專(zhuān)利名稱(chēng)：用動(dòng)物乳房生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)方法及新的人生長(zhǎng)激素基因，將該基因置于特定啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)移至動(dòng)物中，使其僅在動(dòng)物乳腺中表達(dá)。
人生長(zhǎng)激素是一種蛋白質(zhì)類(lèi)激素，由一個(gè)基因編碼，正常情況下在腦垂體中生產(chǎn)，然后分泌到血液中，發(fā)揮其生理功能。在重組DNA技術(shù)出現(xiàn)之前，人的生長(zhǎng)激素只能從死人腦垂體中提取，產(chǎn)量非常低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用豬的腦垂體提取豬的生長(zhǎng)激素，提取一克生長(zhǎng)激素需使用8000個(gè)垂體。據(jù)此推算，從人的垂體中提取生長(zhǎng)激素，產(chǎn)量也差不多。重組DNA技術(shù)出現(xiàn)之后，人類(lèi)可以用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素。其主要過(guò)程是從人的腦垂體中提取信使RNA，在試管中用信使RNA模板，使用酶學(xué)反應(yīng)合成一條與信使RNA堿基互補(bǔ)的DNA，然后去掉信使RNA，再用酶學(xué)方法合成與信使相同的DNA。至此，就完成了人生長(zhǎng)激素基因的人工合成。這個(gè)人工合成的人生長(zhǎng)激素基因與適當(dāng)載體連結(jié)后，可以轉(zhuǎn)入大腸桿菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞系或動(dòng)物細(xì)胞系中生產(chǎn)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)化學(xué)處理和反復(fù)提純后，就得到醫(yī)用的人生長(zhǎng)激素。
現(xiàn)有技術(shù)的主要缺點(diǎn)有三方面，第一產(chǎn)量比較低。用大腸桿菌、酵母菌和昆蟲(chóng)細(xì)胞系生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素，從每升發(fā)酵液中只能提取出幾十毫克至一兩百毫克生長(zhǎng)激素。用動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量更低，從每升培養(yǎng)液獲得的生長(zhǎng)激素還不到一毫克。第二生產(chǎn)成本很高。用發(fā)酵法生產(chǎn)生長(zhǎng)激素，激素存在于細(xì)胞之內(nèi)，必須首先破碎細(xì)胞，然后從幾千種細(xì)菌蛋白質(zhì)中把生長(zhǎng)激素提純出來(lái)。在提純過(guò)程中每一步都會(huì)造成損失，回收率只有20-30％。所以，總的成本比較高。第三活性差，激素分子是一種蛋白質(zhì)，其生物學(xué)活性依賴(lài)其立體構(gòu)型。用微生物生產(chǎn)出的人生長(zhǎng)激素，其立體構(gòu)型不正確，沒(méi)有生物學(xué)活性。為了恢復(fù)其正確立體構(gòu)型，一般都采取在強(qiáng)還原溶液中(如8M尿素溶液)使其拉伸成線性分子，然后再通過(guò)緩慢的復(fù)性過(guò)程使其重新折疊成天然立體構(gòu)型，恢復(fù)活性。在這一過(guò)程中，不可能使所有激素分子都有天然立體構(gòu)型。因此，由這種方法生產(chǎn)的人生長(zhǎng)激素活性較差。
本發(fā)明目的在于提供一種人生長(zhǎng)激素的基因，以及提供一種可在動(dòng)物乳房中高效表達(dá)該基因的載體結(jié)構(gòu)，并且構(gòu)造一種產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低的生長(zhǎng)激素生產(chǎn)方法，所生產(chǎn)的生長(zhǎng)激素完全和從垂體中提取的一樣具有天然活性，可替代用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素。


圖1pBLGH62的構(gòu)建。圖2用動(dòng)物乳房生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素工藝示意。圖3轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)結(jié)果。圖4小鼠基因組DNA的Southern雜交結(jié)果。
本發(fā)明所涉及的是一種可以在動(dòng)物乳腺組織表達(dá)并且其產(chǎn)物與天然人生長(zhǎng)激素相同的生長(zhǎng)激素基因，其DNA結(jié)構(gòu)如下所示----TATAA----進(jìn)入BLG外顯子----AAGCACGACCCCAGGTCGACAACCC以下進(jìn)入hGH序列GATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACGCTCACCTAGCTGCA ATG GCT ACA G GTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCATAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGTATGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAG GC TCC CGG ACG TCC CTG CTCCTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGTGCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT AGTCTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAGGAG TTTGTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGACTTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGAAAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGGGCGGTCCTTCTCCTAG GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCATTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATTCCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCCGTGAGTGGATGCCTTGACCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAG AAC CTAGAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAGCCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TACGGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAGGAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG GTGGGGGTGGCGCTAGGGGTCCCCAATCTTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTAGAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCCAGGCCCTGACCCAAGAGAACTCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCTAGCCTTTCTCTACACCCTGAAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAGCAGTACCCAAGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAG AGG CTG GAA GATGGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAGTTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TACGGG CTG CTC TAC TGC TTC AGGAAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACATTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGCTTC TAG CTGCCC注序列中黑體字母表示外顯子序列。
上述基因經(jīng)轉(zhuǎn)化真核生物的培養(yǎng)細(xì)胞，或經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)插入動(dòng)物染色體之后，可以表達(dá)為人的生長(zhǎng)激素。其氨基酸組成如下MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeuCysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThrIleProLeuSerArgLeuPheAspAsnAlaSerLeuArgAlaHisArgLeuHisGlnLeuAlaPheAspThrTyrGlnGluPheGluGluAlaTyrThrProLysGluGlnLysTyrSerPheLeuGlnAsnProGlnThrSerLeuCysPheSerGluSerIleProThrProSerAsnArgGluGluThrGlnGlnLysSerAsnLeuGluLeuLeuArgIleSerLeuLeuLeuIleGlnSerTrpLeuGluProValGlnPheLeuArgSerValPheAlaAsnSerLeuValTyrGlyAlaSerAspSerAsnValTyrAspLeuLeuLysAspLeuGLuGluGlyIleGlnThrLeuMetGlyArgLeuGluAspGlySerProArgThrGlyGlnIlePheLysGlnThrHisSerLysPheAspThrAsnSerHisAsnAspAspAlaLeuLeuLysAsnTyrGlyLeuLeuTyrCysPheArgLysAspMetAspLysValGluThrPheLeuArgIleVaeGlnCysArgSerValGluGlySerCysGlyPhe上述人生長(zhǎng)激素的一級(jí)結(jié)構(gòu)同從人腦垂體提取的天然人生長(zhǎng)激素完全相同。因此，用動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物體生產(chǎn)上述基因的產(chǎn)品，可以代替從人腦垂體提取的生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明還涉及一種表達(dá)人生長(zhǎng)激素基因的載體結(jié)構(gòu)，其構(gòu)建方法是將人生長(zhǎng)激素基因上游插入牛乳球蛋白啟動(dòng)子，并去掉人生長(zhǎng)激素的啟動(dòng)子，使人生長(zhǎng)激素基因置于牛乳球蛋白基因啟動(dòng)子的控制之下。牛乳球蛋白的啟動(dòng)子的核苷酸序列如附圖1所示，牛乳球蛋白啟動(dòng)子和人生長(zhǎng)激素基因重組的技術(shù)路線如附圖1所表示。附圖1是pBLGH62的構(gòu)建。其中牛BLG基因5’R.E(調(diào)控序列)的5’末端位于牛BLG基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游650bp處，3’末端位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游11bp處。
