專利名稱：含聚乙二醇蛋白質(zhì)結(jié)合物的藥物組合物的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的、蛋白質(zhì)的聚乙二醇(PEG)結(jié)合物。
各種天然的和重組的蛋白質(zhì)都具有醫(yī)藥有用性。一旦它們被純化、分離和配制后，它們便可經(jīng)非經(jīng)胃腸途徑給藥來用于各種治療適應(yīng)征。然而，非經(jīng)胃腸道途徑給藥的蛋白質(zhì)可能具有免疫原性，可能是相對不溶于水的，也可能具有短的藥理學(xué)半壽期。因此，要在病人體內(nèi)使蛋白達(dá)到有治療作用的血液水平，可能是困難的。
將蛋白質(zhì)與聚合物如聚乙二醇結(jié)合，可以克服這些問題。Davis等人在美國專利4,179,337中公開了將聚乙二醇(PEG)與蛋白質(zhì)如酶和胰島素結(jié)合以得到結(jié)合物，其中的蛋白質(zhì)免疫原性較小并保留了大部分生理活性。Nakagawa等人在美國專利4,791,192中公開了將PEG與胰島活化蛋白質(zhì)結(jié)合以降低其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.and Biotech，11，141-152(1985)中公開了用氯甲酸苯酯類化合物活化聚乙二醇以修飾核糖核酸酶和過氧化物歧化酶。Katre等人在美國專利4,766,106和4,917,888中還公開了通過聚合物結(jié)合作用而使蛋白質(zhì)增溶。將PEG和其它聚合物與重組蛋白質(zhì)結(jié)合可降低免疫原性，增大半壽期。參見Nitecki等人的美國專利4,902,502；Enzon，Inc.的國際申請PCT/US 90/02133；Nishimura等人的歐洲專利申請154,316以及Tomasi的國際申請PCT/US 85/02572。King等人在Int.Archs.Allergy appl.Immun.66，439-446(1981)中描述了一種用O-(RO-PEG)-S-甲酰氨基甲基-二硫代碳酸酯中間體使蛋白質(zhì)與PEG鍵合的方法。
形成PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的先有方法和由所述方法產(chǎn)生的結(jié)合物存在著一些問題。其中包括，形成這些蛋白質(zhì)-PEG結(jié)合物的某些方法可能會使蛋白質(zhì)失活，使得產(chǎn)生的結(jié)合物生物活性可能很差。此外，在形成這些PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物時所用的某些鍵合劑可能易于發(fā)生體內(nèi)水解裂解。如果給藥后發(fā)生這樣的裂解，這些結(jié)合物便失去了由PEG提供的有益性質(zhì)。
本發(fā)明通過使用獨特的鍵合劑提供了新的PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物，所述鍵合劑使蛋白質(zhì)中的各個游離氨基與PEG連接起來，這樣就避免了蛋白質(zhì)與PEG形成結(jié)合物時帶來的問題。
具體講，本發(fā)明提供了具有生理活性的下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物中
式中R1為低級烷基；R2為-O-或-NH-；R3為＝N-R4、＝S或＝O；R4為低級烷基或環(huán)烷基；m和n選自≥1的整數(shù)，并要使結(jié)合物具有至少一部分非結(jié)合蛋白質(zhì)的生物活性；條件是，當(dāng)R2為-O-時，R3不是＝N-R4；當(dāng)R2為-O-、R3是＝O時，蛋白質(zhì)為α-干擾素、白細(xì)胞介素-1或白細(xì)胞介素-1ra；以及當(dāng)R2為-O-、R3為＝S時，蛋白質(zhì)不是得自豚草花粉或牛血漿清蛋白的E抗原。
更具體地講，本發(fā)明提供了下列各式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物
式中R1、R4、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
根據(jù)本發(fā)明，我們還首次提供了與PEG結(jié)合的蛋白質(zhì)白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)。
根據(jù)本發(fā)明，式I的蛋白質(zhì)結(jié)合物通過使活化的PEG(即其中一個羥基已被活化的鍵合劑置換了的PEG)與蛋白質(zhì)中的一個或多個游離氨基縮合來產(chǎn)生。用來生成結(jié)合物的活化PEG化合物具有下列各式結(jié)構(gòu)II-A R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝C＝N-R4
II-D R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N＝C＝S
式中R1為低級烷基，R4為低級烷基或環(huán)烷基，R5為低級烷基或H，n為1～1000的整數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用式II-A、II-B、II-C、II-D、II-E、II-F或II-G的活化PEG化合物產(chǎn)生結(jié)合物，在蛋白質(zhì)的游離氨基和PEG之間形成了連接鍵，結(jié)果使所形成的結(jié)合物保持了蛋白質(zhì)的至少一部分生物活性，同時降低了其免疫原性。此外，通過使用式II-A～I(xiàn)I-G所示的任何一種活化聚乙二醇在本發(fā)明的結(jié)合物中形成的連接基團(tuán)，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)合物不易發(fā)生體內(nèi)水解裂解，并且沒有在先有技術(shù)的PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物中存在的許多缺點。
根據(jù)本發(fā)明，R1和R5可以是任何低級烷基，優(yōu)選甲基?！暗图壨榛币辉~意指含有1～6個碳原子的低級烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基等。通常，優(yōu)選的烷基是含有1～4個碳原子的低級烷基，最優(yōu)選的是甲基。
根據(jù)本發(fā)明，m和n可以選自≥1的任何整數(shù)，并要使產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)合物具有至少一部分形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)的生物活性。顯然，m和n的總和與結(jié)合物保持的蛋白質(zhì)生物活性的量成反比。n的數(shù)值關(guān)系到形成結(jié)合物的聚乙二醇中乙二醇單元的數(shù)目，為1～1000。m涉及與活化PEG反應(yīng)的蛋白質(zhì)中所含的游離氨基的數(shù)目。m優(yōu)選為1～5，最優(yōu)選為1。m+n的值越大，結(jié)合物的分子量就越大。本技術(shù)領(lǐng)域中的專業(yè)人員可容易地測得式II-A～I(xiàn)I-G的聚乙二醇聚合物的分子量及式I和式I-A～I(xiàn)-E的蛋白質(zhì)結(jié)合物的分子量。從測得的分子量可以推算出m和n的值?！暗鞍踪|(zhì)”一詞不僅包括多肽，而且也包括生理上可接受的加成鹽。
當(dāng)式II-A～I(xiàn)I-G任何一式所示的化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)，而蛋白質(zhì)含有一個以上游離氨基時，所得到的結(jié)合物為各種蛋白質(zhì)-PEG結(jié)合物的混合物。在蛋白質(zhì)含有兩個游離氨基的情況下，活化的PEG既可以與其中一個游離氨基反應(yīng)，也可以與兩個游離氨基都反應(yīng)。在這種情況下，混合物含有兩種結(jié)合物，其中一種是由兩個游離氨基與PEG反應(yīng)形成的，而另一種是僅有一個游離氨基與PEG反應(yīng)形成的。由于該混合物中的各種結(jié)合物具有不同的分子量，所以可以通過諸如層析法之類的常規(guī)方法分離這些結(jié)合物。為了m和n選擇得是否合適，可以對分離出的結(jié)合物進(jìn)行生物活性篩選，以確定該結(jié)合物是否仍保持有一部分形成該結(jié)合物所用的蛋白質(zhì)的生物活性，篩選方法與篩選母體蛋白質(zhì)時所用的方法相同。這樣，便可以以任何所希望的方式調(diào)整m和n的數(shù)值，得到所希望的活性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，m和n可為任何整數(shù)，只要結(jié)合物的分子量(不包括蛋白質(zhì)的分子量)為大約300至大約30,000道爾頓。根據(jù)該優(yōu)選實施方案，m為1。如果m為1，那么即使存在兩個或更多個游離氨基，也可以得到該結(jié)合物?；罨腜EG化合物首先與蛋白質(zhì)中所含的游離氨基之一進(jìn)行反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)各試劑如蛋白質(zhì)的濃度和反應(yīng)條件，按照一般的胺縮合方法，便可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中所含的游離氨基的聚乙二醇化(pagylation)的程度。在含有一個或多個游離氨基的蛋白質(zhì)中，如果游離氨基中的一個比其它的游離氨基活潑，那么可以選擇條件使蛋白質(zhì)與活化的PEG化合物反應(yīng)形成其中m為1的式I化合物。然后通過延長縮合反應(yīng)或使用其它更劇烈的反應(yīng)條件，可以使形成蛋白質(zhì)的氨基酸中所含的其它游離氨基與PEG反應(yīng)。根據(jù)m為1的優(yōu)選實施方案，n可為任何整數(shù)，只要使形成結(jié)合物的聚乙二醇的分子量為300～30,000道爾頓，這相應(yīng)于n為大約6～680。更優(yōu)選地，n為大約28、112和225，這分別相應(yīng)于分子量為1325、5000和10000，而最優(yōu)選的是n為112左右。由于通常由其平均分子量而不是其自重復(fù)單元限定的起始PEG化合物的潛在不均一性，優(yōu)選用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整數(shù)n表示PEG聚合物中的自重復(fù)單元。各種分子量的起始PEG化合物可以通過本領(lǐng)域中的已知方法制備或者可以從商業(yè)來源得到。
在通過測定分子量而得到的m和n的值不是整數(shù)的情況(往往就是這樣一種情況)下，必須按通常的方法對這些值進(jìn)行舍入。
當(dāng)R4為低級烷基時，R4可以是含有1-6個碳原子的任何低級烷基，如上面所述的低級烷基。當(dāng)R5為環(huán)烷基時，R5優(yōu)選為含有3-7個碳原子的環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)丁基和環(huán)己基。優(yōu)選的環(huán)烷基為環(huán)己基。
下述各實施例的標(biāo)題化合物是以IUPAC命名法命名的。然而，這些化合物也可以如下命名實施例1、2、3和4α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-[2-[[(環(huán)己基氨基)亞甲基]氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)。實施例1A、1a和1dα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-甲氧基-ω-(2-氯乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。實施例1B、1b和1eα(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-甲氧基-ω-(2-疊氮基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。實施例1C、1c和1fα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。實施例11、11a、11b、12、12A和13-17α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)。實施例18、18a、19、19A、20、20A、21和22α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶基氧基)羰基]氧基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)。實施例23-27α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-[甲氧基-ω-[2-(異硫氰酸根合)乙基]聚(氧-1，2-乙二基)。實施例28α-[(2-吡啶氧基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦稱α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)硫代羰基]氧基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)。
