專利名稱：突變型人生長激素和它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有

圖1所給氨基酸序列的突變型人生長激素蛋白，一種具有編碼所述氨基酸序列的堿基序列的脫氧核苷酸，均具有一定的氨基酸序列的突變型人生長激素蛋白，其中它的氨基酸殘基部分被部分置換，插入或缺失至一定程度，但不致使其對生長激素受體顯示增強的親和性以及保持其降低了的生長激素活性的特征性特點喪失，以及涉及它們在制備治療巨人癥和肢端巨大癥的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的無生物活性的人生長激素作為正常生長激素受體的拮抗劑而起作用，從而抑制由于過量分泌而造成的紊亂和過度生長，并且可被用作對巨人癥和肢端巨大癥的治療具有改善的安全性的藥物。
因為由生長激素帶來的基因異常，業(yè)已知由于生長激素的不足而致使的生長遲緩以及由于過度表達而造成的巨人癥和肢端巨大癥。對于生長激素不足，已廣泛使用補充生長激素的療法，但是迄今還未開發(fā)出對于巨人癥和肢端巨大癥有效的藥物。
在1978年，Kowarski等首次報道發(fā)現(xiàn)了一種無生物活性的生長激素(一種突變型生長激素)(Kowarski，A.A.等.J.Clin.Endocrinol.Metab.，47461，1978)。然而，至今仍未在分子水平上對突變型生長激素進行說明，雖然已公開報道在來自患侏儒癥的小孩的血液中鑒定出一種生長激素的異常多聚體(Valena，L.J.等，N.Engl.J.Med.，312214，1985)。在循環(huán)系統(tǒng)的血液中被發(fā)現(xiàn)含有無生物活性的生長激素的小孩顯示出突變型生長激素的高血液水平，而胰島素樣生長因子(IGF-1)的低血液濃度，從而導(dǎo)致遲緩的生長和發(fā)育。但是，該種生長遲緩以對施用的正常生長激素具有良好的反應(yīng)為特征(Hayek A.等，Pediatr.Res.，12413，1973；Rudman，D.等，N.Engl.J.Med.，305123，1981；Plotnick，L.P.等，Pediatrics 71324，1983；Bright，C.M.等，71576，1983)。
在最近一些年里，蛋白質(zhì)工程和基因工程的發(fā)展已使對激素與它們的受體的結(jié)合以及它們活性的引發(fā)的結(jié)構(gòu)研究成為可能，并由此弄清楚了各種遺傳疾病的原因。
Cunningham等通過使用蛋白質(zhì)工程方法制備了大量人生長激素變異體來對生長激素受體的結(jié)合位點進行研究，并且因此而鑒定出參與生長激素與其受體結(jié)合的區(qū)域，該區(qū)域形成了由氨基末端(2-19)氨基酸殘基，羧基末端(54-74)氨基酸末端和羧基末端(167-191)氨基酸殘基組成的區(qū)域(Cunningham，B.C.等，Science 2431330，1989)。
此外，Uchida等制備了氨基酸殘基被經(jīng)過不同的置換的生長激素變異體，由此測定它們對3T3-F 442A細(xì)胞的分化活性，從中得到啟發(fā)即氨基酸序列62-67區(qū)域?qū)τ谏锘钚缘陌l(fā)揮具有極其重要的意義(Uchida等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，172352，1990)。
最近，對人生長激素與其結(jié)合蛋白(受體蛋白質(zhì)的一部分)的結(jié)合方式的結(jié)晶學(xué)研究得到一個值得注意的發(fā)現(xiàn)(De Vos A.M.等，Science 255.306，1992)；其假設(shè)生長激素連續(xù)地以一種方式與生長激素受體結(jié)合，該方式為第一個位置上的生長激素的功能區(qū)1與第一個生長激素受體結(jié)合，接著生長激素的第二個功能區(qū)2與第二個生長激素受體結(jié)合，從而形成了生長激素受體的二聚體，于是生長激素的信號被傳遞至細(xì)胞中。
其它的感興趣的是雖然人生長激素的區(qū)域1與來自區(qū)域2的氨基酸殘基不同，但受體蛋白的結(jié)合位點表明了共同的氨基酸殘基。而且還認(rèn)識到通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)產(chǎn)生的生長激素變異體競爭性地與受體結(jié)合(Fuh G.等，Science，2561677，1992)。