本發(fā)明涉及的另一個(gè)方面是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指其染色體上含有本發(fā)明中描述的牛乳球蛋白基因啟動(dòng)子和人生長(zhǎng)激素基因融合在一起的DNA片段。這種動(dòng)物可以在其奶中生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素，這種動(dòng)物的制備方法可以用向單細(xì)胞階段的胚胎注射DNA的方法。也可以用其它的方法，如用精子作載體或用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體將DNA攜帶進(jìn)胚胎。本發(fā)明所涉及的是利用動(dòng)物乳房作反應(yīng)器生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的方法，它與用發(fā)酵細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法從介質(zhì)中提取生長(zhǎng)激素有重大差別。其工藝過(guò)程如附圖2所示，可作如下描述(1)人生長(zhǎng)激素基因向動(dòng)物轉(zhuǎn)移對(duì)供卵母畜一次耳靜脈注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)20單位/公斤體重。注射后七十二小時(shí)觀察發(fā)情狀況，若表現(xiàn)明顯發(fā)情狀況，于耳靜脈注射排卵激素(HCG)20單位/公斤體重，立即用自然交配或人工授精法配種。注射HCG后20-22小時(shí)，于腹部中央作一切口(切口大小視畜種而定)，輕輕拉出子宮及卵巢，清點(diǎn)卵巢上排卵窩數(shù)目，同時(shí)用PBS緩沖液從子宮角和輸卵管結(jié)合部注入輸卵管，在輸卵管的近卵巢端接PBS于表面皿中。然后，將表面皿放在解剖鏡下清點(diǎn)所得胚胎數(shù)并將它們轉(zhuǎn)移到一滴新鮮的PBS液中，液滴上蓋上一滴液體石蠟油，防止水分蒸發(fā)，收集到的胚胎可以在二氧化碳培養(yǎng)箱中暫存，條件為箱中CO25％，濕度100％，溫度37℃。
向胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA主要用顯微注射法。將欲被注射的動(dòng)物胚胎置于一塊經(jīng)硅化處理的載玻片上，覆蓋上PBS和液體石蠟。然后，將玻片放在微分干涉相差顯微鏡(DIC顯微鏡)下。對(duì)于豬、羊和牛的胚胎，在放置在顯微鏡下之前，還需作離心處理，以便將胚胎細(xì)胞內(nèi)的脂肪球移到一旁，使細(xì)胞核顯現(xiàn)出來(lái)。作離心處理的條件是在臺(tái)式離心機(jī)上以8000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，然后立刻放到DIC顯微鏡下。注射DNA時(shí)，用一根外徑100微米，內(nèi)徑10-20微米的細(xì)玻璃管將胚胎吸住，然后用一根外徑為1微米的玻璃針直接向細(xì)胞核注射DNA溶液，注射量為2-3 PL(百萬(wàn)分之二微升)內(nèi)含基因分子600至1000個(gè)。注射后的胚胎放在二氧化碳培養(yǎng)箱中作短暫保存后，移植到作同樣PMS G和HCG處理，但不予配種的受體母畜的子宮角和輸卵管結(jié)合部位內(nèi)。將子宮角送回腹腔，作抗菌處理后縫合。接受胚胎移植后的母畜將會(huì)懷孕并生出后代。
(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)接受胚胎移植的母畜產(chǎn)生后代時(shí)，將新生兒耳部或尾部剪下小塊組織，提取總DNA。將總DNA和經(jīng)過(guò)不同內(nèi)切酶消化的DNA置于瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)中分離。將凝膠片上的DNA條帶轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用鑒定探針進(jìn)行Southern分子雜交分析。
綜上所述，本發(fā)明涉及一種全新的生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素的工藝，它和現(xiàn)行的提取技術(shù)和用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)有重大差別，在重要經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo)上優(yōu)于現(xiàn)行技術(shù)。具體差別和優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在A、使用的基因結(jié)構(gòu)不同?，F(xiàn)行提取法是用人的腦垂體直接提取蛋白質(zhì)，未涉及基因分離和在人體以外表達(dá)。用微生物發(fā)酵生產(chǎn)所用的基因是以信使RNA為模板用酶學(xué)方法合成的，是一種人造基因，在自然界并不存在。從結(jié)構(gòu)上講，它只包括體內(nèi)合成人生長(zhǎng)激素的全部遺傳密碼，沒(méi)有稱(chēng)作內(nèi)含子(Intron)的間隔DNA序列。本發(fā)明所用的基因是從人類(lèi)染色體上切下來(lái)的。包括編碼生長(zhǎng)激素的外顯子(Exon)，內(nèi)含子(Intron)和上、下游調(diào)控序列。
B、基因在體內(nèi)工作方式不同。現(xiàn)行用基因工程微生物生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的工藝，基因在微生物體內(nèi)按微生物的方式轉(zhuǎn)錄成信使RNA，信使RNA直接和核糖體結(jié)合生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素肽鏈。本發(fā)明的基因在乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，首先轉(zhuǎn)錄成一條信使RNA的前體。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后經(jīng)過(guò)剪切和加工，變成成熟的信使RNA，再通過(guò)核糖體合成人生長(zhǎng)激素肽鏈。