本發(fā)明還包括制備通式I或式I-A～I(xiàn)-E的PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的方法，該方法包括，使下列各通式所示的活化化合物之一與蛋白質(zhì)的游離氨基或其鹽反應(yīng)，并從反應(yīng)混合物中分離蛋白質(zhì)結(jié)合物II-A R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝C＝N-R4
II-D R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N＝C＝S
式中R1、R5和n如上所定義。
具體講，用來與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的各個PEG衍生物的合成以及它們與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，可以如下面各段和實施例中所述的那樣來進(jìn)行。
為了得到其中R2為-NH-、R3為＝N-R4的蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-A化合物)，可以采用下列反應(yīng)式
式中R1、R4、n、m和蛋白質(zhì)如上所述。
在該反應(yīng)式中，通過常規(guī)方法如用亞硫酰鹵處理將PEG分子末端的羥基轉(zhuǎn)化成鹵素基團(tuán)。通過常規(guī)方法如用疊氮化鈉處理將所生成的PEG鹵化物轉(zhuǎn)化成疊氮化物。然后通過常規(guī)方法如氫化可將PEG疊氮化物轉(zhuǎn)化成胺。再使PEG-胺與異硫氰酸烷基酯或環(huán)烷基酯如異硫氰酸環(huán)己酯反應(yīng)形成式III的硫脲，后者用常規(guī)方法脫硫后形成了含有碳化二亞胺官能團(tuán)的式II-A化合物。在將式III的硫脲轉(zhuǎn)化成式II-A的PEG-碳化二亞胺時，優(yōu)選的脫硫劑為三苯膦。
然后，可以在任何常規(guī)的使碳化二亞胺縮合的條件下使式II-A的PEG碳化二亞胺與蛋白質(zhì)縮合。通常，為了得到式I-A的結(jié)合物，在pH為7～9的一般水性緩沖液中進(jìn)行該反應(yīng)。該縮合反應(yīng)可以產(chǎn)生各種分子量的PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物的混合物，這取決于蛋白質(zhì)中游離氨基的數(shù)目和反應(yīng)時間。然后，可通過常規(guī)方法如高效液相色譜法或凝膠電泳法將PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物分離成其各個組分。
為了得到其中R2為-O-、R3為＝S的蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-B化合物)，可以采用下列反應(yīng)式
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
在該反應(yīng)中，將PEG與1，1-硫代羰基二(2(1H)-吡啶酮)在高沸點烴類溶劑中回流，形成式II-B化合物。按照與式II-A化合物和蛋白質(zhì)縮合制備式I-A的結(jié)合物混合物時所述的方式相同的方式，可使式II-B化合物與蛋白質(zhì)的一個或多個游離氨基進(jìn)行縮合，形成式I-B結(jié)合物。根據(jù)如上所述形成的產(chǎn)物的分子量可以進(jìn)行該混合物的分離。
此外，其中R2為-O-、R3為＝S的本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-B化合物)也可以按照下列反應(yīng)式來制備
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
按照該反應(yīng)式，PEG與式VI的硫代碳酸酯在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，形成式II-F的硫代碳酸PEG酯?？梢圆捎萌魏纬Ｒ?guī)的使硫代碳酸酯與羥基縮合的方法來進(jìn)行該反應(yīng)。
通過使式II-F化合物與蛋白質(zhì)的至少一個游離氨基縮合，將式II-F化合物轉(zhuǎn)化成式I-B結(jié)合物。該反應(yīng)按照將式II-A化合物轉(zhuǎn)化成式I-A結(jié)合物時所述的方式來進(jìn)行。該反應(yīng)所形成的產(chǎn)物可以是不同分子量的結(jié)合物的混合物，這取決于所用的蛋白質(zhì)中游離氨基的量。按照前文所述方法，可將這些結(jié)合物按分子量分開。
為了得到其中R2為-NH-、R3為＝O的蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-C化合物)，可以采用下列反應(yīng)式
式中R1、R5、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
用任何常規(guī)的使酰鹵與醇縮合的方法，使光氣與2-羥基吡啶(若R5為低級烷基，則為取代的形式)縮合，得到了式IV化合物。
通過在鹵代烴溶劑中回流，使PEG胺與式IV化合物縮合，得到了式II-C化合物。通過蛋白質(zhì)上的一個或多個游離氨基使式II-C化合物與蛋白質(zhì)縮合，得到了式I-C化合物。該反應(yīng)按照式II-A化合物縮合成式I-A的結(jié)合物時所述的方式進(jìn)行。根據(jù)與式II-C化合物反應(yīng)的蛋白質(zhì)中所含的游離氨基的數(shù)目，形成的式I-C結(jié)合物可以是具有不同分子量的結(jié)合物的混合物。該結(jié)合物混合物可以按上文所述的方法分離。
為了得到其中R2為-NH-、R3為＝S的本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-D化合物)，可以采用下列反應(yīng)式
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
在該反應(yīng)式中，PEG胺與硫代碳酸二(2-吡啶基)酯反應(yīng)，形成了式II-D化合物。在該步中，可以使用任何常規(guī)的使胺與硫代碳酸酯縮合產(chǎn)生異硫氰酸酯的方法。按照將式II-A化合物轉(zhuǎn)化成式I-A化合物時所述的方法，使式II-D化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成了式I-D結(jié)合物。根據(jù)蛋白質(zhì)中所含的游離氨基的量，式II-D化合物與蛋白質(zhì)縮合，產(chǎn)生了各種結(jié)合物的混合物，按照前文在分離式I結(jié)合物時所述的方法，可將所產(chǎn)生的結(jié)合物混合物分離成其各個組分。
另外，式I-D化合物可以采用下列反應(yīng)式得到
用任何常規(guī)的使酰鹵與醇縮合的方法，使硫光氣與2-羥基吡啶(若R5為低級烷基，則為其取代形式)縮合，得到了式V化合物。然后按制備式II-C化合物時所述的方法使化合物V與PEG-胺反應(yīng)，生成了式II-E化合物。式II-E化合物與蛋白質(zhì)上的一個或多個游離氨基縮合后，得到了式I-D結(jié)合物。該反應(yīng)按照形成結(jié)合物I-A時所述的方式進(jìn)行。
為了得到其中R2為-O-、R3為O的本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合物(式I-E化合物)，可以采用下列反應(yīng)式
式中，R1、m、n和蛋白質(zhì)如上所述。
在上述反應(yīng)式中，碳酸二(2-吡啶基)酯與PEG反應(yīng)，形成了式II-G化合物。使用醇與碳酸酯縮合時所用的常規(guī)條件進(jìn)行該反應(yīng)。通過式II-G化合物與蛋白質(zhì)中的一個或多個游離氨基縮合，將式II-G化合物轉(zhuǎn)化成式I-E化合物。按照將式II-A化合物轉(zhuǎn)化成式I-A化合物時所述的相同方法進(jìn)行所述反應(yīng)。根據(jù)蛋白質(zhì)所含的游離氨基，如此形成的反應(yīng)混合物可以含有式I-E結(jié)合物的混合物。該混合物構(gòu)成了不同分子量的各種結(jié)合物的混合物。按照前述方法，可從混合物中分出各種結(jié)合物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，可以按下列反應(yīng)式得到α-干擾素與PEG的結(jié)合物
式中R1為甲基，n為大約112。該反應(yīng)對于α-干擾素中的αA-干擾素(亦稱α2-干擾素)亞型具有特殊意義。
活化PEG化合物II-C的合成如前文中就其中R2為-NH-、R3為＝O的蛋白質(zhì)結(jié)合物的合成所述的那樣來進(jìn)行。按照與前述相似的方法或與實施例中合成蛋白質(zhì)結(jié)合物I-C時所述方法相似的方法，可以得到最終的α-干擾素結(jié)合物。
具有生理活性的任何蛋白質(zhì)或其鹽都可用于制備與PEG的結(jié)合物，只要所述蛋白質(zhì)含有至少一個可供縮合的氨基。
可用于本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)有白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和各種干擾素即IEN-α(白細(xì)胞干擾素)、IFN-β(成纖維細(xì)胞干擾素)和IFN-γ(免疫干擾素)，它們的天然存在形式及其類似物、同系物或截短形式。
這里的白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)可由組織培養(yǎng)得到或通過重組技術(shù)得到。獲得IL-1ra的一種方法是，用分化劑佛波醇十四酸乙酸復(fù)酯(PMA)培養(yǎng)U937人骨髓單核細(xì)胞(ATCC CRL 1594)，然后用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，可從Amgen得到)刺激它們，如Carter等人在Nature 344，633-637(1990)中所述的那樣從培養(yǎng)上清液中分出IL-1ra并純化之。
重組IL-1ra是指具有可與天然IL-1ra相比擬的生物活性的IL-1ra，但它們是如Carter等人在上述文獻(xiàn)中所述的那樣或如Eisenberg等人在Nature 343，341-346(1990)中所述的那樣，通過重組技術(shù)制得的。
干擾素包括所有類型的干擾素如α、β、γ或ω-干擾素以及任何類型的任何亞型。干擾素可從組織或組織培養(yǎng)物中得到，也可以用文獻(xiàn)如歐洲專利申請公開43980中所述的重組技術(shù)得到。產(chǎn)生和分離天然或重組干擾素的方法在技術(shù)上也是熟知的。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合物與用于形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)同樣有用。因此，這些結(jié)合物與形成它們的蛋白質(zhì)具有相同的治療活性，可與蛋白質(zhì)本身一樣使用，而不會產(chǎn)生服用蛋白質(zhì)本身時可能引起的不希望的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明還包括基于式I化合物或其鹽的藥物組合物及其制備方法。
用于控制或預(yù)防疾病的本發(fā)明的藥物組合物包含通式I的蛋白質(zhì)結(jié)合物和治療上惰性的、無毒的和治療上可接受的載體物質(zhì)，所用的藥物組合物可以以與優(yōu)良的醫(yī)學(xué)實踐相一致的方式配制和給藥，同時要考慮到待治療的疾病、個體病人的狀況、蛋白質(zhì)結(jié)合物的釋放部位、給藥方法以及專業(yè)人員已知的其它因素。
下述實施例代表本發(fā)明的說明性具體實施方案，而不是限制本發(fā)明。
