專利名稱：新的a1腺苷受體興奮劑和拮抗劑的制作方法
本申請是1994年10月28日申請的申請順序號為08／330，640的待審申請的繼續(xù)申請；它也是1993年10月28日申請的申請順序號08／144，459(現(xiàn)為美國專利號5，446，046)的申請的繼續(xù)申請。
腺苷是一種由身體中的所有細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外信使物質(zhì)。腺苷本身具有重要的臨床應(yīng)用，一方面表現(xiàn)腺苷的作用，另一方面又中和其作用。在心臟(其功能關(guān)鍵依賴于供氧充足的一種器官)中，腺苷可調(diào)節(jié)供氧(冠狀血流)與需氧(心臟工作)之間的平衡。從工作中的心臟細(xì)胞釋放的腺苷通過冠脈擴(kuò)張增加供氧，并通過減慢心率和調(diào)節(jié)β-腎上腺素能的興奮作用來減少氧消耗。當(dāng)心臟的供氧有限如冠狀動脈狹窄時，腺苷的保護(hù)性作用是極為重要的。
最近的幾件文獻(xiàn)對腺苷系統(tǒng)進(jìn)行了詳細(xì)描述(Belardinelli，L．，J．Linden，R．M．BerneProg．Cardiovasc．Dis．32∶73-97；Belardinelli，L．，A．PellegJ．Cardiovasc．Elecrrophysiol．1∶327-339；Olsson，R．A．，J．D．PearsonPhysiol．Rev．70761-845)。心臟的腺苷系統(tǒng)包括三個部分(1)腺苷生成的機(jī)制；(2)腺苷受體和將其與效應(yīng)體結(jié)合的蛋白質(zhì)；以及(3)去除腺苷的機(jī)制。通過使用如腺苷受體拮抗劑和腺苷吸收抑制劑藥物的一種或多種這些系統(tǒng)的選擇性變化，可以改進(jìn)對治療有利的腺苷的作用。
當(dāng)需氧大于供氧時，腺苷生成增加，這樣促進(jìn)了腺苷核苷酸的降解。從神經(jīng)末梢和神經(jīng)介質(zhì)釋放的腺苷酸的降解以及S-腺苷高半胱氨酸(甲基化反應(yīng)的副產(chǎn)物)的降解是心臟腺苷的又一來源。心肌和冠狀血管細(xì)胞吸收幾乎所有由心臟產(chǎn)生的腺苷，并使腺苷重?fù)饺氲郊?xì)胞的核苷酸庫中。
至少有兩種類型的受體介導(dǎo)心臟腺苷的作用。例如，A1腺苷受體(A1AR)通過減慢心率以減少氧消耗，A2腺苷受體(A2AR)通過使血管舒張而增加供氧。腺苷對心臟細(xì)胞的作用可以是直接的(cAMP-非依賴性)或是間接的(cAMP依賴性)。直接作用包括對AV結(jié)的負(fù)變導(dǎo)性效應(yīng)。這些電生理學(xué)效應(yīng)是腺苷的抗心率失常特性的基本原理；腺苷對控制陣發(fā)性室上心搏過速(PSVT)極為有效(＞90％)。興奮劑刺激的(但不是根本的)腺苷酸環(huán)化酶活性的A1AR介導(dǎo)的抑制作用構(gòu)成腺苷的間接作用。而腺苷的直接作用出現(xiàn)在沒有興奮劑時，通過腺苷環(huán)化酶起作用，間接作用反映了當(dāng)受到比如β-腎上腺素能興奮劑的刺激時這些酶的抑制作用。
許多采用選擇性受體興奮劑的藥理學(xué)研究支持A2ARs介導(dǎo)冠狀血管舒張這一觀點。雖然內(nèi)皮細(xì)胞含有A2ARs，因而在血管舒張中發(fā)揮作用，但它們不是必需的，因為腺苷可作用于冠狀血管平滑肌細(xì)胞，使之松弛。
當(dāng)腺苷用作藥物時，它的副作用通常只是短暫的，表現(xiàn)為其在體內(nèi)極為快速的降解(秒)。在PSVT的診斷和治療中腺苷的安全性現(xiàn)已很明確了。阻止腺苷類似物的治療進(jìn)展的一個重要因素是腺苷作用于各種組織時普遍存在的特點。
有兩種藥物根據(jù)它們是否增強(qiáng)或減弱核苷酸的作用來改變腺苷的作用。細(xì)胞膜核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑阻止腺苷從細(xì)胞外去除，這樣就使?jié)舛壬吡藦亩鰪?qiáng)了它的作用。腺苷吸收阻滯劑也抑制人類紅細(xì)胞和心細(xì)胞膜的核苷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，增強(qiáng)狗的腺苷的心臟作用。
甲基黃嘌呤能完全拮抗腺苷與A1AR和A2AR的結(jié)合。某些天然產(chǎn)的甲基黃嘌呤如咖啡因和茶堿可拮抗腺苷的心血管作用。例如，給已服用茶堿的病人服用腺苷，不會產(chǎn)生AV阻斷和PSVT停止。然而，那些甲基黃嘌呤對實驗動物和人的腺苷的電生理和血管舒張效應(yīng)的拮抗作用相對較弱，且更為重要的是它是非選擇性的。茶堿也能改善腺苷的非心臟效應(yīng)如潮紅、局部疼痛以及呼吸興奮。
合成的烷基黃嘌呤如8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(CPX；見美國專利號4，364，922和4，980，379)是較茶堿或咖啡因在A1AR上明顯更為有效的選擇性拮抗劑。
本發(fā)明是有關(guān)某些能與腺苷受體結(jié)合并具有極強(qiáng)的親和力、專一性和選擇性的新化合物的發(fā)明。在此特別強(qiáng)調(diào)的是包含環(huán)氧化物的黃嘌呤和腺苷類似物。本文更詳細(xì)指出了這些腺苷興奮劑和拮抗劑在許多臨床應(yīng)用(包括心臟和腎臟的調(diào)節(jié))中具有治療作用。其中這些新化合物既是腺苷興奮劑，又是腺苷拮抗劑。
本發(fā)明的一個實施方案中，將新化合物1，3-二丙基-8-{3-噁三環(huán)[3．1．2．02，4]辛-6(7)-基}黃嘌呤(在此稱作ENX)用作腺苷拮抗劑。突出的是，已發(fā)現(xiàn)ENX是唯一有效、專一且高度選擇性的A1腺苷受體。將ENX化合物的特殊對映異構(gòu)體用于合成和測驗其相對活性。ENX的R-和S-對映異構(gòu)體的試驗揭示了S-對映異構(gòu)體的優(yōu)點，即較其外消旋物或R-對映異構(gòu)體而言，對A1AR的選擇性更強(qiáng)，更有效。但是，由于R-對映異構(gòu)體的生物半衰期較短，它可在需要短期產(chǎn)生作用的一定的治療應(yīng)用中更為有益。
本發(fā)明還涉及其它在環(huán)外取代基中含環(huán)氧化物的黃嘌呤和腺苷。本發(fā)明更進(jìn)一步的實施方案包括可用作腺苷的興奮劑或拮抗劑并具有治療作用的含ENX的組合物和制劑，或它們的類似物或衍生物。
本發(fā)明另一方面涉及使用這些已公開的調(diào)節(jié)腺苷的生物活性的化合物的方法。這些化合物或含此化合物的組合物，可以用來調(diào)節(jié)腺苷，例如作為腺苷受體的興奮劑或拮抗劑的效應(yīng)。本化合物的這種拮抗劑活性可用于治療腺苷含量升高的疾??；當(dāng)需要腺苷受體的刺激時此興奮劑便起作用了。這些疾病包括(但不限于此)心、腎、肝或肺疾病，如心率失常、腎衰、肝功能衰竭腹水和哮喘。調(diào)節(jié)腺苷活性也可用于治療成人初始糖尿病。
還發(fā)現(xiàn)一些N6-取代的腺苷化合物也具有象A1腺苷受體興奮劑一樣的活性?，F(xiàn)已合成了N6-(5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷的外-和內(nèi)-兩種外消旋異構(gòu)體，它們都是A1腺苷受體的有效且高度選擇性的興奮劑。制備這些化合物時，通過最佳的庫爾提斯重排可以合成并得到外-和內(nèi)-降冰片基胺。
合成本發(fā)明化合物的新方法也已作了描述，這也是本發(fā)明的一部分。


圖1是概述了合成含環(huán)氧化物部分、具有C-8取代基的1，3-二丙基黃嘌呤的反應(yīng)圖解。
圖2是用二甲基二環(huán)氧乙烷合成含環(huán)氧化物部分的腺苷衍生物的反應(yīng)圖解(反應(yīng)圖解1)。反應(yīng)圖解1用特定的外-或內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯合成相應(yīng)的腺苷衍生物的外-或內(nèi)-異構(gòu)體。圖2(反應(yīng)圖解1)還顯示了降冰片烯與?；?偏-氯苯甲酸)的氧化過程，這是已公認(rèn)的氧化反應(yīng)，但可導(dǎo)致嘌呤的N-1位的氧化。
圖3表示(2R)-和(2S)-及(2S)-內(nèi)-5-降冰片烯-2-羧酸的合成。
圖4A-4D表示ENX對腺苷(Ado)的負(fù)變導(dǎo)性(S-H間期延長)效應(yīng)的選擇性拮抗作用。圖4A-4B表示在有或無0．4μM ENX存在時輸注腺苷(4μM)3分鐘所導(dǎo)致的S-H間期延長(A1反應(yīng)，圖4A)和冠脈傳導(dǎo)增強(qiáng)(A2反應(yīng)，圖4B)的模擬記錄。ENX抑制腺苷的負(fù)變導(dǎo)性效應(yīng)，但不會拮抗由腺苷所致的冠狀血管舒張(冠脈傳導(dǎo)增強(qiáng))。圖4C-4D表示ENX(0．4μM)對腺苷(4μM)引起的A1受體介導(dǎo)的S-H間期增加(而不是A2受體介導(dǎo)的冠狀血管舒張)的選擇性拮抗作用。這些值是從五只幾內(nèi)亞豬心臟得到的平均數(shù)±SEM。星號表示這些值與腺苷本身相比具有顯著性差異(P＜0．05)。
圖5A-5D表示ENX對左室壓力(LVP)和dP／dtmax不產(chǎn)生作用。幾內(nèi)亞豬心臟前房以300毫秒的不變周期搏動，并出現(xiàn)逐漸較高的ENX濃度，如2和200μM。在同樣的心臟中，僅ENX不會引起對其束間期刺激的顯著變化(未表示)。在其它三個心臟中得到完全相同的結(jié)果。
圖6表示ENX和異丁基黃嘌呤(IBMX)對DDT1MF-2細(xì)胞勻漿的磷酸二酯酶(PDE)活性的作用。IBMX的數(shù)據(jù)在圖中以方塊表示，它清楚地表明了磷酸二酯酶活性的抑制作用。與此相對照，給予ENX后的磷酸二酯酶的活性(在圖中以圓圈表示)保持不變，沒有出現(xiàn)抑制作用。
圖7表示ENX拮抗幾內(nèi)亞豬心臟中腺苷的負(fù)變導(dǎo)性效應(yīng)(S-H延長)的專一性作用。測定了ENX(2nM，2μM)對由腺苷(ADO，4μM)，鎂(Mg2+，3mM)和碳酰膽堿(CCh0．14μM)而致的類似S-H延長所產(chǎn)生的作用。每一條線圖的高度代表四個實驗的平均值±SEM。僅僅腺苷引起S-H間期延長受到ENX的拮抗。
圖8表示靜脈內(nèi)給予0．1mg／kg ENX(外消旋的)混合物、ENX(R-對映異構(gòu)體)、ENX(S-對映異構(gòu)體)以及用賦形劑作為對照時大鼠總的尿排出量。