C、初始產(chǎn)品形式不同?；蚬こ涛⑸锖铣傻娜松L(zhǎng)激素，在細(xì)胞內(nèi)被緊密地包在一種叫包涵體(Incolsion Body)的細(xì)胞器中，沒(méi)有任何生物活性。這種初始產(chǎn)品必須在體外通過(guò)化學(xué)方法將分子拉直，然后使其慢慢折疊成天然三維結(jié)構(gòu)，以恢復(fù)其生理活性。由于體外條件與體內(nèi)不同，即使經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性過(guò)程，得到的人生長(zhǎng)激素同天然品有差別，生理活性較低，本發(fā)明的工藝過(guò)程是讓乳腺細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)人的生長(zhǎng)激素進(jìn)行加工，然后分泌到乳汁中，生長(zhǎng)激素的三維結(jié)構(gòu)與天然品完全相同，生理活性較好。
D、總體工藝過(guò)程不同，現(xiàn)行的用重組微生物生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素，是一個(gè)工業(yè)過(guò)程，重組微生物在發(fā)酵罐內(nèi)用合成培基培養(yǎng)；生產(chǎn)出大量細(xì)菌后用離心機(jī)收集，收集的細(xì)菌經(jīng)破碎后得粗的總蛋白；總蛋白經(jīng)分步提純后得到生長(zhǎng)激素。本發(fā)明生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的過(guò)程是一個(gè)農(nóng)業(yè)過(guò)程。動(dòng)物用飼料飼養(yǎng)，擠出奶之后通過(guò)提純得到生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明從根本上改革了現(xiàn)行的人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)工藝，其效果表現(xiàn)為三個(gè)主要方面。第一，產(chǎn)量提高很多倍，用現(xiàn)行方法生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素，每升發(fā)酵液的理論產(chǎn)量可達(dá)數(shù)百毫克。但由于要使生長(zhǎng)激素變性和恢復(fù)天然構(gòu)型，又要從上千種細(xì)胞蛋白中提純，最終產(chǎn)量只有每升數(shù)十毫克。本發(fā)明用動(dòng)物乳房生產(chǎn)，每一升奶中人生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量可達(dá)5-10克。由于分泌到奶中的人生長(zhǎng)激素與天然產(chǎn)品相同，不需要重新將蛋白分子拉直和折疊，加上奶中其它蛋白質(zhì)只有少數(shù)幾種，提純回收率可高達(dá)90％。兩項(xiàng)因素相加，可使生產(chǎn)效率比現(xiàn)有技術(shù)提高50-100倍。第二，生產(chǎn)成本低。用動(dòng)物乳房生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素，研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程比較復(fù)雜。一旦有了這種動(dòng)物，生產(chǎn)過(guò)程相當(dāng)簡(jiǎn)單，不需要工廠，也不需要人工培養(yǎng)基，是一個(gè)養(yǎng)牛養(yǎng)羊和擠奶過(guò)程。由于奶中生長(zhǎng)激素含量高，提純工藝簡(jiǎn)單，總成本大約是現(xiàn)有技術(shù)的1％，有很好市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。第三，產(chǎn)品質(zhì)量好，乳腺組織可以對(duì)生長(zhǎng)激素進(jìn)行正確加工，分泌的生長(zhǎng)激素與腦垂體生產(chǎn)的生長(zhǎng)激素相同。此外，由于奶中生長(zhǎng)激素含量很高，其它蛋白數(shù)量只有幾種，而不是像細(xì)菌破碎之后那樣有幾千種，產(chǎn)品可以提得很純。因此，用乳房生產(chǎn)的人生長(zhǎng)激素品質(zhì)好。
用動(dòng)物乳房生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素是一種新的工藝過(guò)程，目前尚無(wú)任何產(chǎn)品由這種工藝生產(chǎn)并在市場(chǎng)上銷(xiāo)售。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而非限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍參見(jiàn)權(quán)利要求書(shū)。
實(shí)施例1 BLG/hGH轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诒緦?shí)驗(yàn)中，應(yīng)用DNA顯微注射法將牛乳球蛋白啟動(dòng)子(BLG)和人生長(zhǎng)激素基因(hGH)融合結(jié)構(gòu)DNA輸入小鼠胚胎，生產(chǎn)出乳房分泌人生長(zhǎng)激素的小鼠。
一、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小白鼠和昆明小鼠與C57 BL的雜交鼠，購(gòu)自計(jì)劃生育研究所動(dòng)物部2、儀器 倒置相差顯微鏡(日本尼康)顯微操作儀(德國(guó)Leitz)拉針儀(日本Narishige PD-5型)解剖顯微鏡(東分公司)二氧化碳培養(yǎng)箱(pharmacia)3、藥品 三溴乙醇，60％乳酸鈉，氯化鈣，透明質(zhì)酸酶、丙酮酸鈉均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，牛血清白蛋白(組分V)購(gòu)自華美公司。PMSG，HCG購(gòu)自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物研究所，其余藥品為國(guó)產(chǎn)。