實施例1α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備A.α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備(此處所用的SRU是指PEG聚合物中存在的自重復(fù)單元的數(shù)目)從50gMPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量為5000)在700ml甲苯中的淤漿中蒸出200ml溶劑。向該回流溶液中滴加0.8ml無水吡啶和2.2ml亞硫酰氯。回流4小時后，將反應(yīng)物攪拌過夜。然后減壓下除去溶劑，向殘留物中加入500ml CH2Cl2。將產(chǎn)生的溶液用無水K2CO3干燥后，通過50g堿性氧化鋁(Wolem Super I)。然后減壓下除去大部分CH2Cl2，向所得糖漿狀物中加入1e乙醚。蒸餾除去醚，并加入另外的乙醚造成沉淀。將混合物在室溫下攪拌2小時，然后過濾，得到45gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C3H7ClO(CH2CH2O)111.7分析計算值C，53.97；H，9.12；Cl，0.71實測值C，54.21；H，8.70；Cl，0.71B.α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備將20g疊氮化鈉和50gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的混合物在375ml無水DMF中于120-125℃下加熱。7小時后，于高真空下除去溶劑。將殘留物溶于500ml CH2Cl2中，通過硅藻土過濾。然后蒸去大部分CH2Cl2并加入乙醚造成沉淀。將混合物攪拌過夜，然后過濾。將殘留物在50℃下溶于最少量的甘醇二甲醚中，將所得溶液冷卻，濾出沉淀產(chǎn)物，得到α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C3H3N3O(CH2CH2O)111.7分析計算值C，53.77；H，9.09；N，0.84實測值C，53.61；H，9.08；N，0.89C.α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備向25gα-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7在250ml無水甘醇二甲醚中的混合物中加入3.5g 10％Pd/C。然后將混合物置于50 p.s.i.的氫氣氛下并于50℃振蕩18小時。將混合物過濾，用CH2Cl2洗滌固體物，合并有機(jī)液，減壓下除去溶劑。再將殘留物溶于100ml溫?zé)岬母蚀级酌阎校巩a(chǎn)物從冷卻后的溶液中沉淀出。濾出沉淀，在減壓條件下溫?zé)岣稍?，得?3gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧1，2-乙二基)SRU 111.7。
C3H9NO(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.43；H，9.20；N，0.28實測值C，54.43；H，9.18；N，0.36或者，將40gα-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SUR111.7和6.7g(25.6mmol)三苯膦溶解在200ml無水CH2Cl2中，將該溶液在氬氣氛下攪拌過夜。加入水(2ml)，再將混合物攪拌12小時。減壓下除去大部分二氯甲烷，加入400ml乙醚。濾出沉淀，用乙醚洗滌后，溶于300ml溫?zé)?50℃)的甘醇二甲醚中。將該溶液在室溫下放置過夜，濾出產(chǎn)生的沉淀，用2×100ml甘醇二甲醚、2×100ml乙醚洗滌，在N2流存在下于真空烘箱中干燥，得到35gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
D.α-[2-[[(環(huán)己基氨基)硫羰基]氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備向4gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7在60ml無水甘醇二甲醚中的溶液(40℃)中加入0.1ml異硫氰酸環(huán)己基酯。將該溶液在40℃下攪拌18小時。過濾混合物，在高真空條件下除去溶劑。殘留物溶于100ml溫?zé)岬母蚀级酌阎?，冷卻該溶液，濾出產(chǎn)生的沉淀，在高真空條件下干燥，得到3.5gα-[2-[[(環(huán)己基氨基)硫羰基]氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C10H20N2OS(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.25；H，9.13；N，0.54；S，0.62實測值C，54.39；H，8.87；N，0.55；S，0.59E.α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備將1gα-[2-[[(環(huán)己基氨基)硫羰基]氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7、120mg三苯膦、90μlCCl4和84μl三乙胺在5ml無水CH2Cl2中的溶液回流72小時。然后減壓下除去溶劑，殘留物溶于最少量的無水甘醇二甲醚中。冷卻后，有產(chǎn)物沉出，過濾，減壓下干燥，得到α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C10H18N2O(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.61；H，9.15；N，0.55實測值C，54.95；H，9.27；N，0.50實施例1aα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(聚-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例1A中所述方法，將MPEG(分子量10,000)轉(zhuǎn)化成α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C3H7ClO(CH2CH2O)225分析計算值C，54.37；H，9.14；Cl，0.35實測值C，54.30；H，9.15；Cl，0.41實施例1bα(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(聚-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例1B中所述的方法，將α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225轉(zhuǎn)化成α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C3H7N3O(CH2CH2O)225分析計算值C，54.34；H，9.13；N，0.42實測值C，54.32；H，9.28；N，0.50實施例1cα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例1C中所述方法，將α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225轉(zhuǎn)化成α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C3H9NO(CH2CH2O)225分析計算值C，54.48；H，9.17；N，0.14實測值C，54.80；H，9.21；N，0.12
實施例1dα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制備向新蒸過的草酰氯(0.5ml)在40ml無水CH2Cl2中的溶液(0℃)中滴加在10ml CH2Cl2中的0.5ml無水DMF。將所得溶液溫?zé)嶂潦覝?，攪?5分鐘，然后再冷卻至0℃。加入MPEG(分子量1325)(5.6g)，將所得溶液回流5小時。然后將混合物倒入水中，用CH2Cl2提取。干燥CH2Cl2溶液(MgSO4)，減壓下除去溶劑，得到107gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3，為白色粉末。
C3H7ClO(CH2CH2O)28.3分析計算值C，53.38；H，9.03；Cl，2.64實測值C，53.48；H，9.10；Cl，2.41實施例1eα-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制備按照實施例1B所述的方法，將α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3轉(zhuǎn)化成α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基) SRU 28.3。
C3H7N3O(CH2CH2O)28.3分析計算值C，53.12；H，8.99；N，3.11實測值C，53.21；H，9.07；N，2.98實施例1fα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制備按照實施例1C所述的方法，將α-(2-疊氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3轉(zhuǎn)化成α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3。
C3H9NO(CH2CH2O)28.3分析計算值C，54.47；H，9.17；N，0.14實測值C，54.44；H，9.19；N，0.15實施例2
用試劑α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的重組干擾素-α(IFN-α)將按實施例1制得的α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH9.0)中的1mg均一IFN-α中，每1摩爾IFN-α加入10摩爾試劑。將該溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)估測IFN-α衍生化(或聚乙二醇化)的量(表I)。通過用考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)顯色。對60分鐘反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，新的較高分子量的蛋白質(zhì)相應(yīng)于PEG結(jié)合的IFN-α。由SDS-PAGE測得，IFN-α的表觀分子量為15kD。未修飾的IFN-α的表觀分子量保持不變，因此沒有與PEG結(jié)合。經(jīng)PEG修飾的IFN-α產(chǎn)物的表觀分子量為28kD。
表I用實施例1所述試劑對IFN-α的修飾IFN蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的百分率15(未修飾) 802820實施例3用試劑α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的重組白細(xì)胞介素-2(rIL-2)將按實施例1制得的試劑α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH9.0)中的2mg rIL-2中，每1摩爾rIL-2加入10摩爾試劑。將該溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-PAGE法估測蛋白質(zhì)衍生化(或聚乙二醇化)的量(表II)。通過用考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)顯色。對60分鐘反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，新的較高分子量的蛋白相應(yīng)于PEG結(jié)合的rIL-2。由SDS-PAGE測得，rIL-2的表觀分子量為15kD。未修飾的rIL-2是從反應(yīng)混合物中分離到的蛋白質(zhì)，其表觀分子量保持不變，因此沒有與PEG結(jié)合。經(jīng)PEG修飾的rIL-2主產(chǎn)物的表觀分子量為28kD。
表II用實施例1所述試劑對rIL-2的修飾rIL-2蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的百分率15(未修飾)2028 5033 2043 10用疏水性交換層析法(Bio-Rad；Biogelphenyl 5-PW)，如Katre等人[Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，841483-1491，1987]所述的那樣，從反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的rIL-2。在30分鐘內(nèi)將(NH4)2SO4在50mM磷酸鈉(pH 7.0)中的濃度從1.53M降低至0.0M進(jìn)行線性梯度洗脫以分離經(jīng)PEG修飾的和未修飾的rIL-2。用SDS-PAGE法檢測各等份級分。按Gillis等人所述的方法[J.Immunology 1202027-2032，(1978)]對合并級分進(jìn)行分析，測定其在CTLL細(xì)胞增殖試驗中的比活性。通過分光光度法，用0.667的消光系數(shù)在280nm處測定rIL-2的蛋白質(zhì)濃度。所分離出的rIL-2蛋白質(zhì)的比活性以單位/毫克蛋白質(zhì)表示，結(jié)果綜述于表III中。顯然，rIL-2的比活性沒有由于與PEG結(jié)合而發(fā)生顯著改變。