基因分析的最新進展已使識別導(dǎo)致大量遺傳疾病的異?；虺蔀榭赡?。對于造成侏儒癥的生長激素的基因也是這樣。由于生長激素發(fā)揮它的生理活性是通過細(xì)胞膜上的受體來介導(dǎo)的，因此與生長激素相關(guān)的基因異?？杀淮致缘胤譃閮深悾词荏w基因的異常和生長激素本身的異常。
因為生長激素存在于常染色體上，因此它被已知采取隱性遺傳的形式。為了讓這些異常的表型表達，因此要求親代的等位基因同時產(chǎn)生異常。
過去，已報道多例由于親代生長激素基因的突變型的復(fù)雜組合而產(chǎn)生的生長遲緩，例如全部缺失，部分缺失以及堿基置換。當(dāng)親代之一為正常時，已知突變型生長激素存在于細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒內(nèi)部。
然而，對于生物體中的錯義突變產(chǎn)生的突變型生長激素的分子水平的分析以及其在生物體中將起的作用仍未進行詳細(xì)的研究。現(xiàn)已知的都不是抑制生長激素過度作用的有效方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有延遲骨齡的患有侏儒癥的5歲男孩顯示出生長激素的高血清濃度，并且在誘導(dǎo)試驗中保持較低水平的IGF-1，雖然他顯示出增高生長激素的血清濃度，這個發(fā)現(xiàn)和接下來的另外的進一步研究結(jié)果成為了本發(fā)明。
這些內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)現(xiàn)似乎可能與在生長激素不敏感性綜合癥中注意到的現(xiàn)象一致(Rosen bloom，A.L.，Acta Pediatr.Scand.(Suppl)，383117，1192)。
然而，連續(xù)施用生長激素導(dǎo)致了病人的生長的明顯提高，這排除了將它診斷為Laron類型綜合癥的可能，因為Laron類型侏儒癥是由于生長激素受體的異常而造成的。
本發(fā)明人使用Nb2生物分析方法發(fā)現(xiàn)在患有這類缺陷的小孩中所發(fā)現(xiàn)的血清生長激素是一種無活性類型的生長激素，不象正常小孩分泌的那種，并且還通過使用等電聚焦將該激素鑒定為突變型生長激素。
發(fā)現(xiàn)該突變型生長激素在生長激素的密碼子77上用半胱氨酸殘基置換了精氨酸殘基(R→C)(圖1)。置換的位點位于生長激素的第二條α螺旋上，在與受體結(jié)合的位點1之后(Cunningham，B.C.等，Science，254821，1991)。被取代的半胱氨酸被認(rèn)為形成了一個新的二硫鍵，并使產(chǎn)生的分子改變電荷，并且導(dǎo)致構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生了具有降低了的生長激素活性的突變型生長激素。
在生長激素的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，通過配體結(jié)合的生長激素受體的二聚作用以及它們蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基的磷酸化被認(rèn)為是極其重要的(Argetsinger，L.S.等，Cell，74237，1993Silva，C.M.等，J.Biol Chem.26927532，1994)。
生長激素結(jié)合蛋白位于胞外功能區(qū)，并在體內(nèi)血清中起生長激素儲存器的作用(Herington，A.C.等，Acta Endocrinol(Copenh)，12414，1991)。
發(fā)現(xiàn)突變型生長激素對生長激素結(jié)合受體的親和性比野生型的大約6倍(圖7和8)，這意味著突變型生長激素的功能區(qū)1和2顯示出對來自野生型的受體的不同的親和性。突變型生長激素的生物學(xué)特征在于通過受體的磷酸化而形成的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的明顯降低，盡管它對受體蛋白的親和性大。