4、地高辛DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒，Boehringer公司。SephaglasesBandprep kit Phamacia公司。人生長(zhǎng)激素放免試劑盒購(gòu)自301醫(yī)院內(nèi)分泌室。
5、尼龍膜 購(gòu)自Boehrnger公司。
6、質(zhì)粒pBLGH62見(jiàn)附圖1大腸桿菌中間載體PA28具體構(gòu)建過(guò)程如下以?；蚪MDNA為模板采用PCR法擴(kuò)增牛BLG基因5’端1680個(gè)核苷酸長(zhǎng)的一個(gè)片段，擴(kuò)增時(shí)使用的引物是參照綿羊BLG基因序列而設(shè)計(jì)和合成的，其具體序列為引物1ATCCCACGTGACTGCATTAGCC引物2CATTTCTGAAGCAGGATCTCCA擴(kuò)增出來(lái)的牛BLG 5’端1680個(gè)核苷酸的一段DNA含有帶動(dòng)連接其下游基因在乳腺中表達(dá)的功能元件。將這一段PCR擴(kuò)增出的DNA插入質(zhì)粒pGEM72f(+)的SmaI位點(diǎn)，就構(gòu)成了一個(gè)中間質(zhì)粒，命名為PA28。質(zhì)粒pGEM72f(+)是一種商品載體，購(gòu)自promaga公司。
大腸桿菌pGEMhGH載體的構(gòu)建過(guò)程是將人生長(zhǎng)激素編碼DNA序列用BamHl從原克隆載體上切下，得到一個(gè)長(zhǎng)度為2.2kb的DNA片段。此片段含有人生長(zhǎng)激素基因(hGH)全部外顯子(Exon)和內(nèi)含子(Intron)，但不帶有其本身的調(diào)控序列。將這一DNA片段插入商品質(zhì)粒載體pGEM72f(+)的BamHI位點(diǎn)，就構(gòu)建成中間載體pGEMhGH。
中間載體的構(gòu)建，主要是便于將牛BLG基因的調(diào)控序列和人hGH基因的結(jié)構(gòu)基因準(zhǔn)確組合到一起，構(gòu)建成適宜在動(dòng)物乳腺組織中特異表達(dá)的融合基因bBLG/hGH。
二、方法(一)主要試劑的配制1.20×SSC，在800毫升水中溶種175.3克NaCL和88.2克檸檬酸鈉，NaOH調(diào)pH至7.0，加水定容至1升，高壓滅菌。
2、變性液 1.5M NaCL，0.5M NaOH。
3、中和液 1M Tris.Cl(pH7.4)，1.5M NaCL4、鼠尾DNA抽提緩沖液50mM Tris.Cl(pH7.4)，0.16mM EDTA，三蒸水配制，過(guò)濾除菌。
(二)M2與M15培養(yǎng)液的配制1、貯存液的配制配制M2與M15培養(yǎng)液的貯存液貯存液 成分 體積克數(shù)與濃度(mL)A10× 100NaCL 5.534KCL0.356KH2PO40.162MgSO4.7H2O 0.293乳酸鈉 2.610或4.349克60％的漿1.000葡萄糖 0.060鏈霉素 0.050B10×100NaHCO32.101酚紅 0.101C100× 10丙酮酸鈉 0.036D100×CmCL2.H2O 10 0.252E10× 100HEPES5.958酚紅 0.010上述貯存液均過(guò)濾除菌，A液-20℃保存二周，其余4℃保存一周。
2、M2與M16的配制由貯存液配制M2貯存液 M2工作液 (單位mL)10 50 100A(10×) 1.0 5.0 10.0B(10×) 0.160.8 1.6C(100×) 0.100.5 1.0D(100×) 0.100.5 1.0E(10×) 0.844.2 8.4BSA 40.0mg 200mg 400mg雙蒸水 7.8039.078.0由貯存液配制M16貯存液 M16工作液 (單位mL)10 50 100A(10×) 1.0 5.0 10B(10×) 1.0 5.0 10C(100×) 0.1 0.5 1D(100×) 0.1 0.5 1BSA 40.0mg 200mg 400mg雙蒸水 7.8039.078.0M2和M16均現(xiàn)用現(xiàn)配(三)轉(zhuǎn)基因用DNA的制備1.質(zhì)粒pBLGH6 2經(jīng)EcoRI.HindIII和PvuII三酶切后，TAE瓊脂糖凝膠電泳，回收3.0kb左右的片段，即為BLG/hGH融合基因，將所需分子量的DNA條帶切下，再用Sephaglass Bandprep試劑盒純化。純化方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。純化的DNA一部分做酶切進(jìn)一步鑒定，另一部分制備顯微注射液。
2、用顯微注射用DNA稀釋液將純化后的DNA稀釋至2ug/ml，離心(12，00rpm，30分鐘)，取上1/2體積，分裝，即可用作顯微注射(四)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)方法1、小鼠的準(zhǔn)備
轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)用的小鼠分為四種類(lèi)型，即供體母鼠、受體母鼠、種公鼠和結(jié)扎公鼠。
①供體母鼠，8-10周齡的雌性昆明白鼠和雜交鼠。人工誘導(dǎo)發(fā)情后與結(jié)扎公鼠交配，作為超排卵供體母鼠。
②受體母鼠，8-10周齡的雌性昆明白鼠和雜交鼠。人工誘導(dǎo)發(fā)情后與結(jié)扎公鼠交配，獲得假孕母鼠，可作為顯微注射后受精卵的受體。
③種公鼠8-10周齡雄性昆明白鼠，購(gòu)回后單籠飼養(yǎng)，并標(biāo)號(hào)。1-2周后與供體母鼠交配。
④結(jié)扎公鼠8-10周齡的雄性昆明白鼠，實(shí)驗(yàn)前三周作雙側(cè)輸精管結(jié)扎。
2、公鼠的輸精管結(jié)扎麻醉2.5％三溴乙醇，(0.017毫升/克體重)，腹腔注射。結(jié)扎將小鼠仰臥定于手術(shù)板上，下腹部剪毛消毒，打開(kāi)腹腔，分別找出并結(jié)扎左右側(cè)輸精管，還納后閉合手術(shù)通路，關(guān)腹前切口處上少許磺胺粉以防感染。
3、超排卵供體母鼠在明暗循環(huán)的動(dòng)物房中飼養(yǎng)一周，即可作超排卵用。用生理鹽水將PMSG及hCG稀釋為100iu/mL，每只鼠腹腔注射0.1mL，注射時(shí)間為14.00 PMSG，48小時(shí)后hCG，注射hCG后分別將每只供體母鼠放入一種公鼠籠內(nèi)。排卵時(shí)間一般為注射hCG后10-13小時(shí)。