圖9A-9B表示合成外-或內(nèi)-5-降冰片-2-烯或內(nèi)／外-5-降冰片-2-烯鹽酸鹽的可選擇的兩個圖。圖中符號說明(ⅰ)KNCS，H2SO4；(ⅱ)NaOH；(ⅲ)SOCl2／ClC(O)OEt，NEt3；(ⅳ)NaN3，H2O，△(ⅴ)TFA；(ⅵ)K2CO3；(ⅶ)NaN3；H2O，2M HCl／CCl4。圖9A是在此之前未描述的圖；圖9B是制備外-5-降冰片-2-烯的標(biāo)準(zhǔn)圖。
本發(fā)明涉及新的化合物，含這些化合物的制劑，以及合成這些化合物的方法。本發(fā)明的化合物或組合物可優(yōu)先用作腺苷受體的興奮劑或拮抗劑。特別是，這些化合物既能促進(jìn)又可拮抗由A1腺苷受體(A1AR)介導(dǎo)的負(fù)變導(dǎo)性、變時性、變力性效應(yīng)。在心臟中，這些化合物既能促進(jìn)又可拮抗由A1AR介導(dǎo)的負(fù)變導(dǎo)性、變時性、變力性效應(yīng)，而在腎臟中，拮抗劑通過A1AR促進(jìn)排尿。
本發(fā)明化合物有兩種常見類型(1)包含環(huán)氧化物(環(huán)氧乙烷基)部分、含C-8取代基的1，3-二烷基黃嘌呤，和(2)包含環(huán)氧化物部分、含N-6取代基的腺苷。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，黃嘌呤環(huán)氧化物是環(huán)氧化物部分以共價鍵與黃嘌呤的C-8取代基結(jié)合的1，3-二烷基黃嘌呤。優(yōu)選的黃嘌呤或腺苷的環(huán)氧化物是那些以環(huán)氧化物部分作為環(huán)外取代基的環(huán)氧化物。
1，3-二烷基黃嘌呤的一級通式如下式Ⅰ所示
其中R1和R2可以相同或不同，可以是長為1-4C的烷基；n=0-4。還應(yīng)清楚R1和／或R2可以是H。有一個R基團(tuán)是H、另一個R基團(tuán)是烷基的化合物為烷基黃嘌呤的環(huán)氧化物；兩個R基團(tuán)均為烷基的化合物為二烷基黃嘌呤的環(huán)氧化物。
1，3-二烷基-8-噁三環(huán)烷基黃嘌呤的通式如下面式Ⅱ所示
其中R1和R2可以相同或不同，可以是H或1-4C的烷基；R3可以是O或1-4C的烷基；n=0-4。
長為1-4C的聚亞甲基鏈可將環(huán)氧化物部分與1，3-二甲基黃嘌呤的C-8相連接，如式1所示。環(huán)氧化物基團(tuán)也可是直接或通過長1-4C的(聚)亞甲基與黃嘌呤部分的C-8相連的環(huán)外取代基的一部分，如式Ⅱ所示。式Ⅱ所示的環(huán)外取代基可以是二環(huán)烷基(形成噁三環(huán)烷基取代基)。其它環(huán)外環(huán)氧化物結(jié)構(gòu)也可以是此化合物的組成部分，根據(jù)本說明書公開的內(nèi)容，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很容易知道的。二環(huán)烷基可進(jìn)一步含有鏈烯基以形成第二個環(huán)氧化物部分。
圖1描繪的是8-取代的1，3-二丙基黃嘌呤的總合成圖。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是化學(xué)名為1，3-二丙基-8-{3-噁三環(huán)[3．1．2．02，4]辛-6(7)-基}-黃嘌呤的化合物，通常稱作環(huán)氧降冰片基黃嘌呤或ENX。ENX的通式如下面式Ⅲ所示
已證實ENX作為腺苷拮抗劑具有非常優(yōu)越且未料想的特性，即對A1腺苷受體的高度選擇性和親和力。實際上，患有任何內(nèi)源性腺苷水平過量的疾病的病人，都可從使用本發(fā)明拮抗劑化合物或含此化合物的組合物治療得到改善。例如，本發(fā)明涉及利用本拮抗劑化合物作為利尿劑或治療腎衰。另外，本發(fā)明拮抗劑化合物或含這些化合物的組合物可用于治療一些影響心臟的疾病，包括伴有缺氧或局部缺血(心肌梗塞形成)的心律緩慢，病竇結(jié)綜合征，還可用于心衰，其中拮抗劑的正變導(dǎo)性效應(yīng)可起作用。其它由內(nèi)源性腺苷的水平升高而導(dǎo)致或受此影響的疾病也可用本發(fā)明腺苷拮抗劑治療。
本發(fā)明化合物如ENX所具有的對A1腺苷受體的高度選擇性和親和力，使得它們特別適用于作為利尿劑。已證實ENX作為利尿劑的效能至少與速尿(Lasix)(人類和動物醫(yī)學(xué)常用的利尿劑)的效能一樣強(qiáng)。因此，應(yīng)該清楚，使用ENX的方式與速尿?qū)Σ∪水a(chǎn)生利尿作用的使用方式可以進(jìn)行比較。
ENX所具有的利尿活性可用于治療一些通常影響哺乳動物特別是人類的疾病。例如，充血性心力衰竭(CHF)就是一種廣泛使用利尿劑的疾病。高血壓(通常是CHF的并發(fā)癥)也經(jīng)常用利尿劑治療。已知ENX與目前市售的用于治療這些疾病的利尿劑如Lasix的利尿活性和效能具有可比性。因此，本發(fā)明化合物特別是ENX可以按治療這些疾病的同樣方式使用。
本發(fā)明腺苷拮抗劑也可稱作腎保護(hù)性化合物。已知與A1腺苷受體結(jié)合的ENX，在使用已知的腎中毒性的對照劑期間可用來阻斷那些受體，或用于中和一些抗菌素(如慶大霉素、兩性霉素或環(huán)孢菌素)的腎中毒性作用的治療中。
此外，本發(fā)明A1腺苷拮抗劑如ENX可用于治療肝功能衰竭腹水。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很清楚，進(jìn)行治療方案的某些修改，ENX也是適用的，可用于治療肝功能衰竭的非移植病人，移植前病人，或患肝腎綜合征的移植病人。
作為腺苷A1受體抑制劑和利尿劑的這些活性表明本發(fā)明拮抗劑化合物如ENX也可用作止痛劑，特別是用于治療心絞痛、跛行和伴有局部缺血、缺氧或reperfusion的心律緩慢。另外，已知外源性地使用腺苷用于心臟診斷過程(比如，假設(shè)心臟脈管系統(tǒng))時會產(chǎn)生短暫的包括疼痛在內(nèi)的副作用。由于這些副作用是因為腺苷與A1受體(而不是A2受體)的結(jié)合和對它的刺激而致，因此抑制腺苷與A1受體結(jié)合的腺苷拮抗劑可用來消除接受診斷過程的病人所經(jīng)受的疼痛。抑制腺苷結(jié)合的本發(fā)明化合物(包括ENX)選擇性地與A1腺苷受體結(jié)合(這樣阻止或消除了因腺苷與A1受體結(jié)合而致的任何副作用)。
而且，本發(fā)明拮抗劑化合物(包括ENX)可用作支氣管擴(kuò)張藥，比如止喘藥。已知ENX可松弛氣管平滑肌，這樣產(chǎn)生支氣管擴(kuò)張。其它很弱的黃嘌呤衍生物如茶堿也通常具有這種特性。本發(fā)明拮抗劑化合物用作止喘治療的這種用途表明此化合物經(jīng)吸入途徑給藥時也是有效的。
也可使用本發(fā)明化合物的其它給藥途徑。例如，通常根據(jù)適用于所治療疾病的最佳途徑來決定如何給予該化合物。因此，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，很清楚本化合物可以通過靜脈內(nèi)，口服，經(jīng)皮等方式給藥，以單劑量或多劑量方式給藥。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還知道本發(fā)明化合物的上述用途可以通過使用具有不同的生物活性的特殊異構(gòu)體而達(dá)到最佳。已知含手性中心的ENX至少存在兩種對映異構(gòu)體形式。采用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，已將ENX對映異構(gòu)體(即S-對映異構(gòu)體和R-對映異構(gòu)體)合成為5-降冰片烯-2-羧酸的R-異構(gòu)體和S-異構(gòu)體。參見Poll，T．et al．(1985)Tetrahedron Lett．26∶3095-3098，和Poll，T．et al．(1989)Tetrahedron Lett．30∶5595-5598．ENX的內(nèi)-R-和內(nèi)-S-對映異構(gòu)體分別如式Ⅳ和Ⅴ所示。
對ENX的兩種對映異構(gòu)體的研究表明，與A2AR相比這兩種異構(gòu)體對A1AR具有選擇性。S-對映異構(gòu)體較R-對映異構(gòu)體具有更長的作用周期。雖然R-和S-對映異構(gòu)體的外消旋混合物可具有其中一種或同時具有兩種異構(gòu)體的生物活性。現(xiàn)已知S-異構(gòu)體和R-異構(gòu)體可分別用作單一的對映異構(gòu)體，以產(chǎn)生任意一種對映異構(gòu)體的特別有利的活性。
例如，ENX的外消旋混合物所表現(xiàn)的生物活性約有80-90％是屬于S-對映異構(gòu)體的。這種結(jié)果主要是由于與S-對映異構(gòu)體所具有的作用周期相比，R-對映異構(gòu)體的活性周期非常短。S-對映異構(gòu)體的延長作用是由于在肝中的清除速度較慢，比如，被酶系統(tǒng)(如細(xì)胞色素P450)代謝性降解較慢。S-對映異構(gòu)體與R-對映異構(gòu)體相比，表現(xiàn)出稍強(qiáng)的體外效能，實際上它具有更高的體內(nèi)效能，并且與A2受體相比，它對A1腺苷受體的選擇性更高。參見實施例4比較ENX的S-和R-對映異構(gòu)體的選擇性和親和力特性的特殊數(shù)據(jù)。
S-對映異構(gòu)體具有的突出特性(如，增強(qiáng)的效能(體外和體內(nèi))和較高的選擇性，以及較長的作用周期)表明S-對映異構(gòu)體作為動物和人的利尿劑是非常有用的。在大多數(shù)情況下，如上面舉例說明的，S-對映異構(gòu)體是優(yōu)選的化合物，這是因為它的活性周期較R-對映異構(gòu)體更長，可關(guān)鍵性地發(fā)揮作用。換句話說，本化合物至少應(yīng)產(chǎn)生足以達(dá)到預(yù)期結(jié)果的作用。
另一方面，在需要短期作用的情況下，如靜脈內(nèi)注射腺苷或心肌短暫缺血發(fā)作時，當(dāng)出現(xiàn)腺苷水平快速升高且僅短時間持續(xù)時(以秒或分計)可以優(yōu)先使用具有短期作用的腺苷拮抗劑，例如ENX的R-對映異構(gòu)體。ENXR-對映異構(gòu)體的活性短時期有效。但是ENX的R-對映異構(gòu)體易快速降解或代謝。由于ENX的R-對映異構(gòu)體的濃度迅速下降，這種快速代謝可以防止藥物相互作用所導(dǎo)致的并發(fā)癥。由于ENX的R-對映異構(gòu)體的止痛特性，它可以用于心絞痛的急性疼痛。
具有短期作用的本發(fā)明化合物的另一個應(yīng)用是作為止喘藥或支氣管擴(kuò)張藥。已經(jīng)有人提出，ENX的S-對映異構(gòu)體具有強(qiáng)的生物活性是由于ENX的R-對映異構(gòu)體在肝臟快速并選擇性的代謝。這種結(jié)果可能是由于R-對映異構(gòu)體具有的首次排泄效應(yīng)所致，當(dāng)通過藥物被肝酶降解的途徑給藥時，在此之前或與此同時，對映異構(gòu)體到達(dá)合適的受體部位，引起藥理學(xué)效應(yīng)。但是，也可優(yōu)先使用一些其他的給藥途徑，以利用這種首次排泄效應(yīng)。例如，已證實ENX的S-和R-對映異構(gòu)體為支氣管擴(kuò)張藥。用吸入法給予R-對映異構(gòu)體(或含R-對映異構(gòu)體但不含S-對映異構(gòu)體的組合物)，可立即使本化合物與氣管和支氣管中的適當(dāng)受體結(jié)合而產(chǎn)生作用。任何已吸收的化合物被快速去除，這樣可減少體內(nèi)化合物的殘余量。