表III用實施例1所述的試劑將rIL-2與PEG結(jié)合后rIL-2的生物活性rIL-2蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)比活性(單位/毫克)15(未修飾的IL-2) 2.0×10728 2.4×107實施例4用試劑α-[2-[(環(huán)己基亞氨基亞甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的重組白細(xì)胞介素-1α(rIL-1α)
將實施例1所述的試劑加到在1.0ml 0.1M硼酸鈉(pH 9.0)中的2.0mg均一rIL-1α中，每1摩爾rIL-1α加入10摩爾試劑。將所得溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-PAGE法估測蛋白質(zhì)衍生化(或聚乙二醇化)的量(表IV)。通過用考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)顯色。對60分鐘反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，新的較高分子量的蛋白質(zhì)相應(yīng)于PEG結(jié)合的rIL-1α蛋白質(zhì)。由SDS-PAGE法測得，rIL-1α的表觀分子量為17 kD。未修飾的rIL-1α是從反應(yīng)混合物中得到的表觀分子量保持不變的蛋白質(zhì)，因此它沒有與PEG結(jié)合。經(jīng)PEG修飾的rIL-1α產(chǎn)物的表觀分子量為30kD。
表IV用實施例1所述試劑對rIL-1α的修飾rIL-1α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的百分率17(未修飾)853015實施例5α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備從1g(0.2 mmol)MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量5000)在15ml無水甲苯中的溶液中蒸去5ml溶劑。將所得溶液冷卻，加入46.5mg(0.2mmol)1，1-硫羰基二(2(1H)-吡啶酮)。然后將該混合物在氬氣氛下回流4小時。減壓下除去溶劑，殘留物溶于5ml無水甘醇二甲醚中，放置過夜。濾出產(chǎn)生的沉淀，用2×5ml無水甘醇二甲醚和5ml乙醚洗滌。在緩慢的氮氣流下，將產(chǎn)物置于真空烘箱中進(jìn)行干燥，得到0.96gα-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C9H11NO3S(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.37；H，8.99；N，0.27；S，0.62
實測值C，54.03；H，8.98；N，0.18；S，0.59實施例5aα-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例5所述的方法，將MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量為10,000)轉(zhuǎn)化成α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C9H11NO3S(CH2CH2O)225分析計算值C，54.54；H，9.08；N，0.14；S，0.32實測值C，54.38；H，9.16；N，0.15；S，0.31實施例6用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)將按照實施例5制備的α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在1.0ml緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的10mg均一IL-1ra中，每1摩爾IL-1ra加入5摩爾試劑。將該溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-PAGE法估測蛋白質(zhì)衍生化(或聚乙二醇化)的量(表V)。通過用考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)顯色。對60分鐘反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，新的較高分子量的蛋白質(zhì)相應(yīng)于PEG結(jié)合的IL-1ra蛋白質(zhì)。由SDS-PAGE法測得，IL-1ra的表觀分子量為19 kD。未修飾的IL-1ra是從反應(yīng)混合物中得到的表觀分子量保持不變的蛋白質(zhì)，因此它沒有與PEG結(jié)合。
經(jīng)PEG修飾的IL-1ra蛋白質(zhì)主產(chǎn)物的表觀分子量為26和33 kD。
表V用實施例5所述試劑對IL-1ra的修飾IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的百分率
19(未修飾的)3626 3333 21＞3310用疏水性交換層析法(Bio-Rad；HRLC MP7 HIC)從反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的IL-1ra。在20分鐘內(nèi)將(NH4)2SO4在50mM磷酸鈉(pH7.0)中的濃度從0.43M降至0.0M進(jìn)行線性梯度洗脫以分離聚乙二醇化的IL-1ra和未修飾的IL-1ra。用SDS-PAGE法檢測各等份級分。用IL-1放射性受體競爭結(jié)合測定法測定合并級分[Kilian等人，J.Immunol.，136，4509-4514(1986)]。簡單地講，將各種不同濃度的IL-1ra和PEG-IL-1ra與EL-4膜一起在37℃下溫育30分鐘。然后加入[125I]IL-1α，繼續(xù)溫育30分鐘。通過真空過濾并把與細(xì)胞結(jié)合的[125I]IL-1收集在濾板上終止試驗。用作圖法確定抑制50％[125I]IL-1的結(jié)合時IL-1ra或PEG-IL-1ra的濃度(IC50)。結(jié)果列在表VI中。該試驗中IL-1ra的IC50為1-2.0 ng/ml。聚乙二醇化的IL-1ra混合物與EL-4膜上的IL-1受體結(jié)合的能力保持在未修飾IL-1ra的1/2至1/3范圍內(nèi)。
表VI用實施例5所述試劑結(jié)合的IL-1ra對[125I]IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)IC50(ng/ml)19K(未修飾)2.026K，33K(混合物) 5.0用IL-1ra抑制rIL-α的白細(xì)胞介素-6誘導(dǎo)作用的能力對IL-1ra蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)進(jìn)行體內(nèi)評價。從用rIL-1α處理后的小鼠得到血清含有高濃度的IL-6[McIntosh等人，Immunol.，143162-167(1989)]。與IL-1α一起給予未修飾的IL-1ra(0小時時間點)抑制IL-6的誘導(dǎo)。用該試驗體系對未修飾的和經(jīng)PEG修飾的IL-1ra的藥物動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較。取若干雌性C57B1/6小鼠，以三只為一組，對各組小鼠皮下注射0.2μgrIL-1α，在此之前48小時、24小時或6小時或與此同時(0小時)，給所述動物皮下注射200μg未修飾的IL-1ra或PEG-IL-1ra。三小時后，收集血清樣品。用前人所述的改進(jìn)的IL-6測定法[Van Snick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839679-9683(1986)]測定IL-6濃度水平(單位)。在IL-6測定法中，在96孔微量滴定板中用受試血清的兩倍系列稀釋液處理B9雜交瘤細(xì)胞。在包含5％CO2和95％空氣的潮濕氣氛中于37℃溫育3天后，用0.5μCi的氚化胸苷對各孔進(jìn)行標(biāo)記，并再溫育18小時。然后將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾器上，用閃爍計數(shù)法測定氚化胸苷的摻入量。Il-6活性以U/ml表示，IL-6單位定義為與參比標(biāo)準(zhǔn)相比氚化胸苷摻入量達(dá)到最大值的一半時血清稀釋度的倒數(shù)。
藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)綜述的表D1中。僅用IL-1處是的小鼠，其IL-6活性為28852 U/ml。未修飾的和修飾了的IL-1ra在0小時時抑制IL-6誘導(dǎo)。但是與未修飾的IL-1ra相比，聚乙二醇化的IL-1ra在給藥后8小時和24小時時表現(xiàn)出延長的IL-6抑制作用。
表D1與實施例5所述試劑結(jié)合的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布給予IL-1前的時間(小時) IL-6(單位/ml)19kD26 kD0 772 7056 8361158724 22525984448 184852111972 1322021470實施例6A用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)用實施例5a所述的試劑，按照實施例6所述方法，將IL-1ra結(jié)合并純化。
主要的經(jīng)PEG修飾的IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量為33 kD和48kD，它們分別占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的46％和27％。
如實施例6中所述的這些蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力綜述于表VII中。33 kD的經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力保持在IL-1ra的1/6以上，而如對48 kD的蛋白質(zhì)所觀察到的，用PEG對蛋白質(zhì)進(jìn)行更大程度的修飾導(dǎo)致了其與IL-1受體結(jié)合的能力顯著喪失。
表VII用實施例5a所述試劑結(jié)合的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的) 1.633 9.048 50.0為了測定各種PEG-IL-1ra的藥物動力學(xué)分布，給C57 BF/6小鼠皮下注射100μg的修飾了的或聚乙二醇化的IL-1ra。在小鼠接受了未修飾的IL-1ra后1、2、3、4和6小時和接受了PEG-IL-1ra后2、4、8、10和24小時時采集血清樣品。用實施例6所述的EL4膜結(jié)合試驗測定血清濃度。數(shù)據(jù)列在表D2中。與IL-1ra相比，血清樣品中可檢測到PEG-IL-1ra的時間更長，且濃度更高，這表明了其延長的血清時間歷程。
表D2如在實施例6a中聚乙二醇化的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布給藥后經(jīng)過的時間(小時) IL-1ra的血清濃度19kD 33kD
1400-2130 25003 404 15 8006 168 30010 25024 15實施例7用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-1α按照實施例4所述的方法，用實施例5所述的試劑，對重組IL-1α進(jìn)行聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鑒定出反應(yīng)混合物中存在有三種主要的分子量，它們的表觀分子量相應(yīng)于17(未修飾)、26和33kD。后兩種聚乙二醇化蛋白質(zhì)分別占總蛋白質(zhì)的25％和55％。
用疏水性交換層析法(Bio-Rad；HRLC MP7 HIC)從60分鐘后的反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的rIL-1α。在20分鐘內(nèi)將(NH4)2SO4在50mM磷酸鈉(pH7.0)中的濃度從0.43降至0.0M進(jìn)行線性梯度洗脫，以分離聚乙二醇化的rIL-1α和未修飾的rIL-1α。用SDS-PAGE法檢測各等份級分，按照Kaye等人所述的方法[J.Exp.Med.，158836-854(1983)]對合并的級分進(jìn)行分析，測定其在D10細(xì)胞增殖試驗中的比活性。通過分光光度法，用1.0的消光系數(shù)在280 nM處測定rIL-1α的蛋白質(zhì)濃度。rIL-1α的比活性為大約1.0×108單位/mg。比活性結(jié)果綜述在表VIII中。26 kD的聚乙二醇化的IL-1α結(jié)合物的生物活性保持在IL-1α的1/2-1/3范圍內(nèi)。進(jìn)一步修飾生成了33 kD蛋白質(zhì)，結(jié)果生物活性顯著喪失。