在給病人連續(xù)三天施用野生型生長激素后，沒有引起對IGF-1的顯著反應(yīng)，而當(dāng)在一段延長的時間內(nèi)施用以起拮抗劑的作用來抑制內(nèi)源突變型生長激素的分泌以及它與受體的結(jié)合時，它被發(fā)現(xiàn)在增加IGF-1的血漿濃度和促進生長和發(fā)育中起作用。
因此，這些發(fā)現(xiàn)使得本發(fā)明人得出結(jié)論，即突變型生長激素，當(dāng)被施用于患有由生長激素過度分泌造成的巨人癥和肢端巨大癥的病人時，可起拮抗劑的作用以抑制他們的過度生長。
在上面新的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明，并涉及(1)一種具有圖1所給氨基酸序列的突變型人生長激素蛋白，(2)具有編碼所述氨基酸序列的堿基序列的脫氧核苷酸，(3)均具有一定氨基酸序列的突變型生長激素蛋白，其中該氨基酸殘基部分被部分置換，插入或缺失至一定程度，但不致使其顯示出的對生長激素受體的增強的親和性以及保持其降低了的生長激素活性的特征性特點喪失，以及(4)它們的應(yīng)用。
本發(fā)明的突變型人生長激素由于其內(nèi)源性的同一性，對生物體不產(chǎn)生任何副作用，然而它們只誘導(dǎo)生長的遲緩，并且可由此找到作為治療巨人癥和肢端巨大癥的有效藥物的應(yīng)用，在過去對于這些病還未開發(fā)出治療劑。突變型生長激素顯示出高出約6倍的受體親和性，并可以等于或小于在侏儒癥治療中采用的劑量用作治療巨人癥的藥物。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可容易并可行地將本發(fā)明的新的突變型生長激素DNA進行核苷酸的部分缺失，插入或取代從而產(chǎn)生具有增強的受體親和性，但基本上無激素活性的生長激素變異體，它通過圖2和3所示序列來說明。另外通過使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，不僅可以識別突變型生長激素與受體的結(jié)合位點，而且可產(chǎn)生該結(jié)合位點的肽，從而利用它作為治療巨人癥和肢端巨大癥的藥物。
本發(fā)明的新的突變型生長激素可通過將激素編碼DNA連鎖至可復(fù)制質(zhì)粒上，接著用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞并培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。這些宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，酵母和動物細(xì)胞。
原核細(xì)胞，例如細(xì)菌適宜于脫氧核苷酸的克隆。例如，源于大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322含有抗氨芐青霉素或四環(huán)素的基因，提供了一切實可行的識別產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。此外，細(xì)菌質(zhì)粒含有在它們自身蛋白質(zhì)的表達中起作用和操縱的啟動子。
除原核細(xì)胞外，包括酵母在內(nèi)的真核細(xì)胞也是可用的，在酵母屬(Saccharomyces)，酵母的一個菌株的表達中通?？刹捎觅|(zhì)粒YRp7(Stinchcomb等，Nature，28239，1979)。
還可使用動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，它們的細(xì)胞系包括例如海拉細(xì)胞，CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞，COSM6和COS-7，由此多瘤病毒，腺病毒2，巨細(xì)胞病毒和猴病毒的啟動子起著有利的作用以控制這些細(xì)胞系的質(zhì)粒表達(Thomsen等，PNAS，81659，1984)。
可將動物用突變型生長激素或它的變異體免疫，從而產(chǎn)生它們的抗體。另外，可將動物用已知方法免疫以制備來自可分泌特異性抗體的細(xì)胞的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明，可容易地大量制備突變型生長激素和它的變異體，并可提供對它們在分子水平上的較好認(rèn)識，這使得有可能開發(fā)與生長激素相關(guān)的疾病的治療和診斷劑。這包括基因治療的藥物的制備，它提供了對于這些疾病的必需的治療方法。