含環(huán)氧化物部分的腺苷衍生物，特別是那些在N-6取代基上有環(huán)氧化物部分的腺苷衍生物，可以用作A1AR興奮劑。腺苷興奮劑的環(huán)氧化物衍生物對腺苷受體也可表現(xiàn)出高度選擇性。對心臟組織的高度選擇性也已得到證實。更為特別的是含環(huán)氧環(huán)烷基的腺苷的N6-取代作用可導(dǎo)致有效的和組織選擇性的興奮劑。詳細(xì)的結(jié)構(gòu)活性和制作型分子模型的研究表明腺苷興奮劑通過含N6-，2-和9-(核糖)取代基的三種結(jié)構(gòu)域與A1受體相互作用。
A1腺苷受體的N6-亞區(qū)包含手性識別位點，這些位點對于確定A1／A2選擇性非常重要。環(huán)氧化物可被環(huán)烷基取代，如腺苷的環(huán)戊基，降冰片基或硬石基衍生物。下面式Ⅵ所示的是在N6位上有環(huán)氧化物取代基的腺苷環(huán)氧化物。此環(huán)氧化物可與環(huán)戊基或降冰片基連接。
且R1=1-4碳的烷基。含N6-降冰片基的興奮劑化合物的實例包括下面式Ⅶ和Ⅷ分別所示的外-和內(nèi)-異構(gòu)體。
本發(fā)明興奮劑化合物可以是四種異構(gòu)體(2R-內(nèi)，2R-外，2S-內(nèi)或2S-外形式)中的一種。2R-內(nèi)和2S-內(nèi)對映異構(gòu)體如下面式Ⅸ和Ⅹ所示
本發(fā)明興奮劑化合物的另一個例子包括下面式Ⅸ所示的化合物，它在嘌呤環(huán)的N-1位上連接有氧原子。此化合物為N6-(5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷-1-氧化物。
如圖2所示，使用文獻(xiàn)中已知的方法，從降冰片二烯經(jīng)兩步可容易地生成外-5-氨基降冰片-2-烯。然而，已證實內(nèi)-異構(gòu)體的合成更難，根據(jù)本文所述方法和圖9A所示，使用降冰片-2-羧酸可使之變得容易。由內(nèi)-降冰片烯-2-羧酸合成化合物內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯(圖9A中的化合物7b)具有適合于合成2R和2S-內(nèi)異構(gòu)體檢驗的優(yōu)點。本發(fā)明包括這一發(fā)現(xiàn)，即三氟乙酸(TFA)是用庫而提斯反應(yīng)的修改形式將中間體異氟酸酯轉(zhuǎn)化為三氟乙酰胺的有用試劑。已證實TFA為有效的捕獲劑，不論反應(yīng)是否在丙酮中或在相轉(zhuǎn)移情況下(見表1)進(jìn)行，由?；?圖9A中的化合物9，其中X=Cl)或混合酐(圖9A中的化合物9，其中X=C(O)OEt)生成?；B氮，最后均同樣生成異構(gòu)的三氟乙酰胺(圖9A中的化合物11)。盡管內(nèi)-和外-異構(gòu)體具有相似的極性，但用柱層析只能將少量內(nèi)-異構(gòu)體完全純化。隨后的加堿水解可得到相應(yīng)的胺(圖9B中的化合物7b)。
更直接的方法包括仔細(xì)調(diào)節(jié)的兩相混合物中的中間體異氰酸酯的酸水解。這樣，用等摩爾數(shù)的2MHCI水溶液回流四氯化碳中的?；B氮／異氰酸酯后，轉(zhuǎn)化成胺鹽酸鹽，但不影響降冰片烯雙鍵。此反應(yīng)產(chǎn)率很高，它是目前合成5-氨基降冰片-2-烯鹽酸鹽(圖9B中的化合物7c)的最有效的方法。在從鹽酸鹽中析出5-氨基降冰片-2-烯時，升高PH和用有機(jī)溶劑萃取，得到低產(chǎn)率的游離胺。然而，鹽酸鹽可直接用于6-氯嘌呤核苷的烷基化。
將6-氯嘌呤核苷與外-和內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯(分別為圖9A中的化合物7a和7b)反應(yīng)生成N6-取代的腺苷，N6-(內(nèi)-降冰片-5-烯-2-基)腺苷或N6-(外-降冰片-5-烯-2-基)腺苷。最后一步，通過用二氯甲烷中的間氯過苯甲酸處理N6-(降冰片-5-烯-2-基)腺苷，而使這些烯烴轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物。加入1mol當(dāng)量過酸后，用薄層色譜觀察兩種化合物。繼續(xù)加入間氯過苯甲酸(另外2當(dāng)量)直至僅觀察到此化合物。用乙酸乙酯、氯仿和氨(85∶15∶1)的混合物作洗脫液，通過柱層析達(dá)到純化。在1H NMR光譜中用δ3．23處的2-質(zhì)子單峰取代δ6．17和δ6．20處的烯屬信號，這與烯烴部分的氧化作用是一致的。但是，質(zhì)譜顯示392時的分子離子(比預(yù)期的高16質(zhì)量單位)，提示N1點也可出現(xiàn)氧化作用。用少量過酸重復(fù)此反應(yīng)，并通過薄層色譜和NMR密切觀測，經(jīng)48小時，僅加入了約0．1當(dāng)量一小部分。立即檢測N-氧化物的生成，所有起始物質(zhì)反應(yīng)完全后，通過NMR觀察到N-氧化物N6-(內(nèi)／外-降冰片-5-烯-2-基)腺苷之比為1．5∶1。通過使用選擇性地使烯烴環(huán)氧化的二甲基二環(huán)氧乙烷，可防止N1氧化，從而得到高產(chǎn)率N6-(內(nèi)／外-環(huán)氧降冰片-5-烯-2-基)腺苷。主要副產(chǎn)物(丙酮)的揮發(fā)特性使產(chǎn)物的分離變得極為容易，并可避免過多的層析。二甲基二環(huán)氧乙烷是一種優(yōu)選的氧化劑，這是因為它對烯烴部分具有選擇性，已氧化的產(chǎn)物容易純化，并且可用于將外-、內(nèi)-或外消旋降冰片烯分別轉(zhuǎn)化為外-、內(nèi)-或外消旋環(huán)氧化物。也可使用本領(lǐng)域熟知的其它對烯烴有選擇性的氧化劑。
通過改變環(huán)烷基腺苷分子的其它部分也可增強(qiáng)其生物活性。例如，N6-環(huán)烷基腺苷的2-和5′-氯取代物兩者都用于增加A1選擇性。圖2表示一個圖例，即化學(xué)上將腺苷分子或其衍生物轉(zhuǎn)化為含環(huán)氧二環(huán)烷基(作為N6取代基)的腺苷化合物。二甲基二環(huán)氧乙烷是用于生成腺苷化合物的環(huán)氧化物優(yōu)選的氧化劑。參見lyer，R．S．等，(1994)J．Am．Chem．Soc．116∶1603-1609?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法和步驟制備二甲基二環(huán)氧乙烷。參見Murray，R．W．，R．Jeyaraman(1985)，J．Org．Chem．502847-2853；Adam，W．等(1991)Chem．Ber．124-2377。
本發(fā)明腺苷興奮劑可用于治療需要A1AR的刺激的病人。本發(fā)明腺苷興奮劑和含那些興奮劑的組合物的用途包括，用作功能性β-阻斷劑；控制心率的抗心率失常劑，包括室上性心律過速，兒茶酚胺(CAMP-依賴性)室上性和心室性心律失常；Ⅱ型糖尿病；以及心肌保護(hù)，如減少梗塞范圍和增加對心肌局部缺血的耐受力。
尤其是，本發(fā)明興奮劑化合物可用于治療腺苷敏感性室上性心律過速，比如，通過給需要這種治療的病人使用有效量興奮劑，在心房撲動或心房纖顫時控制心室速率，或者在室上性心搏過速時抑制A-V結(jié)傳導(dǎo)。
在優(yōu)選的實施方案中，通過給病人使用有效量的內(nèi)-5，6-環(huán)降冰片-2-烯腺苷，而將此化合物用于這些治療中。此化合物可以以2R-和2S-對映異構(gòu)體的外消旋混合物的形式給藥，或以2R-或2S-對映異構(gòu)體兩者的任意一種的形式給藥。更優(yōu)選的實施方案為2R-，2S-，或2R-／2S-外消旋混合物的內(nèi)-形式。最優(yōu)選的實施方案為本發(fā)明興奮劑的2S-內(nèi)-形式，即N6-(2S-內(nèi)-5，6-環(huán)降冰片-2-基)腺苷，如式Ⅹ所示。已證實這種特殊的對映異構(gòu)體對A-V(A1效應(yīng))緩慢傳導(dǎo)的作用效能較冠狀血管擴(kuò)張(A2效應(yīng))強(qiáng)100倍，但在所有動物中未見低血壓(A2)效應(yīng)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還知道興奮劑化合物的核糖部分可以進(jìn)行改變，這可提供某些有利之處。例如，眾所周知可以對核糖部分進(jìn)行乙酰化，氯化或甲基化，這些改變可提高溶解性或吸收，或延長分子的半衰期。特別是這些改變發(fā)生在與核糖分子的C-5相連的羥基時。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可制備包括此興奮劑化合物的脫氧形式在內(nèi)的位于核糖部分的這些或其它羥基取代基的類似取代物，并可按本文所述的進(jìn)行使用，這些也是本發(fā)明的組成部分。
本發(fā)明化合物可提供一種使心室節(jié)律正?；透纳菩氖已鲃恿W(xué)或心房纖顫時的心輸出量的方法。心房纖顫時給病人使用本發(fā)明的一種化合物是藥理學(xué)上使心室節(jié)律正常的唯一方法，由此可改善心房纖顫時病人的心室血流動力學(xué)和心輸出量。
可以將本發(fā)明化合物(興奮劑和拮抗劑)與藥物上可接受的載體一同制備成可給病人使用的組合物，病人將從本發(fā)明化合物或組合物的腺苷受體興奮劑或拮抗劑的特性中得到治療。
有利的是，本發(fā)明腺苷拮抗劑用于治療復(fù)蘇后的心律失常的劑量可以小于0．1-20mg／kg，對于已知的腺苷拮抗劑以前已有此報道。參見美國專利號4，980，379。有效劑量應(yīng)該是能減輕心動過緩和血流動力學(xué)衰退的逆轉(zhuǎn)。
現(xiàn)已確定了有效量的腺苷拮抗劑(如茶堿和氨茶堿)的標(biāo)準(zhǔn)給藥程序，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，用于治療可逆性氣道阻塞病人，推薦的茶堿血漿含量范圍是10-20μg／ml。具有高度選擇性和效能的本發(fā)明化合物為已知的血中濃度時是有效的。
以上列舉的本發(fā)明化合物或組合物的治療用途并沒有完全概括，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易知道其它可優(yōu)選使用本發(fā)明的情況。例如，本技術(shù)領(lǐng)域容易認(rèn)識到，可通過減少升高的內(nèi)源性腺苷的作用或通過增加A1AR的刺激而能夠治療的其它疾病，也可從分別使用本發(fā)明腺苷拮抗劑或興奮劑中得到治療。