4、取卵將有陰栓的供體母鼠挑出，引頸處死，0.2％新潔爾滅浸泡全身，在下腹部打開(kāi)腹腔，暴露兩側(cè)輸卵管及卵巢，分別取出兩側(cè)輸卵管，將之轉(zhuǎn)移到盛有M2的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置解剖鏡下，用尖鑷子將輸卵管壺腹部撕開(kāi)，將卵輕輕撥出，加入少許透明質(zhì)酸酶(0.3mg/ml)。用移卵管輕輕的吹打，待卵分散后，將卵轉(zhuǎn)入M16液滴中，M16洗4次后，放入二氧化碳孵箱中。
5、受精卵的顯微注射①持卵器的制備取直徑1mm的硬玻璃管，在微火上烤軟，將其拉成80-150um直徑的細(xì)管在距頸部2cm處折斷，用燒針儀烤平斷口。
②注射針的制備用拉針儀將直徑1mm的玻璃管拉成針尖約1um直徑的注射針。
③顯微注射在凹玻片上各滴上M2培養(yǎng)液和上述得到的BLG/hGH融合基因的DNA注射液(兩者不可混合)，無(wú)菌石臘油覆蓋后置顯微鏡的載物臺(tái)上。低倍鏡下將注射針吸入適量的DNA注射液。取約10個(gè)受精卵注入M2液滴中。用持卵器吸住一枚卵后轉(zhuǎn)至高倍鏡下。將注射針調(diào)至合適的角度，針尖刺入受精卵雄原核中，將DNA注射液注入約1p1，可見(jiàn)雄原核膨脹，迅速抽出注射針。待凹玻片上所有的卵注射完畢后，立即將卵轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)基中，CO2孵箱培養(yǎng)30分鐘后即行移卵。
6、受精卵的輸卵管移植①移植用移卵管的制備將細(xì)玻璃管在酒精噴燈上燒軟，拉成150um直徑左右，折斷后將斷端烤平。
②受精卵的準(zhǔn)備將受精卵從M16培養(yǎng)液移至M2培養(yǎng)液中，再吸入移卵管中備用。
③受精卵的輸卵管移植選擇有陰栓的假孕母鼠，麻醉，方法同公鼠的輸精管結(jié)扎術(shù)。將鼠背側(cè)酒精消毒，在最后肋骨后約1cm處，沿脊柱作一長(zhǎng)1.5cm的縱長(zhǎng)切口，打開(kāi)腹腔，用鑷子夾住卵巢上的脂肪墊，將卵巢和輸卵管輕輕拉出。在解剖鏡下找到輸卵管傘開(kāi)口，用虹膜剪剪開(kāi)外層被膜，將移卵管插入傘部后將卵吹入。兩側(cè)輸卵部的移植同法，手術(shù)完畢后小夾子夾住切口，一周后除去夾子。
(五)鼠尾DNA的提取2周齡以上的小鼠，即可用于提取鼠尾DNA。
1、剪下2cm長(zhǎng)的鼠尾，先用70％乙醇洗凈。晾干后放入Ependorff管中。
2、加鼠尾DNA抽提液0.7ml，將鼠尾剪碎，再加70ul濃度為10mg/ml的蛋白酶K，混勻。
3、55℃水溶18小時(shí)，不時(shí)顛倒混勻。
4、冷卻至室溫后加RNAase使終濃度為20ug/ml，37℃水溶1小時(shí)。
5、加等體積苯酚，輕輕顛倒混合20分鐘，離心。(4℃，5000rpm，10分鐘)取上清，重復(fù)苯酚抽提兩遍，酚/氯仿抽提一遍，24∶1的氯仿∶異戊醇抽提一遍。
6、轉(zhuǎn)移水相至一新管中，加2倍體積的冷無(wú)水乙醇，混勻，沉淀立即出現(xiàn)。
7、將沉淀吸出，70％乙醇洗兩次，晾干。
8、加500ulTE，室溫溶解48小時(shí)，待DNA溶解后4℃保存。
轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)正常小鼠奶中沒(méi)有BLG，所以推測(cè)其基因組DNA中沒(méi)有BLG基因及其調(diào)控序列，這種調(diào)控序列只有BLG/hGH轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠才會(huì)有。用PCR法擴(kuò)增小鼠基因組DNA中的特異DNA片段是一種簡(jiǎn)便、迅速、有效的方法，所以本試驗(yàn)首先用PCR法檢測(cè)，以上述115只小鼠的基因組DNA為模板，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因鼠特異的牛BLG基因片段，以確定哪些小鼠是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的。
1、引物的設(shè)計(jì)由于導(dǎo)入的融合基因包括牛BLG基因650bp的5’側(cè)翼序列，因此使用的引物I的相應(yīng)序列為ATCCCACGTGACTGCTTTAGCC引物II的序列如下
GCTTCGTCGACGAGGACAATAC它是在引物I相應(yīng)序列下游520bp左右的區(qū)域與編碼鏈互補(bǔ)的22個(gè)堿基。根據(jù)上述引物設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物是牛BLG基因5’調(diào)控序列的片段，長(zhǎng)度為525bp。
2、PCR檢測(cè)從115只兩周齡的小鼠剪尾2cm，提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，死胎從肌肉組織中提取DNA作為模板。PCR反應(yīng)條件為94℃2分鐘，然后是3個(gè)溫度(94℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃2分鐘)的30個(gè)循環(huán)，最后72℃30分鐘。PCR反應(yīng)體系為50ul，其中引物I 0.5uM，引物II 0.5uM，dNTP 125uM，10×Taq酶Buffer5 ul，Taq聚合酶5U，DNA模板1ug。
經(jīng)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)有5只小鼠的基因組DNA可擴(kuò)增出525bp左右的特征條帶，其余110只小鼠和陰性對(duì)照鼠則無(wú)此條帶。見(jiàn)附圖3。附圖3是轉(zhuǎn)基困小鼠的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中1是入DNA HindIII/EcoR 1 marker，2，小鼠死胎，3是未轉(zhuǎn)基因鼠，4是3號(hào)鼠，5是6號(hào)鼠，6是8號(hào)鼠，7是10號(hào)鼠，由該圖可知，5只小鼠可能是BLG/LGH轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。