可將突變型生長激素的核苷酸或結(jié)合位點蛋白質(zhì)的核苷酸摻入到包括來自逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒等的病毒載體的適宜載體中，這提供了將它們用作巨人癥和肢端巨大癥的基因療法的藥物的可能性。
下面參考附圖描述一實例以更詳細(xì)地說明本發(fā)明，其中圖1為實施例1中所得的突變型生長激素的氨基酸序列(77位置上，R→C)以及編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列。
圖2為實施例1中所得的通過取代(53位置，C→A)而產(chǎn)生突變的突變型生長激素的氨基酸序列以及編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列。
圖3為實施例1中所得的通過取代(165位置C→A)而產(chǎn)生突變的突變型生長激素的氨基酸序列以及編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列。
圖4a為突變型生長激素的基因結(jié)構(gòu)，PCR擴增的引物的設(shè)計；五個exxon位點通過框來指示，而PCR引物通過箭頭來指示；圖4b為顯示突變型生長激素的DNA序列的照片，其中顯示出在密碼子77精氨酸改變?yōu)榘腚装彼幔ㄟ^使用PCR對基因組DNA和RNA進行直接序列分析而確定。
圖5為將53或165位置上的半胱氨酸改變?yōu)楸彼岬臉?gòu)建cDNA的流程圖，具有下列序列的寡核苷酸被用作引物f15′ACAGAAACAGGTGGGGGCAA3′f25′AATAGACTCTGAGAAAGCGGG3′f35′GTCCATGTCCTTCCTGAAGGCGTAGAG3′使用引物f1和R2進行PCR擴增，在位置53進行突變(C→A)，同時使用引物f1和R3在位置165進行突變(C→A)。在用限制性酶HinfI和NIaIII進行消化后分別制備正常生長激素的cDNA下游部分，接著分別用連接酶結(jié)合至PCR產(chǎn)物上。
圖6為顯示血清中突變型和野生型生長激素的等電聚焦(IEF)結(jié)果的圖。將血清樣品(150-300ul)在1％ HPMC-4％安佛林(PH3.5-8.0)中進行等電聚焦，分離，合并樣品級分，并分析生長激素(■)的免疫活性，在IEF期間形成的pH梯度用(◆)來表示。通過用半胱氨酸取代精氨酸的突變被認(rèn)為致使等電點降低pH0.16。野生型和突變型生長激素的峰分別用白色和黑色箭頭表示。
a；先證者(病人一男孩)b父親圖7a為顯示野生型和突變型生長激素如何抑制125I-標(biāo)記的人生長激素與IM-9細(xì)胞結(jié)合的圖。
培育最終濃度為1-3×107/ml的細(xì)胞(IM-9)，同時按照它們的加入量-濃度的函數(shù)關(guān)系，以增加的濃度加入野生型和突變型生長激素0.8ng/ml[125I]-標(biāo)記的人生長激素(Du′pont，USA)(0.33uCi/ml)，250ul總?cè)芤海?0℃。培養(yǎng)4小時后，收集、洗滌細(xì)胞，檢測結(jié)合至細(xì)胞上的放射性。
圖7b為顯示抑制[125I]-標(biāo)記的人生長激素與生長激素結(jié)合蛋白的結(jié)合的圖。
在4℃下將[125I]-標(biāo)記的人生長激素(0.6uCi/ml)，重組人生長激素結(jié)合蛋白(0.6nM)和抗生長激素受體鼠克隆抗體(Mab 263；AGEN，澳大利亞)(1∶100,000)培養(yǎng)16小時，同時增大野生型和突變型生長激素各自的濃度，接著加入10％抗鼠IgG(山羊)抗體(50ul)，1％正常鼠血清(50ul)和5％PEG(300ul)。在4℃下，將反應(yīng)溶液再培養(yǎng)4小時并離心，通過γ-計數(shù)器檢測沉淀(片狀沉淀物)，表示出三次測定的平均值。
圖8a為顯示IM-9細(xì)胞中依賴于野生型和突變型生長激素的酪氨酸磷酸化作用的電泳圖譜照片。