表VIII用實施例5所述試劑結(jié)合的rIL-1α的生物活性rIL-1α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) 比活性(單位/mg)17(未修飾的)4.6×10726 1.9×10733 4.5×106實施例8用α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α將按照實施例5制得的α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在100μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的1mg純化的IFN-α中，每1摩爾IFN-α加入8摩爾PEG試劑。將所得溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-PAGE法鑒定反應(yīng)混合物中的主要的分子量，它們的表觀分子量為15(未修飾)和28 kD的聚乙二醇化蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的40％。用疏水性交換層析法(Bio-Rad；Biogel-phenyl-S-PW)從60分鐘反應(yīng)混合物中純化聚乙二醇化的IFN-α并進(jìn)行特性鑒定。在20分鐘內(nèi)將(NH4)2SO4在50mM磷酸鈉(pH 7.0)中的濃度從0.42M降至0.0M進(jìn)行線性梯度洗脫，以分離聚乙二醇化的IFN-α和未修飾的ILN-α。用SDS-PAGE法檢測各等份級分，按照Familletti等人所述的方法[Methods Enzym.，78387-394(1987)]對合并的級分進(jìn)行分析，測定其在MDBK試驗中的抗病毒活性(比活性)。
通過分光光度法，用1.0的消光系數(shù)在280 nM處測定1 mg/mlIFN-α緩沖液的蛋白質(zhì)濃度。分離的蛋白質(zhì)的比活性以單位/mg蛋白質(zhì)表示，結(jié)果列在IX中。
結(jié)果表明，28 kD的聚乙二醇化的IFN-α的比活性相對于IFN-α來說沒有發(fā)生明顯的改變。
表IX用實施例5的試劑結(jié)合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)比活性(單位/mg)15(未修飾的)1.1×10828 1.4×108實施例8A用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IFN-α用實施例5a所述的試劑如實施例8那樣將IFN-α聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鑒定出60分鐘反應(yīng)混合物中有三種主要的分子量，它們的表觀分子量相應(yīng)于15(未修飾)、35和43 kD。后兩種聚乙二醇化的蛋白質(zhì)分別占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的35％和33％。
用實施例8中所述方法測得的聚乙二醇化的IFN-α的比活性列在表X中。結(jié)果表明，35 kD的聚乙二醇化的IFN-α產(chǎn)物的生物活性保持在IFN-α的1/2-1/3范圍內(nèi)。43 kD的結(jié)合物喪失了大部分活性。
表X用實施例5a的試劑結(jié)合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)比活性(單位/mg)15(未修飾的)3.3×10835 1.2×10843 1.5×107實施例8B用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-2用實施例5所述的試劑將rIL-2聚乙二醇化并用實施例3中所述方法進(jìn)行純化。
用SDS-PAGE法鑒定出60分鐘反應(yīng)混合物中的主要的分子量，它們的表觀分子量為15(未修飾)和25 kD。25 kD的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的60％。
如實施例3中所述的那樣，測定分離出的rIl-2蛋白質(zhì)的比活性，并以單位/mg蛋白質(zhì)表示，結(jié)果列在表XI中。
從表XI中可以看出，與PEG結(jié)合后，IL-2的生物活性沒有改變。
表XI用實施例5所述試劑制得的與PEG結(jié)合的rIL-2的生物活性rIL-2蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)比活性(單位/mg)15(未修飾的) 2.0×107252.0×107實施例8C用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基) SRU 225制備與PEG結(jié)合的rIL-2用實施例5a所述的試劑，按照實施例3中所述的方法，將rIL-2聚乙二醇化。
用SDS-PAGE法鑒定出60分鐘反應(yīng)混合物中的主要分子量，它們的表觀分子量為15 kD(未修飾)、33 kD和43 kD。33 kD和43 kD的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)分別占反應(yīng)中總蛋白質(zhì)的60％和20％。
實施例9用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基) SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α將IFN-α與PEG結(jié)合的另一種方法如下用含有5 mM乙酸鈉(pH 5.0)和120 mM NaCl的緩沖液對IFN-α(5mg/ml)進(jìn)行透析。向透析后的蛋白質(zhì)溶液中加入硫氰酸鉀固體使最終鹽濃度為0.5M，加入1/10體積的1M麥黃酮-氫氧化鈉(pH 11.9)調(diào)節(jié)pH值，得pH值為10.0的最終溶液。向試樣中加入α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)，每1摩爾蛋白質(zhì)加入3摩爾試劑。修飾反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘，加入1M甘氨酸(pH 6.3)來停止反應(yīng)，其最終濃度為20mM。加入含3.5M硫酸銨和50mM磷酸鈉(pH7.0)的緩沖液至最終硫酸銨濃度為1.1M使PEG修飾的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來，離心(10,000×g，12分鐘)收集沉淀物。用含1.1M硫酸銨和50 mM磷酸鈉(pH 7.0)的緩沖液漂洗沉淀物后，將沉淀物重新溶于含25ml乙酸銨(pH 5.0)的緩沖液中。如實施例2中所述的那樣對PEG修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化和特性鑒定。得到了單一的聚乙二醇化IFN產(chǎn)物，其表觀分子量為28 kD。按照實施例8中所述的方法測定修飾后蛋白質(zhì)的抗病毒活性(比活性)。起始IFN-α和與PEG結(jié)合的IFN-α的比活性分別為2.6×108U/mg和1.0×108U/mg，表明相對于ILN-α來說PEG結(jié)合的IFN-α的生物活性保持在1/3以上。
實施例10用試劑α-[(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IFN-α按照實施例9所述的方法，將IFN-α與PEG結(jié)合。如實施例2和9所述的那樣純化和鑒定所述蛋白質(zhì)。起始IFN-α的比活性為2.6×108U/mg，而與PEG結(jié)合的IFN-α的表觀分子量為31kD，其比活性為1.0×108U/mg，如實施例8中所述。結(jié)合的IFN-α的生物活性在IFN-α的1/3以上。
實施例11α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備從1g(0.2 mmol)α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7(如在實施例1C中制得的)在40ml無水CH2Cl2中的溶液中蒸出15ml溶劑。然后在0℃下向所得溶液中加入65mg(0.3 mmol)碳酸二(2-吡啶基)酯，再將混合物攪拌4小時。減壓下除去溶劑，殘留物用乙醚研制。濾出沉淀物，依次用50ml乙醚和50ml己烷洗滌。然后在緩慢的氮氣流下在真空烘箱中干燥產(chǎn)物，得到1gα-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7，為白色粉末。
C9H12N2O3(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.56；H，9.04；N，0.55實測值C，54.26；H，9.00；N，0.53實施例11aα-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例11所述方法，將α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如在實施例1c中制得的)轉(zhuǎn)化成α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C9H12N2O3(CH2CH2O)225分析計算值C，54.54；H，9.10；N，0.28實測值C，54.49；H，9.27；N，0.31實施例11bα-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3按照實施例11所述的方法，將α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3(如在實施例1f中制得的)轉(zhuǎn)化成α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3。
C9H12N2O3(CH2CH2O)28.3。
分析計算值C，54.61；H，8.75；N，1.94實測值C，54.67；H，8.96；N，1.63實施例12用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IL-1ra將α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在2.5ml緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的25mg純化的IL-1ra中，每1摩爾IL-1ra加入1摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。然后按實施例6所述的方法純化PEG修飾的IL-1ra。
從60分鐘反應(yīng)中得到的主要的聚乙二醇化產(chǎn)物的表觀分子量為28kD和38 kD，它們分別占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的大約42％和29％。
如實施例6所述的那樣測定從反應(yīng)混合物中得到的純化IL-1ra蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力。結(jié)果列在表XII中。28 kD產(chǎn)物的結(jié)合性質(zhì)沒有發(fā)生明顯改變，38 kD蛋白質(zhì)的結(jié)合能力保持在IL-1ra活性的1/5以上。
表XII用實施例11所述的試劑聚乙二醇化的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)IC50(ng/ml)19(未修飾的) 2.028 3.038 10.0如實施例6中所述的那樣測定PEG-IL-1ra的藥物動力學(xué)分布。數(shù)據(jù)列在表D3中。單獨的IL-1誘導(dǎo)出27283 U/ml的IL-6。未修飾的IL-1ra在給藥后6小時內(nèi)對IL-1響應(yīng)的抑制低于50％。相反，PEG-IL-1ra雖然在早期活性較低，但在注射后24和48小時時活性高得多。因此，PEG-IL-1ra具有延長的藥物動力學(xué)分布。
表D3用實施例11所述試劑結(jié)合的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布IL-1服用前的時間(小時) IL-6單位/ml19kD 26kD0 4789 238066 153241083324 24841572748 163489364
72 12067 12054實施例12A用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IL-1ra將α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如前面在實施例11a中所述的)加到在2.5ml緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的25 mg純化的IL-1ra中，每1摩爾IL-1ra加入4摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。然后按實施例6所述的方法純化PEG修飾的IL-1ra。
