腸疾病的方法，其中胃腸疾病選自這樣一組疾病，這組疾病是潰瘍病、消化紊亂、吸收不良綜合征、短腸綜合征、盲管綜合征、炎癥性腸病、非熱帶性口炎性腹瀉、熱帶口炎性腹瀉、低丙種球蛋白血癥性口炎性腹瀉、腸炎、局限性腸炎(Crohn′s病)、毒物或其它化療制劑所致的小腸損傷以及腸短綜合征，而且其中該方法包括給患胃腸疾病的病人施以治療有效劑量的GLP-2或GLP-2類似物，以減輕胃腸疾病的病理影響或癥狀，GLP-2或GLP-2類似物與符合藥用要求的載體在一起用藥。
17.一種治療糖尿病的方法，包括給患糖尿病的病人施以治療有效劑量的GLP-2或GLP-2類似物，以增加病人的胰島素水平，GLP-2或GLP-2類似物與符合藥用要求的載體在一起用藥。
全文摘要
胰高血糖素基因表達(dá)的一種產(chǎn)物胰高血糖素樣肽－2和胰高血糖素樣肽－2的類似物已被鑒定為胃腸組織生長因子。本文介紹了它們對小腸和胰島生長的作用。本文也介紹了它們的藥用制劑及它們在治療腸紊亂方面的治療應(yīng)用。
文檔編號C07K14/605GK1188485SQ96194693
公開日1998年7月22日 申請日期1996年4月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月14日
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