在37℃下，在存在和缺乏100ng/ml人生長激素(泳道1和2)；存在野生型生長激素(泳道3；10ng/ml，泳道4；100ng/ml)，突變型生長激素(泳道5；10ng/ml，泳道6；100ng/ml)和10ng/ml固定濃度的突變型生長激素，增大濃度的野生型生長激素(泳道7；10ng/ml，泳道8；25ng/ml，泳道9；50ng/ml，泳道10；100ng/ml)時分別將IM-9細(xì)胞處理15分鐘。用磷酸化的酪氨酸特異性抗體免疫沉淀這些細(xì)胞的去污劑溶胞產(chǎn)物并通過使用與辣根過氧化物酶結(jié)合的相同抗體的Western印跡分析來進行檢測。以千道爾頓為單位的分子量表示于左邊。
“箭頭”符號指通過生長激素的作用產(chǎn)生的酪氨酸被磷酸化的蛋白帶。
圖8b為顯示p120的抗磷酸化的酪氨酸免疫印跡分析的光密度檢測結(jié)果的條框圖。
用光密度法確定酪氨酸被磷酸化的p-120(IM-9細(xì)胞被報道稱為JAK2)的量。光密度的強度以相對于由作為無生長激素處理的對照所得到的值來表示。所示的為來自三個獨立實驗的所得值的平均值(±SEM)，統(tǒng)計分析由學(xué)生t-試驗完成。實施例1下面實驗是用取自上面曾提到的顯示出延遲骨齡的患有侏儒癥的5歲男孩的血液樣品來進行的激素分析方法使用由Pharmacia of Sweden生產(chǎn)的放射免疫分析試劑盒來分析血清中生長激素的濃度，用稍加修改的Tanaka等的方法(Tanaka T.等，J.Cli.Endocrinol Metab.，511058，1980)測定生長激素的生物活性，由此在Nb2生物分析方法中，將人催乳素(hPRL)兔抗血清(NIDDK-抗-hORK-IC5；NIH)以100,000倍的稀釋度加入以抑制人催乳素的中和刺激生長的活性。通過這些方法，測定和分析了患有侏儒癥的病人和作為對照的正常受試者的血清中的生長激素。等電聚焦使用Tsventnitsky等的方法(Tsventnitsky V.等，Biochem.J.，307239，1995)進行等電聚焦；用1％ HMPC(羥丙基甲基纖維素)-4％安佛林緩沖液以pH3.0-8.0的pH梯度對血清樣品進行等電聚焦以進行分離，從中收集不同級分用于免疫活性生長激素的分析。來自10位正常受試者的合并血清樣品被用作對照。突變型生長激素基因的分離及基因分析從外周血白細(xì)胞中分離基因組DNA(Gross-BellardM.等，Eur.J.Biochem.，3632，1973)并通過PCR方法擴增(圖4)。稱為F3的是寡核苷酸；5′TATGAATTCCTCTGCCTGCCCTGCCTCAAGAG3′，GAD5′CTAACACAGTCTCTCAAAGT3′，GSD5′ACTTTGAGAGACTGTGTTAG3′，GAE5′TGGAGTGGCAACTTCCAGGG3′ 和GHS15′CTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTAGCTGCA3′，被用作基因組DNA擴增的啟動子。
通過下面方法來進行PCR擴增在92℃，將F3-GAD和GHS1-GAD完成3分鐘的首次變性，接著進行35次由92℃下，1分鐘變性，60℃下，2分鐘復(fù)性，72℃下，2分鐘伸展組成的循環(huán)，最后一次循環(huán)伸展在72℃下進行7分鐘，并且對于GSD-GAE，將由在92℃下，1分鐘變性，60℃下，2分鐘復(fù)性和72℃下，2分鐘伸展組成的循環(huán)重復(fù)35次，僅最末循環(huán)中將伸展進行7分鐘。
提取擴增產(chǎn)物，接著亞克隆至pBS SK(+)(Stratagene，USA)或pT7blue(Novagem，USA)并用373ADNA序列分析儀(Perkin Elmer，USA)進行測序。進一步鑒定病人DNA中的突變位點(Arg→Cys)，并使用雙鏈DNA循環(huán)測序試劑盒(Gibco BRI，USA)將所得到的PCR產(chǎn)物進行直接DNA測序以排除在PCR反應(yīng)中所發(fā)生的任何錯誤反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人DNA已在77位置上由半胱氨酸殘基取代了精氨酸殘基(圖1)。RNA分析通過使用MPRM Ficoll-Hypaque(Flow Lab.，USA)分離淋巴細(xì)胞，用常規(guī)方法分離全部RNA(Maniafes T等，Cold SpringHarborLaboratory Press，1982)。用lug RNA合成cDNA(Martynoff G.等，Biochem Biophys，Res.Commn.，93645，1980)，將合成的cDNA用于PCR反應(yīng)以擴增生長激素基因的cDNA。在下面條件下，GHS2；5′TGGACAGCTCACCTAGCTGCA3′， GHAS1；5′GGATTTCTGTTGTGTTTCCT3′，GHS3；5′TTGACACCTACCAGGAGTTT3′和GHAS3；5′CTAGAAGCCACAGCTGCCCT3′被用作寡核苷酸引物來進行PCR擴增。