從60分鐘反應(yīng)中得到的主要的聚乙二醇化產(chǎn)物的表觀分子量為33kD和48 kD，它們分別占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的大約76％和15％。從反應(yīng)混合物中得到的純化IL-1ra蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力列在表XIII中。33 kD的PEG修飾的蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力保持在IL-1ra的1/8以上。48 kD產(chǎn)物喪失了大部分結(jié)合能力。
表XIII用實施例11a所述的試劑聚乙二醇化的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的)0.833 6.04818.0如在實施例6A中所述的那樣測定PEG-IL-1ra的藥物動力學(xué)分布。數(shù)據(jù)列在表D4中。與未修飾的IL-1ra相比，血清樣品中可檢測到PEG-IL-1ra的時間更長，且濃度更高。
表D4用實施例11a所述試劑結(jié)合的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布給藥后時間(小時)IL-1ra的血清濃度(ng/ml)19kD 33kD1 2202337003134 5.35006 1.58 15010 8324 5實施例13用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-2按照實施例3和8b中所述的方法用α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7對rIL-2進(jìn)行聚乙二醇化。如實施例8所述的那樣測定所述IL-2蛋白質(zhì)的比活性。15 kD的未修飾的rIL-2的比活性為2×107單位/mg，29 kD的聚乙二醇化的IL-2的比活性為2.4×107單位/mg，表明，后者的生物活性沒有因聚乙二醇化而顯著喪失。
實施例14用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的PEG修飾的rIL-1α按照實施例4和7所述的方法，用實施例11中所述試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7對rIL-1α進(jìn)行聚乙二醇化。純化出兩種聚乙二醇化的rIL-1α進(jìn)行聚乙醇化。純化出兩種聚乙二醇的rIL-1α蛋白質(zhì)，它們的表觀分子量為28 kD和38 kD，它們分別占60分鐘反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的50％和25％。和25％。
實施例15用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α按照實施例8中所述的方法，用實施例11中所述試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7使IFN-α聚乙二醇化。60分鐘后，40％的蛋白質(zhì)發(fā)生了衍生化，產(chǎn)物的表觀分子量為26 kD。
實施例16用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α(IFN-α的另一種聚乙二醇化方法)按照實施例9所述方法，用α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7使IFN-α與PEG結(jié)合。如實施例8所述的那樣測定IFN-α的比活性。起始IFN-α的比活性為1.7×108U/mg，用α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制得的與PEG結(jié)合的IFN-α的比活性為0.8×108U/mg，該比活性在IFN-α的1/2-1/3范圍內(nèi)。
實施例17用試劑α-甲基-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IFN-α按照實施例9所述的方法，用實施例11a所述的試劑對IFN-α聚乙二醇化。按照實施例8所述的方法測得的與PEG結(jié)合的IFN-α的比活性為0.4×108U/mg，表明其生物活性并未顯著喪失。
實施例18α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制備10ml溶劑。將溶液冷卻至室溫，加入132mg(0.6 mM)碳酸二(2-吡啶基)酯和4mg DMAP。然后將所得溶液攪拌14小時，減壓下除去溶劑。殘留物用乙醚研制，濾出產(chǎn)生的沉淀物。將該產(chǎn)物溶于7ml無水甘醇二甲醚中，溫?zé)崛芙?，將所得溶液冷卻并于室溫下放置數(shù)小時。濾出產(chǎn)生的沉淀物，用2×5ml無水甘醇二甲醚洗滌。然后將固體物在氮氣存在下置于真空烘箱中干燥，得到0.7gα-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C9H11NO4(CH2CH2O)111.7分析計算值C，54.57；H，9.02；N，0.28實測值C，54.51；H，9.19；N，0.28實施例18aα-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制備按照實施例18所述的方法，將甲氧基聚乙二醇(分子量10,000)轉(zhuǎn)化成α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C9H11NO4(CH2CH2O)225分析計算值C，54.54；H，9.08；N，0.14實測值C，54.54；H，9.12；N，0.11實施例19用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7制備與PEG結(jié)合的IL-1ra按照實施例6和12所述的方法，用α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7將IL-1ra聚乙二醇化。主要的聚乙二醇化產(chǎn)物的表觀分子量為26kD和33kD，它們分別占60分鐘反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的31％和57％。如實施例6中所述那樣測定從反應(yīng)混合物中得到的純化的IL-1ra蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力，結(jié)果列在表XIV中。26 kD的聚乙二醇化的IL-1ra結(jié)合物的結(jié)合能力保持在IL-1ra的1/4以上。33 kD結(jié)合物的競爭結(jié)合活性降低了15倍，這表明它喪失了大部分結(jié)合活性。
表XIV用實施例18所述試劑聚乙二醇化的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的) 2.026 8.033 30.0實施例19A用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU225制備與PEG結(jié)合的IL-1ra按照實施例19所述的方法，用α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225將IL-1ra聚乙二醇化。從60分鐘反應(yīng)混合物中得到的聚乙二醇化的主產(chǎn)物的表觀分子量為33 kD和48 kD，它們分別占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的大約47％和25％。
如實施例6和12所述的那樣測定從反應(yīng)混合物中得到的純化IL-1ra蛋白質(zhì)抑制IL-1結(jié)合的能力，結(jié)果列在表XV中。33 kD蛋白質(zhì)的活性保持在IL-1ra的1/6以上。更高分子量的結(jié)合物便喪失了其大部分活性。
表XV用實施例18a所述試劑聚乙二醇化的IL-Ira蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的) 1.5339.048 40.0如實施例6A所述的那樣測定PEG-IL-1ra的藥物動力學(xué)分布。數(shù)據(jù)列在表D5中。與未修飾的IL-1ra相比，血清樣品中可檢測到PEG-IL-1ra的時間延長，表明了其血清半壽期延長。如實施例6中所述的那樣，測定PEG-IL-1ra的藥物動力學(xué)分布，所不同的是給予0.05μgrIL-1α。數(shù)據(jù)列在表D6中。對單獨IL-1的響應(yīng)是9203單位/ml IL-6。與未修飾的IL-1ra相比，給予PEG-IL-1ra后可觀察到高達(dá)72小時的延長抑制作用，表明藥物動力學(xué)性質(zhì)得到了改進(jìn)。總之，這些數(shù)據(jù)說明，即使聚乙二醇化的蛋白質(zhì)體外活性減低，它也會具有改進(jìn)的體內(nèi)藥物動力學(xué)性質(zhì)。
表D5用實施例18a所述試劑結(jié)合的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布給藥后時間(小時) 血清IL-1ra(mg/ml)19 kD 33 kD1 5802 75 1003 304 30 606 88 1210 1724 10表D6用實施例18所述試劑結(jié)合的IL-1ra的藥物動力學(xué)分布給予IL-1之前的時間(小時) IL-6(單位/ml)19 kD 26 kD0 521 4546 2334 416
2413486 25524816577 46677212800 5148實施例20用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α將試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7加到在200μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的1 mg純化的IFN-α中，每1摩爾IFN-α加入10摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。按照實施例8所述的方法，得到了純化的PEG修飾的IFN-α。36％的蛋白質(zhì)發(fā)生了衍生化，產(chǎn)物的表觀分子量為28 kD。
如實施例8所述的那樣，測定從反應(yīng)混合物中得到的純化的IFN蛋白質(zhì)的比活性，結(jié)果列在表XVI中。修飾的IFN的體外生物活性降低了5-6倍。
表XVI用實施例18所述試劑結(jié)合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) 比活性(單位/mg)15(未修飾的) 1.88×108288.0×107實施例20A用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-2將實施例18中所述的試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的1mg rIL-2中，每摩爾rIL-2加入5摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用SDS-PAGE法鑒定從60分鐘反應(yīng)混合物中得到的主要分子量，它們的表觀分子量為15 kD(未修飾的)和25 kD。25kD的聚乙二醇化蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的60％。
實施例21用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α按照實施例9所述的方法，用實施例18所述的試劑將IFN-α聚乙二醇化。
按照實施例8所述方法測得的起始未修飾的IFN-α的比活性為1.0×108U/mg，與PEG結(jié)合的IFN-α的比活性為0.4×108U/mg，表明生物活性沒有顯著喪失。
實施例22用試劑α-[(2-吡啶氧基)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IFN-α按照實施例9的方法，用實施例18a所述試劑將PEG結(jié)合到IFN-α上。按照實施例8所述方法測得的與PEG結(jié)合的IFN-α的比活性為0.3×108U/mg。
實施例23α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7的制備向在100ml CH2Cl2中的2gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7中加入94.2mg硫代碳酸二(2-吡啶基)酯。將該溶液攪拌18小時，然后用少量冷水提取。減壓下除去大部分CH2Cl2，加入乙醚使產(chǎn)物沉淀，濾出產(chǎn)物，在高真空條件下干燥，得到α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。
C4H7NOS(CH2CH2O)111.7分析計算值C，53.88；H，9.07；N，0.28；S，0.64實測值C，54.45；H，8.93；N，0.28；S，0.53