下面是舉例說明生產(chǎn)方法的實施例，其包括實施本發(fā)明的最佳方式。這些實施例不應(yīng)看成是對本發(fā)明的限定。除非另有說明，所有百分?jǐn)?shù)均為重量百分比，所有溶劑混合物的比例均為體積比。
實施例1-8-環(huán)氧烷基黃嘌呤的制備化學(xué)。圖1所示的圖式描述的是含環(huán)氧化合物并有C-8取代基的1，3-二丙基黃嘌呤的合成。將5，6-二氨基-1，3-二丙基尿嘧啶(1)與ω-鏈烯基鹵化物或ω-鏈烯基酯反應(yīng)得到酰胺(2)，再將(2)在熱堿中環(huán)化生成8-ω-鏈烯基-1，3-二丙基黃嘌呤(3)。與間-氯過苯甲酸氧化得到8-環(huán)氧烷基黃嘌呤(4)?；蛘撸?與1，3-環(huán)鏈二烯產(chǎn)生狄爾斯-阿德爾縮合作用而生成8-二環(huán)鏈烯基黃嘌呤(5)。當(dāng)呋喃為鏈二烯時，反應(yīng)產(chǎn)物則為8-ω-{7-噁二環(huán)[2．2．1]庚-2-烯-5(6)-基}黃嘌呤(5)，它同時包含(a)環(huán)氧化物部分和(b)用于生成第二個環(huán)氧化物部分的鏈烯基部分。5與2．4當(dāng)量偏氯苯甲酸發(fā)生氧化作用生成8-環(huán)氧二環(huán)烷基黃嘌呤(6)。
1，3-二丙基-8-{3-噁三環(huán)[3．2．1．02，4]辛-6(7)基}嘌呤。在室溫下，在50ml CH2Cl2中將含8-二環(huán)[2．2．1]庚-2-烯-5(6)基黃嘌呤(1．0g，3mmol)和間-氯過苯甲酸(0．8g，3．6mmol)的溶液攪拌24小時。加入又一等分過酸，再繼續(xù)攪拌24小時。蒸發(fā)得到黃色的油狀物，通過用70-80％梯度的甲醇水溶液洗脫C-18硅膠上的制備型反相高效液相層析(HPLC)將這種油純化。產(chǎn)率0．54g，52％，mp149-150℃。
1，3-二丙基-8-{7-噁二環(huán)[2．2．1]庚-2-烯-5(6)基}黃嘌呤。在室溫下攪拌置于50ml干燥含呋喃的THF(0．22ml，3mmol)中的1，3-二丙基-8-乙烯基黃嘌呤(0．4g，1．5mmol)懸浮液。加入1滴TMS三氟甲烷磺酸酯溶液，HPLC提示起始物質(zhì)消失了。用50-80％梯度的甲醇溶液洗脫C-18硅膠上的制備型反相HPLC，得到0．25g(50％)產(chǎn)物。
實施例2-含環(huán)氧化物部分的腺苷衍生物的制備用作腺苷興奮劑的化合物是包含N-6取代基為噁二環(huán)-或噁三環(huán)烷基的腺苷衍生物。制備此化合物的通式如圖2所示。
N6-內(nèi)-{-噁三環(huán)[3．2．1．02，4]辛-6(7)-基}腺苷。在冰浴中將100ml干甲醇中的N6-(內(nèi)-2-降冰片烯-5-基)腺苷(0．5g，1．4mmol)冷卻至0-5℃，加入二甲基二環(huán)氧乙烷的丙酮(40ml，4mmol)溶液；在冰浴中持續(xù)攪拌8小時，然后在室溫下過夜。蒸發(fā)溶劑并用層析法純化，得到白色固體物0．42g(81％)。
實施例3-用作腺苷拮抗劑的新化合物的用途為了證明作為腺苷拮抗劑的本發(fā)明化合物的功效，將本化合物的活性與已知拮抗劑進(jìn)行比較。另外，在幾內(nèi)亞豬剝離的心臟，幾內(nèi)亞豬的腦膜，DDT1MF-2和PC12細(xì)胞中，進(jìn)行了有關(guān)作為A1腺苷受體拮抗劑的ENX的專一性、選擇性和效能的試驗，及其功能和生化(放射性配體結(jié)合測定)的試驗。這些試驗結(jié)果如下所述。
1．功能研究。在剝離灌注的幾內(nèi)亞豬心臟中得到這種功能的依據(jù)，即烷基黃嘌呤(ENX)的環(huán)氧化物專一并選擇性地拮抗A1-腺苷受體介導(dǎo)的腺苷的心臟作用，但不拮抗A2-腺苷受體介導(dǎo)的冠狀血管舒張。研究了ENX和其它兩種烷基黃嘌呤(NAX和CPX)對A1受體介導(dǎo)的束間期刺激的變化(S-H間期；測定AV結(jié)傳導(dǎo))和對A2受體介導(dǎo)的冠狀血管舒張所產(chǎn)生的作用。ENX，NAX和CPX拮抗A1興奮劑CCPA的負(fù)變異性(S-H延長)和腺苷的血管舒張作用的能力如表2和3所示
PA2(-Log10KB)，平衡關(guān)系常數(shù)KB和Schild點的斜率的值為平均數(shù)+S．E．M．。心臟反應(yīng)選擇性A1興奮劑CCPA的負(fù)變異性作用的拮抗作用。圓括號中的數(shù)為KB的最小值和最大值。n=試驗數(shù)。拮抗劑中PA2(KB)或Schild點均沒有顯著性差異。
數(shù)值為抑制50％(IC50)由腺苷引起的最大冠狀血管舒張的拮抗劑的濃度。圓括號中的數(shù)值為IC50值的95％置信區(qū)間。n=試驗數(shù)。
雖然所有三種烷基黃嘌呤拮抗A1受體介導(dǎo)的S-H間期延長的作用是完全相同的，但ENX的選擇性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過NAX和CPX。
為了進(jìn)一步證明ENX對A1與A2受體的選擇性，在單獨給予腺苷和同時給予腺苷和ENX期間，觀測了A1受體介導(dǎo)的S-H間期和A2-受體介導(dǎo)的冠脈傳導(dǎo)增強(qiáng)(圖4A-4D)。當(dāng)單獨給予腺苷(Ado，4μM)時，S-H間期和冠脈傳導(dǎo)顯著增加。當(dāng)同時給予腺苷和ENX(0．4μM)時，S-H間期延長完全被抑制，而A2-介導(dǎo)的冠狀血管舒張保持不變。沖洗ENX后，第三次單獨給予腺苷導(dǎo)致S-H間期明顯延長(與第一次給予腺苷相似)和冠脈傳導(dǎo)增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)證明了ENX的作用是可逆的，ENX拮抗A1-受體介導(dǎo)的S-H延長，但不拮抗A2-受體介導(dǎo)的由腺苷引起的冠脈傳導(dǎo)增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)還證明了ENX具有抑制與腺苷同A1受體結(jié)合相關(guān)的活性(和任何副作用)的能力，但A2受體的腺苷刺激的有益的藥理學(xué)活性不受影響。
為了證明ENX是否具有增強(qiáng)收縮力的作用，進(jìn)行了確定它對左心室壓力(LVP)和首次導(dǎo)數(shù)dP／dt及收縮指數(shù)的作用的試驗。如圖5所示，當(dāng)給這些正常幾內(nèi)亞豬心臟使用高濃度的ENX(2-200μM)時，這些豬的LVP或dP／dt均未見明顯變化。在給予各種濃度的ENX和沖洗過程中，LVP和dP／dt保持不變。這些結(jié)果表明ENX沒有增強(qiáng)收縮力作用。
與缺乏增強(qiáng)收縮力作用一致，ENX也不能抑制磷酸二酯酶(圖6)。在40mMpH8．0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液中攪拌細(xì)胞，所有的勻漿均用于酶測定。通過在Tris緩沖液中于30℃將勻漿(0．4mg蛋白)孵育45分鐘來測定PDE活性，這種Tris緩沖液包括20mM的MgCl2，4mM巰基乙醇，0．06mg牛血清蛋白，0．4mM[3H]CAMP的CAMP130nCi和指定濃度的ENX或IBMX。在沒有勻漿的并行測定中進(jìn)行空白孵育。孵育結(jié)束時，將懸浮液在沸水浴器中孵育2分鐘，再轉(zhuǎn)移至冰水浴中2分鐘，后加入0．1mg蛇毒磷酸二酯酶。在30℃將懸浮液孵育10分鐘，用離子交換層析分離所生成的腺苷。形成的腺苷的控制速率為220pmol／mg蛋白／分。形成的腺苷量與所花的孵育期呈線性關(guān)系。
已知抑制磷酸二酯酶的試劑能產(chǎn)生增強(qiáng)收縮力的作用。圖6所示的結(jié)果清楚地表明ENX不能抑制磷酸二酯酶，而異丁基甲基黃嘌呤(IBMX，一種已知地增強(qiáng)收縮力劑)能抑制磷酸二酯酶。這些發(fā)現(xiàn)證實了ENX超出其它能抑制磷酸二酯酶的烷基黃嘌呤的一大優(yōu)點，因而它具有正收縮性作用。
將碳酰膽堿和MgCl2用于測定ENX拮抗作用的專一性，比如，如圖7所示的腺苷介導(dǎo)的S-H間期延長，ENX(2nM，2μM)不能拮抗碳酰膽堿或MgCl2的負(fù)變異性效應(yīng)。相比之下，ENX也不拮抗腺苷引起的S- H延長。
總之，上述功能實驗的結(jié)果表明，在心臟中，ENX是A1受體亞型上腺苷的可逆性的、專一的和高度選擇性的拮抗劑。
2．放射性配體結(jié)合研究。
為了確定一種烷基黃嘌呤的環(huán)氧化物(ENX)的結(jié)合親和力，并與其它烷基黃嘌呤(CPX，NAX和CPT)進(jìn)行比較，在從腦組織、DDT1MF-2和PC12細(xì)胞線中制備的膜中進(jìn)行放射性配體結(jié)合實驗。這些實驗結(jié)果如表4和5所示。下面表4總結(jié)的結(jié)果表明，在腦組織中，ENX較其它烷基黃嘌呤在A1AR上更為有效，而在DDT11MF-2細(xì)胞中，烷基黃嘌呤對A1受體的結(jié)合親和力幾乎一樣。至于PC12細(xì)胞膜中的A2受體，ENX的效能明顯小于CPX。另外，ENX對腦或DDT1MF-2細(xì)胞中的A1受體的結(jié)合親和力明顯高于對PC-12細(xì)胞膜中的A2受體的親和力。
在幾內(nèi)亞豬前腦和心臟膜以及在完整的DDT1-MF2細(xì)胞中用[3H]CPX進(jìn)行A1受體結(jié)合。在PC-12細(xì)胞膜中用[3H]NECA進(jìn)行A2受體結(jié)合。每個數(shù)次(n)制備的數(shù)值為重復(fù)三次測定的平均數(shù)±SEM。Ki值按已述的方法計算。烷基黃嘌呤的縮寫如下ENX=1，3-二丙基-8-{3-噁三環(huán)[3．1．2．02．4]辛-6(7)-基}黃嘌呤；CPX=8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤；NAX=1，3-二丙基-8-(3-非硬石基)黃嘌呤；CPT=8-環(huán)戊基-1，3-二甲基黃嘌呤。
為了證實與前面已知的腺苷受體拮抗劑(NAX或CPX)相比，ENX對A1受體的選擇性更強(qiáng)，在幾內(nèi)亞豬的前腦(A1受體)和紋狀體(A2受體)中進(jìn)行了另一個放射性配體結(jié)合研究。表5表示表達(dá)A1(前腦)和A2(紋狀體)腺苷受體的腦組織的A1和A2受體結(jié)合親和力。表5的結(jié)果清楚地表明ENX較其它烷基黃嘌呤(NAX和CPX)對A1受體的選擇性較A2受體明顯更強(qiáng)。也即是說，ENX對A1的選擇性是A2的800倍，而NAX和CPX對A1的選擇性分別為A2的20和7．5倍。這些放射性配體結(jié)合研究的結(jié)果與幾內(nèi)亞豬剝離心臟的功能研究的結(jié)果完全一致