對于GHS2-GHAS1，在92℃，將變性進行3分鐘，將由在92℃下，變性1分鐘，在68℃下，復(fù)性1.5分鐘和72℃下，伸展1.5分鐘組成的循環(huán)重復(fù)40次，其中最未一次循環(huán)將伸展進行7分鐘。
對于GHS3-GHAS3，進行首次變性，接著將由在92℃下，變性1分鐘，在68℃下，復(fù)性1.5分鐘和在72℃下，伸展1.5分鐘組成的40次循環(huán)重復(fù)40次，其中最末次循環(huán)將伸展進行7分鐘，并對擴增產(chǎn)物進行堿基測序。
野生型和突變型生長激素cDNA的構(gòu)建通過PCR擴增兩種類型的人生長激素即野生型和突變型的cDNA，其中使用從人生長激素產(chǎn)生垂體腺瘤細(xì)胞制備的cDNA文庫(Clontech，USA)。每一個已識別的生長激素cDNA的結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性通過DNA的堿基測序來證實。
對于用于PCR方法中的寡核苷酸引物，GHS1被用作有義引物，而5′TAAGAATTCGAGGGGTCACAGGGATGCCACCCC3′被用作反義引物。
在下面反應(yīng)條件下進行PCR首次變性在92℃下進行3分鐘，將由在92℃下變性1分鐘，在48℃下復(fù)性1.5分鐘及在72℃下伸展1.5分鐘組成的循環(huán)重復(fù)40次，其中最末次循環(huán)將伸展進行7分鐘。
使用轉(zhuǎn)化子(Transformer)MT(C/ontech，USA)構(gòu)建突變型生長激素的cDNA。為了除去生長激素cDNA的信號序列，使用含有人工摻入的BamH1位點的有義引物(5′GCGGATCCTTCCCAACCATTCCCTTATC3′)和GHAS1作為反義引物來進行PCR擴增。通過直接堿基測序方法測定所得到的cDNA以證實突變(圖1)。野生型(正常)和突變型生長激素的表達和功能分析每一個產(chǎn)生野生型和突變型生長激素的表達載體包括含有源于λ-噬菌體的啟動子操縱基因PLOL的DNA序列，含有能結(jié)合宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗轉(zhuǎn)錄終止因子N-蛋白的N利用位點和能將野生型和突變型生長激素的mRNA結(jié)合到宿主細(xì)胞內(nèi)部的核糖體上的核糖體結(jié)合位點，ATG起始密碼子和將所需基因插入到帶有ATG起始密碼子ATG的噬菌體中的載體中的限制性酶位點的DNA序列(Japanese Patent Publication No.87780/1994)。
當(dāng)在阻遏物破壞溫度下加熱宿主細(xì)胞時將表達載體導(dǎo)入含有不耐熱阻遏物C1的適宜宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌，并使其分別表達野生型和突變型生長激素。該表達產(chǎn)物位于氨基末端，甲硫氨酸殘基來源于起始密碼子，但用特異性氨肽酶消去該甲硫氨酸殘基可產(chǎn)生成熟的野生型和突變型人生長激素(日本未審查專利公開號500003/1982)。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，離心或過濾細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，接著通過物理和化學(xué)方法溶胞以分離突變型生長激素。
通過已知方法的結(jié)合來完成純化步驟，這些方法包括用硫酸銨等的分級分離，凝膠過濾層析，離子交換層析，使用抗體的親和層析以及正向或反向高效層析。