實施例24用試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IFN-α將實施例23中所述的試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH9.0)中的1mg純化的IFN-α中，每1摩爾IFN-α加入10摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。30％的IFN-α發(fā)生了衍生化，產(chǎn)物的表觀分子量為26 kD。
實施例25用試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-2實施例23所述的試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在100μl緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的1.0mg重組IL-2(rIL-2)中，每摩爾rIL-2加入10摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。按照實施例3中所述的方法，得到純化的PEG修飾的rIL-2。衍生化結(jié)果列在表XVII中。
表XVII用實施例23所述試劑修飾rIL-2的結(jié)果rIL-2蛋白質(zhì)的表觀分子量 占反應(yīng)中得到的總蛋白質(zhì)的(kD) 百分率15(未修飾的) 7026 2030 10實施例26用試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的IL-1ra按照實施例6中所述方法用α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7對IL-1ra進(jìn)行聚乙二醇化。主要的聚乙二醇化產(chǎn)物的分子量為26、31、38和48 kD，它們分別占總蛋白質(zhì)的大約17％、44％、15％和10％。
按照實施例6所述方法測定從60分鐘反應(yīng)混合物中得到的純化的26 kD IL-1ra蛋白質(zhì)對IL-1結(jié)合的抑制能力，結(jié)果列在表XVIII中。聚乙二醇化的蛋白質(zhì)的結(jié)合能力保持在IL-1ra的1/2-1/3范圍內(nèi)。
表XVIII用實施例23所述試劑聚乙二醇化的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)192.0265.0實施例27用試劑α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制備與PEG結(jié)合的rIL-1α如實施例4所述的那樣，用α-[2-(異硫氰酸根合)乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7對重組IL-1α進(jìn)行聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鑒定60分鐘反應(yīng)混合物中的兩種主要分子量的聚乙二醇化產(chǎn)物，它們的表觀分子量為26和38 kD，分別占總蛋白質(zhì)的46％和48％。如實施例4所述那樣從反應(yīng)混合物純化聚乙二醇化的rIL-1α并進(jìn)行特性鑒定。如實施例7所述那樣以D10細(xì)胞增殖試驗對合并的純化級分的生物活性進(jìn)行評定，結(jié)果列在表XIX中。在表中注明為混合物的樣品含有一種以上未經(jīng)進(jìn)一步純化的蛋白質(zhì)。26 kD的聚乙二醇化蛋白質(zhì)的比活性基本上與IL-1相同。
表XIX用實施例23所述試劑制得的與PEG結(jié)合的rIL-1α的生物活性rIL-1α蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD)比活性(單位/mg)
17 1.1×10826 1.7×10826，38(混合物) 2.0×108＞38(混合物)6.0×106實施例28α-[(2-吡啶氧基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制備從1g(0.1mmol)MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量為10,000)在30mlCH2Cl2中的溶液中蒸去10ml溶劑。冷卻所得溶液，加入69.7mg(0.3mmol)硫代碳酸二(2-吡啶基)酯和2mg DMAP。然后將混合物在氬氣氛下攪拌18小時。減壓下除去溶劑，殘留物重新溶于最少量的CH2Cl2中。然后加入乙醚，濾出形成的沉淀，用乙醚洗滌。將產(chǎn)物溶于5ml溫?zé)岬母蚀级酌阎?，將所得溶液放置過夜。濾出形成的沉淀，用2×5ml甘醇二甲醚和5ml乙醚洗滌。在緩慢的氮氣流下將產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，得到0.9gα-[(2-吡啶氧基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C9H11NO3S(CH2CH2O)225分析計算值C，54.46；H，9.04實測值C，54.67；H，9.30實施例29用試劑α-[(2-吡啶氧基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的IL-1ra將如實施例28所述那樣制得的α-[(2-吡啶氧基)硫代羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225加到在1.0ml緩沖液(0.1M硼酸鈉，pH 9.0)中的2.0mg IL-1ra中，每摩爾IL-1ra加入2摩爾試劑。將溶液充分混合，使聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。然后按照實施例6所述方法純化PEG修飾的IL-1ra。
主要的聚乙二醇化產(chǎn)物的表觀分子量為33 kD，大約占60分鐘反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的17％。如實施例6所述的那樣，測定得自反應(yīng)混合物中的純化IL-1ra蛋白質(zhì)對IL-1結(jié)合的抑制能力，結(jié)果列在表XX中。33 kD蛋白質(zhì)的結(jié)合能力在IL-1ra的1/3-1/4范圍內(nèi)。
表XX用實施例28所述試劑聚乙二醇化的IL-1ra蛋白質(zhì)對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制IL-1ra蛋白質(zhì)的分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的) 1.433 5.0實施例30硫代碳酸O，O-二(6-甲基-2-吡啶基)酯向10g(0.09 mol)6-甲基-2-羥基吡啶在250ml無水CH2Cl2中的溶液中加入12.7ml三乙胺。將該溶液冷卻至0℃，并在氬氣氛下滴加4.1ml(0.046mol)的硫光氣四氯化碳溶液(85％)。再將混合物在室溫下攪拌5小時，過濾，CH2Cl2溶液用100ml飽和NaHCO3溶液洗滌兩次。干燥有機(jī)層，減壓下除去溶劑。然后將己烷(100ml)加到殘留物中，所得混合物浸提過夜。濾出沉淀，用己烷洗滌，在緩慢的氮氣流下于真空烘箱中干燥，得到5.7g硫代碳酸O，O-fg(6-甲基-2-吡啶基)酯，m.p.155-156℃。
C13H12N2O2S分析計算值C，59.98；H，4.65；N，10.76；S，12.32實測值C，59.65；H，4.59；N，10.75；S，12.06實施例31α-甲基-ω-[2-[[(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225將1gα-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如實施例1c制備的)和52.7 mg硫代碳酸O，O-二(6-甲基-2-吡啶基)酯(實施例30)溶解在15ml無水CH2Cl2中，然后將該溶液在室溫下攪拌過夜。減壓下除去溶劑，殘留物用乙醚研制。濾出沉淀，用乙醚洗滌。然后將產(chǎn)物溶于5ml溫?zé)岬母蚀级酌阎校ㄟ^0.75微米的微孔過濾器過濾。將溶液于室溫下放置48小時。濾出產(chǎn)生的沉淀。在氮氣氛中將產(chǎn)物在真空烘箱中干燥18小時，得到0.9gα-甲基-ω-[2-[[(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。
C10H14N2O2S(CH2CH2O)225分析計算值C，54.50；H，9.09；N，0.27；S，0.32實測值C，54.38；H，9.20；N，0.21；S，0.37實施例32用試劑α-甲基-ω-[2-[[(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的rIL-1ra將如實施例31所述那樣制得的試劑加到在1.0ml 0.1M硼酸鈉(pH9.0)中的5.0mg純化的rIL-1ra中，每1摩爾rIL-1ra加入2.0摩爾試劑。將溶液充分混合，使該反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用實施例6所述的方法對rIL-1ra產(chǎn)物進(jìn)行測定。表XXI給出了得自反應(yīng)混合物的主要分子量的修飾百分率。
表XXI用實施例31所述試劑修飾rIL-1ra的結(jié)果rIL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量 占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的(kD) 百分率19(未修飾的) 30.03565.048 5.0用實施例6所述方法純化得自反應(yīng)混合物中的rIL-1ra產(chǎn)物。
如實施例6中所述那樣，以rIL-1放射性受體競爭結(jié)合試驗對得自反應(yīng)混合物的純化級分進(jìn)行測定。結(jié)果列在表XXII中。這些結(jié)果表明，就抑制IL-1結(jié)合來說，35 kD蛋白質(zhì)的活性比未修飾的IL-1ra低5倍，而48 kD蛋白質(zhì)的活性低20倍。
表XXII用實施例31所述試劑結(jié)合的rIL-1ra對[125I]-IL-1結(jié)合的抑制rIL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的) 1.535 9.048 30.0實施例33α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180A.α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180的制備從80gMPEG(聚乙二醇，分子量為8000)在750ml甲苯中的淤漿中蒸去200ml溶劑。在回流條件下向該溶液中滴加1.7ml無水吡啶和4.7ml亞硫酰氯。回流12小時后，將反應(yīng)物攪拌過夜。然后加入二氯甲烷(50ml)，通過60g堿性氧化鋁(Wolem Super 1)過濾所得溶液。然后用500ml CH2Cl2洗柱，合并有機(jī)層，減壓下除去溶劑。將殘留物溶于300mlCH2Cl2中，緩慢加入乙醚，同時在蒸汽浴上除去溶劑。連續(xù)進(jìn)行該步驟，直到形成混濁的懸浮液。然事將混合物在室溫下攪拌數(shù)小時，濾出產(chǎn)物，得到73gα-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。
C2H4Cl2(CH2CH2O)180分析計算值C，54.16；H，9.09；Cl，0.88實測值C，53.40；H，8.81；Cl，0.93B.α-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU180的制備將72gα-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU180、25g疊氮化鈉和700mg無水DMF的混合物在125℃下加熱攪拌180、25g疊氮化鈉和700mg無水DMF的混合物在125℃下加熱攪拌12小時。然后在高真空度下除去溶劑，殘留物溶于1e CH2Cl2中，通過硅藻土過濾。然后在蒸汽浴上除去CH2Cl2，與此同時加入乙醚引起沉淀。將混合物攪拌過夜，然后過濾。再將沉淀溶于最少量的50℃的甘醇二甲醚中，緩慢冷卻，然后過濾。在N2氣流下將產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，得到69gα-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。