在幾內(nèi)亞豬的前腦和紋狀體中用[3H]CPX和[3H]CGS 21，860分別進(jìn)行A1和A2受體結(jié)合。四種制劑中每一個的數(shù)值均為三次重復(fù)測定的平均數(shù)±S．E．M。
實施例4-ENX對映異構(gòu)體的活性依上述合成ENX的S-對映異構(gòu)體和R-對映異構(gòu)體并測定其活性和效能。如下面表6所示，ENX的S-對映異構(gòu)體較低的關(guān)系常數(shù)提示，與R-對映異構(gòu)體相比(Ki=2．1)，S-對映異構(gòu)體的效能稍強(qiáng)(Ki=0．98)。<
另外，ENX的S-對映異構(gòu)體證明對A1受體的結(jié)合選擇性較強(qiáng)。見下表7。
*“IC50”指50％抑制對受體的放射性配體結(jié)合的濃度。
圖8所示的是S-對映異構(gòu)體的增強(qiáng)效能。如圖所示，外消旋混合物ENX所具有的大多數(shù)利尿活性存在于S-對映異構(gòu)體中。尤其是，圖8提供了給予0．1mg／kg ENX外消旋物、ENX R-對映異構(gòu)體和ENX S-對映異構(gòu)體的大鼠中的2小時累積排尿量。由此表明，作為利尿劑，ENX的S-對映異構(gòu)體較ENX的R-對映異構(gòu)體或ENX的R-和S-對映異構(gòu)體的外消旋混合物更為有效。ENX的S-對映異構(gòu)體的作用周期也更長。ENX的S-對映異構(gòu)體的這些特性提示在治療通常需要給予利尿劑的疾病時，它可作為長期利尿劑使用。標(biāo)準(zhǔn)的藥理學(xué)篩選實驗證明ENX的S-對映異構(gòu)體(口服100mg／kg)能使收縮的幾內(nèi)亞豬的氣管肌肉松馳?？诜?00mg／kgENX的S-對映異構(gòu)體后，可減少血清膽固醇和沉淀β-脂蛋白的肝素。在它產(chǎn)生的影響中，所觀察到的HPL／CHOL比例小于0．92的減少提示它可能降低致動脈粥樣化的低密度β-脂蛋白的量。
口服等于或大于3mg／kg，在水合大鼠中可觀察與增加的尿排出量相關(guān)的促尿食鹽排泄作用?？诜?0mg／kg后，也可發(fā)現(xiàn)緩慢的促尿鉀排泄作用，提示少量排鉀的排尿作用。
已知R-對映異構(gòu)體具有用作腺苷拮抗劑的活性。特別是，觀察到R-對映異構(gòu)體可松馳幾內(nèi)亞豬氣管的自發(fā)音。在口服10mg／kg ENX R-對映異構(gòu)體的水合大鼠中觀察到與增加的排尿量有關(guān)的促尿食鹽排泄活性。但是，與S-對映異構(gòu)體相比，ENX R-對映異構(gòu)體的活性作用周期很短。然而，那對于治療適用于短期作用療法的疾病是有用的。
實施例5-N6-取代的腺苷衍生物的合成根據(jù)已知方法可合成式Ⅵ所示的本發(fā)明興奮劑化合物。例如，得到這些化合物的總的合成圖開始包括適當(dāng)取代的胺(如二環(huán)胺)與6-氯嘌呤核苷的烷基化作用。這種直接反應(yīng)通常用于N6-取代的腺苷的合成。參見WO 8404882(1985)。
用一雙鍵可使取代的胺官能化，然后再將它氧化生成環(huán)氧化物。間-氯過苯甲酸可用于這種氧化反應(yīng)。也參見Sharpless，K．B．，w．Amberg，Y．L．Bennani，G．A．Crispino，J．Hartung，K．-S．Jeong，H．-L．Kwong，K．Morikawa，Z．-M．Wong，D．Xu，X．-L．Zhang(1992)J．Org．Chem．57∶2768-2771；和Kolb，H．C．，B．K．Sharpless(1992)Tetrahedron 48∶1015-1030。
生成環(huán)氧化物的另一個可選擇的方法是鋨催化的烯烴二羥基化，這在發(fā)現(xiàn)2，3-二氮雜萘配位體時已為大家所共知，并且通過有機(jī)氨磺?？杉铀黉~酸酯水解。將連二醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物的一種簡單一步法在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的(Kolb，H．C．，B．K．Sharpless，supra)。這種反應(yīng)程序沒有通過鹵化醇酯中間體的差向異構(gòu)。這些方法的結(jié)合可從立體有擇形式的烯烴生成環(huán)氧化物。
如式Ⅵ-Ⅺ所示的，可用于合成本發(fā)明化合物的取代的胺為3-環(huán)戊烯-1-基胺(用于腺苷的環(huán)戊烯氧化衍生物)或5-降冰片烯-2-基(用于腺苷的環(huán)已烯環(huán)氧化物衍生物)。由順-1，4-二環(huán)丁烯和二乙基丙酸通過5步反應(yīng)程序可合成3-環(huán)戊烯-1-基胺，這在本技術(shù)領(lǐng)域也是公知的(Murdock，K．C．，R．B．AngierJ．Org．Chem．272395-2398)。
用5-降冰片烯-2-羧酸可進(jìn)行合成5-降冰片烯-2-基胺(市場上可買到的四種異構(gòu)體(2R和2S的內(nèi)和外)的混合物)。將這種羧酸轉(zhuǎn)化為?；?，接著用疊氮化鈉處理，得到?；B氮。庫爾提斯重排(去掉N2和取代基移位)和緊接著的水解得到異構(gòu)體混合物5-降冰片烯-2-基胺。在合成4-氨基環(huán)己烯時，如沒有?；B氮或異氰酸酯的分離，這種反應(yīng)可連續(xù)繼進(jìn)行。用于庫爾提斯重排的另一個改變，包括通過用亞硝酸處理對應(yīng)的?；弫碇苽漉；B氮。在這兩種情況中，在手性中心重排保留絕對構(gòu)型。內(nèi)外成分可用本領(lǐng)域公知的HPLC方法分離。
旋光純的5-降冰片烯-2-基胺的合成包括利用不對稱的狄耳斯-阿德耳反應(yīng)得到中間體羧酸，接著進(jìn)行上面所述的庫爾提斯重排。合成這些化合物的總圖示于圖3。
實施例6-合成A1腺苷受體興奮劑和中間體的分析數(shù)據(jù)本實施例所述的有關(guān)化合物的參照數(shù)字參見圖9A和／或9B。在電熱熔點儀器上測定熔點并未修正。1H和13CNMR光譜記錄在JEOL JNM-EX270分光計上，除非另有說明，d6-DMSO用作溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)物。通過DEPT實驗測定每個碳的質(zhì)子數(shù)，并且用相應(yīng)的13C NMR信號標(biāo)記。以KBr圓片為基體用Bio-Rad3240-SPC分光光度計得到紅外光譜圖。在JEOL JMS-DX300質(zhì)譜儀上測定FAB質(zhì)譜，并處理MSS數(shù)據(jù)系統(tǒng)。Merck Kieselgel 60和60F254分別用于柱和薄層色譜法。溶劑為AR級或使用前蒸餾。丙酮通過在碳酸鉀上蒸餾而干燥，并于4A篩上貯存。
N6-(外-5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷。在0-5℃將丙酮(40．0mL，≈0．1M，≈4．0mmol)中的二甲基二環(huán)氧乙烷滴加到干甲醇(100mL)中的N6-(外-降冰片-5-烯-2-基)腺苷(0．5g，1．39mmol)溶液中。在0-5℃將反應(yīng)混合物攪拌8小時，再在室溫下放置12小時(過夜)。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并用柱色譜法(CHCl3／MeOH／NH3，80∶20∶1)純化粗產(chǎn)物得到白色結(jié)晶物(0．42g，80％)；mp 240-242℃；1H NMRδ1．15(m，2H，H3”／H7”)，1．72(m，2H，H3”／H7”)，2．41(brs，1H，H1”／H4”)，2．51(brs，1H，H1”／H4”)，3．18(m，2H，H2”，H5”，H6”)，3．64(m，2H，H5a’，b’)，4．00(d，1H，H4’)，4．18(d，1H，H3’)，4．64(M，1H，H2’)，5．24(brs，1H，OH)，5．50(brs，2H，2xOH)，5．92(d，1H，H1’)，7．88(d，1H，NH)，8．26(s，1H，H2／8)，8．38(s，1H，H2／8)；13CNMRδ23．0，34．3，36．3，42．7，49．1，49．6，51．0，61．8，70．8，73．7，86．0，88．1，119．8，139．9，148．6，152．4，154．1；HR MS(C17H22N5O5)計算值376．16208，實驗值376．16109)。
N6-(內(nèi)-5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷。在0-5℃將丙酮(27．8mL，≈0．1M，≈2．78mmol)中的二甲基二環(huán)氧乙烷滴加到干甲醇(40mL)中的N6-(內(nèi)-降冰片-5-烯-2-基)腺苷(0．5g，1．39mmol)溶液中。在0-5℃將反應(yīng)混合物攪拌4小時，再在室溫下放置2小時。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并用柱色譜法(EtOAc／MeOH／NH3，90∶10∶1)純化粗產(chǎn)物得到白色結(jié)晶物(0．36g，68％)；mp 207-214℃(分解)；1HNMRδ0．93-2．08(m，4H，H3”，H7”)，2．42(brs，1H，H1”／H4”)，2．87(brs，1H，H1”／H4”)，3．23-3．41(m，3H，H2”，H6”)，3．68(dd，2H，H5’)，4．03(d，1H，H4’)，4．22(brs，1H，H3”)，4．67(brs，1H，H2’)，5．22(brs，1H，OH)，5．44(brs，2H，2xOH)，5．97(d，1H，H1’)，7．84(brs，1H，NH)，8．25(s，1H H2／8)，8．38(s，1H，H2／8)；13CNMRδ25．2，31．1，36．4，39．5，48．3，50．7，61．6 70．6，73．4，85．8，87．9，120．0，139．7，148．3，152．2，154．7；HR MS(C17H22N5O5)計算值376．16208，實驗值376．16228。