為了制備用于實驗的少量樣品，將野生型和突變型生長激素分別克隆至質(zhì)粒的BamHI-EcoRI位點(pGEXKG)，并接著摻入至DH5α細(xì)胞中。也在用Pharmacia of Sweden提供的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的細(xì)胞系中制備表達產(chǎn)物。
業(yè)已認(rèn)為在通過上面方法獲得的重組突變型生長激素中的兩個半胱氨酸之間的分子內(nèi)交聯(lián)發(fā)生在三種不同的類型中，即正常類型(53-165)以及兩種突變型(53-77)和(77-165)。因此，通過圖5所示步驟將來自病人淋巴細(xì)胞的cDNA進行突變置換，從而產(chǎn)生其中在53或165位置上的半胱氨酸被丙氨酸殘基取代的cDNA。在這種情況下，可產(chǎn)生其中在53或165位置上的半胱氨酸被絲氨酸殘基取代的cDNA。
將這些基因在大腸桿菌中表達以產(chǎn)生兩種突變型生長激素，其中一對半胱氨酸分別在77和165位置(圖2)和53和77位置(圖3)上形成交聯(lián)。
用IRMA和Nb2生物分析體系測定野生型和突變型生長激素的各自生物活性。Nb2生物分析在存在或不存在來自在血清中沒有檢測出生長激素或催乳劑的病人的血清的情況下進行。將重組人生長激素結(jié)合蛋白(rhGHBP)各自加入至樣品中直至最終濃度為0.1，0.5或lnM。
通過一步受體分析方法(Lesniak，M.A.等，J.Biol.Chem.，2491661，1974)在能表達生長激素受體的人淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系IM-9中研究競爭性結(jié)合。
通過使用免疫沉淀來研究野生型和突變型生長激素與rhGHBP的直接結(jié)合。
用silva等的方法(Silva，M.D.等，Endocrinology，132101，1993)檢測IM-9細(xì)胞中的依賴于生長激素的酪氨酸磷酸化作用。在免疫沉淀和Western印跡分析方法中使用抗磷酸化的酪氨酸的單克隆抗體(RC20TranscutionLaboratories，USA)，用Amersham CO of USA生產(chǎn)的ECL試劑盒用肉眼檢測抗體的結(jié)合。
等電聚焦表明除已知的野生型(正常)生長激素外，突變型生長激素也存在于先證者(病人)的血清中(圖6)。
為了測定突變型生長激素基因是否具有生物反應(yīng)性，在用含有源于λ-噬菌體的啟動子操縱基因的表達載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達突變型和野生型生長激素基因從而得到產(chǎn)物，同時也將這些基因在GST融合蛋白質(zhì)體系中表達以獲得產(chǎn)物。
通過在IRMA細(xì)胞中的分析，發(fā)現(xiàn)突變型和野生型生長激素兩者均具有免疫反應(yīng)性。還通過Nb2生物分析法測定了它們的生物活性。
盡管在NB2生物分析法中，在無血清培養(yǎng)基中兩種物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)顯示出類似水平的生物活性，但在病人血清培養(yǎng)基中突變型生長激素的生物活性降低至小于野生型生長激素的一半。預(yù)計到在Nb2生物分析體系中生長激素結(jié)合蛋白造成干擾的可能性，向分析培養(yǎng)基中加入重組生長激素結(jié)合蛋白。
發(fā)現(xiàn)在存在0.5nM和lnM的重組生長激素結(jié)合蛋白時，突變型生長激素的生物活性與免疫反應(yīng)性的比值分別明顯降低至0.45±0.05(P＜0.05)和0.22±0.08(P＜0.05)，這些蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)于外周血液中的有效生理結(jié)合蛋白的濃度。
IM-9細(xì)胞中的[125I]-標(biāo)記的人生長激素與人生長激素受體的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)以依賴于濃度的方式通過從野生型變?yōu)橥蛔冃蜕L激素的置換轉(zhuǎn)換而變化。用突變型生長激素的置換在蛋白質(zhì)濃度為10-11-10-9M范圍內(nèi)顯示出凸出部。
它們各自分別在0.84±0.30nm和0.86±0.41nm處得到的IC50值幾乎相等。