(七)Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠。
1、鼠尾DNA的酶切取鼠尾DNA20ug，BamH I酶切，酶切體系為鼠尾DNA20ug10×buffer E 20ulBamHI酶50u加雙蒸水至200ugl37℃酶切過(guò)夜2、電泳酶切后的DNA取小量電泳檢查，酶切完全后，將樣品用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于20uL，TE中，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，3-4V/cm，8小時(shí)。
3、轉(zhuǎn)膜①將轉(zhuǎn)移槽用清水洗凈，蒸餾水沖洗，鋪上帶窗口的塑料膜。
②剪一塊比窗口稍大的尼龍膜，重蒸水浸泡2分鐘后，蓋于窗口上。
③把凝膠放置在尼龍膜上，放好后不再移動(dòng)。
④裝好真空裝置，啟動(dòng)真空泵。調(diào)真空壓強(qiáng)為40mbar保持2分鐘。
⑤吸去膠上鹽酸加變性液，使之覆蓋膠面，保持30-60分鐘。
⑥吸去膠上變性液，加中和液，使之覆蓋膠面，保持20分鐘。
⑦吸去中和液，加20×SSC調(diào)壓至90mbar，保持60分鐘。
⑧轉(zhuǎn)膜完畢，關(guān)閉真空泵，吸去SSC溶液，除去凝膠，取下尼龍膜，整理好真空轉(zhuǎn)移器及塑料膜。
⑨將尼龍膜用6×SSC漂洗后置濾紙上晾干，80℃干烤2小時(shí)，DNA即固定在尼龍膜上。
4、探針的標(biāo)記，雜交均按Dig DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
(1)DNA探針的制備以BLG基因5’調(diào)控序列作為探針。
將質(zhì)粒pBLGH6 2進(jìn)行BamHI酶切，回收0.7kb片段。此片段含有牛BLG基因的5’調(diào)控序列，見(jiàn)附圖1。將此DNA片段純化后，用Dig標(biāo)記，作為Southern雜交的探針。
(2)小鼠基因組DNA的酶切根據(jù)附圖1可知，顯微注射所用的融合基因DNA序列含有兩個(gè)BamH I位點(diǎn)。推測(cè)此基因整合入小鼠基因組DNA后，用BamH I酶切此鼠基因組DNA可能出現(xiàn)兩種結(jié)果一是如果整合的基因是單拷貝的，則酶切出2.2kb左右的hGH基因和未知分子量的牛BLG基因調(diào)控序列與其上游鼠基因組DNA形成的片段；二是如果整合的基因是首尾相連的多拷貝，則能切出2.2kb左右的hGH基因和0.7kb的牛BLG基因的調(diào)控序列。因?yàn)樗玫奶结樖?.7kb的牛BLG基因的調(diào)控序列，所以推測(cè)Southern雜交的結(jié)果為，BLG/h GH基因的單拷貝整合會(huì)出現(xiàn)一條未知分子量的陽(yáng)性帶，BLG/hGH的首尾相連的多拷貝整合則出現(xiàn)一條0.7kb的陽(yáng)性帶。因此，本試臉用BamH I對(duì)小鼠基因組DNA進(jìn)行酶切，再進(jìn)行Southern雜交。
(3)Southern雜交以Dig標(biāo)記0.7kb的牛BLG基因5’調(diào)控序列為探針，對(duì)BamH I酶切后的56只鼠基因組DNA進(jìn)行雜交，有5只小鼠出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，見(jiàn)附圖4。附圖4是小鼠基因DNA的SouTHern雜交結(jié)果。其中圖4A中的1是0.7kb DNA陽(yáng)性對(duì)照，2是3號(hào)鼠，3是6號(hào)鼠，4是8號(hào)鼠，5是10號(hào)鼠。圖4B中的1是0.7kb DNA探針陽(yáng)性對(duì)照，2和9是陰性鼠對(duì)照，3-8和10-11為1、13、44、62、35、37、38、50號(hào)鼠，12是死胎鼠1號(hào)。
由附圖4可知，5只鼠均出現(xiàn)0.7kb的雜交陽(yáng)性帶，說(shuō)明這5只小鼠是BLG/hGH轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的，與PCR檢測(cè)的結(jié)果一致。而且是以BLG/hGH基因頭尾相連的多拷貝形式整合的。5只小鼠中一只為死胎，存活的4只鼠中一只為雄鼠(NO.6)，三只為雌鼠(NO.3，8，10)整合率為4.4％。
(八)鼠奶中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)1、小鼠奶樣的制備產(chǎn)后第8天的母鼠先與仔鼠隔離3小時(shí)以上，腹腔注射0.3IU的催產(chǎn)素，10分鐘后腹腔注射三溴乙醇。麻醉后，輕輕按摩乳腺，用纏膠布的鑷子輕輕擠奶，用微量加樣器將乳汁吸出。乳汁加無(wú)菌雙蒸水5倍稀釋?zhuān)x心去乳脂，每200ul加4-5ul 1N HCl，混勻后離心。上清液即為乳清，可供檢測(cè)用。
2.hGH放免測(cè)定301醫(yī)院檢測(cè)。
3、乳清蛋白的SDS PAGE電泳5％三氯乙酸沉淀去脂乳蛋白，離心，去上清，丙酮洗沉淀一次，溶于電泳上樣緩沖液中。6％的濃縮膠，1.5％的分離膠。15V/cm3小時(shí)?？捡R斯亮藍(lán)染色。
4、小鼠血清的制備小鼠剪尾采血500ul4℃過(guò)夜，離心，取血清備檢。
表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)；BLG/hGH轉(zhuǎn)基因小鼠作為一種乳腺生物反應(yīng)器模型，其乳腺應(yīng)當(dāng)表達(dá)目的基因，未轉(zhuǎn)基因的正常小鼠奶中是不含hGH的。采集乳汁樣品后先去乳脂。去乳脂后的樣品一部分除酪蛋白，即為乳清，一部分作為去脂乳備檢。同時(shí)又做了血清的hGH檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表2表2 BLG/hGH轉(zhuǎn)基因小鼠的hGH放免檢測(cè)結(jié)果(ug/ml

NA未檢測(cè)出 一未檢測(cè)對(duì)10號(hào)小鼠的去脂乳進(jìn)行了SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖7。