N6-(外-降冰片-5-烯-2-基)腺苷。將干甲醇(20mL)中的外-5-氨基降冰片-2-烯(2．02g，18．5mmol)加入干甲醇(40mL)中的6-氯嘌呤核苷-(5．0g，17．4mmol)和三乙胺(3．53g，34．9mmol)溶液中。回流24小時后，加入另一摩爾當(dāng)量外-5-氨基降冰片-2-烯，再繼續(xù)回流40小時。蒸發(fā)溶劑和過量三乙胺后，并用柱色譜法(CHCl3／MeOH／NH3，80∶20∶1)純化粗產(chǎn)物。分離得到純的4a，收率98％；mp 108-113℃；1HNMRδ1．37-1．73(m，4H，H3”，H7”)，2．78(brs，1H，H1”／H4”)，2．83(brs，1H，H1”／H4”)，3．20(m，1H，H2”)，3．62(m，2H，H5a’，b’)，3．96(d，1H，H4’)，4．14(d，1H，H3’)，4．60(m，1H，H2’)，5．19(d，1H，OH)，5．44(d，2H，2xOH)，5．89(d，1H，H1’)，6．16(dd，1H，H5”／H6”)，6．20(dd，1H，H5”／H6”)，7．97(brs，1H，NH)，8．23(brs，1H，H2／8)，8．35(s，1H，H2／8)；13CNMRδ34．5，41．5，46．5，48．3，51．7，62．4，71．4，74．5，86．8，89．0，120．2，135．4，140．1，140．7，148．7，153．4，154．9。
N6-(內(nèi)-降冰片-5-烯-2-基)腺苷。在氮氣中將6-氯嘌呤核苷(0．70g，2．44mmol)和內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯(0．32g，2．93mmol)溶于干甲醇(20ml)中。加入三乙胺(0．51mL，0．37g，3．66mmol)，將反應(yīng)混合物回流48小時。經(jīng)此過程后，HPLC監(jiān)測顯示未出現(xiàn)進(jìn)一步改變，因此蒸發(fā)溶劑得到褐色油狀固體。經(jīng)柱色譜法(用乙酸乙酯／甲醇／氫氧化銨90∶10∶1)得到白色泡沫狀化合物(0．69g，79％)；mp 108-112℃；1HNMRδ 1．11-2．14(m，4H，H3”，H”)，2．79(brs，1H，H1”／H4”)，2．83(brs，1H，H1”／H4”)，3．22(brs，1H，H2”)，3．61(m，2H，H5a’，b’)，3．97(d，1H，4H’)，4．15(d，1H，H3’)，4．61(m，1H，H2”)，5．20(d，1H，OH)，5．45(d，2H，2xOH)，5．89(d，1H，4H’)，5．97(dd，1H，H5”／H6”)，6．35(dd，1H，H5”／H6”)，6．93(brs，1H，NH)，8．25(brs，1H，H2／8)，8．36(s，1H，H2／8)；13CNMRδ33．5，42．1，45．5，47．9，50．4，61．6，70．6，73．5，85．8，87．9，119．6，131．6，138．8，139．6，148．2，152．2，154．4。
外-降冰-5-烯-2-基異硫氰酸鹽(6)。在35-40℃將水(12mL)中的濃縮H2SO4(38．4g)滴加到(超過2小時)二環(huán)[2．2．1]庚-2，5-二烯(60mL)、苯(150mL)和KSCN(57．5g)的混合物中。3小時后，將反應(yīng)混合物冷卻再加入水。在真空下通過多孔玻璃過濾漏斗將反應(yīng)混合物過濾，并用乙醚(200mL)漂洗。分離有機(jī)層，用水沖洗，再用硫酸鎂干燥。過濾和蒸發(fā)溶劑得到橙色液體。在減壓(70-74℃，1 mbar，lit．676-78℃，1mmHg)得到純化合物(40％)；1H NMRδ1．61-1．77(m，4H，H3，H7)，2．92(brs，1H，H1／H4)，3．10(brs，1H，H1／H4)，3．53(t，1H，H2)，5．98(dd，1H，H5／H6)，6．21(dd，1H，H5／H6)；13C NMRδ35．6，41．0，46．1，49．8，55．3，132．7，140．2外-5-氨基降冰片-2-烯(7a)。在乙二醇中的降冰片基異硫氰酸鹽(56．7g，0．375mmol)攪拌溶液(保持在100℃)中加入(超過5分鐘)固體NaOH(45．0g)。溫度升高至165℃，再攪拌反應(yīng)物3小時。冷卻后，再將反應(yīng)混合物冷卻并注入飽和碳酸鉀(1L)溶液中，然后由二氯甲烷(3×400mL)萃取。分離有機(jī)層再用HCl(2N，3×200mL)萃取，用2N NaOH使之堿化，并用碳酸鉀使之飽和。過濾和蒸發(fā)溶劑得到液體，液體在真空下(54-54．5℃，30mmHg，lit．770℃，40-41mmHg)蒸餾得到褐色產(chǎn)物(14．3g，35％)。1H NMRδ0．88(dd，1，H2)，5．92(dd，1H，H5／H6)，5．96(dd，1H，H5／H6)；13C NMR(CDCl3δ37．0，41．2，44．8，50．9，51．9，135．0，138．0內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯(7b)。在室溫，氮氣下將甲醇(5mL)和水中(20mL)中的2-三氟乙酰基氨基降冰片-5-烯(0．54g，2．6mmol)和碳酸鉀(0．61g，4．4mmol)的混合物攪拌25小時。在旋轉(zhuǎn)式汽化器中濃縮后，用二乙醚(3×20mL)萃取反應(yīng)混合物。將有機(jī)相在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)得到褐色油(0．23g，80％)。蒸餾得到純的7b(152-160℃，lit．10150-160℃)。1H NMRδ0．43(dt，1H，H3／H7)，1．20-1．30(m，2H，H3／H7)，1．95(m，1H，H3／H7)，2．72(brs，1H，H1／H4)，2．75(brs，1H，H1／H4)，3．28(m，1，H2)，5．97(dd，1H，H5／H6)，6．30(dd，1H，H5／H6)；13C NMR(CDCl3)δ33．6．42．6，47．9，48．5，51．1，131．6，138．9。
外／內(nèi)-5-氨基降冰片-2-烯鹽酸鹽(7c)。方法A(用酰基氯)在冰浴中冷卻含溴化四丁銨(≈50mg)的降冰片-5-烯-碳酰氯(2．66g，17．0mmol)CCl4(25mL)溶液，加入疊氧化鈉(1．33g，20．5mmol)的水(5ml溶液，在0℃用力攪拌反應(yīng)混合物2小時。將反應(yīng)混合物傾注在冰(≈10mL)上，用CCl4(2×25mL)萃取水相。所有有機(jī)部分被合并，再用2MHCl(8．5mL)回流17小時。冷卻后，收集水相并用0．5MHCl(10mL)沖洗CCl4。蒸發(fā)已合并的含水層得到白色固體(2．37g，96％)。通過用乙酸乙酯研制以將這種固體純化，或直接用于合成N6-(內(nèi)-降冰片-5-烯-2-基)腺苷。方法B(用混合酐)在冰浴中冷卻干丙酮(40mL)中的降冰片-5-烯-2羧酸(3．74g，27．1mmol)和三乙胺(4．40mL，3．21g，31．7mmol)的溶液。加入丙酮(15mL)中的新蒸餾的氯甲酸乙酯(2．98mL，3．38g，31．2mmol)，在0℃攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。經(jīng)此過程后，加入疊氮化鈉(2．21g，34．0mmol)的蒸餾水(10mL)溶液，在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時。將反應(yīng)混合物傾注在冰(≈10mL)上，用CCl4(2x25mL)萃取水相。所有有機(jī)部分被合并，再用2MHCl(13．6mL)回流20小時。冷卻后，收集水相并用0．5MHCl(10mL)沖洗CCl4。蒸發(fā)已合并的含水層得到油狀固體，用乙酸乙酯(3．72g，94％)研制此固體；mp256-265℃(分解)；1H NMRδ0．85-2．09(m，H3外，內(nèi)，H7外，內(nèi))，2．82(brs，H1／H4內(nèi))，2．99(brs，H1／H4外)，3．02(brs，H1／H4外)，3．08(brs，H1／H4內(nèi))，3．38(m，H2外，內(nèi))，5．96(dd，H5／H6內(nèi))，6．05(dd，H5／H6內(nèi))，6．20(dd，H5／H6外)，6．37(dd，H5／H6內(nèi))，8．03(brs，NH2)，8．50(brs，HCl)；13C NMRδ31．6，40．8，41．9，44．7，44．8，45．2，45．4，47．9，49．3，50．2，130．3，133．9，139．3，140．4。
1HNMR信號的積分表明此混合物約含85％內(nèi)-異構(gòu)體。
外／內(nèi)-降冰片基-5-烯-2-碳酰氯(9)。在室溫下，在氮氣中攪拌(一夜)亞硫酰氯(2．7mL，35．2mmol)中的溶液8(3．5g，28．9mmol)。在減壓下蒸發(fā)過量亞硫酰氯，再蒸餾所得的油狀物(65℃，7．5mmHg)；1H NMR(CDCl3)δ1．32-1．56(m，H3／H7外／內(nèi))，1．95(m，H3／H7外／內(nèi))，2．98(brs，H1／H4外／內(nèi))，3．42(dd，1H，H5／H6外)，6．26(dd，1H，H5／H6內(nèi))；13C NMR(CDCl3)δ30．0，31．1，41．7，42．8，42．9，46．2，46．8，47．0，49．1，56．3，131．5，134．8，138．6，138．9，174．8，176．6。
2-三氟乙酰氨基降冰片-5-烯(11)。方法A(用混合酐)在冰浴中冷卻干丙酮(25mL)中的降冰片-5-烯-2羧酸(1．75g，12．Smmol)和三乙胺(1．95mL，1．43g，14．1mmol)的溶液。加入新蒸餾的氯甲酸乙酯(1．41mL，1．60g，14．7mmol)，在0℃攪拌反應(yīng)混合物。經(jīng)此過程后，加入蒸餾水(5mL)中的疊氮化鈉(1．04g，16．0mmol)溶液，在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時。將反應(yīng)混合物傾注在冰(≈10mL)上，用二氯甲烷(2×20mL)萃取水相。所有有機(jī)部分被合并，在硫酸鎂上干燥14小時，過濾并蒸發(fā)得到無色的油狀物。在二氯甲烷中收集該油狀物，并用三氟乙酸(1．28mL，1．90g，1．67mmol)回流14小時。冷卻后，用飽和碳酸氫鈉(2×25mL)沖洗反應(yīng)混合物，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)得到粗產(chǎn)物。用氯仿／己烷(1∶1)作洗脫液，通過柱層析使之純化。得到的目的產(chǎn)物為白色結(jié)晶狀固體(1．48g，57％)。方法B(用?；?，單相)在冰浴中冷卻丙酮(25mL)中的降冰片-5-烯-羰基氯(1．90g，12．5mmol)溶液。加入蒸餾水(5mL)中的疊氮化鈉(0．98g，15．1mmol)溶液，在0℃攪拌反應(yīng)混合物2小時。將反應(yīng)混合物傾注在冰(≈10mL)上，用二氯甲烷(3×40mL)萃取水相。所有有機(jī)部分被合并，在硫酸鎂上干燥14小時，然后過濾。在濾液中加入三氟乙酸(1．