然而，在蛋白質(zhì)濃度為10-1110-9M的范圍時，用突變型生長激素的置換不能平穩(wěn)地進行(圖7)。
此外，IM-9細(xì)胞中的[125I]-標(biāo)記的人生長激素與重組人生長激素結(jié)合蛋白的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)也以依賴于濃度的方式通過從野生型變?yōu)橥蛔冃蜕L激素的置換轉(zhuǎn)換而變化。
突變型生長激素具有0.12±0.02nM的IC50(3次測定，平均值±SE)，明顯低于野生型生長激素0.68±0.08nM的對應(yīng)值，證明對于結(jié)合蛋白的親和性高出野生型種類約6倍。
通過借助于Western印跡分析，比較了野生型和突變型生長激素之間的在使用的IM-9細(xì)胞中的生長激素受體中的依賴于生長激素的酪氨酸磷酸化作用。
與重組型生長激素和野生型生長激素，稱為正常生長激素兩者都促進酪氨酸磷酸化的事實相反，突變型生長激素自身不僅不能對酪氨酸的磷酸化起任何作用，而且明顯抑制由野生型生長激素誘導(dǎo)的磷酸化作用。抑制酪氨酸的磷酸化甚至可在當(dāng)突變型生長激素與野生型生長激素以1∶10的濃度被同時加入時觀察到(圖8)。
權(quán)利要求
1.一種具有圖1所給氨基酸序列的突變型人生長激素蛋白。
2.一種具有圖1所給堿基序列的脫氧核苷酸，它編碼權(quán)利要求1所述氨基酸序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的突變型人生長激素蛋白，特征在于所述突變型人生長激素具有對生長激素受體增強的親和性，并還保持降低了的生長激素活性。
4.一種具有如權(quán)利要求1所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它的氨基酸殘基部分被部分置換，插入或缺失至一定程度，但不致使其顯示出對生長激素受體的增強的親和性以及保持降低了的生長激素活性的特征性特點喪失。
5.一種具有圖2所給氨基酸序列的蛋白質(zhì)和編碼它的脫氧核苷酸。
6.一種具有圖3所給氨基酸序列的蛋白質(zhì)和編碼它的脫氧核苷酸。
7.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的肽，它包含一個所述蛋白的受體蛋白的結(jié)合位點，以及編碼所述肽的氨基酸序列的脫氧核苷酸。
8.一種具有編碼權(quán)利要求4所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列的脫氧核苷酸。
9.一種具有如權(quán)利要求2，5，6，7或8所述的各自排列在啟動子下游的脫氧核苷酸的表達質(zhì)粒。
10.一種通過用如權(quán)利要求9所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的生物細(xì)胞表達產(chǎn)生的產(chǎn)物。
11.一種抗體，它與權(quán)利要求1，4，5或6中所述的突變型人生長激素蛋白產(chǎn)生相互作用。
12.一種如權(quán)利要求11所述的為單克隆抗體的抗體。
13.一種用于治療巨人癥或肢端巨大癥的藥物，它包含一種如權(quán)利要求1，4，5，6或7所述的作為活性成分的蛋白或肽。
14.一種用于基因治療的藥物，它使用如權(quán)利要求2，5，6，7或8中所述的脫氧核苷酸。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，提供了對于生長激素顯示增強的親和性，但降低了激素活性的突變型人生長激素，編碼它的堿基序列，它們的生產(chǎn)方法以及所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的，對于生長激素受體具有增強的親和性的蛋白質(zhì)，可抑制生長激素與其受體的結(jié)合，同時它們保持降低了的生長激素活性，從而發(fā)現(xiàn)了其作為治療肢端巨大癥和巨人癥的藥物的用途。
文檔編號C07K14/575GK1162600SQ9710486
公開日1997年10月22日 申請日期1997年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月13日
發(fā)明者千原和夫 申請人:日本化學(xué)研究股份有限公司