從表2可以看出，10鼠表達(dá)了hGH基因，奶中的hGH含量是血清中的8000多倍，而且96％的hGH在乳清中，結(jié)果表明，本試驗(yàn)克隆的0.66kb的牛BLG基因5’調(diào)控序列能控制hGH基因在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中表達(dá)，而且能隨乳汁分泌出來(lái)。hGH在10號(hào)鼠血清中含量遠(yuǎn)低于乳汁中的含量。
實(shí)施例2；用綿羊乳房生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素利用乳房作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素的工作原理，是要用一種辦法把編有體內(nèi)合成人生長(zhǎng)激素遺傳密碼的基因?qū)胙蚧蚱渌梢悦谌榈膭?dòng)物。導(dǎo)入時(shí)必須是在動(dòng)物胚胎剛剛形成，只有一兩個(gè)細(xì)胞時(shí)，只有這樣，將來(lái)發(fā)育成的動(dòng)物每個(gè)細(xì)胞都含有人生長(zhǎng)激素基因。此外，人生長(zhǎng)激素基因前邊還要加上能控制基因在特定組織和器官合成，而不會(huì)在不理想的部位合成。本實(shí)施例中，人生長(zhǎng)激素基因之前裝了能控制人生長(zhǎng)激素基因在乳腺中發(fā)揮功能的生物元件，使人生長(zhǎng)激素基因不會(huì)在其它任何組織和器官發(fā)揮功能，生產(chǎn)出人的生長(zhǎng)激素。這一點(diǎn)與實(shí)施例一完全相同。
但是，在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊時(shí)，使用的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)略有不同。在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，采用了把單細(xì)胞階段的胚胎沖出體外，通過(guò)向細(xì)胞核注射DNA之后又移植到小鼠體內(nèi)，在本實(shí)施例中，等待綿羊?qū)⒙雅诺捷斅压苤兄?，用手術(shù)切開(kāi)綿羊腹部作一切口，拉出子宮和輸卵管，將DNA和精子的混合物從輸卵管近子宮端注入輸卵管。精子和卵子在輸卵管中相遇，發(fā)生受精作用，形成胚胎，在這個(gè)過(guò)程中，精子穿透卵子外膜時(shí)，將DNA帶入卵子，精子的細(xì)胞核和卵子的細(xì)胞核發(fā)生融合時(shí)，外源基因(DNA分子)就插入到新生胚胎的染色體上。在新生的羊羔中，用分子檢側(cè)法查出其染色體上插入人生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因羊，養(yǎng)到泌乳時(shí)(母羊)或養(yǎng)到其女兒泌乳時(shí)(公羊)，檢查羊奶中人生長(zhǎng)激素含量，用免疫化學(xué)法(抗體-抗原特異反應(yīng))確定羊奶中生產(chǎn)出人生長(zhǎng)激素。本實(shí)施例共試驗(yàn)處理綿羊200只，生出小羊99只，其中含有人生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因羊12只(7公、5母)。其中只有一只母羊活到產(chǎn)奶時(shí)，其奶中生長(zhǎng)激素含量達(dá)到200毫克/升。已有工業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。由于經(jīng)費(fèi)短缺，轉(zhuǎn)基因公羊未保留到其女兒產(chǎn)奶。
本實(shí)施例說(shuō)明，本發(fā)明的技術(shù)程序有通用性，不論什么動(dòng)物，不管用什么方法轉(zhuǎn)基因，只要將控制人生長(zhǎng)激素基因在乳腺中特異表達(dá)的生物元件與該基因一塊轉(zhuǎn)入動(dòng)物，使之插入該動(dòng)物每一個(gè)細(xì)胞的染色體上，就生產(chǎn)出乳汁中含生長(zhǎng)激素的動(dòng)物，是一種成熟的工藝過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種新的人生長(zhǎng)激素基因，它具有表1所述DNA結(jié)構(gòu)。
2.一種生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的方法，其特征在于將含有權(quán)利要求1所述基因的DNA轉(zhuǎn)移到動(dòng)物中，在動(dòng)物乳腺組織中表達(dá)并產(chǎn)生人的生長(zhǎng)激素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于采用顯微注射方法將所述DNA注射到動(dòng)物胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于所述注射用DNA中人生長(zhǎng)激素基因上游插入了牛乳球蛋白啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可在動(dòng)物乳腺組織中表達(dá)并且其產(chǎn)物與天然人生長(zhǎng)激素相同的人生長(zhǎng)激素基因,還提供了將所述基因置于特定啟動(dòng)子控制之下轉(zhuǎn)移生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法,所述動(dòng)物可在其奶中產(chǎn)生人的生長(zhǎng)激素,從而提供了利用動(dòng)物乳房作為反應(yīng)器生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的技術(shù)。
文檔編號(hào)C07K14/61GK1208730SQ97116678
公開(kāi)日1999年2月24日 申請(qǐng)日期1997年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月15日
發(fā)明者陳永福, 郭志勤, 陳東, 楊國(guó)慶, 齊順章, 戴蘊(yùn)平 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)