25mL，1．85g，16．2mmol)，然后將它回流24小時。冷卻后，用飽和碳酸氫鈉(2×25mL)沖洗反應(yīng)混合物，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)，用洗脫劑洗脫純化。得到的目的產(chǎn)物為白色結(jié)晶狀固體(1．41g，57％)。方法C(用?；龋噢D(zhuǎn)移條件)在冰浴中冷卻含溴化四丁銨(50-100mg)，二氯甲烷(25mL)中的降冰片-5-烯-2羰基氯(2．0g，13．4mmol)溶液。加入蒸餾水(5mL)中的疊氮化鈉(1．05g，16．2mmol)溶液，在0℃用力攪拌反應(yīng)混合物2小時。將反應(yīng)混合物傾注在冰(≈10mL)上，再用二氯甲烷(2x20mL)萃取水相。所有有機(jī)部分被合并，在硫酸鎂上干燥14小時，然后過濾。在濾液中加入三氟乙酸(1．14mL，1．69g，14．8mmol)，然后將它回流14小時。冷卻后，反應(yīng)混合物用飽和碳酸氫鈉洗滌(2×50ml)。在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)得到粗產(chǎn)物。用氯仿／己烷(1∶1)作洗脫液，通過柱層析使之純化。將所選擇的部分蒸發(fā)得到純的內(nèi)-2-三氟乙酰胺降冰片-5-烯(0．77g，28％)，而外和內(nèi)異構(gòu)體兩者的總產(chǎn)率為56％(1．46g)；mp44-46℃；1H NMR(CDCl3)δ0．83(dt，2H，H3／H7)，1．37-1．57(m，2H，H3／H7)，2．28(m，1H，H3／H7)，2．93(brs，1H，H1／H4)，3．13(brs，1H，H1／H4)，4．53(m，1H，H2)，6．04(dd，1H，H5／6)，6．45(dd，1H，H5／6)；13C NMR(CDCl3)δ35．2，42．5，45．8，48．8，50．0，115．8(q，J-288．1 Hz，-CF3)，130．7，141．0，156．7(q，J=36．6Hz，C=O)。
N6-(外-5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷-1-氧化物(式Ⅺ)。將間氯過苯甲酸(216mg，1．25mmol)加入二氯甲烷(40mL)中的N6-外-降冰片-5-烯-基腺苷(359mg，10mmol，1．0eq)溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)物，同時用薄層色譜監(jiān)測。24小時后再加入間氯過苯甲酸(173mg，1．0mmol)，48小時后再加一次。又過24小時后，蒸發(fā)溶劑得到粗產(chǎn)物。用CHCl3／MeOH／NH3(80∶20∶1)作洗脫液通過柱層析純化，得到純產(chǎn)物5(239mg，61％)；mp125-132℃；1H NMRδ1．1 5(dd，2H，H3／H7)，1．76-1．95(m，H3／H7)，2．46(brs，1H，H1”／H4”)，2．55(brs，1H，H1”／H4”)，3．23(m，3H，H2”，H5”，H6”)，3．62(m，2H，H5a’，b’)，3．95(d，1H，H4’)，4．15(brs，1H，H3’)＜4．63(s，1H，H2’)，5．12(brs，1H，OH)，5．27(d，1H，OH)，5．72(d，1H，OH)，5．90(d，1H，H1’)，8，17(brs，1H，NH)，8．60(s，1H，H2／8)，8．65(s，1H，H2／8)；13C NMRδ22．8，34．8，36．4，43．8，48．8，50．7，52．1，61．1，70．1，73．8，85．5，87．4，118．5，142．2，142．7，142．8，146．3，MS(C17H22N5O5)m／e 392。
實施例7-興奮劑化合物的活性對本興奮劑化合物進(jìn)行試驗以檢測其抑制DDT1MF-2(DDT)細(xì)胞中異丙基腎上腺素刺激所致的cAMP積聚的能力。這種作用是通過A1-腺苷受體(A1AR)的作用而介導(dǎo)的。為了對比，將環(huán)氧化物N6-(5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷(內(nèi)-和外-化合物的R-和S-對映異構(gòu)體)及其N-1氧化物與明確且有效的A1AR興奮劑(N6-環(huán)戊基腺苷(CPA))進(jìn)行比較。
原料和方法。
細(xì)胞培養(yǎng)。在37℃下，在被水濕潤的5％CO2和95％空氣混合氣中，在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基上將DDT1MF-2細(xì)胞(美國模式培養(yǎng)物保藏所)培養(yǎng)成單層細(xì)胞，此培養(yǎng)基包括5％胎牛血清，100U／mL青霉素G，0．1mg／mL鏈霉素和2．5μg／mL兩性霉素B。以0．2-1．0×104細(xì)胞／cm2種植細(xì)胞，用含1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的二價陽離子游離磷酸鹽緩沖溶液解吸后，每周進(jìn)行兩次傳代培養(yǎng)。試驗在細(xì)胞中進(jìn)行，將其生長至1天預(yù)匯合(preconfluent)。
cAMP測定。通過A1AR興奮劑抑制(-)異丙基腎上腺素刺激所致的cAMP積聚來確定A1AR興奮劑的能力。通過在5mL含1mM EDTA的二價陽離子游離Hank’s平衡鹽液中培養(yǎng)而使DDT細(xì)胞解吸。以500g將細(xì)胞懸浮液離心5分鐘，用輕度懸浮液再次沖洗，再離心，并懸浮在HBSS中。然后于37℃在微型驅(qū)散管(microfuge tubes)中用0．5mL HBSS培養(yǎng)細(xì)胞(0．15-2mg蛋白)共10分鐘，HBSS含100μM環(huán)戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮、1μM(-)異丙基腎上腺素和不同濃度的腺苷受體興奮劑(0．05-1000nM)。培養(yǎng)結(jié)束時，將試管置于沸水浴中5分鐘以使反應(yīng)終止。冷卻至室溫后，以10，000g將試管離心2分鐘，保留上清液。使用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)對照，根據(jù)Lowry等的方法(Lowry，O．H．，N．J．Rosebrough，A．L．Farr，R．J．RandallJ．Biol．Chem．193∶265-275)測定細(xì)胞的蛋白含量。
根據(jù)前面所述的競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法測定上清液的cAMP含量(Standifer，K．M．，J．Pitha，S．P．BakerNaunyn-Schmiedeberg’s Arch。Pharmacol．339129-137)。簡言之，即在4℃將等份上清液(50μL)在0．2mL含25mM Tris-HCl緩沖液(PH7．0)，8mM茶堿，0．8pmol[3H]cAMP(31．4Ci／mmol，New England Nuclear)和20μg牛心臟cAMP依賴性蛋白激酶(Sigma，Chemical Co．)的容積中培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)結(jié)束時，向每管中加入75μl的50％(v／v)羥基磷灰石一水懸浮液，再加入4ml用冰預(yù)冷的10mM Tris-HCl緩沖液(PH7．0)。然后在減壓下將懸浮液注入Whatman GF／B玻璃纖維過濾器中，用另6ml用冰預(yù)冷的緩沖液沖洗濾液，置于又4mL Liquiscint(國家鑒定)的閃爍小瓶中，用液體閃爍儀測定放射活性。用未標(biāo)記的cAMP的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的cAMP數(shù)量。用無線性回歸公式(Marquardt-Levenberg)的濃度效應(yīng)分析法確定對最大cAMP積聚產(chǎn)生50％抑制的化合物的有效濃度。
結(jié)果。(-)異丙基腎上腺素(1μM)本身可使DDT細(xì)胞中的cAMP積聚增加至超出基本水平57倍。CPA和環(huán)氧化物衍生物以濃度依賴性方式抑制(-)異丙基腎上腺素刺激所致的cAMP積聚，如下表8所示用EC50值表示。CPA和N6-(5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷的外和內(nèi)消旋異構(gòu)體抑制cAMP積聚時相似的EC50值約為1-2nM。相對而言，外異構(gòu)體(12)的N-氧化衍生物較CPA或N6-(5，6-環(huán)氧降冰片-2-基)腺苷的外-和內(nèi)-異構(gòu)體的效能更小，EC50值為403nM。
在37℃用1μM(-)異丙基腎上腺素和各種濃度的化合物將aDDT細(xì)胞培養(yǎng)10分鐘。按試驗部分所述測定積聚的cAMP和EC50值。每10分鐘形成的基本的cAMP和(-)異丙基腎上腺素刺激所致cAMP積聚分別為8±3和458±41 pmol。每個值為進(jìn)行三次重復(fù)測定的平均數(shù)±SE。
實施例8-用途、制劑和用法使用本領(lǐng)域技術(shù)人員目前已知或預(yù)知的任何適合的方法和技術(shù)，可以達(dá)到本發(fā)明化合物和含此化合物的組合物的治療和預(yù)防的應(yīng)用。而且，本發(fā)明化合物還可用作制備其它有用的化合物和組合物的起始原料或中間體。本發(fā)明化合物用于各種非治療和治療的目的。從實驗中很顯然本發(fā)明化合物具有有效的抗心律失常的活性。尤其是，它們可用于調(diào)節(jié)動物(更優(yōu)選哺乳動物，最佳優(yōu)選是人)的心臟心律失常(包括PVST)。
已證實興奮劑和拮抗劑對心臟的變時性、變導(dǎo)性和收縮性起作用，這使得它們在治療上可用作心臟活動的刺激劑或調(diào)節(jié)劑，因而影響心臟功能。例如，本發(fā)明化合物的調(diào)節(jié)活性可影響心率(變時性作用)和心沖動傳導(dǎo)(變導(dǎo)性作用)。診斷學(xué)上本發(fā)明化合物也可用于確定心功能參數(shù)，如用作確定腺苷受體是否是心臟或其它器官機(jī)能障礙的介質(zhì)的藥理學(xué)試劑。
本發(fā)明化合物也可作為體內(nèi)和體外研究的標(biāo)準(zhǔn)，即測定或比較直接或間接通過腺苷受體起作用的其它興奮劑和拮抗劑的活性。作為這些比較的試劑，本化合物是非常有價值的藥理學(xué)物質(zhì)。它們對A1腺苷受體的高度親和力和選擇性，使它們成為有關(guān)全身的那些受體的功能的信息的重要來源。