C2H4N6(CH2CH2O)180分析計算值C，54.07；H，9.08；N，1.044實測值C，53.76；H，9.28；N，0.96C.α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180的制備在氬氣氛下，將69gα-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180和6.7g(25.6mmol)三苯膦溶解在200ml無水CH2Cl2中形成的溶液攪拌過夜。加入水(2ml)，再將混合物攪拌12小時。減壓下除去大部分二氯甲烷，加入400ml乙醚。濾出沉淀物，用乙醚洗滌，溶于300ml溫?zé)?50℃)的甘醇二甲醚中。將該溶液在室溫下放置過夜，濾出形成的沉淀，用2×100ml甘醇二甲醚和2×100ml乙醚洗滌，在氮氣流下于真空烘箱中干燥，得到66gα-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。
C2H8N2(CH2CH2O)180分析計算值C，54.42；H，9.18；N，0.35實測值C，53.85；H，9.20；N，0.43D.α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180從1gα-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU180在40ml無水CH2Cl2中的溶液中蒸出15ml溶劑。將溶液冷卻至0℃，加入85mg(6.39 mmol)碳酸二(2-吡啶基)酯。然后將混合物在0℃乙醚(2×75ml)洗滌。然后在真空下干燥產(chǎn)物，再將產(chǎn)物溶于8ml無水甘醇二甲醚(50℃)中。將該溶液冷卻并于室溫下放置12小時。濾出沉淀出的產(chǎn)物，用2×5ml甘醇二甲醚洗滌，在氮氣流下于真空烘箱中干燥，得到1gα-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。
C14H14N4O4(CH2CH2O)180分析計算值C，54.57；H，8.99；N，0.68實測值C，54.32；H，8.79；N，0.77實施例34α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452A.α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452的制備按照實施例33A的方法，將聚乙二醇(分子量為20,000)轉(zhuǎn)化成α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。
C2H4Cl2(CH2CH2O)452分析計算值C，54.38；H，9.13；Cl，0.35實測值C，54.36；H，9.23；Cl，0.40B.α-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU452的制備按照實施例33B所述方法，將α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452轉(zhuǎn)化成α-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。
C2H4N6(CH2CH2O)452分析計算值C，54.35；H，9.12；N，0.42實測值C，54.38；H，9.30；N，0.47C.α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452的制備按照實施例33C所述方法，將α-(2-疊氮基乙基)-ω-(2-疊氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452轉(zhuǎn)化成α(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。
C2H8N2(CH2CH2O)452分析計算值C，54.49；H，9.17；N，0.14實測值C，54.44；H，9.19；N，0.15D.α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452按照實施例33D所述方法，將α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452轉(zhuǎn)化成α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。
C14H14N4O4(CH2CH2O)452分析計算值C，54.56；H，9.08；N，0.28實測值C，54.33；H，9.13；N，0.33實施例35用試劑α-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙基]-ω-[2-[[(2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452制備與PEG結(jié)合的rIL-1ra將如實施例34所述的那樣制得的試劑加到在1.0ml 0.1M硼酸鈉(pH 9.0)中的5.0mg純化的rIL-1ra中，每4.0摩爾rIL-1ra加1.0摩爾試劑。將溶液在室溫下充分混合60分鐘。
用實施例6所述的方法對rIL-1ra產(chǎn)物進(jìn)行測定。表XXIII給出了得自反應(yīng)混合物的主要分子量的修飾百分率。
表XXIII用實施例33所述試劑修飾rIL-1ra得到的結(jié)果rIL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量 占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的(kD) 百分率
19(未修飾的)50.055 35.075 15.0實施例36碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯在0℃下，將4.6g(42 mmol)3-甲基-2-羥基吡啶和6ml三乙胺在20mlCH2Cl2中的溶液滴加到50 ml CH2Cl2和11ml光氣在甲苯(1.93摩爾)中的溶液中。將混合物在0℃下攪拌2小時，然后在室溫下攪拌2小時。用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和NaCl溶液依次洗滌反應(yīng)混合物，然后干燥(Na2SO4)。減壓下除去溶劑，殘留物用EtOAc/己烷結(jié)晶，得到3g碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯，m.p.110-112℃。
C13H12N2O3分析計算值C，63.93；H，4.95；N，11.47實測值C，63.78；H，4.86；N，11.23實施例37α-甲基-ω-[2-[[(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225從1gα-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225在25ml CH2Cl2中的溶液中蒸出10ml溶劑。然后在氬氣氛下向該溶液中加入49.2mg(0.2 mmol)碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯并將所得混合物攪拌過夜。減壓下除去溶劑，向殘留物中加入80ml乙醚。濾出固體，用乙醚洗滌后溶于10ml CH2Cl2中。然后緩慢地加入乙醚，同時蒸出溶劑直到溶液變混濁。然后將混合物在室溫下放置18小時，濾出產(chǎn)生的沉淀。將該固體物溶于8ml溫?zé)岬母蚀级酌阎校儆谑覝叵路胖?8小時。濾出產(chǎn)物，在氮氣流下置于真空烘箱中干燥，得到0.6gα-甲基-ω-[2-[[(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU225。
C10H14N2O3(CH2CH2O)225
分析計算值C，54.59；H，9.09；N，0.28實測值C，55.64；H，9.14；N，0.22實施例38用試α-甲基-ω-[2-[[(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基]氨基]乙氧基]聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制備與PEG結(jié)合的rIL-1ra將如實施例37所述制得的試劑加到在1.0ml 0.1M硼酸鈉(pH 9.0)中的5.0mg純化的rIL-1ra中，每1摩爾rIL-1ra加入2.0摩爾試劑。將溶液充分混合，然后使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。
用實施例6所述方法對rIL-1ra產(chǎn)物進(jìn)行測定，表XXIV給出了從反應(yīng)混合物中得到的主要分子量的修飾百分率。
表XXIV用實施例37所述試劑對rIL-1ra的修飾rIL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量 占反應(yīng)混合物中總蛋白質(zhì)的(kD) 百分率19(未修飾的) 45.035 43.045 12.0如實施例6所述的那樣對得自反應(yīng)混合物中的rIL-1ra產(chǎn)物進(jìn)行純化。如實施例6所述那樣以rIL-1放射性受體競爭結(jié)合試驗對得自反應(yīng)混合物的純化級分進(jìn)行測定。結(jié)果列在表XXV中。就抑制IL-1結(jié)合而言，35 kD蛋白質(zhì)的活性比未修飾的IL-1ra低4倍，45 kD蛋白質(zhì)的活性低30倍。
表XXV用實施例35所述試劑結(jié)合的rIL-1ra對[125I]IL-1的抑制rIL-1ra蛋白質(zhì)的表觀分子量(kD) IC50(ng/ml)19(未修飾的)1.035 4.0
4530.0
權(quán)利要求
1.制備含有具有生理活性的式I所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物的藥物組合物的方法，
其中R1為低級烷基；R2為-O-或-NH-；R3為＝N-R4、＝S或＝O；R4為低級烷基或環(huán)烷基；m是1或2，n為大約28、112和225；其中所述的蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-1ra、α-干擾素或白細(xì)胞介素-2；前提是，當(dāng)R2為-O-時，R3不是＝N-R4；當(dāng)R2為-O-、R3為＝O時，蛋白質(zhì)不是白細(xì)胞介素-2；所述方法包括，將一種或多種所述的式I蛋白質(zhì)結(jié)合物以及需要的話一種或多種其他有治療價值的物質(zhì)制成合適的制劑形式。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，在所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物中，m為1。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中R1、R4、m、n和蛋白質(zhì)如在權(quán)利要求1中所定義。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如在權(quán)利要求1中所定義。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如在權(quán)利要求1中所定義。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如在權(quán)利要求1中所定義。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中R1、m、n和蛋白質(zhì)如在權(quán)利要求1中所定義。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中，在所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物中，R1為CH3。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中n為大約112。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)結(jié)合物是下式所示的蛋白質(zhì)結(jié)合物，
式中n為大約112。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中α-干擾素為αA-干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有具有生理活性的、基本上無免疫原性的水溶性聚乙二醇蛋白質(zhì)結(jié)合物的藥物組合物的制備方法,其中所述的結(jié)合物具有至少一部分形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)的生物活性,而不產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的不利免疫反應(yīng)。
文檔編號C07C331/18GK1175465SQ9711275
公開日1998年3月11日 申請日期1997年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年3月25日
發(fā)明者J·哈基米, P·基利恩, P·羅森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司