本發(fā)明化合物的其它用途包括用于描繪器官或組織的腺苷受體的結(jié)構(gòu)或位置的特征。例如，用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或方法，在本發(fā)明化合物上附著適當(dāng)?shù)臉?biāo)記或信息來實現(xiàn)這一目的。適用于與本發(fā)明化合物接合的標(biāo)記包括(但不限于此)放射性標(biāo)記(如放射性同位素)、熒光標(biāo)記和生物素標(biāo)記。適用于標(biāo)記本發(fā)明化合物的放射性同位素包括溴-77、氟-1 8、碘-131、碘-123、碘-125、碘-126、碘-133、銦-111、銦-113m、鎵-67、鎵-68、釕-95、釕-97、釕-103、釕-105、汞-107、汞-203、錸-99m、錸-105、錸-101、锝-99m、碲-121m、碲-99m、碲-125m、銩-165、銩-167、銩-168和氚。優(yōu)選的同位素是γ-發(fā)射的銦和锝-99m，因為這些同位素可用γ相機(jī)檢測到，并具有適于體內(nèi)成象、適合的半衰期?；蛘?，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都知道也可使用非放射性標(biāo)記，例如，酶-底物復(fù)合體，如生物素-親和素，辣根過氧化酶-堿性磷酸酶等。另外，用于標(biāo)記本發(fā)明化合物的熒光實體包括熒光素鈉、熒光素異硫氰酸鹽和德克薩斯紅磺酰氯。照此，本化合物可用于顯現(xiàn)體內(nèi)或體外器官或組織的結(jié)構(gòu)或功能，其中有A1腺苷受體。
本發(fā)明的另一個實施方案包括本化合物將治療化合物帶到A1腺苷受體位點的用途。由于本發(fā)明化合物的專一性，它們可與治療化合物接合以將治療化合物帶到A1腺苷受體附近。還有，在本發(fā)明化合物對特殊類型組織(如心臟組織)具有選擇性的情況中，這些化合物可將治療劑或診斷劑帶到這些部位。
本發(fā)明化合物的用法是用作抗心律失常劑。因此，作為活性成分的包含本發(fā)明化合物的藥物組合物可用于預(yù)防或治療人或其它哺乳動物的心律失常。
給藥量將依據(jù)所需的抗心律失常效應(yīng)；所治患者的類型；患者的年齡、健康狀況、體重、當(dāng)前的治療方法；治療次數(shù)；治療比率等情況來決定。有利的是，所給予的活性成分的劑量可以是，例如，皮膚給藥為1-約500mg／kg；口服，0．01-200mg／kg；鼻內(nèi)，0．01-約100mg／kg；以及氣霧劑0．01-約50mg／kg(動物體重)。
以濃度表示，本發(fā)明的活性成分可在新組合物中經(jīng)皮膚、皮下、鼻內(nèi)、支氣管、肌肉、陰道內(nèi)、靜脈內(nèi)或口服使用，濃度為占組合物的約0．01約-50％w／w，尤其是占組合物的約0．1-約30％w／w。優(yōu)選新化合物占組合物的約1-約10％，最佳優(yōu)選新組合物包含約5％新化合物。
本發(fā)明組合物可以各種形式，如片劑、軟膏、膠囊、丸劑、粉劑、氣霧劑、顆粒劑和口服液或懸浮劑等形式使用是有利的，其中含有指定的適量活性成分。本文和所附的權(quán)利要求書中所指的這些組合物通稱“藥物組合物”。尤其是它們可以是單位劑量形式，即，適合用于人或動物的物理上分散單位(適合作為單元劑量)，每一單位包含預(yù)定量活性成分和一種或多種藥物上可接受的其它成分(如稀釋劑或載體)，其中活性成分足以產(chǎn)生預(yù)期的治療或預(yù)防作用。
當(dāng)藥物組合物為氣霧劑時，可將活性成分裝在含推進(jìn)劑(如二氧化碳、氮氣、丙烷等)和常用輔助劑(如共溶劑、濕潤劑等)的加壓氣霧劑容器中。
當(dāng)藥物組合物為軟膏時，活性成分可與稀釋劑賦形劑(如可可脂、粘性聚乙二醇、氫化油)混合，如需要可將這些混合物乳化。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物包含作為活性成分的有效量的一種或多種無毒的藥物上可接受的成分。用于組合物中的這些成分的實例包括乙醇、二甲亞礬、甘油、礬土、淀粉、碳酸鈣、滑石、面粉和等量無毒載體與稀釋劑。
應(yīng)該清楚，本文所述的實施例和實施方案僅僅是用于舉例說明本發(fā)明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種修改或變化，這些修改或變化應(yīng)包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種腺苷環(huán)氧化合物，其選擇性和特性地結(jié)合作為所述受體興奮劑的A1腺苷受體，其中所述化合物是N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷或類似物、衍生物或其異構(gòu)體。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自下式
5．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物具有下面結(jié)構(gòu)式
6．一種用于控制心房纖顫時的心室速率的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷。
9．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物選自下式
10．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物具有下面結(jié)構(gòu)式
11．一種用于控制心房撲動時的心室速率的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
13．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷。
14．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物選自下式
15．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物具有下面結(jié)構(gòu)式
16．一種用于控制腺苷依賴性室上心搏過速的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
18．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述第二種化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷，或類似物，衍生物或其異構(gòu)體。
19．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述化合物選自下式
20．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述化合物具有下式
21．一種用于抑制室上心搏過速時的A-V結(jié)性傳導(dǎo)的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物，或類似物，衍生物或其異構(gòu)體。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
23．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷。
24．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物選自下式
25．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物具有下式
26．一種用作A1腺苷受體的興奮劑的組合物，所述組合物包括N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物，或類似物，衍生物或其異構(gòu)體；以及藥物上可接受的載體。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
28．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述化合物為N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述化合物選自下式
30．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述化合物具有下式
31．一種用于制備核苷或類似物、衍生物、異構(gòu)體，或其鹽的環(huán)氧化物的方法，其中所述方法包括將核苷或類似物、衍生物、異構(gòu)體，或其鹽與二甲基二環(huán)氧乙烷反應(yīng)。
32．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述核苷為腺苷。
33．一種用于制備5-氨基-降冰片-2-烯的優(yōu)選異構(gòu)體的方法，所述方法包括用降冰片-5-烯-2-羧酸作為反應(yīng)起始原料。
34．一種使室性節(jié)律恢復(fù)正常并改善心房纖顫時的室性血流動力學(xué)和心輸出量的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧環(huán)烷基)腺苷化合物。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物具有下式
其中R1=1-4個碳原子的烷基。
36．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，所述方法包括給予有效量的N6-(環(huán)氧降冰片基)腺苷化合物。
37．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物選自下式
38．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物具有下式
全文摘要
腺苷和黃嘌呤衍生物以及包含這些化合物的組合物都是腺苷受體的有效的選擇性興奮劑和拮抗劑。這些衍生物和組合物常用于治療包括某些心臟心律失常在內(nèi)的疾病。
文檔編號C07D473/06GK1206420SQ96199338
公開日1999年1月27日 申請日期1996年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月29日
發(fā)明者路易茲·比拉迪內(nèi)里, 雷·奧爾桑, 斯蒂芬·巴克爾, 彼得·J·斯卡梅里斯, 彼得·G·米爾納, 朱格·R·普菲斯特 申請人:佛羅里達(dá)大學(xué)